CN102212581A

CN102212581A - 虫草多糖锗的生产制备方法及其应用

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Publication number: CN102212581A
Application number: CN2010101436132A
Authority: CN
Inventors: 李鹄鸣
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-04-12
Filing date: 2010-04-12
Publication date: 2011-10-12

Abstract

一种虫草多糖锗的生产制备方法，在虫草及各种虫草菌株的菌丝体发酵液中，或在虫草的固体培养基中，加入适量无机锗GeO₂或有机锗Ge132，使虫草吸收，并合成富锗的虫草多糖，即虫草多糖锗，然后用提取纯化多糖的方法将虫草多糖锗提取纯化，得到含多糖和含锗的虫草多糖锗。本发明把虫草多糖和锗两者的功能整合提高，特别是抗癌、抗病毒方面的功能进一步得到强化，同时去掉可能的毒副作用。

Description

虫草多糖锗的生产制备方法及其应用

技术领域：

本发明涉及一种生物医药，具体涉及一种虫草多糖锗的生产制备方法及其应用。

背景技术：

(一)虫草多糖的生物医学意义

已有大量的研究表明，虫草多糖具有显著的生物医学意义，具体的功效有：

1、提高肌体免疫力改善肝功能

何雅军等研究发现虫草多糖能显著降低肝损伤小鼠血清中谷丙和谷草转氨酶活性，对D2半乳糖所致小鼠肝损伤有保护作用。冬虫夏草的胞内多糖，戴氏虫草无性型、戴氏绿僵菌(M etarhizium taii L iangetliu)的胞外多糖均有促进体外淋巴细胞转化作用。虫草多糖能拮抗免疫抑制剂，刺激淋巴细胞增生，增强淋巴细胞经PHA刺激的增生反应。虫草多糖能改变大鼠淋巴细胞表面分子，从而调节机体免疫反应。冬虫夏草多糖可单独或协同PHA诱导IL 22R的表达，促进可溶性IL 22R(s IL 22R)的生成，但对PHA诱生的IL 22、IFN 2C活性有选择性抑制作用；其协同或抑制作用均呈剂量依赖性，吲哚美辛可部分或全部消除其抑制效应。这提示虫草多糖对体外培养的外周血淋巴细胞(PBL)具有双向免疫调节作用。王根维等在实验中采用相同浓度不同剂量冬虫夏草水提取物灌胃小鼠，结果表明冬虫夏草水提取物可促进特异性抗体的产生，增强机体体液免疫能力，此外小鼠腹腔巨噬细胞吞噬指数也明显高于对照组。

2、抗放作用虫草多糖能选择性地增加脾脏营与性血流量，药理实验表明，冬虫夏草多糖能使脾脏明显增重，脾中浆细胞明显增多，具有一定的抗放作用。从冬虫夏草中提取的多糖可提高小鼠8002C射线一次全身照射的保扩指数，具一定的抗放射作用；冬虫夏草水提物，对C射线照射所致小鼠脾脏萎缩和血小板数量减少及血小板超微结构的损伤均有一定的保护作用。这些作用提示虫草及其无性型作为肿瘤放疗的辅助药具有很好的应用前景。

3、抗肿瘤作用虫草多糖能提高血清的皮质酮含量，促进机体核酸及蛋白质的代谢，具有抑瘤作用。袁建国等的研究表明，冬虫夏草多均对小鼠有明显的抑瘤作用，抑瘤率可达45.71％。有报道称冬虫夏草中提取的多糖(CS2 II)对小鼠艾氏腹水癌抑制作用，生存率与肿瘤未发率与对照有明显差异。但也有报道冬虫夏草多糖对小鼠接种肉瘤S180的生长抑制较弱。不过动物实验证明冬虫夏草配合6M P和CY后，可提高抗癌效果，而又不增加毒性。因此虫草在中西医结合防治肿瘤方面是有一定价值的。此外，需要说明的是虫草多糖的抗肿瘤作用是非直接杀伤癌细胞，而是通过刺激人体非特异性防御机能达到抗癌和肿瘤的效果的，尤其是在癌症病人经放疗、化疗机体免疫力受损的情况下，与放疗、化疗配合治疗可达到治愈疾病的目的。

4、降低血糖季晖等对人工虫草菌丝多糖生理功能的研究中发现，虫草多糖(CP)对正常小鼠与四氧嘧啶糖尿病和链脲佐菌素糖尿病的模型小鼠均有显著的降血糖作用，且有一定量效关系。冬虫夏草不仅化为我国名贵传统的强壮滋补药材，冬虫夏草多糖的研究，无疑对后续开发保健功能食品提供很广阔的前景。

(二)锗的生物医学意义

1、锗金属能通过少量的能源(体温)产生作用，但其它的半导体必须要透过高量能源(高温、电流、电压)，锗原子核周围有32个电子，最外侧轨道上的4个电子做不规则运动。一旦温度上升，最外侧轨道上的一个电子就会因受刺激而离轨。而脱离了轨道的电子有助于调整生物的离子平衡，使身体神经电路的异常恢复正常，具有预防和改善身体的不适感及按摩温泉效果等功效。锗还有调整人体不正常电位的功能，在癌细胞电位剧烈上升时，锗元素会夺取癌细胞的电子，使它电位下降，抑制病症的恶化。锗金属的半导体功能可以提升体温，从而促进血液循环，减轻疲劳。

2、锗的药用保健功效：强化自然治愈力、改善全身体质、防止老化、预防癌症、消除肿瘤、肝病、气喘、血压调整、排除体内的毒素、自律神经失调症等等慢性病症。

有机锗的功效有：(1)锗可以抗癌锗是有强大启动白血球作用的物质，它可以使身体里的超氧供应增加，随之白血球的敏感度也大大提高。癌细胞虽然电位接近正常细胞，但总是和正常细胞有点差距，由于白血球的辨认灵敏度提高了，癌细胞就逃不过白血球的吞噬了。(2)锗又是干扰素的诱导剂干扰素是可以抑制病毒增殖的物质，锗则可以诱发人体产生更多的干扰素，进而抵抗病毒，并防止病毒扩散或增加。

有机锗是人体需要的一种元素，它具有多种功能。由于它具有脱氢富集氧功能，能够使体能保持充足的氧，从而维护人体的健康。在人体中，食物的分解是借助氧气进行的，在食物分解过程中，需要消耗大量的氧，同时生成水和二氧化碳。如果没有充足的氧，就有可能使机体引起各种疾病。而有机锗能把人体内的氢离子带出体外，减少了机体对氧的需求量，从而有利于健康。有机锗进入人体后，可均匀地分布在各器官组织中，24小时完全排出体外，属于不会在身体中蓄积的微量元素，其毒性极低，无副作用。人体各器官细胞在生命过程中产生废物，一部分经过分泌系统排出体外，还有一部分以自由基的形式存在于各器官中，形成病变，导致器官功能下降影响健康，有机锗能与这部分自由基结合后排出体外，增强器官生命。临床研究发现，目前被人们广泛认可有机锗对多种疾病有着良好的治疗作用。主要体现在：抗肿瘤、治疗老年痴呆、增强免疫功能、延缓衰老、预防及治疗动脉硬化、降低血液粘稠度、抗类风湿关节炎、调节内分泌、止痛消炎、降血压、治疗骨质疏松、调节内分泌、治疗慢性肝炎等方面。

但是无机锗是有毒的，简单的有机锗也有一定的毒性，如徐锡坤等(1997)的研究显示高剂量的Ge132导致尿蛋白含量和尿酶活性的明显升高，同时肾小管上皮细胞空泡变性、线粒体肿胀、上皮细胞基底面微皱褶加宽，提示可能是尿蛋白含量和尿酶活性升高的病理基础。因此如何提高锗的安全性是我们要面对的课题。

由于虫草多糖和锗都具有非常重要的生物医学意义，因此，如何把两者结合起来，强化已有的功能，去掉可能的毒副作用，特别是在抗癌、抗病毒方面，功能得到进一步强化，是摆在广大医学科学工作者目面前的重要课题。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是：解决上述现有技术存在的问题，而提供一种把虫草多糖和锗两者的功能整合提高、特别是抗癌、抗病毒方面的功能进一步得到强化、同时去掉可能的毒副作用的虫草多糖锗的生产制备方法及其应用。

本发明采用的技术方案是：这种虫草多糖锗的生产制备方法为：在虫草及各种虫草菌株的菌丝体发酵液中，或在虫草的固体培养基中，加入适量无机锗GeO₂或有机锗Ge132，使虫草吸收，并合成富锗的虫草多糖，即虫草多糖锗，然后用提取纯化多糖的方法将虫草多糖锗提取纯化，得到含多糖和含锗的虫草多糖锗。

上述技术方案中，所使用的虫草包括蛹虫草(Cordycepus militaris)的各种菌株、古尼虫草(Cordycepus guni)及其各种菌株、冬虫夏草(Cordycepussinensis)等。

上述技术方案中，锗的化合物可以加入虫草菌丝体发酵液中，或者加入虫草的固体培养基中。

上述技术方案中，其工艺流程是：锗加入液体培养基或固体培养基，培养成菌丝体或子实体，然后均浆，过滤，醇沉，溶解，再除蛋白，醇沉，然后离心、干燥，制得虫草多糖锗；上述溶解、醇沉的重复次数可根据需要和微量元素的结合度确定。

虫草多糖和锗都具有非常重要的生物医学意义。本发明是把两者结合起来，强化已有的功能，去掉可能的毒副作用。本发明的虫草多糖锗是大分子有机锗，把两者的功能整合提高，综合了蛹虫草多糖和有机锗的功能，特别在抗癌、抗病毒方面，功能进一步得到强化；同时去掉了可能的毒副作用，蛹虫草多糖锗在毒副作用方面比有机锗进一步降低。

附图说明：

图1为本发明产品虫草多糖锗的分子量用凝胶电泳法测定结果图；

图2为本发明产品虫草多糖锗的单糖组成标样图谱；

图3为本发明蛹虫草多糖锗图谱。

具体实施方式：

蛹虫草多糖锗的生产技术

1、材料与药品

1.1菌种：蛹虫草(Cordyceps militaris)。

1.2培养基配方

斜面培养基：PDA培养基，即马铃薯琼脂培养基。自然pH。

种子培养基：蔗糖2.0％，蛋白胨1.0％，酵母膏1.0％，p H6.0。

发酵培养基：砂糖，蛋白胨，酵母膏3％，KH₂PO₄ 0.10％，CaCl₂ 0.01％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.0074％，pH 6.5。另加入Ge-132，使发酵液锗浓度在50-100ppm。

1.3其它药品：琼脂粉(纯化)(中国医药集团上海化学试剂公司)、浓硫酸、苯酚、氯仿、正丁醇、葡萄糖、

2、仪器设备

超净工作台；菌种培养箱；金怡THZ-82B气浴恒温振荡器(江苏金坛市医疗仪器厂)；XK24-1060007电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；SIGMA3-18K台式高速冷冻离心机(德国制造)；HVE-50高压灭菌锅、AE100电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)(上海)、MP520B型电子天平、电炉、各种烧杯、18mm×180mm试管若干、漏斗、铁架台、玻璃棒、容量瓶、量筒、三角瓶、剪刀、尖头镊、接种针、酒精灯、移液管、吸耳球、无菌白纱布、橡胶圈、脱脂棉等。

3、实验方法

3.1菌种的活化：将菌种放在培养箱内，在25±1℃下无光培养7天左右，待菌丝长满培养基后终止培养。准备扩繁。

3.2菌种扩繁：将活化的菌种在超净工作台上接种到斜面培养基上，然后把斜面菌种放在25℃±1℃培养箱中避光培养10天左右，待菌丝体长满斜面，终止培养，作为摇瓶菌种。

3.3摇瓶培养：从经扩繁活化的斜面菌种(25℃，培养10天)取0.5cm²大小的菌苔6-8块接入发酵培养基(装液量为100ml/250ml三角瓶，或400ml/1000ml 三角瓶)内，分别于22℃旋转摇床(振荡器)上以转速为135-140r/min发酵培养。

3.4菌丝体收集与生物量的测定：培养4-8天后的发酵液在转速10000r/min离心10min，沉淀(湿菌体)用蒸馏水洗涤2次后，置60℃干燥箱中烘干至恒重，称量。

3.5富锗虫草多糖含量的分离纯化

将离心得到的菌丝体粉碎或未干燥前直接匀浆，加水加热提取三次，过滤，合并三次滤液，真空浓缩到一定体积。加3倍体积95％的乙醇沉淀多糖，离心得粗多糖锗，多糖含量在35％左右。

将粗多糖锗10g加水1000ml，于65℃下保温6h，使粗多糖锗溶解，3000rpm/min离心，除去沉淀。浓缩溶液至250ml，加入氯仿50ml、正丁醇10ml；搅拌10min，静置分层，除去有机溶剂层，将蛋白质除去。

将上述多糖锗溶液，加3倍体积95％的乙醇沉淀多糖，离心，弃去上清液。如此反复5次，干燥，得白色蛹虫草多糖锗精品，检测多糖含量。

3.6产品指标检测

3.6.1虫草多糖纯度(苯酚-硫酸法)

(1)标准曲线

精确称取105℃干燥恒重的葡萄糖200mg，置于100ml容量瓶中，定容，摇匀。取1ml溶液于25ml容量瓶中定容，摇匀，备用。

分别吸取25ml容量瓶中的葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0ml，各自用蒸馏水补充至2.0ml，加入6％的苯酚溶液1ml，摇匀，再迅速加入95-98％浓硫酸5ml，摇匀，室温下放置5min，再于80℃水浴上显色15min，取出冷却至室温，最后于490nm处测定吸光度值(以2.0ml蒸馏水作为空白调零)，得到回归方程和葡萄糖标准曲线。

(2)多糖含量的测定

精确吸取样品滤液1ml，置于50ml小烧杯中，加蒸馏水补足至2ml，再加入6％苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入浓硫酸5ml，摇匀，放置5min，置于80℃水浴中显色15min，取出冷却至室温，于490nm处测定吸光度值(以蒸馏水作空白对照)。

3.6.2虫草多糖分子量测定(凝胶电泳法)

柱1：G6000PWxl，柱温：40℃；柱2：G3000PWxl，柱温：40℃；供试液(虫草多糖锗)浓度：1.000g/L；供试液(虫草多糖锗)体积：20μl；洗脱液：0.1MNaNO3；流速：0.500ml/min；检测器1：DAD B，Sig＝254,16 Ref＝360,100；检测器2：RID A，Refractive Index Signal。

3.6.3虫草多糖的单糖组成(气相色谱法测定)

(1)多糖的水解

称取多糖样品10-15mg置于安瓿瓶内。加入3ml 2mol/L的三氟乙酸(TFA)，封管，在110℃下水解4小时，冷却后敲开瓶口，将安瓿瓶内的液体减压蒸干。

(2)单糖的还原

水解糖样溶解在0.5ml的0.05mol/L氢氧化钠溶液中，加入20mg的硼氢化钠，加入100μg的肌醇作为内标物，在70℃还原2h，加乙酸至无气泡逸出为止。用氮气除去水，加入1m L甲醇并振荡溶解后，用氮气除去甲醇。这样反复5次以除去硼酸根。残渣在含有P₂O₅的真空中干燥48h。

(3)单糖的乙酰化

将0.5ml吡啶和0.5ml乙酸酐加入到干燥的盛有还原糖样的反应瓶中。在100℃反应1h，室温下用氮气除去过量的反应试剂。加入0.5ml二氯甲烷溶解衍生物，使用微型过滤器过滤并收集滤液，残渣再用二氯甲烷萃取一次，合并2次滤液后用氮气浓缩至所需体积。

(4)测定

用日本ZHIMADZU(岛津)生产的GC-14C气相色谱仪(配有氢火焰离子化检测器)测定。色谱条件为：OV-275石英毛细管柱(30m×0.32mm×0.25μm)；柱温以10℃/min从180℃升至250℃，保持5min；检测器和进样器温度均为250℃；氮气作载气，分流比10∶1。

3.6.4蛹虫草多糖锗的锗含量测定

用苯基荧光酮——溴化十六烷基三甲胺(CTMAB)分光光度法测定锗含量。

(1)标准工作曲线的制作：

精确吸取锗标准工作液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml，在10mI比色管内，加入0.03％苯基荧光酮0.5ml，1.0％CTMAB0.5ml，1∶1H₂SO₄1.0ml，用纯水稀释至刻度摇匀；30min后以试剂空白作参比，在紫外可见分光光度计514nm波长处测吸收值。

(2)样品分析：

准确称取试样(约20μg锗)，置50ml锥形瓶中，加入5.0ml浓HNO₃，瓶口插玻璃小漏斗一只，小火加热，持微沸腾态回流；待溶液变为无色时，大火赶酸至近干，冷却；加入0.5mlH₂O₂，再加热至近干，冷却，加入少量纯水洗涤漏斗与消化瓶，转移至10ml容量瓶内，纯水定容。准确吸取1.0ml上述溶液按标准工作曲线方法操作，测定吸光度。

4.测定结果(产品各项参数)

4.1虫草多糖锗的多糖含量

第一次沉淀的粗多糖锗，多糖含量为35％；除蛋白、并经5次反复溶解、醇沉后，得到精多糖锗；经苯酚-硫酸法测定，多糖含量为95％。

4.2虫草多糖锗的分子量

凝胶电泳法测定结果见图1。

4.3虫草多糖锗的单糖组成

4.3.1标样图谱

以鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖为标样，以肌醇为内标，用日本ZHIMADZU(岛津)生产的GC-14C气相色谱仪测定，得到图谱，见图2：

表1标样数据

序号保留时间峰面积％峰面积峰高名称

1 7.105 15.05 303266 22735 鼠李糖

2 8.616 9.00 181280 17321 阿拉伯糖

3 9.634 23.46 472552 50021 木糖

4 10.447 17.17 345798 33163 半乳糖

5 10.835 17.15 345645 33134 葡萄糖

5 11.201 18.17 365946 37295 肌醇(内标)

总计 100 2014480 193669

4.3.2蛹虫草多糖锗图谱

蛹虫草多糖锗经水解、还原和乙酰化处理，GC-14C气相色谱仪测定结果见图3。

表2蛹虫草多糖锗样品检测数据

序号保留时间峰面积％峰面积峰高名称

1 7.448 1.94 34627 3652 鼠李糖

2 8.647 14.42 257463 22471 阿拉伯糖

3 9.497 1.21 21596 2710 木糖

4 10.490 58.82 1049997 107599 半乳糖

5 10.833 13.35 238269 29360 葡萄糖

6 11.233 10.26 183129 19412 醇(内标)

总计 100 1785081 185204

表2中从蛹虫草多糖锗样品中检出五种单糖(鼠李糖\阿拉伯糖\木糖\半乳糖\葡萄糖)，它们的物质的量比为：1.6∶12∶1∶48.6∶11。

4.4虫草多糖锗的锗含量

用苯基荧光酮——溴化十六烷基三甲胺(CTMAB)分光光度法测定虫草多糖锗的锗含量，在多糖纯度为95％的样品中，锗的含量高达308μg/g。

实验数据

蛹虫草多糖锗的毒性实验

(一)急性毒性实验

试验目的：为了观察小鼠、大鼠口服蛹虫草多糖锗后所产生的急性毒性反应及死亡情况，为临床验证安全性提供资料，特进行此项试验。

1实验材料

1.1药物：蛹虫草多糖锗，由湖南天国力生物工程有限公司提供，含锗量为308μg/g，多糖含量为95％。取蛹虫草多糖锗30g，加水至60ml，溶解，制成1ml含0.5g的混悬液，此浓度为最大浓度。

1.2动物：昆明种小鼠，18～22g，50只，雌雄各半；SD大鼠，120～150g，50只，雌雄各半，均由湖南农业大学动物科技学院实验动物养殖场提供(实验动物生产许可证：SCXK(湘)2003-0003号)；实验室温度18～28℃，自制标准颗粒饲料喂养，自由摄食、摄水。

2实验方法与结果

2.1蛹虫草多糖锗小鼠的急性毒性试验

经10只小鼠预试，ig测不出LD₅₀，故进行最大给药量测定。

取小鼠40只，20～22g，雌雄各半，均分成两组(n＝20)，给药组和对照组。隔食不隔水12小时后，给药组动物灌胃上述蛹虫草多糖锗混悬液0.8ml/20g，对照组动物灌胃等体积注射用水，每次间隔12小时，共给药二次，给药后连续观察7天动物的毒性反应，包括行为活动、精神状态、食欲、大小便，以及毛发、呼吸，口、鼻、眼、耳、肛门等有无异常分泌物，体重变化及死亡等情况。结果除给药组动物在给药后活动略有减少外，其它均未见异常。动物全部成活，对照组体重平均增加17.7％，给药组体重平均增加18.6％。第八天处死小鼠解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，均未见表面与切面异常。结果小鼠ig金生宝每日最大给药量为40g生药/kg，相当于临床60公斤成人一日用量(1.8g/日，1.8g/60kg＝0.03g生药/kg)的1333倍。

表1蛹虫草多糖锗小鼠急性毒性试验结果

名称动物数最大浓度最大体积给药次数最大给药量动物死亡行为饮食大小体重增相当人用

(只) (g/ml) (ml/20g) (次/日) (g/kg/日) 数(只) 活动便长(％) 量的倍数

对照组 20 - 0.8 2 - 0 正常正常正常 17.7 -

多糖锗组 20 0.5 0.8 2 40 0 正常正常正常 18.6 1333

2.2蛹虫草多糖锗大鼠的急性毒性试验

经10只SD大鼠预试，ig测不出LD₅₀，故进行最大给药量测定。

取SD大鼠40只，130～150g，雌雄各半，均分成两组(n＝20)，给药组和对照组。隔食不隔水12小时后，给药组动物灌胃上述蛹虫草多糖锗混悬液5.0ml/200g，对照组动物灌胃等体积注射用水，每次间隔12小时，共给药二次，给药后连续观察7天动物的毒性反应，包括行为活动、精神状态、食欲、大小便，以及毛发、呼吸，口、鼻、眼、耳、肛门等有无异常分泌物，体重变化及死亡等情况。结果除给药组动物在给药后活动略有减少外，其它均未见异常。动物全部成活，对照组体重平均增加14.9％，给药组体重平均增加15.9％。第八天处死大鼠解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等主要脏器，均未见表面与切面异常。结果大鼠ig蛹虫草多糖锗每日最大给药量为25g生药/kg，相当于临床60公斤成人一日用量(1.8g/日，1.8g/60kg＝0.03g生药/kg)的833倍。

表2蛹虫草多糖锗大鼠急性毒性试验结果

(只) (g/ml) (ml/200g) (次/日) (g/Kg/日) 数(只) 活动便长(％) 量的倍数

对照组 20 - 5.0 2 - 0 正常正常正常 14.9 -

多糖锗组 20 0..5 5.0 2 25 0 正常正常正常 15.9 833

3结论

蛹虫草多糖锗小鼠灌胃40g内容物/kg，相当于临床60公斤成人一日用量的1333倍；大鼠灌胃25g内容物/kg，相当于临床60公斤成人一日用量的833倍，均未见毒性反应，提示本品毒性小，在临床推荐的用药剂量下使用是安全的。

参考文献

[1]中华人民共和国卫生部药政局：《中药新药研究指南》1999年

[2]陈奇：中药药理研究方法学，人民卫生出版社，1993年

(二)长期毒性实验

1、前言

蛹虫草多糖锗是以国家卫生部批准的新资源食品蛹虫草(Cordyceps militaris)为工程菌种，以有机锗Ge-132为原料，应用生物工程合成的生物锗化物。在蛹虫草菌丝体的发酵过程中，加入有机锗Ge-132，使蛹虫草菌丝体吸收有机锗并与多糖结合产生蛹虫草多糖锗，再经提取、纯化而得到的含锗量为308μg/g、多糖含量为95％的蛹虫草多糖锗。

大量研究表明^[1-10]蛹虫草多糖具有提高人体免疫力、抗衰老、镇静、抗癌、降血糖、洚血脂等功效；有机锗具有抗肿瘤、抗炎与免疫调节、抗病毒、抗衰老以及镇痛等作用^[11]，它还具有抗癌谱广、毒性极低、无骨髓毒性等优点，其本身无直接细胞毒作用。此外刘德宗^[12]认为蛹虫草多糖锗促进生理功能正常化；有研究表明有机锗对糖尿病小鼠血糖无明显降低作用，但具有显著的预防血糖升高作用^[13]。蒋颂谨^[14]的研究表明有机锗确有抗脑细胞老化，提高智商作用，并可增加抗氧自由基的能力。

与蛹虫草多糖锗的两个前体蛹虫草多糖和有机锗Ge-132比较，蛹虫草多糖锗具有两大变化：一、综合了蛹虫草多糖和有机锗的功能，特别在抗癌、抗病毒方面，功能进一步得到强化；二、从理论上来看，蛹虫草多糖锗在毒副作用方面比有机锗进一步降低，本实验就是就是要从临床上检验蛹虫草多糖锗的毒性状况。

为了观察连续服用蛹虫草多糖锗后，由于积蓄而对机体产生的可能毒性反应及其严重程度，提供毒性反应的靶器官及其损害的可逆性，确定无毒反应剂量，为拟定人用安全剂量提供参考，我们参照《中药新药研究指南》及文献^[15-16]的要求，用大鼠对蛹虫草多糖锗进行了六个月连续给药的长期毒性试验研究，结果报告如下：

2、实验材料

2.1实验药物：蛹虫草多糖锗，由湖南天国力生物工程有限公司提供。取蛹虫草多糖锗，临用时用蒸馏水配成所需浓度的混悬液。

2.2动物：清洁级SD大鼠160只，90～110g，均由湖南农业大学动物科技学院实验动物养殖场提供。

2.3饲养管理：每组分笼饲养，每个不锈钢笼五只，用5％苦味酸溶液标记、编号，用自制全价营养颗粒饲料饲养，配方：玉米20％、麦麸20％、面粉15％、大米25％、豆饼5％、鱼粉7％、牛奶粉2％、鸡蛋3％、鱼肝油1％、酵母粉1％、骨粉0.5％、食盐0.5％。自由采食和饮水，室温15-25℃，湿度60％，换气次数12次/小时，照度2000lux，氨气浓度20ppm以下，噪音50分贝以下。

2.4试剂和仪器：F-800全血细胞分析仪，日本东亚生产；自动生化分析仪，ACTOANALYSER，意大利出品。

3、实验方法

3.1动物及分组：按体重将160只大鼠均分成四组(n＝40，雌雄各半)。第一组为对照组，给予蒸馏水20ml/kg；第二、三、四组为蛹虫草多糖锗高、中、低剂量组。剂量分别为3.0、1.5和0.75g/kg。相当于人用剂量的100、50和25倍(人1日用量6粒，即1.8g，以人均体重60kg计算，即：1.8g/60kg＝0.03g/kg)。

3.2药物配制和给药方法：取虫草多糖锗内容物，用蒸馏水配成0.30、0.15和0.075g/ml的混悬液，均按大鼠体重10ml/kg灌胃给药，每天一次，连续给药(周日停药)，每一周称体重一次并调整给药量，同时计算摄食量，共给药26周。

3.3实验方法：给药至第8周、第17周和第26周，于末次给药后24小时，每组活杀10只动物(先隔食16小时，雌雄各半)，其余动物继续给药，各组动物处死时取血做血液细胞学和血液生化指标检查，系统解剖肉眼观察各脏器并对主要脏器进行组织病理检查。第26周即第三次活杀动物后，每组剩余的10只动物停止给药，继续观察2周后再同法处理。

3.4观察指标

3.4.1一般观察：外观体征和行为活动，二便，饮食，饮水，体重变化及摄食量等。

3.4.2血液学指标：红细胞(RBC)，红细胞压积(HCT)，血红蛋白(HB)，白细胞总数(WBC)及其分类，血小板(PT)及凝血时间(CT)。

3.4.3血液生化指标：天门冬氨酸氨基转移酶(AST)，丙氨酸氨基转移酶(ALT)，碱性磷酸酶(ALP)，尿素氮(BUN)，肌酐(Crea)，总蛋白(TP)，白蛋白(ALB)，总胆固醇(T-CHO)，血糖(GLU)，总胆红素(T-BIL)。

3.4.4尸解及组织学检查

(1)系统尸解；(2)脏器系数：脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、睾丸、前列腺、子宫。(3)组织学检查：心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、胰腺、胸腺、大脑、食道、胃、小肠、膀胱、睾丸、前列腺、子宫、卵巢。

4、实验结果

4.1一般观察：实验期间，各组大鼠行为活动正常，毛色光亮，紧贴其身，二便，饮食、饮水均正常，眼、口及肛门等处无异常分泌物，体重正常增长，且三个给药组分别与对照组比较，差异无显著性意义(P＞0.05)，结果见表1。

表1、蛹虫草多糖锗对大鼠体重的影响(

雄性)

时间对照组高剂量组中剂量组低剂量组

实验前(n＝20) 100.7±5.9 101.0±5.9 101.1±6.6 103.5±6.3

第一周 109.5±6.5 110.1±7.5 110.7±7.7 113.0±7.2

第二周 121.5±6.8 121.7±7.6 121.7±8.2 123.8±7.3

第三周 132.0±7.7 132.2±9.4 133.9±8.5 135.7±8.7

第四周 147.6±9.4 145.1±10.0 146.3±10.0 149.4±10.3

第五周 159.5±10.6 156.3±11.8 158.9±12.1 162.0±11.1

第六周 174.5±12.4 170.1±13.1 172.9±13.4 176.3±12.0

第七周 186.7±12.7 182.3±13.4 186.6±13.8 190.0±13.7

第八周 201.0±14.0 196.1±14.7 200.7±16.3 204.8±14.6

第九周(n＝15) 214.4±15.2 205.5±13.6 212.5±17.4 219.9±16.2

第十周 228.6±17.3 219.4±14.9 226.6±19.6 234.8±18.2

第11周 240.7±17.3 232.3±16.3 237.3±20.8 246.5±20.2

第12周 255.4±18.7 246.6±18.2 252.2±23.7 260.1±21.8

第13周 268.2±19.3 259.6±19.6 263.4±25.0 273.1±22.6

第14周 283.1±21.1 274.4±21.8 278.0±26.7 287.2±23.6

第15周 295.6±21.3 286.8±22.9 291.5±27.4 299.8±24.5

第16周 309.0±21.5 300.1±23.8 307.2±30.9 313.1±25.9

第17周 321.8±22.7 311.3±23.8 319.9±31.5 326.5±24.4

第18周(n＝10) 336.8±26.5 327.0±25.5 334.4±35.1 340.4±24.1

第19周 347.5±27.8 340.0±28.7 345.3±36.1 352.1±25.5

第20周 363.6±30.1 356.5±28.8 358.3±37.7 365.8±27.3

第21周 373.8±29.8 368.8±30.7 369.8±39.1 380.2±28.3

第22周 388.9±32.4 382.0±32.5 384.1±40.9 396.9±31.0

第23周 401.7±32.9 394.5±32.3 407.5±39.7 409.7±32.1

第24周 416.5±34.7 409.1±33.5 409.4±42.4 424.9±34.2

第25周 428.3±35.2 422.0±33.5 421.4±43.5 435.7±35.9

第26周 442.3±35.7 435.0±35.9 434.5±45.4 450.9±34.6

第27周(n＝5) 454.4±34.2 444.0±37.2 447.8±58.1 455.2±48.0

第28周 468.2±34.7 456.5±37.9 461.9±58.4 470.1±47.9

续表1、虫草多糖锗对大鼠体重的影响(

雌性)

时间对照组高剂量组中剂量组低剂量组

实验前(n＝20) 98.6±5.7 98.8±5.2 100.8±5.9 100.0±6.3

第一周 107.8±6.9 109.6±6.3 110.2±6.6 109.1±7.3

第二周 119.7±7.5 121.5±7.5 123.0±7.4 121.1±7.5

第三周 131.3±7.7 133.4±8.1 133.9±8.0 132.4±8.8

第四周 144.2±8.9 145.7±8.7 146.4±9.4 145.6±10.3

第五周 154.7±9.7 157.4±9.7 157.8±10.7 156.6±10.5

第六周 168.4±11.4 171.2±10.4 170.2±12.3 168.9±11.0

第七周 178.9±11.4 181.8±10.8 179.9±13.2 179.4±12.0

第八周 190.9±10.6 194.5±12.1 192.6±13.1 191.9±13.3

第九周(n＝15) 201.8±10.9 204.0±11.8 202.3±13.4 202.5±13.3

第十周 213.6±11.5 215.7±13.0 213.4±14.5 214.7±14.1

第11周 222.7±12.4 224.4±13.6 222.8±14.3 225.0±13.9

第12周 233.8±13.4 233.8±14.1 234.5±14.7 235.9±14.0

第13周 241.0±13.6 241.1±14.9 241.9±15.0 243.5±14.3

第14周 249.8±14.6 248.7±15.9 251.0±14.9 252.3±14.8

第15周 257.9±15.9 256.3±15.8 258.1±15.0 258.8±15.3

第16周 267.7±17.9 263.6±15.9 265.9±16.5 266.6±16.4

第17周 276.1±17.7 271.5±16.8 273.3±17.3 273.7±15.9

第18周(n＝10) 284.9±18.5 277.4±19.2 284.6±19.4 278.1±18.0

第19周 289.8±17.8 284.9±17.9 290.1±19.7 283.3±18.0

第20周 295.8±17.6 289.4±18.2 295.6±20.0 289.4±19.0

第21周 301.7±19.0 294.6±17.8 300.6±20.0 296.2±19.0

第22周 309.1±20.3 300.5±18.3 307.2±20.6 302.6±20.0

第23周 315.8±20.3 307.8±17.8 312.8±20.7 309.3±19.8

第24周 323.0±21.7 314.2±18.3 318.7±20.1 315.5±19.9

第25周 327.9±22.1 321.0±18.0 325.3±19.7 321.4±20.0

第26周 333.1±23.2 327.3±18.5 331.5±20.1 328.4±19.8

第27周(n＝5) 335.4±11.4 334.6±12.4 348.4±20.2 348.0±20.7

第28周 345.6±17.8 340.9±13.0 356.9±21.7 357.4±21.5

表2、虫草多糖锗对大鼠摄食量的影响(

单位：g/100g体重.d)

时间对照组高剂量组中剂量组低剂量组

第一周 16.6±0.4 16.4±0.4 16.2±0.4 15.7±0.5

第二周 15.8±0.4 15.5±0.3 15.6±0.5 15.3±0.6

第三周 15.3±0.8 15.1±0.7 15.4±0.6 15.1±1.0

第四周 14.7±0.3 14.6±0.5 14.4±0.3 14.5±0.4

第五周 14.9±0.5 14.9±0.6 15.0±0.6 14.9±0.7

第六周 14.3±0.7 14.4±0.6 14.2±0.5 14.0±0.6

第七周 14.2±0.6 14.1±0.3 14.1±0.4 14.1±0.5

第八周 13.6±0.6 13.6±0.6 13.6±0.3 13.6±0.7

第九周 13.2±0.6 13.4±0.3 13.2±0.4 13.1±0.6

第10周 12.9±0.5 12.9±0.3 12.9±0.5 12.7±0.7

第11周 12.2±0.6 12.5±0.7 12.6±0.3 12.7±0.9

第12周 11.8±0.7 12.0±0.3 12.1±0.4 11.9±0.7

第13周 11.5±0.4 11.7±0.4 11.5±0.3 11.4±0.6

第14周 11.3±0.4 11.4±0.5 11.2±0.5 11.2±0.8

第15周 10.9±0.4 11.0±0.4 10.9±0.3 10.8±0.4

第16周 10.8±0.2 10.9±0.4 11.0±0.2 10.7±0.4

第17周 11.1±0.5 10.9±0.5 10.9±0.4 10.8±0.7

第18周 10.6±0.2 11.0±0.5 10.6±0.3 10.9±0.7

第19周 10.5±0.3 10.9±0.2 10.7±0.3 10.7±0.3

第20周 10.4±0.1 10.5±0.4 10.6±0.1 10.6±0.5

第21周 10.6±0.4 10.8±0.4 10.6±0.4 10.7±0.4

第22周 10.4±0.3 10.5±0.5 10.3±0.4 10.1±0.7

第23周 10.1±0.2 10.3±0.5 10.0±0.3 10.1±0.8

第24周 9.9±0.4 10.2±0.3 10.1±0.4 10.2±0.5

第25周 10.1±0.2 10.3±0.4 10.3±0.5 10.2±0.5

第26周 10.2±0.2 10.4±0.3 10.2±0.3 10.1±0.6

第27周 10.0±0.1 10.3±0.2 9.9±0.2 9.9±0.4

第28周 9.7±0.4 9.9±0.3 9.7±0.4 9.7±0.3

4.2血液细胞学指标：七个血液细胞学指标三个给药组分别与对照组比较，三个给药期和恢复期各项指标差异均无显著性意义(P＞0.05)。且各组所有指标均在动物血象正常值范围，结果见表3。

表3、蛹虫草多糖锗对大鼠血液细胞学指标的影响( n＝10)

组别 RBC HB HCT PLT WBC 白细胞分类(％凝血时间

(X10¹²个/L) (g/L) (％) (X10⁹个/L) ( X10⁹个/L) N L (秒)

二对照组 6.35±0.63 130.7±11.2 39.9±2.2 572.5±105.3 10.5±1.5 31.2±1.4 68.8±5.4 111.8±16.0

个高剂量 6.44±0.54 129.1±9.4 39.9±3.8 567.7±142.0 10.7±1.7 32.0±4.2 68.0±4.2 115.5±13.6

月中剂量 6.35±0.68 131.0±10.8 40.1±3.0 546.9±106.3 10.8±1.1 30.1±4.7 69.9±4.7 119.0±10.9

低剂量 6.36±0.64 135.8±10.7 39.6±2.4 513.2±130.0 10.6±1.1 32.9±6.4 67.1±6.4 119.0±12.7

四对照组 6.49±0.72 128.2±10.4 38.8±2.6 540.6±100.6 10.7±1.6 31.4±5.1 68.6±5.1 112.1±14.3

个高剂量 6.23±0.60 136.1±12.8 39.1±2.9 558.8±112.5 10.5±1.4 28.7±6.6 71.3±6.6 123.5±13.5

月中剂量 6.22±0.64 128.6±12.0 38.1±1.5 574.4±131.1 10.8±1.7 28.4±5.2 71.7±5.2 115.6±14.7

低剂量 6.41±0.73 134.4±8.8 38.6±2.8 551.0±112.4 11.0±1.7 31.1±6.9 68.9±6.9 115.2±10.4

六对照组 6.50±0.59 131.9±10.8 38.5±2.8 607.5±107.4 11.2±1.6 30.0±4.3 70.0±4.3 115.5±10.9

个高剂量 6.38±0.62 136.0±10.8 39.1±3.2 566.4±110.3 10.9±1.5 28.2±4.7 71.8±4.7 119.2±12.5

月中剂量 6.44±0.64 130.1±9.7 40.1±3.7 519.9±116.2 11.1±1.8 30.8±5.5 69.2±5.5 112.7±13.5

低剂量 6.49±0.72 132.4±11.0 40.8±3.0 557.7±134.0 10.7±1.6 30.8±4.2 69.2±4.2 124.1±11.3

恢对照组 6.51±0.66 133.4±11.3 41.7±2.6 526.7±127.8 10.8±1.3 30.4±6.1 69.6±6.1 120.7±13.4

复高剂量 6.69±0.75 132.5±10.4 40.5±2.4 521.6±119.7 11.1±1.6 28.4±7.3 71.6±7.3 115.1±11.4

期中剂量 6.61±0.69 132.3±10.6 41.1±2.7 562.9±130.5 10.4±1.2 33.1±4.8 66.9±4.8 117.0±14.0

低剂量 6.40±0.50 133.6±11.4 39.9±3.4 583.3±129.7 10.5±1.0 32.3±6.4 67.7±6.4 111.6±14.6

4.3血液生化学指标：所检10项生化指标，三个给药组分别与对照组比较，两个给药期和恢复期各项指标差异均无显著性意义(P＞0.05)。结果见表4。

表4、虫草多糖锗对大鼠血液生化指标的影响(

n＝10)

组别 AST ALT ALP BUN Crea

(u) (u) (u) (mmol/L) (μmol/L)

二对照组 106.7±17.0 44.3±6.9 179.7±33.7 6.22±0.81 93.1±22.9

个高剂量 98.3±27.3 47.9±4.1 177.9±45.7 6.11±0.98 97.0±16.6

月中剂量 97.8±23.1 46.5±5.8 191.7±37.8 6.07±0.98 99.4±21.8

低剂量 89.5±20.5 44.9±5.0 180.1±33.8 6.06±0.99 96.2±17.5

四对照组 102.9±24.3 47.0±5.4 171.4±35.3 6.06±0.73 93.1±22.9

个高剂量 109.0±29.2 46.2±8.6 192.6±23.2 6.13±1.04 97.0±16.6

月中剂量 103.3±23.0 43.2±5.5 165.1±35.6 6.22±1.06 99.4±21.8

低剂量 106.5±21.4 45.0±6.8 179.6±28.7 5.96±0.93 96.2±17.5

六对照组 103.8±24.6 43.8±5.9 178.6±36.7 6.06±0.73 93.5±21.7

个高剂量 106.1±21.3 41.1±5.4 178.6±33.4 6.13±1.04 107.8±19.1

月中剂量 105.4±18.8 42.3±6.0 175.2±30.7 6.22±1.06 103.3±18.2

低剂量 95.5±27.5 48.0±4.2 181.9±38.6 5.96±0.93 95.8±17.5

恢对照组 100.3±20.2 42.5±4.7 175.0±31.5 5.96±1.06 98.8±14.8

复高剂量 99.8±22.1 45.8±6.6 186.2±25.5 6.04±0.91 107.6±18.9

期中剂量 98.1±21.6 45.9±5.6 164.3±35.0 5.95±0.9 188.8±19.7

低剂量 102.2±18.5 46.0±5.0 184.8±35.1 6.23±0.98 104.7±18.5

续表4、虫草多糖锗对大鼠血液生化指标的影响(

n＝10)

组别 T-CHO TP ALB GLU T-BIL

(mmol/L) (g/L) (g/L) (mmol/L) (μmol/L)

二对照组 2.17±0.54 70.7±4.2 35.2±3.5 5.44±1.26 6.40±2.04

个高剂量 1.84±0.47 73.7±5.3 34.4±6.0 5.86±1.42 6.20±2.44

月中剂量 2.00±0.57 73.3±6.6 37.2±3.8 6.32±0.92 5.93±2.82

低剂量 1.85±0.41 70.6±4.3 38.7±5.5 5.98±0.75 6.04±1.72

四对照组 2.01±0.60 75.2±6.6 39.3±4.0 6.41±0.84 5.70±2.19

个高剂量 1.81±0.50 76.3±6.2 42.3±3.4 6.31±1.30 6.19±2.45

月中剂量 1.69±0.57 71.9±4.7 37.6±5.6 5.98±1.32 6.89±2.39

低剂量 2.07±0.48 72.1±7.1 36.5±5.5 5.91±1.28 6.17±1.88

六对照组 2.19±0.50 72.9±6.0 36.4±4.4 6.28±1.39 6.49±1.93

个高剂量 1.72±0.60 77.0±6.4 38.8±5.1 6.09±1.15 6.20±1.64

月中剂量 1.81±0.58 72.9±5.6 36.8±7.1 6.21±1.07 6.16±1.82

低剂量 1.96±0.58 74.5±5.6 36.9±5.3 6.28±1.20 6.70±1.92

恢对照组 1.66±0.63 72.0±6.4 33.7±2.7 5.67±1.38 5.28±1.72

复高剂量 1.83±0.67 75.5±6.1 35.9±4.4 6.26±1.10 6.00±2.89

期中剂量 1.80±0.74 73.0±5.1 34.9±5.4 5.81±1.08 6.23±2.21

低剂量 2.01±0.48 76.5±5.4 35.8±4.6 5.77±1.25 5.96±2.21

4.4病理解剖及组织学检查

4.4.1脏器系数：12个脏器系数可见，三个给药组分别与对照组比较，两个给药期和恢复期各个器官差异均无显著性意义(P＞0.05)，结果见表5。

表5、蛹虫草多糖锗对大鼠脏器系数的影响(

n＝10，g/100g体重)

组别脑心肝脾肺肾

二对照组 0.83±0.06 0.50±0.03 4.73±0.68 0.54±0.05 0.76±0.07 0.99±0.07

个高剂量 0.81±0.07 0.50±0.04 4.50±0.62 0.52±0.04 0.72±0.06 0.98±0.08

月中剂量 0.82±0.06 0.52±0.06 4.34±0.45 0.56±0.05 0.70±0.07 0.98±0.06

低剂量 0.83±0.07 0.53±0.05 4.53±0.57 0.52±0.06 0.76±0.08 1.03±0.10

四对照组 0.71±0.07 0.42±0.03 4.27±0.54 0.45±0.04 0.65±0.05 0.81±0.05

个高剂量 0.72±0.05 0.44±0.04 4.24±0.45 0.44±0.05 0.64±0.05 0.81±0.07

月中剂量 0.69±0.09 0.42±0.04 4.13±0.43 0.44±0.05 0.61±0.04 0.77±0.07

低剂量 0.69±0.07 0.42±0.04 4.08±0.45 0.43±0.04 0.60±0.06 0.79±0.06

六对照组 0.74±0.08 0.36±0.05 3.77±0.53 0.37±0.04 0.57±0.06 0.72±0.09

个高剂量 0.76±0.08 0.37±0.05 3.99±0.55 0.40±0.06 0.57±0.05 0.75±0.08

月中剂量 0.76±0.06 0.38±0.04 3.72±0.46 0.39±0.05 0.59±0.06 0.76±0.08

低剂量 0.77±0.10 0.37±0.05 3.91±0.56 0.40±0.06 0.58±0.08 0.74±0.09

恢对照组 0.71±0.07 0.37±0.05 3.80±0.52 0.38±0.04 0.53±0.03 072±0.07

复高剂量 0.73±0.08 0.37±0.04 3.74±0.34 0.37±0.02 0.56±0.05 0.72±0.07

期中剂量 0.71±0.07 0.35±0.04 3.75±0.47 0.37±0.05 0.56±0.06 0.72±0.07

低剂量 0.70±0.07 0.35±0.04 3.69±0.40 0.37±0.05 0.55±0.06 0.69±0.07

续表5：

组别睾丸子宫肾上腺甲状腺前列腺卵巢

二对照组 1.01±0.09 0.17±0.03 0.019±0.003 0.014±0.002 0.41±0.04 0.053±0.004

个高剂量 0.97±0.06 0.16±0.02 0.018±0.003 0.014±0.002 0.38±0.02 0.049±0.004

月中剂量 0.99±0.12 0.18±0.02 0.018±0.003 0.015±0.001 0.44±0.06 0.050±0.008

低剂量 1.00±0.08 0.18±0.03 0.018±0.002 0.014±0.003 0.43±0.04 0.050±0.003

四对照组 0.87±0.09 0.18±0.01 0.015±0.001 0.013±0.003 0.35±0.05 0.049±0.007

个高剂量 0.90±0.08 0.17±0.02 0.015±0.001 0.013±0.002 0.39±0.01 0.047±0.005

月中剂量 0.85±0.10 0.19±0.01 0.015±0.002 0.013±0.002 0.37±0.04 0.050±0.007

低剂量 0.85±0.09 0.17±0.03 0.014±0.002 0.012±0.002 0.35±0.03 0.048±0.001

六对照组 0.81±0.07 0.18±0.03 0.014±0.002 0.012±0.002 0.35±0.03 0.051±0.006

个高剂量 0.80±0.07 0.20±0.02 0.013±0.002 0.012±0.002 0.35±0.02 0.053±0.006

月中剂量 0.83±0.06 0.18±0.01 0.014±0.002 0.012±0.002 0.34±0.04 0.054±0.006

低剂量 0.78±0.03 0.19±0.02 0.014±0.002 0.013±0.003 0.32±0.03 0.054±0.006

恢对照组 0.78±0.06 0.18±0.02 0.014±0.002 0.011±0.002 0.34±0.03 0.053±0.004

复高剂量 0.79±0.07 0.18±0.02 0.014±0.002 0.012±0.002 0.37±0.03 0.054±0.004

期中剂量 0.80±0.11 0.18±0.02 0.014±0.001 0.012±0.002 0.33±0.04 0.050±0.003

低剂量 0.78±0.08 0.19±0.01 0.013±0.002 0.012±0.002 0.33±0.04 0.050±0.003

(睾丸、前列腺、子宫、卵巢，n＝5)

4.4.2组织学检查：给药期大鼠解剖时经肉眼观察，各脏器均未见异常或病变。二个给药期大鼠心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、甲状腺、胰腺、胸腺、大脑、食道、胃、小肠、膀胱、睾丸、前列腺、子宫、卵巢等组织经病理切片检查，结果给药组和对照组大鼠：1、心：大鼠心肌纤维染色均匀，横纹清楚，无变性、坏死；间质无出血，无炎细胞浸润；2、肝：大鼠肝细胞无变性、坏死，肝细胞索排列有序；肝窦无淤血，汇管区无炎细胞浸润、无纤维组织增生；3、脾：大鼠脾白髓、红髓结构清楚，无淤血，无纤维组织增生；4、肺：大鼠的支气管、细支气管黏膜上皮完整、无脱落；肺泡腔无炎性渗出物，肺间质无炎细胞浸润、无出血、无纤维增生；5、肾：大鼠肾小球无炎细胞浸润，毛细血管无增生、肾小管上皮无变性、坏死；6、肾上腺：大鼠肾上腺皮质球状带、束状带、网状带和髓质结构清楚，无炎细胞浸润，无灶性坏死；7、甲状腺：大鼠甲状腺滤泡完整，上皮无增生；间质无出血、无炎细胞浸润；8、胰腺：大鼠胰腺实质小叶未见异常，泡状腺和胰岛可见，细胞形态无异常；9、胸腺：大鼠胸腺组织结构未见异常，胸腺皮质与髓质可见，细胞形态无异常；10、脑：大鼠脑灰质和白质无炎细胞浸润；海马区无水肿及灶性坏死；11、胃：大鼠胃粘膜无坏死脱落，粘膜下层、肌层、浆膜层无炎细胞浸润、无炎性充血；12、大鼠食道壁粘膜无坏死脱落，粘膜下层、肌层、浆膜层无炎细胞浸润、无炎性充血；13、小肠：大鼠小肠粘膜无坏死脱落，粘膜下层、肌层、浆膜层无炎细胞浸润、无炎性充血；14、膀胱：大鼠膀胱粘膜无坏死，固有层、肌层、外膜层无炎细胞浸润、无炎性充血；15、睾丸：大鼠睾丸曲细精管及各级生精细胞无变性、坏死，间质无炎性细胞浸润；16、前列腺：大鼠前列腺腺体无萎缩、无坏死；间质无出血、无炎细胞浸润；17、子宫：大鼠子宫内膜无坏死脱落，肌层、浆膜层无炎细胞浸润、无炎性充血；18、卵巢：大鼠卵巢各级卵泡无变性坏死；间质无出血、无炎细胞浸润。

5、结论

以上结果表明蛹虫草多糖锗是一种无毒的生物锗。大鼠灌胃给以药3.0、1.5和0.75g/kg(分别相当于人用量的100、50和25倍)，连续26周和恢复期，所有指标检查均未见异常，因此蛹虫草多糖锗在临床推荐用药剂量下使用是安全的，可以作为为进一步开发药品和保健食品的原料。

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(三)蛹虫草多糖锗的致突变试验

1Ames试验

称取蛹虫草多糖锗1.0g，加蒸馏水至10ml，高压灭菌后配成4种浓度的受试液：100mg/ml、10mg/ml、1.0mg/ml及0.1mg/ml。选用鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100和TA102。四个实验用标准菌株，采用标准平皿渗入法，每一平皿加受试液0.1ml，二天后计数每平皿菌落回变数。试验结果见表1.

表1蛹虫草多糖锗的Ames试验结果()

Table 1 The results of polysacchoride-germanium from Cordyceps militaris on Ames test

浓度(μg/皿) -S9 +S9

Concentration

(μg/plate) TA97 TA98 TA100 TA102 TA97 TA98 TA100 TA102

对照control 136.9 18.4 141.8 352.9 139.1 25.1 155.9 326.6

10.00 92.8 17.3 110.4 119.4 130.8 32.4 149.4 312.8

100.00 120.4 20.5 125.8 324.5 125.8 32.6 150.8 319.0

1000.00 136.2 18.4 130.0 312.0 126.6 33.8 151.4 315.8

10000.00 147.3 18.2 117.8 318.7 127.0 32.9 152.6 314.1

Positve control 748.8 240.4 880.0 986.3 969.4 702.4 990.0 ＞1000

注：表中数据为四个皿的均数。

试验结果显示，在上述四种试验浓度下，各皿回变菌落数均未超过阴性对照组自发回变数的2倍，而阳性对照组显示了强烈的诱变作用，表明蛹虫草多糖锗在每皿10mg(及低于10mg)的剂量下，未显示致突变阳性作用。

2.3.2小鼠骨髓细胞微核试验取小鼠50只，随机分成5组，每组雌雄各5只。试验组设5.0g/kg、1.0g/kg和0.2g/kg三个剂量，以环磷酰胺40mg/kg作为阳性对照，连续给药5天，于第6天处死动物，取胸骨进行骨髓涂片，每只小鼠镜检1000个嗜多染红细胞，计算微核出现率，结果见表2。由表2可见，阴性对照组及各试验组的微核出现率均在正常范围内，而阳性对照组为雌：35‰，雄26.82‰，显著高于阴性对照组(P＜0.01)，提示蛹虫草多糖锗对小鼠骨髓细胞微核出现率无影响。

表2蛹虫草多糖锗对小鼠骨髓细胞微核试验

Table 2 The result of polysacchoride-germanium from Cordyceps militaris on micronuclear test of bonemarrow cell of mice

组别剂量(g/kg) 雌性Female 雄性Male

Group Dose n micronuclear rate(‰) n micronuclear rate(‰)

Control -- 5 1.25 5 0.88

试验组1 0.20 5 1.20 5 1.00

试验组2 1.00 5 1.36 5 1.25

试验组3 5.00 5 1.45 5 1.58

Positive control 0.04 5 35.00 5 26.8

2.3.0小鼠精子畸变试验

取雄性小鼠25只，随机分成5组，每组5只，给药剂量及阳性对照组同微核试验。连续灌胃给药5天，再饲养30天，于第35天处死动物，分离两侧附睾于2ml生理盐水中撕碎，过滤后制片，每只小鼠镜检1000个精子，计算其畸变率，结果见表3。

表3蛹虫草多糖锗对雄性小鼠精子畸变的影响

Table 3 Effect of polysacchoride-germanium from Cordyceps militaris on Aberratuin of sperm in mice

组别剂量检查精子数畸变数畸变率(％)

Group Dose Sperm examined Aberration Aberration rate

Control - 5000 145 2.9

试验组1 0.2 5000 98 2.0

试验组2 1.0 5000 88 1.8

试验组3 5.0 5000 129 2.6

Positive control 0.04 5000 486 9.7

由表3可见，阴性对照组及各给药组精子畸变率均在正常畸变-范围内，且各组间畸变类型分布也较一致；而阳性对照组的畸变率显著高于阴性对照组(P＜0.01)，提示蛹虫草多糖锗对小鼠精子无致畸变作用，而且还表现出抑制畸变的趋势。

5结论

Ames试验、小鼠骨髓细胞徽核试验及小鼠精子畸变试验结果表明，蛹虫草多糖锗对小鼠无致突变作用。

参考文献

徐学瑛等.一个改进的体液免疫测定方法——溶血素测定方法.药学学报1979，

14(7)：443

三、蛹虫草多糖锗的功效实验

(一)蛹虫草多糖锗的免疫增强作用

1实验材料

1.1动物昆明种小鼠，体重20±2g；SD大鼠，体重200±20g，均由湖南农业大学提供。大、小鼠均雌雄兼用。

1.2蛹虫草多糖锗蛹虫草多糖锗粉(含锗量为308μg/g，多糖含量为95％)由湖南天国力生物工程有限公司提供，是将Ge-132作为外加锗源，进行蛹虫草的液体发酵培养，通过菌体的物质代谢转化，结合于多糖的大分子上。蛹虫草多糖锗经200目筛后用蒸馏水稀释，冰箱保存备用。

1.3试剂

1.3.1Alsever溶液萄葡糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl 0.42g，蒸馏水100ml。

1.3.2都氏试剂碳酸氢钠1.0g，氰化钾0.05g，高铁氰化钾0.2g，蒸馏水1000ml。以上均为市售分析纯。

1.3.3印度墨汁英国BDH Limited Poole产品。

1.3.4鼠血清血清分离后用生理盐水1∶10稀释，冰箱保存备用。

1.3.5菌株选用鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100和TA102四个实验标准菌株。肝微粒体酶混台物组成如下：8mmol/L MgCl₂，33mmol/L KCl，5mmoI/L 6一磷酸葡萄糖，4mmol/L NADP，10mmol/L磷酸钠，每ml混合液中含0.04ml肝微粒体酶。以上菌株和试剂均由吉首大学天然药物研究中心提供。

2试验方法与结果

2.1溶血素含量测定在无菌条件下，由健康成年绵羊颈静脉取血，置于有玻璃珠的三角烧瓶中，摇动10min以除去纤维蛋白，加入相当于绵羊血体积2倍的Alsever溶液，播匀，置于4℃冰箱备用。取小鼠20只，雌雄各半；随机分成3组，每组10只。给予等量生理盐水作为阴性对照组；第1组给予蛹虫草多糖锗2g/kg，第2组给予蛹虫草多糖锗4g/kg，灌胃给药连续12天。取上述保存的羊RBC，反复洗涤后以3∶5(v/v)的比例用生理盐水稀释，显微镜下计数，使RBC浓度为每毫升约20亿个。于给药后第8天，每小鼠腹腔注射0.2ml稀释过的绵羊RBC进行免疫，免疫后第4天(即给药后第12天)，摘除小鼠眼球取血，分离血清，参照徐学瑛等[4]方法测定各组半数溶血值HC50，将试验组的平均血清半数溶血值(Hc50)与对照组进行组间t检验，判断其差异的显著性，结果见表1。

表1蛹虫草多糖锗对小鼠血清溶血素含量的影响(M±SD，n＝10)，

Table 1 Effect of polysacchoride-germanium from Cordyceps militaris on the content of serumhemolysin in mice

组别Group. 剂量Dose Hc50 增加百分率Percentage increased

对照 0 115.5±32.5 -

Control

第1组 2g/kg 165.8±38.4^*(P＜0.05) 43.55％

Group 1

第2组 4g/kg 191.4±34.5^**(P＜0.01) 65.71％

Group2

表1表明，蛹虫草多糖锗在2g/kg和4g/kg的剂量下可显著提高小鼠血清中溶血素的含量，其Hc50值与对照组相比有显著性差异。

22碳粒廓清试验

动物分组及给药同溶血素含量测定试验于末次给药后2h经小鼠尾静脉注射印度墨汁0.2ml/20g，注射后2min自眼眶静脉丛采血20μl，溶于2ml9.4mmol/L Na₂CO₃中，于721分光光度计650nm波长下比色，测定光密度(OD)，将试验组与对照组进行组t检验，结果见表2。

由表2可见，蛹虫草多糖锗可非常显著地提高小鼠单核巨噬细胞系统的吞噬功能，使外周血中碳粒含量明显减少。

本实验证明蛹虫草多糖锗能明显提高小鼠血清溶血素含量及单核巨噬细胞系统的吞噬功能，具有显著的免疫增强作用。

表2蛹虫草多糖锗对小鼠碳粒廓清的影响(M±SD，n＝10)，

Table 2 Effect of polysacchoride-germanium from Cordyceps militaris on carbon clearance in mice

组别Group 剂量Dose OD 增加百分率Percentage increased

对照 0 0.165±0.03 -

Control

第1组 2g/kg 0.108±0.02^**(P＜0.01) 34.55％

Group 1

第2组 4g/kg 0.099±0.03^***(P＜0.001) 40.00％

Group2

(二)蛹虫草多糖锗的抗衰老功能(蛹虫草多糖锗对大鼠MAO酶活力的影响)

单胺氧化酶是人体肝脏中的一种生物酶，对酪胺、多巴胺等单胺类所含的有毒物质具有解毒作用。因此肝脏MAO活性水平可以表示肝脏功能的强弱。

而在大脑中单胺氧化酶(MAO)是衰老的重要指标.国内外许多研究证明，MAO活性随龄增加。许多研究发现人脑单胺氧化酶的活性，在45岁以后随增龄而急剧增加。本实验旨在探讨长期服用蛹虫草多糖锗对肝脏功能和对衰老的影响。

1实验材料

1.1试剂蛹虫草多糖由湖南天国力生物工程有限公司提供，含锗量为308μg/g，多糖含量为95％。单胺氧化酶(MAO)测试盒和考马斯亮兰蛋白测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。超纯水(无荧光)：由Milli-Q系统纯化(Millipore China Limited)，电导率≥18.2M.cm。分析纯氯仿(无荧光)：由湖南师范大学化工厂提供。

1.2设备LS50-D荧光分光光度计(Perkin-Elmer，Norwalk，US)，配有标配光电倍增管(R-628)。

1.3动物：清洁级SD大鼠160只，90～110g，均由湖南农业大学动物科技学院实验动物养殖场提供；实验动物生产许可证：SCXK(湘)2003-0003号。

1.4饲养管理：每组分笼饲养，每个不锈钢笼五只，用5％苦味酸溶液标记、编号，用自制全价营养颗粒饲料饲养，配方：玉米20％、麦麸20％、面粉15％、大米25％、豆饼5％、鱼粉7％、牛奶粉2％、鸡蛋3％、鱼肝油1％、酵母粉1％、骨粉0.5％、食盐0.5％。自由采食和饮水，室温15-25℃，湿度60％，换气次数12次/小时，照度2000lux，氨气浓度20ppm以下，噪音50分贝以下。

2实验方法

2.1动物及分组：按体重将160只大鼠均分成四组(n＝40，雌雄各半)。第一组为对照组(C)，给予蒸馏水20ml/kg；第二、三、四组为蛹虫草多糖锗高(H)、中(M)、低(L)剂量组。剂量分别为1.5、0.75和0.375g/kg。

2.2蛹虫草多糖锗液的配制与饲喂方法：取虫草多糖锗内容物，用蒸馏水配成1.5、0.75和0.375g/ml的混悬液，均按大鼠体重10ml/kg灌胃给药，每天一次，连续给药(周日停药)，每一周称体重一次并调整给药量，同时计算摄食量，共给药26周。

2.3单胺氧化酶(MAO)活性测定：给药至第8周、第17周和第26周，于末次给药后24小时，每组活杀10只动物(先隔食16小时，雌雄各半)。第26周即第三次活杀动物后，每组剩余的10只动物停止给药，继续观察2周后再同法处理。

2.4样品制备动物杀死后，称取出肝脏和大脑，加9倍生理盐水，低温匀浆。2500转/分离心10分钟，取上清液待测。

2.5检测按试剂盒说明书进行，将制备好的脑组织匀浆液悬浮于3ml氯仿中，充分振荡几分钟后，于离心管中6000×g离心10min，吸取下层进行常规荧光分光光度方法检测(最高峰位置：Ex360/Em433nm)。

同时用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测定蛋白质含量。

3结果与分析

3.1蛹虫草多糖锗对大鼠肝脏MAO活性的影响

表1 蛹虫草多糖锗对雄鼠肝脏MAO活性的影响

时间三批检测均值饲喂6个月

剂量 C L M H C L M H

MAO活性 19 20 21.4 36.3 18.1 20.3 26.1 46.2

单位为U，即每mg组织蛋白在37℃，1小时内产生0.01个吸光度为1个酶活力单位.C：对照；L：低剂量组；M：中剂量组；H：高剂量组

从上表可以看出，雄鼠肝MAO活性随着摄入剂量的增加而增加，呈现正相关关系；在高摄入量情况下，雄鼠肝MAO活性平均提高到了对照组的两倍，而连续高剂量饲喂6个月，雄鼠肝MAO活性则提高到了对照组的2.5倍。这种活性的提高，有利于肝脏的解毒功能的发挥。

表2蛹虫草多糖锗对雌鼠肝脏MAO活性的影响

时间 2个月 4个月 6个月

剂量 C L H C L H C L M H

MAO活性 21.6 12.1 10.6 23.0 14.0 12.1 19.2 27.7 20.9 15.7

单位为U，即每mg组织蛋白在37℃，1小时内产生0.01个吸光度为1个酶活力单位.C：对照；L：低剂量组；M：中剂量组；H：高剂量组。

表2显示对雌鼠而言，肝MAO活性与摄入蛹虫草多糖锗剂量的关系非常复杂。除6个月的长期实验结果外，都是处理组的雌鼠肝MAO活性明显低于对照组的雌鼠肝MAO活性。

总的来看，在大多数情况下，雌鼠肝MAO活性因摄入蛹虫草多糖锗的而降低，呈现负相关关系。在两个月和四个月的实验中，高剂量组雌鼠肝MAO活性比对照组雌鼠肝MAO活性将近降低了50％。

同时可以看出，随着实验的延长，在各剂量组中都表现出一个趋势，雌鼠肝MAO活性在缓慢提高。

6个月的长期实验结果提示，对于雌鼠，以低剂量长期服用可以提高肝MAO活性。因此，妇女在服用蛹虫草多糖锗时，建议低剂量长期服用。

另一方面，MAO和HA、IN的检测可作早期诊断肝纤维化的血清学指标(郭会，2005)。条件是当MAO＞67.11±23.44u/I时，对肝纤维有诊断价值。本实验的数据表明蛹虫草多糖锗只在正常范围内提高MAO活性，提高肝脏的解毒功能。

以上结果提示，不同性别的大鼠肝MAO活性对蛹虫草多糖锗的反应不同，这可能与雌雄的生理功能不同有关，这有待进一步深入研究。

在具体服用蛹虫草多糖锗时，我们建议妇女以低剂量长期服用为宜。

3.2蛹虫草多糖锗对大鼠脑MAO活性的影响

在研究衰老指标中单胺氧化酶(MAO)是重要指标之一.国内外许多研究证明，MAO活性随龄增加。近年来，许多研究者发现人脑中单胺氧化酶的活性，在45岁以后随增龄而急剧增加。根据Finch和Samorajski学说，脑内儿茶酚胺的变化是下丘脑的中央寿命钟，而使用单胺氧化酶抑制剂能影响脑内儿茶酚胺的水平，从而调节衰老过程，因而认为MAO也是衰老的重要指标之一(郭朝阳郭忠兴，1997)。

本实验6个月的饲喂实验表明蛹虫草多糖锗能显著影响大鼠脑MAO活性(表2)。

表2蛹虫草多糖锗对脑MAO活性的影响

时间 2个月 6个月

剂量 C L M H C L M H

♂ 59.9 56.2 71.6 63.7 63.5 59.0 64.4 -

♀ 57.3 54.9 43.9 43.0 65.0 39.4 49.0 42.7

单位为U，每mg组织蛋白在37℃，1小时内产生0.01个吸光度为1个酶活力单位.

C：对照；L：低剂量组；M：中剂量组；H：高剂量组。

表2结果显示，蛹虫草多糖锗对雄鼠脑MAO活性的影响不大。但对雌鼠脑MAO活性有较大影响，饲喂两个月，高剂量组雌鼠脑MAO活性降低25％；饲喂6个月，高剂量组雌鼠脑MAO活性降低34.3％，低剂量组雌鼠脑MAO活性降低39.4％。据此我们可以推定，蛹虫草多糖锗可以显著缓解雌性大鼠的衰老，延长其寿命。

长期服用蛹虫草多糖锗，有利于提高雄性肝功能，有利于延缓雌性的衰老。

参考文献

郭会 2005 乙肝患者血清HA、LN及MAO水平变化的临床价值国医论坛 20卷(6)

郭朝阳郭忠兴 1997 当归注射液对老年小鼠脑、肝脏MAO·B活性的影响佳木斯医学院学报20(4)

胡梅等 2005 还少丹对大、小白鼠B型单胺氧化酶活性的影响湖南中医学院学报 25(5)

(三)蛹虫草多糖锗的对果蝇寿命的影响

考虑到我国60岁及以上老年人口每年以5％左右的速度增长.因此，延长老年人的寿命并且使之保持良好的健康状况就显得非常重要。蛹虫草多糖锗能够提高肝、脑等主要器官中超氧歧化酶的活性，该酶具有抗氧剂的能力，能防止脂质过氧化作用，有助于保护机体不受自由基反应的损伤，延缓机体衰老。本实验选取模式动物果蝇作为实验动物，进行其寿命延长实验，观察不同浓度蛹虫草多糖锗浓度的培养基对果蝇的寿命延长效果。

1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1果蝇品种及其来源

实验果蝇为野生型黑腹果蝇(Dr.melanogaster)，由湖南师范大学生命科学学院提供

1.1.2蛹虫草多糖锗

由湖南天国力生物工程有限公司提供，含锗量为308μg/g，多糖含量为95％。

1.1.3主要仪器及设备

恒温箱、培养指管(平底)3x10cm、纱布、一次性注射器、麻醉瓶。

1.2实验方法

1.2.1果蝇培养基配方

玉米10％、红塘13.5％、琼脂1.5％、苯甲酸0.15％、干酵母粉1％、水，自然pH。

1.2.2受试物的处理

用乳钵将受试物研磨成粉末，越细越好，然后加水在室温条件下浸泡4h，再在100℃水浴锅中处理1h，用定量滤纸抽滤，抽滤到一定程度后，称重按需要分别加入基础饲料当中。受试物加入前后，必须注意饲料pH值的变化，一般情况下应使各组的pH值保持一致。

1.2.3果蝇的收集及培养

取成熟野生型黑腹果蝇于装有普通培养基的50ml三角锥瓶内饲养，在其交配产卵形成蛹时去掉亲本蝇，收集10h内羽化未交配且个体大小差异不大的的雌雄果蝇各400只，用蘸有乙醚的脱脂棉球放入带有内径1mm针头的10mL注射器内，来回抽动，利用打入盛有果蝇的试管中的乙醚蒸汽将果蝇麻醉，然后将果蝇雌雄分装在培养指管中，饲以普通培养基。

1.2.4果蝇寿命试验及统计方法

1.2.4.1寿命实验方法

在第12天，对雌雄果蝇分别进行随机分组，共8组，每组100只果蝇，每只培养试管中25只果蝇，对照组各予普通培养基，实验组分别给予含有0.2％、1％、5％蛹虫草多糖锗的培养基。培养条件：温度(25+1)℃，相对湿度50％～70％，每天定时(7:00am、3:00pm、11:00pm)3次观察记录果蝇死亡数目，培养基粘住等人为因素造成的死亡不计算在内，每4天更新一次培养基，一直观察到果蝇全部死亡为止。

1.2.5.2统计方法

平均寿命：每组果蝇全部寿命的算术平均数；最高寿命：每组最后死亡的25只果蝇寿命的算术平均数；半数死亡天数：前半数果蝇寿命的算术平均数。所得数据采用SPSS10.0软件进行分析，采用方差分析进行统计学显著性检验，以P＜0.05为差异有显著性。

2结果与分析

2.1蛹虫草多糖锗对雄性果蝇的平均寿命、最高寿命、半数死亡天数的影响

实验结果见下表1.

表1蛹虫草多糖锗对雄性果蝇寿命的影响

平均寿命/d 最高寿

组别果蝇数半数死亡时间/d

Mean Maximum

(n) Half death time/d

life-span/d life-span/d

对照组

96 50.52±12.74 35.26±12.56 71.95±1.66

Control

0.2％ 91 59.46±11.59 39.10±9.22 78.18±4.10

1.0％ 97 63.29±11.30^a 43.06±10.15^a 79.63±4.61^a

5.0％ 89 52.09±11.38 36.87±6.77 72.03±4.97

注：果蝇数为果蝇自然死亡数，人为或因培养基沾连引起的果蝇非正常死亡不在计算之列；a为与对照组、0.2％组和5.0％组比较，P＜0.01。

研究结果表明(表1)，在温度(25+1)℃，相对湿度50％～70％，蛹虫草多糖锗含量1.0％组雄性果蝇的的平均寿命和最高寿命均明显高于其它组(P＜0.01)。5.0％组和对照组间平均寿命、半数死亡时间、最高寿命均无统计学意义差异。与对照组比较，实验组的平均寿命、半数死亡时间以及最高寿命都有所提高。其中1％实验组，平均寿命比对照组延长25.28％，最高寿命延长10.672％，半数死亡时间延长22.12％。因此蛹虫草多糖锗对雄性果蝇寿命的影响与浓度有关，但不是呈线性相关，而是有一最适浓度。

2.2蛹虫草多糖锗对雌性果蝇的平均寿命、最高寿命、半数死亡天数的影响

由表2可以看出，在温度(25+1)℃，相对湿度50％～70％条件下，0.2％组和1.0％组明显雌性果蝇的的平均寿命、半数死亡时间和最高寿命均显著高于对照组，统计学意义的差异显著；5％组平均寿命、半数死亡时间和最高寿命也略高于对照组，但无统计学意义的差异存在。5.0％组果蝇平均寿命、半数死亡时间、最高寿命等参数都明显低于0.2％组和1.0％组。

1.0％组雌性果蝇的的平均寿命比对照组延长42.93％，最高寿命高于对照组28.33％，半数死亡时间比对照组延长41.63％。

表2蛹虫草多糖锗对雌性果蝇寿命的影响

平均寿命/d 最高寿命

组别(％) 果蝇数半数死亡时间/d

Mean Maximum

Group(％) (n) Half death time/d

life-span/d life-span/d

对照组

46.19±13.03 35.98±7.34 65.39±3.74

Control 99

0.2％ 10055.45±18.14^a， 45.70±15.55^a 84.99±2.38^a

1.0％ 96 66.02±16.42^a 50.86±14.54^a 91.26±2.95^a

5.0％ 94 48.93±14.47 37.26±5.62 68.14±4.18

注：果蝇数为果蝇自然死亡数，人为或因培养基沾连引起的果蝇非正常死亡不在计算之列；a为与对照组或与5.0％组比较，P＜0.01。

3.讨论

衰老通常是指随着年龄的增长而伴随生殖力的减弱和死亡率增加的渐进性功能丧失[39]，是生命过程中的正常生理现象，延缓衰老主要是提高生命率，改善机体体质并能在遗传性所决定的限度内有效延长机体寿命。而衡量延缓衰老效果最为准确的方法就是进行动物生存实验。

果蝇虽属昆虫类，但其许多代谢途径、生理学功能和发育阶段同哺乳动物基本相同，所以经常被用于衰老或寿命等方面的研究[36]。果蝇寿命实验中，有几个指标十分重要，即平均寿命、半数死亡时间和最高寿命。其中平均寿命指标最为重要，是药物对果蝇影响的综合反映；而半数死亡时间则更偏重于反映药物对体弱果蝇的寿命延长效果；最高寿命则偏重于反映药物对强壮果蝇的寿命延长效果以及果蝇对药物过多摄取条件下的耐受力。

在本实验中，采用蛹虫草多糖锗作为实验药物，通过实验所测数据显示，在低剂量条件下，蛹虫草多糖锗可以有效的提高雌雄果蝇的平均寿命、半数死亡时间和最高寿命，而在高剂量的蛹虫草多糖锗对果蝇平均寿命、半数死亡时间和最高寿命的影响不明显。这表明蛹虫草多糖锗能够很好的提高果蝇整体的寿命水平，并可以在一定程度上延长体弱个体寿命。但长期过量摄取会减弱蛹虫草多糖锗延长寿命的效果。

此外，通过表1与表2的比较，还能发现，同等条件下，培养基中蛹虫草多糖锗的浓度对雌性果蝇的平均寿命、最高寿命及半数死亡时间影响的程度都明显高于对雄性果蝇的影响。

四、结论

急性毒性实验、长期毒性实验显示蛹虫草多糖锗完全无毒、安全；Ames实验、骨髓细胞微核试验和精子畸变实验显示蛹虫草多糖锗无致突变作用；溶血素实验和碳粒廓清试验证明蛹虫草多糖锗具有显著的免疫增强作用；大鼠MAO酶活性测定和果蝇寿命实验表明蛹虫草多糖锗具有显著的抗衰老功能。因此蛹虫草多糖锗是一种安全的抗衰老原料。

Claims

1.一种虫草多糖锗的生产制备方法，其特征在于：在虫草及各种虫草菌株的菌丝体发酵液中，或在虫草的固体培养基中，加入适量无机锗GeO₂或有机锗Ge132，使虫草吸收，并合成富锗的虫草多糖，即虫草多糖锗，然后用提取纯化多糖的方法将虫草多糖锗提取纯化，得到含多糖和含锗的虫草多糖锗。

2.根据权利要求1所述的虫草多糖锗的生产制备方法，其特征在于：所使用的虫草包括蛹虫草(Cordycepus militaris)的各种菌株、古尼虫草(Cordycepus guni)及其各种菌株、冬虫夏草(Cordycepus sinensis)。

3.根据权利要求1所述的虫草多糖锗的生产制备方法，其特征在于：锗的化合物可以加入虫草菌丝体发酵液中，或者加入虫草的固体培养基中。

4.根据权利要求1所述的虫草多糖锗的生产制备方法，其特征在于其工艺流程是：锗加入液体培养基或固体培养基，培养成菌丝体或子实体，然后均浆，过滤，醇沉，溶解，再除蛋白，醇沉，然后离心、干燥，制得虫草多糖锗；上述溶解、醇沉的重复次数可根据需要和微量元素的结合度确定。