CN101912377A - 紫檀芪在制备抗宫颈癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种治疗宫颈癌的药物，这种治疗宫颈癌的药物是紫檀芪(Pterostilbene，Pte)。该药可以制成粉剂、颗粒剂、胶囊、片剂、纳米乳、脂质体、栓剂、软膏等剂型。经过体内、体外实验表明将紫檀芪用于宫颈癌的治疗能有效地抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡。经过动物急性毒性实验，表明紫檀芪急性毒性较低，因此可以用于制备抗宫颈癌药物。

Description

紫檀芪在制备抗宫颈癌药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种紫檀芪的药物应用，具体为紫檀芪在制备抗宫颈癌药物中的应用。

背景技术

在全球范围内，每年约有50多万女性被检出患有宫颈癌，27万女性死于宫颈癌，在某些国家和地区，每两分钟就有一位女性死于宫颈癌。在发展中国家，宫颈癌则属于常见多发的妇科肿瘤，死亡率排行榜首。我国每年新发现的病例为13.15万，数目庞大。由于其发病原因复杂，不能有效预防。宫颈癌早期常用的治疗方法多为广泛性全子宫切除，对患者及家庭都会带来不良影响。随着近年来抗癌化学药物的迅猛发展，过去认为对宫颈癌无效的化疗，现已成为辅助治疗的常用方法，尤其在晚期或复发者。但是随着化疗时间的延长，药物所带来的副作用会越来越大。因此研发新的、低毒性、高选择性治疗宫颈癌的药物有着重要意义。

在寻找抗癌药物过程中，膳食源性多酚类物质因容易获取且不良反应较低而成为人们关注的目标。这使得来源于葡萄等植物的芪类物质(stilbenes)成为抗肿瘤药物研究的一个热点。近年来，白藜芦醇(芪三酚)作为芪类物质的代表被证明具有很好的抗氧化及抗肿瘤活性。白藜芦醇甲基化后的产物紫檀芪(Pterostilbene，Pte)是一种多羟基二苯乙烯类化合物，人们发现紫檀芪具有很强的抗氧化(Renata Mikstacka，et al.Antioxidant Effect of trans-Resveratrol，Pterostilbene，Quercetin and Their Combinations in Human Erythrocytes In Vitro.Plant Foods for Human Nutrition，2010，65(1)：57-63)、降血糖(Marudamuthu Amarnath Satheesh，et al.Effect of pterostilbene on lipids and lipid profiles in streptozotocin-nicotinamide induced type 2 diabetes mellitus，J Appl Biomed，6：31-37，2008)和降低胆固醇(Rimando A.et al.Pterostilbene，a New Agonist for the Peroxisome Proliferator-Activated Receptor α-Isoform，Lowers Plasma Lipoproteins and Cholesterol in Hypercholesterolemic Hamsters.J Agric Food Chem，2005，53(9)：3403-7)的作用。紫檀芪的化学结构式如下：

近些年来人们也对紫檀芪的抗肿瘤活性做了初步研究，比如紫檀芪对黑色素瘤(J G Schneider，et al.Effects of pterostilbene on melanoma alone and in synergy with inositol hexaphosphate.Am J Surg，2009，198(5)：679-84)、肝癌细胞(Min-Hsiung Pan，et al.Pterostilbene inhibited tumor invasion via suppressing multiple signal transduction pathways in human hepatocellular carcinoma cells，Carcinogenesis，2009，30(7)：1234-42)、结肠癌细胞(Nanjoo Suh，et al.Pterostilbene，an Active Constituent of Blueberries，Suppresses Aberrant Crypt Foci Formation in the Azoxymethane-Induced Colon Carcinogenesis Model in Rats，Clin Cancer Res，2007，13(1)：350-55)、胃癌细胞(Min-Hsiung Pan，et al.Pterostilbene Induces Apoptosis and Cell Cycle Arrest in Human Gastric Carcinoma Cells，J Agric Food Chem，2007，55(19)：7777-85)均有抑制增殖和诱导凋亡的作用。然而因各类肿瘤性质及发病机理各不相同，紫檀芪对各种肿瘤作用的药理效果也不尽相同，经文献和专利检索，利用紫檀芪在制备抗宫颈癌药物的研究方面还未见报道。

发明内容

针对现有技术中所述的不足，本发明要解决的问题是提供一种紫檀芪在制备抗宫颈癌药物中的应用。

本发明所述紫檀芪在制备抗宫颈癌药物中的应用，同时还包括以紫檀芪为有效成分的组合物在制备抗宫颈癌药物中的应用。

以本发明所述紫檀芪再添加药学上可接受的辅料或赋形剂可以制成任何一种抗宫颈癌的药剂学上所说的剂型。

所说的药学中可以接受的辅助性成分，可包括例如在片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂或适当形式的缓释剂型等固体制剂形式口服药物制剂中可以接受和使用的填充剂：如淀粉、糊精、糖粉、预胶化淀粉、乳糖、葡萄糖、碳酸钙等；黏合剂：如羟丙甲纤维素、聚维酮、淀粉浆、糊精浆、糖浆、胶浆、阿拉伯胶等；赋形剂、润滑剂：如硬脂酸镁、硬脂酸钠、滑石粉、微粉硅胶、液体石蜡、聚乙二醇等；软胶囊剂中的基质：如植物油、聚乙二醇等；抗氧化剂：如亚硫酸钠、抗坏血酸、半胱氨酸、维生素E等；在口服缓控释制剂中的阻滞剂：如蜂蜡、巴西棕榈蜡、氢化植物油、硬脂酸、聚维酮、乙基纤维素等；在注射制剂中允许使用的溶剂、助溶剂、稳定剂和附加剂等。经相应的制剂方法和过程，即可制备得到相应的口服或注射制剂形式的药物。在栓剂中使用的基质：如可可豆脂、半合成甘油脂肪酸酯类、香果脂、氢化油等；水溶性及亲水性基质：如甘油明胶、聚乙二醇、吐温-61、硬脂酸聚烃氧(40)酯、水溶性壳聚糖、泊洛沙姆等；吸收阻滞剂：如大豆卵磷脂、海藻酸、羟丙基甲级纤维素、硬脂酸、蜂蜡等；在软膏中使用可药用辅料或赋形剂，如黏合剂：如预胶化淀粉、羟丙基纤维素等、填料：如乳糖、蔗糖、甘露醇等；润滑剂：如硬脂酸、聚乙二醇、硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅等、崩解剂：如淀粉、羧甲基纤维素钠；润滑剂：如十二烷基硫酸钠等。

其中口服制剂优选为片剂、胶囊、颗粒剂、纳米乳、脂质体；注射制剂优选冻干粉针、静脉乳剂、脂质体、纳米乳；外用制剂优选栓剂。

本发明所述的紫檀芪用于临床时，人用剂量为1mg·人^-1·天^-1至500mg·人^-1·天^-1，优选5mg·人^-1·天^-1至200mg·人^-1·天^-1，最优选10·人^-1·天^-1至100mg·人^-1·天^-1。

附图说明

图1为不同浓度紫檀芪对HeLa细胞处理24、48、72小时后的抑制率

图2为80μmol·L^-1紫檀芪处理48小时后HeLa细胞的形态学观察及DNA断裂片段化分析

图3为紫檀芪对HeLa细胞ROS和GSH变化的影响

图4为ROS清除剂和GSH调节剂对紫檀芪诱导的HeLa细胞凋亡的影响，其中*表示与对照组相比P＜0.01，#表示与紫檀芪组相比P＜0.01

图5为半定量RT-PCR检测不同处理下grp78和CHOP的表达

具体实施方式

为了更好地理解本发明的实质，下面结合实施例和实验例对本发明进行说明，但本发明并不限于该实施例。

实施例一

SRB法检测紫檀芪对HeLa细胞增殖的影响细胞用0、20、40、60、80、100、120、140、160、180μmol·L^-1紫檀芪处理24、48、72小时后，以SRB方法在酶标仪上测定细胞反应液的OD值(490nm)并计算细胞生长抑制率。结果表明不同浓度紫檀芪对HeLa细胞均有一定的增殖抑制作用，这与处理时间和剂量成正相关，结果见图1。紫檀芪浓度小于20μmol·L^-1时对HeLa细胞抑制率较低，当浓度增加至40-80μmol·L^-1时细胞抑制率呈快速上升趋势。紫檀芪作用48h的半数抑制浓度(IC₅₀)为80μmol·L^-1。经过长时间(72h)高浓度紫檀芪(120μmol·L^-1)处理，HeLa细胞近乎全部死亡。

实施例二

细胞凋亡检测通过DNA特异荧光染料染色观察核凋亡小体形态(Hoechst-33258)。通过照片观察出现核凋亡细胞数来进行细胞凋亡率统计，每份数据至少统计400个细胞。DNA ladder通过琼脂糖凝胶电泳(1.2％)并使用SDNAClear核酸染料染色，凝胶成像系统拍照分析。细胞计数通过Hoechst/PI双染荧光法来进行测算。细胞数标准曲线制作如下：根据测定5×10⁶到5×10³细胞的Hoechst(1.15mg·L^-1)荧光值变化绘制总细胞数标准曲线；根据对同样数目细胞的温和裂解后PI(20mg·L^-1)的荧光值变化绘制死亡细胞标准曲线；通过对处理样品的Hoechst/PI联合染色的双荧光吸收标准曲线计算非坏死细胞数。所有计数均在96孔板上(NUNC)完成，37℃恒温反应30分钟后测定。结果见图2：普通光镜下正常对照组的HeLa细胞成簇平铺分布，呈不规则菱形，细胞界限清晰，结果见图2A。紫檀芪处理48h后，HeLa细胞出现明显凋亡形态。细胞膜呈现囊泡化特殊结构，结果见图2B，2F。细胞核DNA经Hochest荧光试剂染色后，空白对照组细胞核呈圆形，结果见图2C，药物处理组则表现出核凋亡所特有的不均一化形态，结果见图2D。通过AO/EB双染可以看出凋亡是紫檀芪引起HeLa细胞死亡的主要因素，结果见图2E，2F。经凝胶电泳分析，对照组HeLa细胞DNA没有片段化，而80μmol·L^-1紫檀芪处理HeLa细胞48h后DNA呈现梯状片段化，120μmol·L^-1则更加明显，结果见图2G。

实施例三

紫檀芪对HeLa细胞氧化还原状态的改变及在凋亡中的作用细胞内氧化还原水平的变化以细胞总活性氧及还原型谷胱甘肽的变化来表示。使用荧光探针(H₂DCFDA)(Ex/Em＝488nm/525nm)来检测细胞内总活性氧，CMFDA探针检测还原型谷胱甘肽(Ex/Em＝492nm/517nm)。收集经不同浓度紫檀芪处理的HeLa细胞，使用终浓度20μmol·L^-1 H₂DCFDA或5μmol·L^-1 CMFDA于37℃孵育30分钟，2000rpm离心收集细胞并用PBS洗掉未进入细胞内的荧光探针。无酚红培养基重悬HeLa细胞，酶标仪检测荧光光度。MFI表示为每10000个非坏死细胞对应的荧光吸收。选择活性氧及GSH的相应抑制剂与调节剂按照CAT(2×10⁵Units·L^-1)、BSO(200μmol·L^-1)、NAC(200μmol·L^-1)、Temp(200μmol·L^-1)所标示浓度加入HeLa细胞培养基中，预处理2小时后加入紫檀芪80μmol·L^-1处理48小时后测定凋亡率，空白对照为培养2小时后更换培养基继续培养48小时的HeLa细胞。为了研究紫檀芪引起HeLa细胞凋亡的原因，本实验测定了紫檀芪引起HeLa细胞活性氧与还原力(GSH)随药物浓度改变而变化的动态关系，结果见图3。在紫檀芪浓度由5μmol·L^-1至160μmol·L^-1增加过程中，HeLa细胞内活性氧含量也在增加，且当紫檀芪浓度超过80μmol·L^-1后迅速升高。但细胞内GSH含量在紫檀芪浓度低于80μmol·L^-1时，随着ROS的升高而升高；而当紫檀芪浓度超过80μmol·L^-1后，细胞内GSH含量又迅速下降。为了研究这一GSH水平的剧烈变化是否影响到细胞的凋亡，我们使用了氧化还原反应抑制剂来分析紫檀芪诱导HeLa细胞凋亡过程中对氧化还原态变化的影响。在氧化还原反应抑制剂中，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)特异性抑制剂BSO能够引起细胞凋亡。抗氧化酶及底物过氧化氢酶CAT、GSH合成前体物NAC以及超氧阴离子淬灭剂Tempol均不引起HeLa细胞凋亡。在紫檀芪处理HeLa细胞前通过这些氧化还原抑制剂预处理，我们发现BSO预处理明显升高了紫檀芪引起HeLa细胞的凋亡率，而CAT和NAC可以显著抑制紫檀芪所引起的HeLa细胞凋亡。但Tempol预处理对紫檀芪引起HeLa细胞凋亡影响并不显著，结果见图4。

实施例四

紫檀芪对内质网胁迫标志分子的转录水平的影响分别使用CAT(2×10⁵Units·L^-1)或NAC(200μmol·L^-1)预处理HeLa细胞2小时后，加入紫檀芪80μmol·L^-1处理48小时。阳性对照培养2小时后加入DTTox(20μmol·L^-1)处理48小时。空白对照为培养2小时后更换培养基继续培养48小时的HeLa细胞。处理完毕后，所有处理同时测定内质网胁迫相关分子表达情况。本实验使用相对半定量RT-PCR方法来检测内质网胁迫标志分子grp78、CHOP的表达变化。使用Trizol试剂盒提取总RNA。不同处理的细胞样品RNA通过RevertAid H Minus反转录试剂盒并使用Oligo(dT)18进行cDNA第一链合成，42℃延伸60分钟。PCR扩增条件为：热启动，起始温度94℃，3分钟；变性94℃，30秒；复性58℃，30秒；延伸72℃，45秒；为了使扩增产物量与循环数保持在线性范围内，我们根据文献设定了以下引物及对应反应循环数(16-35)。grp78，上游引物：5′-TAG CGT ATG GTG CTG CTG TC-3′，下游引物：5′-TTT GTC AGG GGT CTT TCA CC-3′，扩增循环数19；CHOP，上游引物：5′-AGC TGA GTC ATT GCC TTT CT-3′，下游引物：5′-CTG GTT CTC CCT TGG TCT TC-3′，扩增循环数32；内标β-actin，上游引物：5′-ATG ATA TCG CCG CGC TCG-3′，下游引物：5′-CGC TCG GTG AGG ATC TTC A-3′，扩增循环数35。PCR产物经琼脂糖凝胶(1.2％)电泳后，使用SDNAClear核酸染料染色，凝胶成像系统拍照分析。结果表明紫檀芪诱导HeLa细胞凋亡过程中，内质网胁迫是其凋亡的主要原因之一，结果见图5。随着紫檀芪浓度增大，grp78及CHOP的表达量均相对于对照明显增加，甚至超过阳性对照(DTTox)所引起的程度。通过CAT及NAC共处理HeLa细胞，我们发现内质网胁迫分子grp78与CHOP表达量均明显降低，这与图4中二者能够抑制紫檀芪引起的HeLa细胞凋亡现象一致。

实施例五

紫檀芪的急性毒性实验将昆明种小鼠以灌胃注射分别给予0、30、300、3000mg·kg^-1·天^-1紫檀芪，观察给药后动物28天内的毒性反应及死亡情况。小鼠单次灌胃给药后4小时内未见异常，给药后28天内小鼠未出现死亡，第29天处死全部小鼠，解剖，肉眼观察各脏器，均为见明显病变。

实施例六

紫檀芪对小鼠实体瘤的抑制作用将昆明种小鼠称重，随机分为4组，每组10只。紫檀芪分为高、中、低三个剂量组。在无菌条件下取预先在小鼠体内传代第7天的U14肿瘤细胞，以无菌生理盐水按1∶3稀释，调整细胞数约2×10⁹个·L^-1，于每只小鼠右前肢腋下注射0.2ml。从接种第二天起，将三个剂量组的紫檀芪按20、40、80mg·kg^-1·天^-1定时给小鼠灌胃给药，模型组每只给予生理盐水0.5ml灌胃。以上连续给药10天。第11天颈椎脱臼处死小鼠，剖取瘤块进行称重，记录瘤重以及抑瘤率。肿瘤抑制率＝(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)÷模型组平均瘤重×100％。结果见表1。

表1紫檀芪对实体瘤U14小鼠肿瘤抑制率的影响

注：与模型组相比，**P＜0.01，*P＜0.05

实施例七

紫檀芪对腹水瘤宫颈癌U14小鼠生命延长时间的影响将昆明种小鼠称重，随机分为4组，每组10只。紫檀芪分为高、中、低三个剂量组。在无菌条件下取预先在小鼠体内传代第7天的U14肿瘤细胞，以无菌生理盐水按1∶3稀释，调整细胞数约2×10⁹个·L^-1，于每只小鼠腹腔注射0.2ml。从接种第二天起，将三个剂量组的紫檀芪按20、40、80mg·kg^-1·天^-1定时给小鼠灌胃给药，模型组每只给予生理盐水0.5ml灌胃。以上连续给药10天。停药后观察小鼠存活天数，计算小鼠生命延长率。生命延长率＝(给药组平均存活天数-模型组平均存活天数)÷模型组平均存活天数×100％。结果见表2。

表2紫檀芪对腹水瘤U14小鼠生命延长率的影响

注：与模型组相比，**P＜0.01，*P＜0.05

以上结果表明紫檀芪具有良好的抑制人宫颈癌细胞生长和诱导凋亡的作用，能明显抑制体内肿瘤生长、延长腹水瘤小鼠存活时间，且因为毒副作用极低，不仅为恶性肿瘤的治疗增加了一种疗效高、毒性反应低的新药物，也为长期静脉输注细胞毒药物后继发血管炎患者改用其他途径继续治疗提供了可能。

Claims (5)

1.一种以紫檀芪为有效成分，在制备抗宫颈癌药物中的应用。

2.如权利要求1所述的药物，其特征在于和药学上可接受的载体组成。

3.如权利要求1或2所述的药物，其特征在于用于临床，人用剂量为1-500mg/天，优选5-200mg/天，最优选10-100mg/天。

4.如权利要求2所述的药物，其特征在于口服制剂可以为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、滴丸、软胶囊、悬浮液、溶液、糖浆、纳米乳、脂质体；注射用制剂可以为冻干粉针、注射用静脉乳剂、注射剂、脂质体、纳米乳、输液；外用制剂可以为栓剂、软膏。

5.如权利要求4所述的药物，口服制剂优选为片剂、胶囊、颗粒剂、纳米乳、脂质体；注射制剂优选冻干粉针、静脉乳剂、脂质体、纳米乳；外用制剂优选栓剂。

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