CN105012281A - 紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中的应用。本发明紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中的应用的有效浓度为20～140μmol/L。本发明对肝癌细胞系HepG2进行常规培养，利用MTT法，倒置显微镜和流式细胞术，实时定量PCR和Western？blot等方法，分别检测不同浓度紫檀芪对HepG2细胞活力的影响、紫檀芪处理后HepG2细胞的凋亡情况、紫檀芪处理后Bax、Bcl-2、Fas、Cycs(细胞色素C)和Caspase3基因mRNA和蛋白表达情况。实验结果充分证明了紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中的应用。同时作为天然物质提取物，紫檀芪将会在抗肿瘤的药物治疗领域具有广阔的应用前景。

Description

紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种紫檀芪的应用，具体涉及紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

肝癌是多药耐药肿瘤，多数患者确诊时已是晚期且药物疗效差，寻找低毒、有效、安全的抗肿瘤药物是治疗肝癌的关键(卢创新，周云，薛飞，王文玉，李晓燕，郭志松.槲皮素抑制肝癌HepG2细胞的增殖及促凋亡机制的研究.中华实用诊断与治疗杂志.)。近些年来，因为一些天然的抗肿瘤药物效果显著且几乎无不良反应。因此人们越来越重视这些物质在抗肿瘤方面的研究和应用(王宁,杨阳,段维勋,梁振兴,李悦,金振晓,等.紫檀芪对人肺腺癌A549细胞系增殖及凋亡的影响.中华临床医师杂志.)。

细胞凋亡是一种独特的细胞死亡方式，它是生物体最重要的生理和病理现象之一，是在基因调控下，由于内外环境改变或死亡信号触发引起的细胞程序性死亡。目前有两大类最受重视的调控细胞凋亡的基因家族：一类叫做抑制凋亡因子，如Bcl-2；另一类叫做促进凋亡因子，如Bax,Fas,Cycs和Caspase3。在细胞凋亡时,Bcl-2家族中的促凋亡蛋白成员(如Bax)发生蛋白质的加工修饰,易位到线粒体的外膜上,引起细胞色素C(Cycs)和caspase等其他促凋亡因子的释放,导致细胞凋亡；而平时被隔离在线粒体等细胞器内的该家族的抑制凋亡蛋白成员(如Bcl-2)则抑制Cycs和caspase等促凋亡因子的释放,具有抑制细胞凋亡的功能(付永锋，樊廷俊.Bcl-2家族蛋白与细胞凋亡.生物化学与生物物理学报.)。另外，Fas/FasL系统是肿瘤细胞凋亡的重要途径之一,通过影响肿瘤细胞的Fas/FasL表达可以诱导其凋亡(孙麟，陈乔尔.Fas/FasL凋亡系统与肿瘤免疫逃逸研究进展.医学综述.)。而Caspase-3是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡过程中的主要效应因子。它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志(岳原亦，张扬，张一奇.Caspase家族与细胞凋亡.中国医疗前沿.)。陈阳等(陈阳，赵秋宇，宋囡，贾连群.丹参酮ⅡA诱导 人肝癌HepG2细胞凋亡的机制.中国老年学杂志.)研究发现丹参酮ⅡA通过上调Bax和下调Bcl-2基因的表达等方式诱导肝癌HepG2细胞凋亡。谢晓东等(谢晓东,吴荧荧,黄文斯,刘庆,王颖,朱海涛,等.澳洲茄边碱对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响.江苏医药.)研究发现澳洲茄边碱能够通过上调Bax和Caspase3，下调Bcl-2基因的表达诱导肝癌HepG2细胞凋亡。

紫檀芪(Pterostilbene，PTE)广泛存在于多种小浆果和红酒中，是植物在受到外来侵害时产生的一种植物抗毒素，属于抗体性物质。与白藜芦醇(Resveratrol，RES)都属于芪类化合物，RES苯环上3,5羟基的氢原子被甲基替换则成为紫檀芪。值得一提的是，紫檀芪的多种生物活性都优于或至少不低于RES且具有良好的安全性(焦峰，黄海进.紫檀芪对人食管癌EC9706细胞生长的影响及其机制.西南国防医药.)。研究发现，PTE对乳腺癌(Nikhil K,Sharan S,Chakraborty A,Bodipati N,Peddinti R,Roy P.Role of isothiocyanate conjugate of pterostilbene on the inhibition of MCF-7cell proliferation and tumor growth in Ehrlich ascitic cell induced tumor bearing mice.Exp Cell Res 2014；320(2):311-328.)、肺癌(Yang Y,Yan X,Duan W,Yan J,Yi W,Liang Z,etal.Pterostilbene exerts antitumor activity via the Notch1signaling pathway in human lung adenocarcinoma cells.PLos One 2013；8(5):e62652.)、前列腺癌(Lin VC,Tsai YC,Lin JN,Fan LL,Pan MH,Ho CT,etal.Activation of AMPK by pterostilbene suppresses lipogenesis and cell cycle progression in p53positive and negative human prostate cancer cells.J Agric Food Chem 2012；60(25):6399-6407.)、食管癌等多种恶性肿瘤均有抑制作用，但其对治疗肝癌的研究尚无明确报道。本发明以体外培养的人肝癌HepG2细胞为研究对象，探讨紫檀芪对HepG2细胞增殖及凋亡的影响，进而为临床药物治疗肝癌提供新靶点。

发明内容

目前，治疗肝癌的有效方法多以化疗、放疗为主，但其毒副作用较大。因此，研制和开发新型高效低毒的抗癌药物已经成为治疗和攻克癌症的新希望。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：

紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中的应用，具体涉及紫檀芪在制备通过上调Bax、Fas、Cycs和Caspase3基因，下调Bcl-2基因进而抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡的药物中的应用。

在本发明中，优选的，所述肝癌细胞为人肝癌HepG2细胞。

在本发明中，优选的，所述紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中应用的有效浓度为20～140μmol/L。

在本发明中，优选的，所述紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中应用的有效浓度为80μmol/L。

本发明的技术方案是对肝癌细胞系HepG2进行常规培养，MTT法检测不同浓度紫檀芪对HepG2细胞活力的影响；倒置显微镜和流式细胞术检测紫檀芪处理后HepG2细胞的凋亡情况；实时定量PCR和Western blot分别检测紫檀芪处理后Bax、Bcl-2、Fas、Cycs(细胞色素C)和Caspase3基因mRNA和蛋白表达情况。

本发明探讨了紫檀芪(PTE)对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制，本发明研究结果显示，紫檀芪能够使Bax,Fas,Cycs和Caspase3基因的表达上调和Bcl-2基因的表达下调。此外，通过线粒体跨膜电位的变化和上调Fas和Caspase3基因的表达，可以推断出紫檀芪可能通过线粒体途径和死亡受体途径双重机制介导诱导肝癌HepG2细胞凋亡。

1.细胞培养和药物配制

HepG2细胞培养液为含10％的胎牛血清、100mg/L链霉素和1×10⁵U/L青霉素的完全培养液，培养箱环境为37℃、5％CO₂、饱和湿度。紫檀芪先用DMSO溶解，然后再用完全培养基稀释，用其做后续实验。

2.紫檀芪对细胞增殖能力的影响

用不同浓度紫檀芪(20～140μmol/L)分别处理HepG2细胞24,48,72h后，用酶标仪在570nm波长下测定吸光度值(OD)，并计算出细胞增殖抑制率和IC50值。经测定，细胞增殖出现抑制效应且呈剂量时间依赖性，紫檀芪作用HepG2细胞48h的最佳药物浓度为80μmol/L，IC50值为80.068μmol/L。

3.细胞形态观察 

取对数生长期的HepG2细胞，分别加入终浓度为0,40,80,120μmol/L的紫檀芪培养48h后，光学显微镜下观察细胞形态的改变并拍照。用200μL吖啶橙(0.5μg/μL)在室温条件下孵育3～5min，荧光显微镜下观察细胞核的变化并拍照。形态学观察发现紫檀芪作用后的细胞呈明显凋亡状态，出现细胞周期阻滞现象。

4.紫檀芪对肝癌HepG2细胞凋亡的作用

不同浓度紫檀芪(0,40,80,120μmol/L)处理HepG2细胞48h后， AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率及统计分析。紫檀芪能够诱导肝癌HepG2细胞凋亡，且随着药物浓度的不断增大，细胞早期凋亡率呈现先增加后减小的趋势，在80μmol/L和120μmol/L时变化显著。当紫檀芪浓度达到80μmol/L时细胞早期凋亡率最大，为(15.61±0.71)％(P<0.05)。

5.紫檀芪对肝癌HepG2细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的作用

不同浓度紫檀芪(0,40,80,120μmol/L)处理HepG2细胞48h后，流式细胞术检测紫檀芪对HepG2细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的影响及统计分析。对照组的HepG2细胞线粒体膜电位为294.15±20.35，当药物浓度达到80μmol/L和120μmol/L时，线粒体膜电位明显下降为165.39±11.35和103.22±8.72(P<0.01)，且变化极显著。

6.紫檀芪对肝癌HepG2细胞周期的作用

不同浓度紫檀芪(0,40,80,120μmol/L)处理HepG2细胞48h后，流式细胞仪检测细胞周期的变化及统计分析。对照组的HepG2细胞处于G1期的数目最多，其次是S期，G2期数目最少。当药物浓度达到40μmol/L和80μmol/L时，G2期细胞含量和S期细胞含量变化显著。当药物浓度达到120μmol/L时，G2期细胞含量变化显著。细胞阻滞于G2期和S期。

7.Real Time RT-PCR检测Bax、Bcl-2、Fas、Cycs、Caspase3的mRNA表达水平

收集并提取经0,40,80,120μmol/L的紫檀芪处理48h后的HepG2细胞总RNA，Real Time RT-PCR检测Bax、Bcl-2、Fas、Cycs、Caspase3的mRNA表达水平。与对照组的HepG2细胞相比，加药组的HepG2细胞中Bax、Fas、Cycs和Caspase3基因表达上调，Bcl-2基因表达下调，其中Bax和Fas基因变化显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。

8.Western blot检测蛋白表达水平

收集并提取经0,40,80,120μmol/L的紫檀芪处理48h后的HepG2细胞全蛋白，Western blot检测蛋白表达水平。与对照组的HepG2细胞相比，加药组可使HepG2细胞中的Bax、Fas、Cycs和Caspase3的蛋白表达上调，Bcl-2的蛋白表达下调，其中Bax和Fas蛋白变化显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述实验数据统计分析

数据经SPSS 17.0软件分析处理后，进行单因素方差分析(One-way ANOVA),组间比较用LSD法检测其差异性，数据以均数±标准差表示，*P<0.05, ^▲P<0.05为差异显著,**P<0.01,^▲▲P<0.01为差异极显著。

通过以上实验结果，可得出如下结论：

(1)20～140μmol/L的紫檀芪作用于HepG2细胞后可显著降低HepG2细胞活力，诱导细胞凋亡且存在药物浓度时间依赖性，并与细胞形态学结果相一致。80μmol/L的紫檀芪作用下细胞凋亡率出现最大值，因此，80μmol/L确定为最佳药物作用浓度

(2)紫檀芪能够使Bax,Fas,Cycs和Caspase3基因的表达上调和Bcl-2基因的表达下调。其中，Bax基因和Fas基因在不同药物浓度的作用下，组间变化显著(P<0.05)。此外，通过线粒体跨膜电位的变化和上调Fas和Caspase3基因的表达，可以推断出紫檀芪可能通过线粒体途径和死亡受体途径双重机制介导诱导肝癌HepG2细胞凋亡。

紫檀芪能够抑制HepG2细胞增殖并诱导其凋亡。同时作为天然物质提取物，紫檀芪将会在抗肿瘤的药物治疗领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为紫檀芪对HepG2细胞增殖的影响图；

图2为光学显微镜下紫檀芪作用HepG2细胞48h的细胞形态图(100×)，其中，A：对照，B：40μmol/L PTE，C：80μmol/L PTE，D：120μmol/L PTE；

图3为荧光显微镜下紫檀芪作用HepG2细胞48h的细胞形态图(100×)，其中，A：对照，B：40μmol/L PTE，C：80μmol/L PTE，D：120μmol/L PTE；

图4为紫檀芪对HepG2细胞凋亡的影响图，其中，A：对照，B：40μmol/L PTE，C：80μmol/L PTE，D：120μmol/L PTE；

图5为紫檀芪对HepG2细胞线粒体膜电位的影响图，其中，A：对照，B：40μmol/L PTE，C：80μmol/L PTE，D：120μmol/L PTE；

图6为紫檀芪对HepG2细胞周期的影响图，其中，A：对照，B：40μmol/L PTE，C：80μmol/L PTE，D：120μmol/L PTE；

图7为紫檀芪对HepG2细胞周期的影响柱状图，其中，*P<0.05,**P<0.01,与对照组比较；^▲P<0.05,^▲▲P<0.01各组间比较；

图8为QPCR检测紫檀芪对Bax、Bcl-2、Fas、cycs和caspase3的mRNA表达的影响图，其中，*P<0.05,与对照组比较；^▲P<0.05,各组间比较；

图9为Western blot检测紫檀芪对Bax、Bcl-2、Fas、cycs、caspase3和β-actin的蛋白表达的影响图，其中，A：对照，B：40μmol/L PTE，C：80μmol/L PTE，D：120μmol/L PTE；

图10为Western blot检测紫檀芪对Bax、Bcl-2、Fas、cycs、caspase3和β-actin的蛋白表达的影响柱状图，其中，*P<0.05,与对照组比较；^▲P<0.05,各组间比较。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

试验例1

1材料与方法 

1.1材料

人肝癌HepG2细胞株购自中国科学院上海细胞库。紫檀芪购自南京南通飞宇生物科技有限公司。Bax、Bcl-2、Fas、Cycs、Caspase3和β-actin一抗购自北京博奥森生物科技有限公司；二抗购自碧云天生物研究所。罗丹明123(Rho123)购自Sigma公司。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、PI染液、线粒体膜电位检测试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。RPMI-1640培养基购自Gibco公司。胎牛血清、二甲基亚砜(DMSO)、总RNA提取试剂盒、全蛋白提取试剂盒均购自上海生工生物工程有限责任公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和药物配制

HepG2细胞培养液为含10％的胎牛血清、100mg/L链霉素和1×10⁵U/L青霉素的完全培养液，培养箱环境为37℃、5％CO₂、饱和湿度。紫檀芪先用DMSO溶解，然后再用完全培养基稀释。

1.2.2紫檀芪对细胞增殖能力的影响

取对数生长期的HepG2细胞，经胰酶消化后接种于96孔板中，加入终浓度为0,20,40,80,100,120,140μmol/L的紫檀芪，将96孔板置于培养箱中分别培养24,48和72h。用酶标仪在570nm波长下测定吸光度值(OD)，并计算出细胞增殖抑制率和IC50值。

1.2.3细胞形态观察 

取对数生长期的HepG2细胞，分别加入终浓度为0,40,80,120μmol/L的紫檀芪培养48h后，光学显微镜下观察细胞形态的改变并拍照。用200μL吖啶橙(0.5μg/μL) 在室温条件下孵育3～5min，荧光显微镜下观察细胞核的变化并拍照。

1.2.4紫檀芪对肝癌HepG2细胞凋亡的作用

收集经0,40,80,120μmol/L的紫檀芪处理48h后的HepG2细胞，用预冷的PBS洗涤2遍，将细胞重悬于500μL Binding Buffer中，再向细胞悬液中加入5μL Annexin V-FITC染液和5μL Propidium lodide(PI)染液，室温下避光孵育15-20min后进行流式细胞仪的上机检测。

1.2.5紫檀芪对肝癌HepG2细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的作用

收集经0,40,80,120μmol/L的紫檀芪处理48h后的HepG2细胞，用预冷的PBS洗涤2遍，向其中加入500μL配制好的Incuation Buffer(需37℃预热)，再加入稀释好的罗丹明1231μL，37℃培养箱中避光孵育20-30min，再用Incuation Buffer洗涤2遍后悬浮细胞，最后进行流式细胞仪的上机检测。

1.2.6紫檀芪对肝癌HepG2细胞周期的作用

收集经0,40,80,120μmol/L的紫檀芪处理48h后的HepG2细胞，用预冷的PBS洗涤2遍，弃上清，向其中加入冷PBS和无水乙醇(比例为1:3)，充分混匀后，于4℃冰箱固定12h以上，离心收集细胞，用预冷的PBS洗涤2遍，弃上清后加入500μLPI染液和RNaseA(使其终浓度为0.25mg/mL)，37℃避光孵育20-30min，进行流式细胞仪的上机检测。

1.2.7 Real Time RT-PCR检测Bax、Bcl-2、Fas、Cycs、Caspase3的mRNA表达水平

收集并提取经0,40,80,120μmol/L的紫檀芪处理48h后的HepG2细胞总RNA，再反转录成cDNA。反应体系为25μL Hotstart Fluo-PCR mix，21μL ddH₂O，2μLcDNA和上下游引物各1μL。Bcl-2基因上游引物序列为：5′-atgtgtgtggagagcgtcaac-3′，下游引物序列为：5′-agcagccaggagaaatcaaac-3′，扩增产物大小为180bp。Bax基因上游引物序列为：5′-aagctgagcgagtgtctcaag-3′，下游引物序列为：5′-caaagtaga aaagggcgacaac-3′，扩增产物大小为178bp。Fas基因上游引物序列为：5′-tgatgtggaacacagcaagg-3′，下游引物序列为：5′-ggctgtggtgactcttagtgataa-3′，扩增产物大小为107bp。Cycs基因上游引物序列为：5′-ctgggtgacgagtgaaactg-3′，下游引物序列为：5′-tgagcacaacaggaactgga-3′，扩增产物大小为104bp。Caspase3基因上游引物序列为：5′-ggaacgaacggacctgtg-3′，下游引物序列为：5′-gcctccactggtatcttctg-3′，扩增产物大小为135bp。β-actin基因上游引物序列为：5′-agcgagcatccccca aagtt-3′， 下游引物序列为：5′-gggcacgaaggctcatcatt-3′，扩增产物大小为205bp。其中β-actin为内参。实验设有3次重复，数据以2^–ΔΔCt进行分析。

1.2.8 Western blot检测蛋白表达水平

收集并提取经0,40,80,120μmol/L的紫檀芪处理48h后的HepG2细胞全蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后将蛋白经恒流电转移到PVDF膜上，5％脱脂奶粉封闭1h，一抗(1:500)4℃孵育过夜，次日PBST洗膜，二抗IgG(1:15000)4℃避光孵育1h，再用PBST漂洗后进行扫描检测。

1.3统计分析

数据经SPSS 17.0软件分析处理后，进行单因素方差分析(One-way ANOVA),组间比较用LSD法检测其差异性，数据以均数±标准差()表示，*P<0.05,^▲P<0.05为差异显著,**P<0.01,^▲▲P<0.01为差异极显著。

2结果

2.1紫檀芪对HepG2细胞增殖的影响

用不同浓度紫檀芪(20～140μmol/L)分别处理HepG2细胞24,48,72h后，细胞增殖出现抑制效应且呈剂量时间依赖性(图1)。紫檀芪作用HepG2细胞48h的最佳药物浓度为80μmol/L，IC50值为80.068μmol/L。

2.2细胞形态观察 

2.2.1光学显微镜下观察紫檀芪对细胞形态的影响

对照组细胞形态规则，大小均一，生长状态良好；而加药组的细胞形状发生了明显改变，部分细胞胞浆浓缩，出现凋亡小体和凋亡小泡等明显的凋亡特征(图2)。

2.2.2荧光显微镜下观察紫檀芪对细胞形态的影响

经吖啶橙染色后，对照组细胞多且染色质均匀，而加药组细胞细胞核发生明显改变，部分细胞出现染色质浓缩、断裂、边缘化和凋亡小泡等明显的凋亡特征(图3)。

2.3流式细胞术检测紫檀芪对HepG2细胞凋亡的影响

图4和表1为不同浓度紫檀芪处理HepG2细胞48h后，AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率及统计分析结果。如图4和表1所示，紫檀芪能够诱导肝癌HepG2细胞凋亡，且随着药物浓度的不断增大，细胞早期凋亡率呈现先增加后减小的趋势，在80μmol/L和120μmol/L时变化显著。当紫檀芪浓度达到80μmol/L时细胞早期凋亡率最大，为(15.61±0.71)％(P<0.05)。

表1流式细胞术检测紫檀芪诱导HepG2细胞48h后的细胞早期凋亡率

注:*P<0.05,与对照组比较；^▲P<0.05，各组间比较。

2.4流式细胞术检测紫檀芪对HepG2细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的影响

图5和表2为不同浓度紫檀芪处理HepG2细胞48h后，线粒体膜电位(ΔΨm)的变化及统计分析结果。如图5和表2所示，对照组的HepG2细胞线粒体膜电位为294.15±20.35，当药物浓度达到80μmol/L和120μmol/L时，线粒体膜电位明显下降为165.39±11.35和103.22±8.72(P<0.01)，且变化极显著。

表2紫檀芪作用HepG2细胞48h的线粒体膜电位(ΔΨm)变化(n＝3)

注:**P<0.01,与对照组比较；^▲▲P<0.01，各组间比较。

2.5流式细胞术检测紫檀芪对HepG2细胞周期的影响

图6和图7为不同浓度紫檀芪处理HepG2细胞48h后，细胞周期的变化及统计分析结果。如图6和图7所示，对照组的HepG2细胞处于G1期的数目最多，其次是S期，G2期数目最少。当药物浓度达到40μmol/L和80μmol/L时，G2期细胞含量和S期细胞含量变化显著。当药物浓度达到120μmol/L时，G2期细胞含量变化显著。细胞阻滞于G2期和S期。

2.6紫檀芪对HepG2细胞Bax、Bcl-2、Fas、Cycs和Caspase3的mRNA表达水平的影响

图8为不同浓度紫檀芪处理HepG2细胞48h后，各凋亡相关基因的mRNA表达水平及统计分析结果。如图8所示，与对照组的HepG2细胞相比，加药组的HepG2细胞中Bax、Fas、Cycs和Caspase3基因表达上调，Bcl-2基因表达下调，其中Bax和Fas基因变化显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.7紫檀芪对HepG2细胞Bax、Bcl-2、Fas、cycs和caspase3的蛋白表达水平的影响

图9和图10为不同浓度紫檀芪处理HepG2细胞48h后，各凋亡相关基因的蛋白表达水平及统计分析结果。如图9和图10所示，与对照组的HepG2细胞相比，加药组可使HepG2细胞中的Bax、Fas、Cycs和Caspase3的蛋白表达上调，Bcl-2的蛋白表达下调，其中Bax和Fas蛋白变化显著，差异具有统计学意义(P<0.05)。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡是通过上调Bax、Fas、Cycs和Caspase3基因，下调Bcl-2基因而达到抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡的目的。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝癌细胞为人肝癌HepG2细胞。

4.根据权利要求1所述的的应用，其特征在于，所述紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中应用的有效浓度为20～140μmol/L。

5.根据权利要求4所述的的应用，其特征在于，所述紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中应用的有效浓度为80μmol/L。