CN110075094A - 紫檀芪在制备药物或保健品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种紫檀芪在制备肝损伤保护和肝纤维化防治药物或保健品中的应用，涉及医药技术领域。本发明所述应用包括紫檀芪在制备预防和/或治疗肝损伤的药物或保健品中的应用。本发明所述紫檀芪分别针对CCl4或TAA诱导小鼠肝纤维化小鼠模型、急慢性酒精脂肪肝模型时，体现出肝保护作用、抗肝纤维化以及调控脂肪肝作用，因此可用于制备预防和/或治疗肝损伤、肝纤维化以及脂肪肝的药物或具有相应功效的保健品。

Description

紫檀芪在制备药物或保健品中的应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及紫檀芪在制备药物或保健品中的应用。
背景技术
各种外界刺激因素，包括酒精、药物以及化学物质刺激，均可造成肝脏急性或慢性损伤，威胁人类健康。常见肝脏疾病如脂肪肝(酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝)、肝脏炎症以及肝硬化等。肝纤维化是机体对肝损伤的一种修复反应，主要表征为肝脏细胞外基质过度沉积，研究表明是一个可逆过程。控制肝纤维化进程对于各类慢性肝病、肝硬化的治疗和预防具有较为重要的意义。临床上肝病治疗，除了去除病因治疗外，中国仅有2例中药复方用于临床，复方鳖甲软肝片和扶正化瘀胶囊；国际上有富马酸替诺福韦酯用于肝硬化治疗。除此之外，尚无其他药物被批准为治疗肝纤维化的药物。
我国是肝病高发国家之一，主要为肝炎患者，近年脂肪肝、酒精肝以及药物性肝炎也呈现逐年递增趋势。因此研发肝损伤保护和肝纤维化新药迫在眉睫。
紫檀芪(3,5-二甲氧基-4’-羟基反式二苯乙烯,pterostilbene)是一类来源于蓝莓葡萄等浆果的非黄酮类多酚化合物，是白藜芦醇的甲基化衍生物，具有抗氧化、延缓衰老、抑制细胞增殖、抗白血病、抗癌及降血脂、降血糖和抗真菌等活性的植物多酚。目前并没有紫檀芪在酒精性和非酒精性肝损伤保护作用和抗肝纤维化活性方面的相关研究报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种紫檀芪在制备治药物或保健品中的应用，在酒精性和非酒精性脂肪肝保护作用、抗肝纤维化以及抗炎方面具有显著的活性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了紫檀芪在制备预防和/或治疗肝损伤、肝纤维化和脂肪肝药物中的应用。
优选的，所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
优选的，所述药物的剂型包括：片剂、胶囊、散剂、颗粒和针剂。
本发明还提供了紫檀芪在制备对肝损伤、肝纤维化和脂肪肝有预防作用的保健品中的应用。
优选的，所述保健品的剂型包括：片剂、胶囊、散剂、颗粒和针剂。
本发明提供了一种紫檀芪在制备预防和/或治疗肝损伤、肝纤维化和脂肪肝的药物或保健品中的应用，在本发明实施例中，所述紫檀芪在急性或慢性酒精性脂肪肝模型、CCl4或TAA诱导肝纤维化模型中都表现出良好的改善作用，可用于制备预防和/或治疗肝损伤、肝纤维化以及脂肪肝药物，以及对肝损伤和肝纤维化、脂肪肝有预防作用的保健品。
附图说明
图1为不同处理对CCl4诱导的肝损伤小鼠模型的血清中ALT、AST和LDH的影响；
图2为不同处理对CCl4诱导的肝损伤小鼠模型的肝脏组织中GSH和CAT的影响；
图3为不同处理对CCl4诱导的肝损伤小鼠模型的肝脏病理结构改变；
图4为不同处理对CCl4诱导的肝损伤小鼠模型中的小鼠肝纤维化相关标志物的测定影响；
图5为不同处理对TAA诱导的肝损伤小鼠模型的血清中ALT和AST的影响；
图6为不同处理对TAA诱导的肝损伤小鼠模型的肝脏病理结构改变；
图7为不同处理对TAA诱导的肝损伤小鼠模型中的小鼠肝纤维化相关标志物的测定影响；
图8为不同处理对TAA诱导的肝损伤小鼠模型中肝纤维化相关蛋白的表达影响；
图9为不同处理对慢性酒精诱导的肝损伤小鼠模型的血清中ALT、AST和TG的影响；
图10为不同处理对慢性酒精诱导的小鼠肝脏病理结构改变的影响；
图11为不同处理对慢性酒精诱导的小鼠肝脏脂质沉积抑制影响；
图12为不同处理对慢性酒精诱导的小鼠肝脏组织中脂质沉积相关蛋白表达的影响；
图13为不同处理对慢性酒精诱导的小鼠肝脏切片SREBP-1阳性表达影响；
图14为不同处理对急性酒精诱导的肝损伤小鼠模型的血清中ALT、AST和TG的影响；
图15为不同处理对急性酒精诱导的肝损伤小鼠模型中肝脏病理结构改变的影响；
图16为不同处理对急性酒精诱导的小鼠肝脏脂质沉积抑制影响；
图17为不同处理对急性酒精诱导的小鼠肝脏组织中脂质沉积相关蛋白表达的影响；
图18为不同处理对极性酒精诱导的小鼠肝脏切片SREBP-1阳性表达影响。
具体实施方式
本发明提供了紫檀芪在制备预防和/或治疗肝损伤、肝纤维化和脂肪肝药物中的应用。
在本发明所述应用中，所述药物中优选还包括药学上可接受的辅料。本发明所述药物中，以紫檀芪为有效成分，所述紫檀芪在所述药物中的质量百分比优选为1～99％。本发明对所述辅料的来源及种类并没有特殊限定，利用本领域的常规药学辅料即可。
本发明所述药物优选制备成口服剂型和非口服剂型，所述口服剂型优选包括：片剂、胶囊、散剂和颗粒；所述非口服剂型优选包括针剂，更优选包括注射液针剂。本发明对所述各剂型的制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规制备方法即可。
本发明所述药物的施用量优选为2mg/kg。
本发明还提供了紫檀芪在制备对肝损伤、肝纤维化和脂肪肝有预防作用的保健品中的应用。
本发明所述保健品的剂型优选包括口服剂型和非口服剂型，所述口服剂型优选包括：片剂、胶囊、散剂和颗粒；所述非口服剂型优选包括针剂，更优选包括注射液针剂。
本发明所述保健品的用量优选为1～2mg/kg。
下面结合实施例对本发明提供的紫檀芪在制备药物或保健品中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
CCl4诱导肝纤维化小鼠模型的制备及紫檀芪(PTE)给药处理：
雄性C57BL/6小鼠(6周龄；体重18-22g)。在实验期间，所有小鼠均保持在受控环境中，温度为22±2℃，相对湿度为50-60％，每天12h昼和12h夜周期交替。适应环境正常生长5天后，将小鼠随机分为以下五组：正常组，CCl4组，CCl4+PTE-10mg/kg组，CCl4+PTE-25mg/kg组，CCl4+Res-20mg/kg组，每组6只小鼠。期间，给药组中，通过口服强饲法每天一次用PTE(10,25mg/kg)或Res(20mg/kg)处理小鼠，连续30天，正常组和CCl4组小鼠分别给予等体积的生理盐水。其中Res为白藜芦醇，作为阳性对照。30天后，除正常组外，其余各组小鼠给予10％CCl4的腹腔注射，剂量为2mL/kg；腹腔注射16h后，对小鼠进行乙醚麻醉处死，从颈动脉取血，将肝组织固定在10％福尔马林中或保持在-80℃中。
①PTE处理对CCl4诱导的小鼠肝功能的检测：
最后一次CCl4处理后16h处死所有小鼠，通过乙醚麻醉从颈动脉取血，室温静置15min，3000r/min，离心15min，取血清进行生化指标的检测，以SP-4430型生化分析仪测定血清中ALT、AST和LDH。结果如图1所示：其中图1-A为不同处理对血清中ALT的影响，图1-B为不同处理对血清中AST的影响，图1-C为不同处理对血清中LDH的影响，可见CCl4显著升高小鼠血清ALT、AST以及LDH水平，而给予PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)则可显著降低CCl4诱导小鼠血清ALT、AST以及LDH水平，其中PTE(20mg/kg)效果优于阳性对照Res，结果表明PTE具有显著改善CCl4诱导的肝损伤。
分别利用GSH、CAT试剂盒分别测定肝脏组织中GSH(谷胱甘肽)、CAT(过氧化氢酶)。CCl4可诱导产生自由基还能在细胞膜上发生脂质过氧化反应，使氧自由基生成增多，组织内抗氧化损伤酶(GSH、CAT)活性降低，肝脏抵御氧化损伤能力下降，进而导致肝脏损伤。实验结果如图2所示，其中图2-A为不同处理对肝脏组织中GSH的影响，图2-B为不同处理对肝脏组织中CAT的影响，可见CCl4显著降低小鼠肝脏GSH和CAT水平，而给予PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)则可显著升高CCl4诱导小鼠肝脏GSH和CAT水平，其中PTE(20mg/kg)效果优于阳性对照Res，结果表明PTE具有显著改善CCl4诱导的肝损伤。结果表明PTE可以改善CCl4诱导产生氧化应激。
②PTE处理对CCl4诱导的小鼠肝脏病理结构改变的分析：
经过脱水，石蜡包埋的肝脏切片仅5μM厚。烤片后，用二甲苯将切片除去石蜡并用乙醇脱水。用曙红和苏木精(HE)溶液染色，用乙醇梯度脱色，用二甲苯玻璃化，用中性树胶密封切片。在光学显微镜下，进行组织病理学观察。观察结果如图3所示：正常组小鼠肝脏小叶结构清晰，未见明显炎症；CCl4小鼠肝脏中央静脉周围多数融合坏死，肝细胞广泛变性、肿胀呈气球样变，易见凋亡小体，可见炎细胞浸润；PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)小鼠小叶结构可辨，偶见凋亡小体，炎细胞浸润区域减少，少数肝细胞呈气球样变。其中PTE(20mg/kg)效果优于阳性对照Res，结果表明PTE具有显著改善CCl4诱导小鼠肝脏组织损伤。
同时，切片用天狼星红和Masson对小鼠肝脏的胶原纤维特异性进行染色，以评估胶原蛋白的表达情况。Masson染色结果如图3所示，正常组小鼠肝小叶结构清晰，无胶原纤维增生，CCl4小鼠肝组织正常结构被破坏，肝小叶结构紊乱，出现蓝色胶原沉积，PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)小鼠较CCl4小鼠肝组织病变减轻，尤其是高剂量PTE。天狼星红染色结果如图3所示，正常组小鼠肝小叶结构清晰，无胶原纤维增生，CCl4小鼠肝组织可见红色胶原沉积，PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)小鼠较CCl4小鼠肝组织病变减轻。
将切片与5％山羊血清在湿盒中室温下孵育30min，并在37℃下分别α-SMA和Collagen-1(肝纤维化相关标志物)抗体封闭1h后置于4℃冰箱湿盒过夜。然后暗黑条件下加入山羊抗兔IgG-FITC，室温下孵育45min，弃二抗加入DAPI室温20min，PBS冲洗，防荧光猝灭剂封片，荧光显微镜下观察。
结果如图4所示，其中4-A为以α-SMA为抗体时的结果图，4-B为以Collagen-1为抗体时的结果图，正常小鼠肝脏切片上基本没有α-SMA和Collagen-1阳性表达，CCl4小鼠肝脏切片上可显著观察到肝纤维化指标α-SMA和Collagen-1阳性表达，PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)小鼠较CCl4小鼠肝脏切片α-SMA和Collagen-1阳性表达显著降低，尤其是高剂量PTE。以上结果表明，PTE能够逆转肝纤维化。
实施例2
TAA诱导肝纤维化小鼠模型的制备及给药处理：
雄性C57BL/6小鼠(6周龄；体重18-22g)。在实验期间，所有小鼠均保持在受控环境中，温度为22±2℃，相对湿度为50-60％，每天12h昼和12h夜周期交替。适应环境正常生长5天后，将小鼠随机分为以下五组：正常组，TAA组，TAA+PTE-10mg/kg组，TAA+PTE-25mg/kg组，TAA+PTE-50mg/kg组，每组6只小鼠。除正常组外，其他小鼠用浓度为100或200mg/kg的TAA腹腔注射5周，每周2/3次，诱导肝纤维化模型。期间，给药组中，通过口服强饲法每天一次用PTE(10,25mg/kg)或Res(20mg/kg)处理小鼠，连续28天。正常组和TAA组小鼠分别给予等体积的生理盐水。在最后一次TAA注射后，所有小鼠在6h后被处死并通过乙醚麻醉从小鼠的颈动脉取血，将肝组织固定在10％福尔马林中或保持在-80℃中。
①PTE处理对TAA诱导的小鼠肝功能的检测：
最后一次乙醇处理后6h处死所有小鼠，通过乙醚麻醉从颈动脉取血，室温静置15min，3000r/min，离心15min，取血清进行生化指标的检测。
以SP-4430型生化分析仪测定血清中ALT、AST含量。结果如图5所示，其中5-A为不同处理对模型小鼠血清中ALT的影响，5-B为对血清中AST的影响，可见TAA显著升高小鼠血清ALT、AST水平，而给予PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)则可显著降低CCl4诱导小鼠血清ALT、AST水平，其中PTE(20mg/kg)效果优于阳性对照Res，结果表明PTE具有显著改善TAA诱导的肝损伤。
③PTE处理对TAA诱导的小鼠肝脏病理结构改变的分析：
经过脱水，石蜡包埋的肝脏切片仅5μM厚。烤片后，用二甲苯将切片除去石蜡并用乙醇脱水。用曙红和苏木精(HE)溶液染色，用乙醇梯度脱色，用二甲苯玻璃化，用中性树胶密封切片。在光学显微镜下，进行组织病理学观察。观察结果如图6所示：正常组小鼠肝脏小叶结构清晰，未见明显炎症；TAA小鼠肝脏中央静脉周围多数融合坏死，肝细胞广泛变性、肿胀呈气球样变，可见炎细胞浸润；PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)小鼠小叶结构可辨，炎细胞浸润区域减少，少数肝细胞呈气球样变。其中PTE(20mg/kg)效果优于阳性对照Res，结果表明PTE具有显著改善TAA诱导小鼠肝脏组织损伤。
切片用天狼星红和Masson对小鼠肝脏的胶原纤维特异性进行染色，以评估胶原蛋白的表达情况。染色结果如图6所示：Masson染色结果显示，正常组小鼠肝小叶结构清晰，无胶原纤维增生，TAA小鼠肝组织正常结构被破坏，肝小叶结构紊乱，出现蓝色胶原沉积，PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)小鼠较TAA小鼠肝组织病变减轻，尤其是高剂量PTE。天狼星红染色结果显示，正常组小鼠肝小叶结构清晰，无胶原纤维增生，TAA小鼠肝组织可见红色胶原沉积，PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)小鼠较TAA小鼠肝组织病变减轻。
④PTE处理对TAA诱导的小鼠肝纤维化相关标志物抑制的测定：
Real-time PCR法检测小鼠肝脏组织中纤维化相关基因α-SMA和Collagen-I的表达，取肝脏组织15-20mg，通过Eastep total RNAExtraction Kit(Beyotime InstituteofBiotechnology，China)从小鼠肝组织中提取总RNA。使用500ng总RNA制备cDNA，在ABIVeriti R热循环仪上进行。PCR产物在2％琼脂糖凝胶和溴化乙锭上运行，内源性GAPDH的mRNA表达水平用作内参。结果如图7所示：小鼠给予TAA后，模型组的α-SMA，Collagen-I的mRNA表达明显增多，与正常组相比较具有显著性的差异，说明TAA致小鼠肝纤维化造模成功；PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)各给药组α-SMA，Collagen-I、TIMP-1的mRNA表达均较TAA模型组显著降低。从肝纤维化指标的mRNA表达结果可见，PTE可显著抑制TAA诱导肝纤维化。
Western blot检测肝脏组织中肝纤维化相关蛋白的表达，取肝脏组织20-25mg，加入1.5mLPARI裂解液和1％的PMSF，在speed8，4min内进行匀浆，结束后冰上涡旋1h，每3min/次。15000rpm，4℃，30min离心，取上清，用BSA进行蛋白浓度测定。将蛋白质样品置于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并转膜到PVDF膜上，5％脱脂牛奶封闭，一抗孵育，PBST漂洗，二抗孵育，使用Bio-Rad显影液进行显影。结果如图8所示：小鼠给予TAA后，模型组的α-SMA，Collagen-I蛋白的表达明显增多，与正常组相比较具有显著性的差异，说明TAA致小鼠肝纤维化造模成功；PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)各给药组α-SMA，Collagen-I、TIMP-1蛋白表达均较TAA模型组显著降低。从肝纤维化指标的蛋白表达结果可见，PTE可显著抑制TAA诱导肝纤维化。
实施例3
慢性酒精诱导小鼠模型的制备及给药处理：
雄性C57BL/6小鼠(8-10周龄，体重20-22g)。在整个实验过程中，所有小鼠适应无特定病原体的受控环境，温度为22±2℃，相对湿度为50-60％，并且具有12h光暗循环。将小鼠随机分为6组：正常组，EtOH(含5％酒精的Liebe-Ddecarli液体饲料)组，EtOH+Res20mg/kg组，EtOH+PTE-10mg/kg组，EtOH+PTE-20mg/kg组和pair-fed(对照液体饲料)组，每组6只。实验开始前，所有小鼠适应对照液体饮食8d，以使它们适应液体饮食和管饲；除正常组外，其余小鼠8d内逐渐给予含1％-5％酒精的Liebe-Ddecarli液体饲料。在实验期间，正常组随意喂食液体饮食和水。EtOH组，EtOH+Res组，EtOH+PTE-10组，EtOH+PTE-20组连续28d喂食含5％酒精的Liebe-Ddecarli液体饲料，pair-fed组喂食对照液体饲料。期间除了正常组，EtOH组和pair-fed组，其余组给予PTE(10mg/kg或20mg/kg)或Res(20mg/kg)连续28d灌胃给药。在最后一次乙醇处理后9h处死所有动物，并通过乙醚麻醉从小鼠的颈动脉取血，将肝组织固定在10％福尔马林中或保持在-80℃中。
①PTE处理对慢性酒精诱导的小鼠肝功能的检测：
最后一次乙醇处理后9h处死所有小鼠，通过乙醚麻醉从颈动脉取血，室温静置15min，3000r/min，离心15min，取血清进行生化指标的检测。
以SP-4430型生化分析仪测定血清中ALT、AST、TG的含量。给予Liebe-Ddecarli液体饲料(5％酒精)诱导28d建立慢性酒精模型。检测血清中ALT、AST和TG水平，以确定PTE对于急性酒精刺激引起小鼠肝脏损伤的影响。结果如图9所示：9-A为不同处理对ALT和AST的影响，9-B为对TG的影响，与正常组比较，给予L-D液体饲料刺激小鼠血清ALT、AST和TG水平显著升高；与L-D液体饲料组比较，PTE、Res给药组的ALT、AST和TG水平均显著降低。结果提示PTE能够抑制慢性酒精引起的小鼠肝脏转氨酶水平升高，并降低甘油三酯水平。
②PTE处理对慢性酒精诱导的小鼠肝脏病理结构改变的分析：
经过脱水，石蜡包埋的肝脏切片仅5μM厚。烤片后，用二甲苯将切片除去石蜡并用乙醇脱水。用曙红和苏木精(HE)溶液染色，用乙醇梯度脱色，用二甲苯玻璃化，用中性树胶密封切片。在光学显微镜下，进行组织病理学观察。H&E染色结果如图10所示，正常组小鼠肝小叶结构正常，无炎性细胞浸润，无脂滴形成；EtOH组(L-D液体饲料)小鼠肝脏明显有脂滴形成，炎性浸润，并出现微孔性及大泡性脂肪变性；PTE给药组及阳性对照Res组与EtOH组相比，脂肪泡的情况均有所改善，且PTE高剂量组改善效果更佳，pair-fed对照饲料组小鼠肝脏与正常组无显著性差异。结果说明PTE能够抑制慢性酒精诱导的小鼠肝脏损伤。
切片也用油红和尼罗红对小鼠肝脏切片细胞中的脂滴进行染色观察，以评估对脂质沉积的影响。油红染色和尼罗红染色结果如图10所示，正常组几乎无脂滴存在，EtOH组(L-D液体饲料)中出现大量弥漫性脂肪滴。而PTE给药组及阳性对照Res组与EtOH组相比，显著地改善了酒精引起的脂肪滴的生成，pair-fed对照饲料组小鼠肝脏与正常组无显著性差异。实验结果说明PTE能够明显的改善由酒精引起的肝脏脂质沉积。
③PTE处理对慢性酒精诱导的小鼠肝脏脂质沉积抑制的测定：
Real-time PCR法检测小鼠肝脏组织中脂质沉积相关基因SREBP-1、Fasn的表达，取肝脏组织15-20mg，根据制造商方案，通过Eastep total RNA Extraction Kit(BeyotimeInstitute ofBiotechnology，China)从小鼠肝组织中提取总RNA。使用500ng总RNA制备cDNA，在ABI Veriti R热循环仪上进行。PCR产物在2％琼脂糖凝胶和溴化乙锭上运行，内源性GAPDH的mRNA表达水平用作内参。结果如图11所示，与正常组相比，EtOH(L-D液体饲料)刺激显著增加SREBP-1、Fasn的mRNA表达；与EtOH(L-D液体饲料)组比较，给予PTE或Res则显著抑制SREBP-1、Fasn的mRNA表达。pair-fed对照饲料组小鼠肝脏SREBP-1、Fasn的mRNA表达与正常组无显著性差异。结果表明，PTE可改善慢性酒精导致的脂质沉积，调控胆固醇、脂肪酸以及甘油三酯的合成，进而调控脂质代谢。
Western blot检测肝脏组织中脂质沉积相关蛋白的表达，取肝脏组织20-25mg，加入1.5mLPARI裂解液和1％的PMSF，在speed8，4min内进行匀浆，结束后冰上涡旋1h，每3min/次。15000rpm，4℃，30min离心，取上清，用BSA进行蛋白浓度测定。将蛋白质样品置于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并转膜到PVDF膜上，5％脱脂牛奶封闭，一抗孵育，PBST漂洗，二抗孵育，使用Bio-Rad显影液进行显影。结果如图12所示，与正常组相比，EtOH(L-D液体饲料)刺激显著增加SREBP-1、FAS、PPARα、PPARγ的蛋白表达；与EtOH(L-D液体饲料)组比较，给予PTE或Res则显著抑制SREBP-1、FAS、PPARα、PPARγ蛋白表达。pair-fed对照饲料组小鼠肝脏SREBP-1、FAS、PPARα、PPARγ的蛋白表达与正常组无显著性差异。结果表明，PTE可改善慢性酒精导致的脂质沉积，调控胆固醇、脂肪酸以及甘油三酯的合成，进而调控脂质代谢。
将切片与5％山羊血清在湿盒中室温下孵育30min，并在37℃下分别SREBP-1抗体封闭1h后置于4℃冰箱湿盒过夜。然后暗黑条件下加入山羊抗兔IgG-FITC，室温下孵育45min，弃二抗加入DAPI室温20min，PBS冲洗，防荧光猝灭剂封片，荧光显微镜下观察。
固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)是激活肝脏中胆固醇和脂肪酸合成全过程的转录因子。研究结果如图13所示，正常小鼠肝脏切片上SREBP-1阳性表达很少，EtOH(L-D液体饲料)小鼠肝脏切片上可显著观察到SREBP-1阳性表达，PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)小鼠较EtOH(L-D液体饲料)小鼠肝脏切片SREBP-1阳性表达显著降低，尤其是高剂量PTE。pair-fed对照饲料组小鼠肝脏SREBP-1阳性表达与正常组无显著性差异。以上结果表明，PTE能够抑制慢性酒精刺激诱发SREBP-1表达，从而改善慢性酒精刺激导致肝脏脂质沉积、脂肪变性等。
实施例4
急性酒精诱导小鼠模型的制备及给药处理：
雄性C57BL/6小鼠(6周龄；体重18-22g)。在实验期间，所有小鼠均保持在受控环境中，温度为22±2℃，相对湿度为50-60％，每天12h昼和12h夜周期交替。适应环境正常生长5天后，将小鼠随机分为以下五组：正常组，EtOH组，EtOH+PTE-10mg/kg组，EtOH+PTE-20mg/kg组，EtOH+Res(20mg/kg)组(阳性对照)，每组6只小鼠。通过口服强饲法用单剂量的PTE(分别为10或20mg/kg)、Res(20mg/kg，白藜芦醇)预处理连续6天。同时，正常组，阳性对照组和EtOH组通过管饲法给予等体积的生理盐水6天。除正常组外，其他组在24h内三次灌胃给予乙醇(5g/kg体重)。在最后一次乙醇处理后9h处死所有动物，并通过乙醚麻醉从小鼠的颈动脉取血，将肝组织固定在10％福尔马林中或保持在-80℃中。
①PTE处理对急性酒精诱导的小鼠肝功能的检测：
最后一次乙醇处理后9h处死所有小鼠，通过乙醚麻醉从颈动脉取血，室温静置15min，3000r/min，离心15min，取血清进行生化指标的检测。
以SP-4430型生化分析仪测定血清中ALT、AST和TG含量。在24小时内给予小鼠三次5g/kg酒精模拟建立急性酒精模型。检测血清中ALT、AST和TG水平，以确定PTE对于急性酒精刺激引起小鼠肝脏损伤的影响。结果如图14所示，其中14-A为不同处理对急性酒精诱导的小鼠模型中ALT的影响，14-B为对AST的影响，14-C为对TG的影响，与正常组比较，给予酒精刺激小鼠血清ALT、AST和TG水平显著升高；与酒精组比较，PTE、Res给药组的ALT、AST和TG水平均显著降低。结果提示PTE能够抑制急性酒精引起的小鼠肝脏转氨酶水平升高，并降低甘油三酯水平。
②PTE处理对急性酒精诱导的小鼠肝脏病理结构改变的分析：
经过脱水，石蜡包埋的肝脏切片仅5μM厚。烤片后，用二甲苯将切片除去石蜡并用乙醇脱水。用曙红和苏木精(HE)溶液染色，用乙醇梯度脱色，用二甲苯玻璃化，用中性树胶密封切片。在光学显微镜下，进行组织病理学观察。H&E染色结果如图15所示，正常组小鼠肝小叶结构正常，无炎性细胞浸润，无脂滴形成；EtOH组小鼠肝脏明显有脂滴形成，炎性浸润，并出现微孔性及大泡性脂肪变性；PTE给药组及阳性对照Res组与EtOH组相比，脂肪泡的情况均有所改善，且PTE高剂量组改善效果更佳。结果说明PTE能够抑制急性酒精诱导的小鼠肝脏损伤。
切片也用油红和尼罗红染色对小鼠肝脏脂质沉积情况进行评估。油红染色和尼罗红染色结果如图15所示，正常组几乎无脂滴存在，EtOH组中出现大量弥漫性脂肪滴。而PTE给药组及阳性对照Res组与EtOH组相比，显著地改善了酒精引起的脂肪滴的生成。实验结果说明PTE能够明显的改善由酒精引起的肝脏脂质沉积。
③PTE处理对急性酒精诱导的小鼠肝脏脂质沉积的抑制作用的测定：
Real-time PCR法检测小鼠肝脏组织中脂质沉积相关基因的表达，取肝脏组织15-20mg，通过Eastep total RNAExtraction Kit(Beyotime Institute of Biotechnology，China)从小鼠肝组织中提取总RNA。使用500ng总RNA制备cDNA，在ABI Veriti R热循环仪上进行。PCR产物在2％琼脂糖凝胶和溴化乙锭上运行，内源性GAPDH的mRNA表达水平用作内参。SREBP-1是调控胆固醇、脂肪酸、甘油三脂合成与代谢的重要转录因子，并且SREBP在体内可激活多种脂肪的合成。结果如图16所示，与正常组相比，EtOH刺激显著增加SREBP-1、Fasn的mRNA表达；与EtOH组比较，给予PTE或Res则显著抑制SREBP-1、Fasn的mRNA表达。结果表明，PTE可改善急性酒精导致的脂质沉积，并调控脂肪酸合成。
Western blot检测肝脏组织中脂质沉积相关蛋白的表达，取肝脏组织20-25mg，加入1.5mLPARI裂解液和1％的PMSF，在speed8，4min内进行匀浆，结束后冰上涡旋1h，每3min/次。15000rpm，4℃，30min离心，取上清，用BSA进行蛋白浓度测定。将蛋白质样品置于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并转膜到PVDF膜上，5％脱脂牛奶封闭，一抗孵育，PBST漂洗，二抗孵育，使用Bio-Rad显影液进行显影。结果如图17所示，与正常组相比，EtOH刺激显著增加SREBP-1、PPARα、PPARγ、FAS的蛋白表达；与EtOH组比较，给予PTE或Res则显著抑制SREBP-1、PPARα、PPARγ、FAS蛋白表达。结果表明，PTE可改善急性酒精导致的脂质沉积，调控胆固醇、脂肪酸以及甘油三酯的合成，进而调控脂质代谢。
将切片与5％山羊血清在湿盒中室温下孵育30min，并在37℃下分别SREBP-1抗体封闭1h后置于4℃冰箱湿盒过夜。然后暗黑条件下加入山羊抗兔IgG-FITC，室温下孵育45min，弃二抗加入DAPI室温20min，PBS冲洗，防荧光猝灭剂封片，荧光显微镜下观察。
固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)是激活肝脏中胆固醇和脂肪酸合成全过程的转录因子。研究结果如图18所示，正常小鼠肝脏切片上SREBP-1阳性表达很少，EtOH小鼠肝脏切片上可显著观察到SREBP-1阳性表达，PTE(10,20mg/kg)或Res(20mg/kg)小鼠较EtOH小鼠肝脏切片SREBP-1阳性表达显著降低，尤其是高剂量PTE。以上结果表明，PTE能够抑制酒精刺激诱发SREBP-1表达，从而改善酒精刺激导致肝脏脂质沉积、脂肪变性等。
本发明提供了一种紫檀芪在肝保护、防治肝纤维化、改善急慢性酒精性脂肪肝中的应用，所述紫檀芪分别针对TAA或CCl4诱导肝纤维化模型、急慢性酒精性脂肪肝模型，表现出较好的预防与治疗效果。因此可用于制备预防和/或治疗肝损伤、肝纤维化以及脂肪肝的药物或具有相应功效的保健品。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.紫檀芪在制备预防和/或治疗肝损伤、肝纤维化和脂肪肝药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物中还包括药学上可接受的辅料。
3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述药物的剂型包括：片剂、胶囊、散剂、颗粒和针剂。
4.紫檀芪在制备对肝损伤、肝纤维化和脂肪肝有预防作用的保健品中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述保健品的剂型包括：片剂、胶囊、散剂、颗粒和针剂。
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