CN104997793A - 川楝素在制备抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及川楝素在制备抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡药物中的应用。本发明川楝素在制备抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡药物中的应用的有效浓度为10～70μmol/L。本发明采用不同浓度的川楝素作用A549细胞48h后，MTT法检测细胞活性；光学显微镜、荧光显微镜、流式细胞术检测细胞凋亡情况。Real？Time？PCR和Western？blot分别检测了Bax、Bcl-2基因mRNA和蛋白表达水平。实验结果充分证明了川楝素能够通过上调Bax、Fas、Cycs、Caspase3基因，下调Bcl-2基因诱导肺癌A549细胞凋亡和抑制细胞增殖。且因川楝素具有低毒环保的特性，可以考虑用来作为化疗辅助药物，从而为改善肺癌等癌症的临床治疗方法提供新依据。

Description

川楝素在制备抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种川楝素的应用，具体涉及川楝素在制备抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

川楝素(Toosendanin)是一种三萜类化合物，是从植物的根皮中分离得到的一种无色针状晶体(Ju JM,Qi ZC,Cai XT,Cao P,Huang Y,Wang SZ,etal.The Apoptotic Effects of Toosendanin Are Partially Mediated by Activation of Deoxycytidine Kinase in HL-60 Cells.PLOS ONE 2012；7(12):1-8.)。研究已证实川楝素具有多种独特的生物效应和在科学研究、临床医学及农业上的应用价值(施玉樑，王文萍.驱蛔中药的活性成分川楝素的生物效应.生理学报.)。川楝素因来源广(川楝子、川楝树、苦楝树等)且生物效应多样,尤其是在人类对恶性肿瘤无法攻克的时候,川楝素可作为新型抗肿瘤药物的候选者之一，具有广阔的发展前景(王小娟，刘妍如，肖炳坤，杨建云，杨雁，黄荣清.川楝素抗肿瘤作用机制研究进展.科学技术与工程.)。恶性肿瘤是细胞无限增殖的结果，抑制肿瘤细胞生长和促进肿瘤细胞凋亡是治疗癌症的有效手段(蔡锦威，汤海标，邵喜英，金洪传，毛伟敏，王晓稼.川楝素对乳腺癌细胞的生长抑制作用.中国肿瘤.)。近年来研究证实，川楝素可诱导多种肿瘤细胞发生凋亡，如乳腺癌(蔡锦威，汤海标，邵喜英，金洪传，毛伟敏，王晓稼.川楝素对乳腺癌细胞的生长抑制作用.中国肿瘤.)、肝癌(He YJ,Wang J,Liu XL,Zhang L,Yi G,Li CW.Toosendanin inhibits hepatocellular carcinoma cells by inducing mitochondria dependent apoptosis.Planta Med 2010；76(13):1447-1453.)、白血病(Ju JM,Qi ZC,Cai XT,Cao P,Liu N,Wang SZ.Toosendanin induces apoptosisthrough suppression of JNK signaling pathway in HL-60cells.Toxicology in Vitro 2013；27(1):232-238.)等。进一步研究发现，川楝素可能通过引起S期阻滞诱导乳腺癌细胞凋亡。这与本研究得到的结果相类似。此外，川楝素对人肝癌细胞和白血病细胞均具有明显的抑制作用。另有报道，在淋巴瘤U937细胞中，川楝素可能通过将细胞阻滞于G0/G1和S期诱导细胞凋亡 (Zhang B,Wang ZF,Tang MZ,Shi YL.Growth inhibition and apoptosis-induced effect on human cancer cells of toosendanin,a triterpenoid derivative from Chinese traditional medicine.National Business Media 2005；23(6):547-553.)。以上研究表明，川楝素为潜在的抗肿瘤药物且效果显著。但对肺癌细胞的作用机制尚不明确。为此，本研究以人肺癌A549细胞为研究对象，对其细胞凋亡机制进行了探索。

细胞凋亡机制对保持自身平衡十分重要，肿瘤的生长速率很难控制，这与凋亡能力的减弱和增殖能力的提升密切相关(邵淑丽，刘锐，隋文静，赵彬，张伟伟，杨希婷，等.大蒜素诱导结肠癌HT-29细胞凋亡.基因组学与应用生物学.)。细胞凋亡途径主要有三条：线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径。其中线粒体途径和死亡受体途径为诱导哺乳动物细胞凋亡的主要途径(HajraKM,Liu JR.Apoptosome dysfunction in humancancer.Apoptosis2004；9(6):691-704.)。在细胞凋亡的早期,线粒体结构会发生一些显著变化。一方面,线粒体的外膜通透性会增加,一些可溶性蛋白从膜间隙释放到胞浆；另一方面，线粒体跨膜电位会降低(邵淑丽，李怀永，孙宏岩，张伟伟，李爽.莪术油对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响.中国细胞生物学学报.)；Caspase-8主要参与的是死亡受体介导的细胞凋亡途径，它通过与死亡受体Fas蛋白相互作用从而自我活化,启动Caspase级联反应,激活下游Caspase-3等，诱导细胞发生凋亡(KroemerG,ReedJC.Mitochondrialcontrolofcelldeath.NatMed2000；6(5):513-519.)。

细胞凋亡程序是一个复杂的、涉及多基因的过程。目前发现了很多参与细胞凋亡的因子，如Fas和FasL、Bcl-2家族(bax、bad、bak等)、Caspase家族(Caspase3、Caspase8、Caspase10等)、Cycs等，它们中有抑制细胞凋亡的和促进细胞凋亡的，其功能和机制还有待进一步研究。Bcl-2家族蛋白在线粒体介导的细胞凋亡途径中起作用。在细胞凋亡过程中，线粒体是调控细胞凋亡的中心，而细胞色素C(Cycs)从线粒体的释放则起着关键性作用。细胞色素C释放到胞质后可激活Caspase，从而引发级联反应，导致细胞凋亡(王艳杰，邓雯，张鹏飞.细胞色素C与细胞凋亡研究进展.动物医学进展.)。张卫东等(张卫东,赵惠儒,阎影,王晓华,宗志红,刘莹.斑蝥素诱导人肺癌A549细胞凋亡及其分子机制的研究.中华肿瘤杂志.)研究发现斑蝥素能够通过抑制Bcl-2等基因的表达诱导肺癌A549细胞凋亡；杨玥等(杨玥，易娟，陈静，魏虎来，李红玲.纳米雄黄对肺癌A549细胞的凋亡诱导作用.亚太传统医药.)研究发现纳米雄黄可以通过上调Caspase3等基因表达诱导肺癌A549细胞发生凋亡。

发明内容

目前，治疗肝癌的有效方法多以化疗、放疗为主，但其毒副作用较大。因此，研制和开发新型高效低毒的抗癌药物已经成为治疗和攻克癌症的新希望。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：

川楝素在制备抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡药物中的应用，具体涉及川楝素在制备通过上调Bax、Fas、Cycs和Caspase3基因，下调Bcl-2基因进而抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡的药物中的应用。

在本发明中，优选的，所述肺癌细胞为人肺癌A549细胞。

在本发明中，优选的，所述川楝素在制备抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡药物中应用的有效浓度为10～70μmol/L。

在本发明中，优选的，所述川楝素在制备抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡药物中应用的有效浓度为40μmol/L。

本发明的技术方案为采用不同浓度的川楝素作用A549细胞48h后，MTT法检测细胞活性；光学显微镜、荧光显微镜下观察细胞形态结构；流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位(ΔΨm)和细胞周期；Real Time RT-PCR和Western blot分别检测Bax、Bcl-2、Fas、Cycs(细胞色素C)和Caspase3基因mRNA和蛋白表达水平。

本发明旨在探讨川楝素诱导人肺癌A549细胞凋亡作用及其作用机制。本发明研究结果显示，川楝素能够通过上调Bax、Fas、Cycs、Caspase3基因，下调Bcl-2基因诱导肺癌A549细胞凋亡和抑制细胞增殖。川楝素可能通过线粒体途径和死亡受体途径双重机制介导诱导肺癌A549细胞凋亡。

1.细胞培养和药物配制

A549细胞培养液为含10％的胎牛血清、100mg/L链霉素和1×10⁵U/L青霉素的完全培养液，培养箱环境为37℃、5％CO₂、饱和湿度。川楝素先用DMSO溶解，然后再用完全培养基稀释，用其做后续实验。

2.川楝素对细胞增殖能力的影响

用不同浓度川楝素(10～70μmol/L)分别处理A549细胞24,48,72h后，用酶标仪在570nm波长下测定吸光度值(OD)，并计算出细胞增殖抑制率和IC50值。经测定，川楝素在浓度为10～70μmol/L之间对A549细胞生长具有显著的抑制作用且呈剂量 和时间依赖关系。川楝素作用A549细胞48h的最佳药物浓度为40μmol/L，IC50值为40.206μmol/L。

3.细胞形态观察 

取对数生长期的A549细胞，分别加入终浓度为0,20,40,60μmol/L的川楝素培养48h后，光学显微镜下观察细胞形态结构并拍照。将原有培养基倒掉，加入1mL预冷的PBS和用200μL吖啶橙(0.5μg/μL)在室温条件下孵育3～5min，荧光显微镜下观察细胞形态结构并拍照。形态学观察发现川楝素作用后的细胞呈明显凋亡状态，出现细胞周期阻滞现象。

4.川楝素对肺癌A549细胞凋亡的作用

不同浓度川楝素(0,20,40,60μmol/L)处理A549细胞48h后，AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率及统计分析。川楝素能够诱导肺癌A549细胞凋亡，且随着药物浓度的不断增大早期凋亡细胞百分比呈现先增加后减少的趋势。其中，20μmol/L和40μmol/L川楝素作用48h时变化最显著。早期凋亡细胞百分比分别为(10.34±0.35)％和(13.18±0.41)％(P<0.05)，且40μmol/L时达到最大值。

5.川楝素对肺癌A549细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的作用

不同浓度川楝素(0,20,40,60μmol/L)处理A549细胞48h后，流式细胞仪检测川楝素对A549细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的影响及统计分析。对照组细胞线粒体膜电位为255.66±13.17，各加药组细胞经川楝素作用48h后线粒体膜电位显著降低，分别为186.32±10.27、143.33±12.54和112.87±8.39(P<0.01)。

6.川楝素对肺癌A549细胞周期的作用

不同浓度川楝素(0,20,40,60μmol/L)处理A549细胞48h后，流式细胞仪检测细胞周期的变化及统计分析。对照组的A549细胞大多分布于G1期，少数分布于S期，G2期最少。用不同药物浓度处理细胞48h后，G1期细胞含量先降低后升高。而G2期和S期细胞含量先升高后降低，且在40μmol/L处均达到最大值。其中，在20μmol/L和40μmol/L处，G2期和S期细胞变化显著。

7.川楝素对A549细胞凋亡相关基因mRNA表达水平的影响

A549细胞经0,20,40,60μmol/L的川楝素作用48h后提取总RNA，应用实时荧光定量PCR仪自带的分析软件测得相应的Ct值,再采用power(2^-Δ(ΔCt))法计算出各实验组细胞的Bax、Bcl-2、Fas、cycs和caspase3mRNA的表达量。与对照组相比，川楝素作用A549细胞48h后Bax、Fas、cycs和caspase3基因表达显著上调，Bcl-2基因表达 显著下调，其中Bax和Cycs基因的变化最显著。差异具有统计学意义(P<0.05)。

8.川楝素对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

A549细胞经0,20,40,60μmol/L的川楝素作用48h后，提取A549细胞全蛋白，Western blot检测蛋白表达水平。不同药物浓度的川楝素处理48h后可使A549细胞中Bax、Fas、cycs和caspase3蛋白表达水平显著上调，Bcl-2蛋白表达水平显著下调，其中Bax和Cycs蛋白的变化最显著。差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述实验数据统计学分析

数据经SPSS16.0软件分析处理后，进行单因素方差分析(One-way ANOVA),组间比较用LSD法检测其差异性，数据以均数±标准差表示，以P<0.05和P<0.01为差异有统计学意义。

通过以上实验结果，可得出如下结论：

(1)在10～70μmol/L浓度范围内，川楝素能抑制A549细胞增殖，诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖性。川楝素作用48h的最佳药物浓度是40μmol/L，增殖抑制率为(46.73％±1.47％)，细胞凋亡率为(13.18％±0.41％)。

(2)川楝素能够使Bax,Fas,Cycs和Caspase3基因的表达上调和Bcl-2基因的表达下调。其中，其中Bax和Cycs蛋白的变化最显著。可以推断出紫檀芪可能通过线粒体途径和死亡受体途径双重机制介导诱导肺癌A549细胞凋亡。

川楝素能够通过上调Bax、Fas、Cycs、Caspase3基因，下调Bcl-2基因诱导肺癌A549细胞凋亡和抑制细胞增殖。且因川楝素具有低毒环保的特性，可以考虑用来作为化疗辅助药物，从而为改善肺癌等癌症的临床治疗方法提供新依据。

附图说明

图1为川楝素对A549细胞增殖能力的影响图；

图2为光学显微镜下川楝素作用A549细胞48h的细胞形态图(100×)，其中，A:对照，B:20μmol/L川楝素，C:40μmol/L川楝素，D:60μmol/L川楝素；

图3为荧光显微镜下川楝素作用A549细胞48h的细胞形态图(100×)，其中，A:对照，B:20μmol/L川楝素，C:40μmol/L川楝素，D:60μmol/L川楝素；

图4为Annexin V-FITC/PI双染检测川楝素作用A549细胞48h的凋亡结果图，其中，A:对照；B:20μmol/L川楝素；C:40μmol/L川楝素；D:60μmol/L川楝素；

图5为川楝素作用A549细胞48h的线粒体膜电位变化图，其中，A:对照； B:20μmol/L川楝素；C:40μmol/L川楝素；D:60μmol/L川楝素；

图6为川楝素对A549细胞周期的影响图，其中，A:对照；B:20μmol/L川楝素；C:40μmol/L川楝素；D:60μmol/L川楝素；

图7为各组A549细胞的细胞周期分布柱状图，其中，*P<0.05,**P<0.01,与对照组比较；^▲P<0.05各组间比较；

图8为RT-PCR检测川楝素作用后Bax、Bcl-2、Fas、cycs和caspase3mRNA水平的变化图，其中，*P<0.05,与对照组比较；^▲P<0.05,各组间比较；

图9为Western blot检测川楝素作用后Bax、Bcl-2、Fas、cycs、caspase3和β-actin蛋白水平的变化图，其中，A:对照；B:20μmol/L川楝素；C:40μmol/L川楝素；D:60μmol/L川楝素；

图10为Western blot检测川楝素作用后Bax、Bcl-2、Fas、cycs、caspase3和β-actin蛋白水平的变化图，其中，*P<0.05,与对照组比较；^▲P<0.05,各组间比较。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

试验例1

1材料与方法 

1.1材料

1.1.1细胞和抗体 

人肺癌A549细胞购自于北京肿瘤生物学检测中心。Bax、Bcl-2、Fas、Cycs、Caspase3和β-actin一抗购自生工生物工程(上海)有限责任公司；二抗购自上海宝曼生物科技有限公司。

1.1.2主要试剂

川楝素购自南通飞宇生物科技有限公司。罗丹明123(Rho123)购自Sigma公司。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒、PI染液、线粒体膜电位检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。RPMI-1640培养基购自Gibco公司。胎牛血清、二甲基亚砜、总RNA提取试剂盒、全蛋白提取试剂盒均购自生工生物工程(上海)有限责任公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养

配制含10％的胎牛血清、100mg/L链霉素和1×10⁵U/L青霉素的完全培养液于37℃、饱和湿度、含5％CO₂的培养箱中进行培养。

1.2.2细胞增殖能力检测

取对数生长期的A549细胞，加入终浓度为0,10,20,30,40,50,60,70μmol/L的川楝素，分别培养24,48和72h。用酶标仪在570nm波长下测定吸光度值(OD)，然后按公式：细胞生长抑制率＝(实验组平均OD值–空白组平均OD值)/(对照组平均OD值–空白组平均OD值)×100％，计算出细胞生长抑制率并通过软件计算获得IC50值。

1.2.3川楝素对细胞形态的影响

取对数生长期的A549细胞，分别加入终浓度为0,20,40,60μmol/L的川楝素作用48h后，光学显微镜下观察细胞形态结构并拍照。将原有培养基倒掉，加入1mL预冷的PBS和200μL吖啶橙(0.5μg/μL)混匀后，室温孵育3～5min，荧光显微镜下观察细胞形态结构并拍照。

1.2.4细胞凋亡率的检测

用胰酶消化收集经0,20,40,60μmol/L的川楝素作用48h的A549细胞，加入预冷的PBS洗涤细胞2次，向悬液中加入500μL Binding Buffer充分混匀后，再加入5μL Annexin V-FITC染液和5μL Propidium lodide(PI)染液，室温下避光孵育15min后进行流式细胞仪的上机检测。

1.2.5细胞线粒体跨膜电位的检测

用胰酶消化收集经0,20,40,60μmol/L的川楝素作用48h的A549细胞，加入预冷的PBS洗涤细胞2次，向悬液中加入稀释好的罗丹明12310μL，37℃培养箱中避光孵育30min，再用预冷的PBS洗涤细胞2次后悬浮细胞，最后用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化。

1.2.6流式细胞术检测细胞周期的变化

用胰酶消化收集，经0,20,40,60μmol/L的川楝素作用48h的A549细胞。用10mMPBS洗涤细胞两次，弃去上清，向其中按1:3的比例加入PBS和无水乙醇，充分混匀，于4℃固定18h后，离心收集细胞，用预冷的PBS洗涤细胞2次，向悬液中加入500μLPI染液，再加入RNaseA(使其终浓度为0.25mg/mL)，于37℃避 光孵育30min后，进行流式细胞仪的上机检测。

1.2.7实时定量PCR检测

A549细胞经0,20,40,60μmol/L的川楝素作用48h后提取总RNA，并反转录成cDNA。反应体系为25μLHotstart Fluo-PCR mix，21μL ddH₂O，2μL cDNA和上下游引物各1μL(用Primer 5.0进行引物设计)。Bax基因上游引物序列为：5′-aagctgagcgagtgtctcaag-3′，下游引物序列为：5′-caaagtaga aaagggcgacaac-3′，扩增产物大小为178bp。Bcl-2基因上游引物序列为：5′-atgtgtgtggagagcgtcaac-3′，下游引物序列为：5′-agcagccaggagaaatcaaac-3′，扩增产物大小为180bp。Fas基因上游引物序列为：5′-tgatgtggaacacagcaagg-3′，下游引物序列为：5′-ggctgtggtgactcttagtgataa-3′，扩增产物大小为107bp。Cycs基因上游引物序列为：5′-ctgggtgacgagtgaaactg-3′，下游引物序列为：5′-tgagcacaacaggaactgga-3′，扩增产物大小为104bp。Caspase3基因上游引物序列为：5′-ggaacgaacggacctgtg-3′，下游引物序列为：5′-gcctccactggtatcttctg-3′，扩增产物大小为135bp。β-actin基因上游引物序列为：5′-agcgagcatccccca aagtt-3′，下游引物序列为：5′-gggcacgaaggctcatcatt-3′，扩增产物大小为205bp。其中β-actin为内参。实验设3次重复，应用实时荧光定量PCR仪自带的分析软件测得相应的Ct值,再采用power(2^-Δ(ΔCt))法计算出各实验组细胞的Bax、Bcl-2、Fas、cycs和caspase3mRNA的表达量。

1.2.8Western Blot检测

A549细胞经0,20,40,60μmol/L的川楝素作用48h后，提取全蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳。然后将蛋白经恒流电转移到PVDF膜上，封闭液封闭1h后，加入稀释好的Bax、Bcl-2、Fas、cycs、caspase3和β-actin一抗(1:500)，4℃恒温摇床孵育过夜。PBST洗膜，二抗IgG(1:15000)，4℃避光孵育1h，再用PBST洗膜后，进行上机扫描检测。

1.3统计学分析 

数据经SPSS16.0软件分析处理后，进行单因素方差分析(One-way ANOVA),组间比较用LSD法检测其差异性，数据以均数±标准差表示，以P<0.05和P<0.01为差异有统计学意义。

2结果

2.1A549细胞增殖能力的检测

川楝素在浓度为10～70μmol/L之间对A549细胞生长具有显著的抑制作用且呈 剂量和时间依赖关系(图1)。川楝素作用A549细胞48h的最佳药物浓度为40μmol/L，IC50值为40.206μmol/L。

2.2川楝素对A549细胞形态结构的影响

2.2.1光学显微镜下观察细胞形态变化

对照组细胞呈梭形且大小均匀，贴壁生长；各加药组细胞随着药物浓度的增大，细胞形态逐渐发生改变，部分细胞变圆，体积变小，出现凋亡小体和小泡，呈现凋亡特征(图2)。

2.2.2荧光显微镜下观察细胞形态结构变化

对照组细胞数量较多且结构清晰，经吖啶橙染色后，核呈圆形，核仁显现橘黄色荧光且细胞质均匀；随着药物浓度的增大，细胞数量逐渐减少，体积明显缩小，部分细胞出现明显的凋亡小体(图3)。

2.3川楝素对A549细胞凋亡的影响

川楝素对A549细胞凋亡的影响结果见图4和表1，结果显示，川楝素能够诱导肺癌A549细胞凋亡，且随着药物浓度的不断增大早期凋亡细胞百分比呈现先增加后减少的趋势。其中，20μmol/L和40μmol/L川楝素作用48h时变化最显著。早期凋亡细胞百分比分别为(10.34±0.35)％和(13.18±0.41)％(P<0.05)，且40μmol/L时达到最大值。

表1流式细胞术检测川楝素诱导A549细胞48h后的细胞凋亡率

注:*P<0.05,与对照组比较；^▲P<0.05，各组间比较。

2.4川楝素对A549细胞的线粒体膜电位(ΔΨm)影响

川楝素对A549细胞的线粒体膜电位(ΔΨm)影响结果见图5和表2，结果显示，对照组细胞线粒体膜电位为255.66±13.17，各加药组细胞经川楝素作用48h后线粒体膜电位显著降低，分别为186.32±10.27、143.33±12.54和112.87±8.39(P<0.01)。

表2川楝素作用A549细胞48h的线粒体膜电位(ΔΨm)变化(n＝3)

注:**P<0.01,与对照组比较；^▲▲P<0.01，各组间比较。

2.5川楝素对A549细胞周期的影响

川楝素对A549细胞周期的影响结果见图6和图7，结果显示，对照组的A549细胞大多分布于G1期，少数分布于S期，G2期最少。用不同药物浓度处理细胞48h后，G1期细胞含量先降低后升高。而G2期和S期细胞含量先升高后降低，且在40μmol/L处均达到最大值。其中，在20μmol/L和40μmol/L处，G2期和S期细胞变化显著。

2.6川楝素对A549细胞凋亡相关基因mRNA表达水平的影响

川楝素对A549细胞凋亡相关基因mRNA表达水平的影响结果见图8，结果显示，与对照组相比，川楝素作用A549细胞48h后Bax、Fas、cycs和caspase3基因表达显著上调，Bcl-2基因表达显著下调，其中Bax和Cycs基因的变化最显著。差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.7川楝素对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响

川楝素对A549细胞凋亡相关蛋白表达的影响结果见图9和图10，结果显示，不同药物浓度的川楝素处理48h后可使A549细胞中Bax、Fas、cycs和caspase3蛋白表达水平显著上调，Bcl-2蛋白表达水平显著下调，其中Bax和Cycs蛋白的变化最显著。差异具有统计学意义(P<0.05)。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.川楝素在制备抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌凋亡是通过上调Bax、Fas、Cycs、Caspase3基因，下调Bcl-2基因而达到抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡的目的。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肺癌细胞为人肺癌A549细胞。

4.根据权利要求1所述的的应用，其特征在于，所述川楝素在制备抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡药物中应用的有效浓度为10～70μmol/L。

5.根据权利要求4所述的的应用，其特征在于，所述川楝素在制备抑制肺癌细胞增殖和诱导肺癌细胞凋亡药物中应用的有效浓度为40μmol/L。