CN1476829A - 川楝素作为抗肿瘤药物的应用 - Google Patents

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施玉�
施玉樑
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Abstract

本发明涉及川楝素在制备抗肿瘤药物领域中的新用途。从川楝韧皮中分离、纯化的川楝素可引起多种来源于人癌的细胞系细胞死亡，半数有效浓度(EC50)均小于1×10－7g/ml(约170nM)，对原髓细胞白血病细胞(HL－60)和组织细胞淋巴瘤细胞(U937)的致死作用最强，EC50在10－9g/ml量级；和已用于临床的治疗肿瘤的药物VP－16进行的比较表明，在相同浓度下，川楝素对U937细胞的作用比VP－16强。川楝素及其具有上述相似作用的衍生物，是能够有效杀死肿瘤细胞的一类化合物，可应用于制备临床治疗肿瘤的药物中。

Description

川楝素作为抗肿瘤药物的应用
技术领域
本发明涉及一种从楝属植物川楝中提取的三萜化合物—川楝素的用途，特别涉及其在制备抗肿瘤药物领域中的应用。
背景技术
川楝素(toosendanin，chuanliansu)是从植物川楝(Melia toosendan Sieb et Zucc)的韧皮分离、纯化的三萜化合物，它可通过氯仿萃取和湿碳吸附两种方法提取，再经乙醇重结晶后得到纯品(四川中药研究所：川楝素生产全过程技术资料，1971)。化学学报的论文(33：35-47，1975；38：196-198，1981)对川楝素的化学结构和理化性质进行了详细的描述。川楝素的分子式为C30H38O11，结构式如下：
在医药和农药领域，楝属植物果实和韧皮及其提取物川楝素已用于制备治疗蛔虫等消化道寄生虫病的药物和杀灭农业害虫的药物。
恶性肿瘤是发病和死亡率居高不下，危害人类健康最严重的疾病之一。发展防治肿瘤药物将造福于人类，具有重要意义。我们先前的研究发现，川楝素在一定浓度范围具有促进神经瘤PC12细胞分化和诱导细胞凋亡的作用(申请号：02111566.4)。肿瘤细胞的重要特征是不能进行正常的分化，启动正常的凋亡过程，因此，能够诱导肿瘤细胞停止恶性增殖，进入分化和凋亡程序，直至死亡的药物有可能用在制备抗肿瘤药物中而应用于临床。由我固学者发现的三氧化二砷(As2O3)就是一成功例子，现已应用于临床治疗白血病，并取得了疗效(Blood，87：3404-3409，1996；Blood，89：3354-3360，1997)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种川楝素的新用途，即川楝素在制备抗肿瘤药物中的新应用。
实际上，本发明涉及川楝素在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述的抗肿瘤药物为抗肝癌药物，抗前列腺癌药物，抗中枢神经系统肿瘤药物，抗白血病药物，抗淋巴瘤药物，抗肺癌药物或抗乳腺癌药物。
附图说明
以下是本发明的附图说明，通过附图说明并结合具体实施例，可以更清楚地理解本发明，其中：
图1为用MTT法检测的川楝素作用后人的6种肿瘤细胞存活率和川楝素浓度的关系图(横坐标代表川楝素浓度，纵坐标代表细胞存活率)。
图2为用磺酰罗丹明B蛋白染色法检测的川楝素作用72小时后人的两种肿瘤细胞，肺癌A-549细胞(●)和乳腺癌MDA-MB-468细胞(■)存活率与药物浓度的关系图(横坐标代表川楝素浓度，纵坐标代表细胞存活率)。
图3为用MTT法检测的川楝素作用不同时间后人的一种组织细胞淋巴瘤细胞，U937细胞存活率和药物浓度的关系曲线(横坐标代表药物浓度，纵坐标代表细胞存活率)。
图4为用MTT法检测的川楝素(●)或VP-16(■)作用48小时后人的一种组织细胞淋巴瘤细胞，U937细胞存活率和药物浓度的关系图(横坐标代表药物浓度，纵坐标代表细胞存活率)。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面将利用8种来源于人的肿瘤细胞系(均购自中国科学院上海细胞库)，包括前列腺癌(PC3)、肝癌(BEL7404)、中枢神经系统肿瘤(SH-SY5Y和U251)、原髓细胞白血病细胞(HL-60)、组织细胞淋巴瘤(U937)、肺癌(A-549)和乳腺癌(MDA-MB-468)，通过四唑蓝快速比色法(MTT法)(张胜本，张连阳主编，《肿瘤化学治疗敏感性与抗药性》，四川科学技术出版社，第一版，成都，1995)或磺酰罗丹明B蛋白染色法(J.Natl.Cancer Inst.，82：1113，1990；J.Natl.Cancer Inst.，82：1107，1990；J.Natl.Cancer Inst.，83：757，1991)测定细胞的存活率，证明川楝素可浓度依赖地引起8种人肿瘤细胞系细胞死亡。
实验方法如下：
1.MTT法是利用活细胞内线粒体脱氢酶能将四甲基偶氮唑蓝转化为蓝紫色衍生物甲替(月旁加替)的原理来检测活细胞数目。产物甲替(月旁加替)颜色深浅(以吸光度A值表示)与活细胞数成正比，吸光度值(A)可以在自动酶标读数仪上记数(方法见张胜本，张连阳主编，《肿瘤化学治疗敏感性与抗药性》，四川科学技术出版社，第一版，成都，1995)。
药物处理后细胞存活率计算按下述公式：
细胞存活率＝加药组吸光度值/对照组吸光度值
药物的半数有效浓度(EC50)用Graphpad Prism软件(3.0版)拟合药物作用的量效曲线。
2.磺酰罗丹明B蛋白染色法是利用磺酰罗丹明B是一种蛋白结合染料，可与生物大分子中的碱性氨基酸结合，其在515nm的吸光度读数与细胞数呈良好的线性关系的原理来检测药物对肿瘤细胞生长的抑制。是大规模筛选抗肿瘤药物常用的方法之一。文献J.Natl.Cancer Inst.，82：1113，1990；J.Natl.Cancer Inst.，82：1107，1990；J.Natl.CancerInst.，83：757，1991，对该技术有详尽的叙述。
实验结果和实施例如下：
将传代的细胞于培养液中做增殖培养。PC3的培养液为HAM-F12，另加10％小牛血清和200mg/L L-谷氨酰胺；其余细胞的培养液为RPMI1640，另加10％小牛血清和200mg/L L-谷氨酰胺，pH均为7.4。细胞培养在37℃，95％空气+5％CO2的恒温培养箱中，每周传代2-3次，于培养不同时间(3-5天)后，检测细胞的存活率作为对照组。观察川楝素引起细胞死亡的实验组亦在同样条件下培养，但于培养液中加入不同浓度的川楝素，亦于培养后不同时间，检测细胞的存活率，并与对照组数据比较。使用的川楝素是经两次乙醇重结晶的纯品，含量大于98％。获得的结果是：
1.PC3、BEL7404、SH-SY5Y、U251、HL-60和U937细胞经含川楝素(10-10-10-4g/ml)的培养液培养3-5天后，观察到川楝素浓度依赖地引起肿瘤细胞死亡，具体结果请参见图1所示。图1为用MTT法检测的川楝素作用后人的6种肿瘤细胞存活率和川楝素浓度的关系图(横坐标代表川楝素浓度，纵坐标代表细胞存活率)。其中：
BEL7404细胞，一种肝癌细胞，川楝素作用4天；
PC3细胞，一种前列腺癌细胞，川楝素作用5天；
SH-SY5Y细胞，一种中枢神经系统肿瘤细胞，川楝素作用4天；
U251细胞，一种中枢神经系统肿瘤细胞，川楝素作用4天；
HL-60细胞，一种原髓细胞白血病细胞，川楝素作用4天；
U937细胞，一种组织细胞淋巴瘤细胞，川楝素作用3天；
结果为3-4次独立实验的平均值(每次实验平行设置4-5个孔)，数据以均值±标准差表示。
其中，半数有效浓度(EC50)均小于1×10-7g/ml(约170nM)，其中HL-60和U937两种细胞系对川楝素的敏感性最高，其EC50值分别为3.5×10-9g/ml和3.1×10-9g/ml，请见表1。
       表1.川楝素导致人癌细胞死亡的半数有效浓度(EC50)
细胞系     来源       川楝素孵育时间(天)    EC50(g/ml)
PC3        前列腺            5              6.9×10-8
BEL7404    肝                4              1.5×10-8
SH-SY5Y    CNS               4              8.5×10-8
U251       CNS               4              1.9×10-8
HL-60      液                4              3.5×10-9
U937       血液              3              3.1×10-9
2.A-549细胞和MDA-MB-468细胞经含川楝素(10-8-10-4mol/L)的培养液培养3天后，川楝素强效抑制肿瘤细胞生长，结果参见图2所示。图2表示用磺酰罗丹明B蛋白染色法检测的川楝素作用72小时后人的两种肿瘤细胞，肺癌A-549细胞(●)和乳腺癌MDA-MB-468细胞(■)存活率与药物浓度的关系图(横坐标代表川楝素浓度，纵坐标代表细胞存活率)。结果为3次独立实验的平均值(每次实验平行设置3个孔)，数据以均值±标准差表示。
3.U937细胞经含川楝素(10-10-10-5g/ml)的培养液培养24-72小时后，发现川楝素时间和浓度依赖地引起细胞死亡，结果参见图3所示。图3表示用MTT法检测的川楝素作用不同时间后人的一种组织淋巴瘤细胞，U937细胞存活率和药物浓度的关系曲线(横坐标代表药物浓度，纵坐标代表细胞存活率)。24小时(●)，36小时(■)，48小时()和72小时(◆)。结果为3-4次独立实验的平均值(每次实验平行设置4-5个孔)，数据以均值±标准差表示。
4.U937细胞经含川楝素(10-10-10-5g/ml)和临床用抗癌药VP-16(10-10-10-5g/ml)的培养液培养48小时后，发现：在相同浓度下，川楝素杀伤U937细胞的作用强于VP-16，其结果参见图4所示。图4表示用MTT法检测的川楝素或VP-16(中文名：足叶乙甙；化学名：4’-去甲基表鬼臼毒素-β-D-乙叉吡喃葡萄糖甙；英文名：etoposide)作用48小时后人的一种组织细胞淋巴瘤细胞，U937细胞存活率和药物浓度的关系图。该图表明川楝素的作用强于VP-16(横坐标代表药物浓度，纵坐标代表细胞存活率)。川楝素(●)，VP-16(■)。结果为3-4次独立实验的平均值(每次实验平行设置4-5个孔)，数据以均值±标准差表示。
这些结果清楚地表明，川楝素可引起体外培养的人肿瘤细胞系死亡，作用有浓度和时间依赖性，其中来源于血细胞的HL-60和U937两种细胞系最敏感。川楝素是由植物分离的天然化合物，中药有效成份，已用于临床做驱蛔药，毒性低(小鼠皮下注射半数致死量为15毫克/公斤体重)；药源丰富，成本低廉；在极低浓度下(10-7-10-9克/毫升)即能有效地杀死人的多种肿瘤细胞，作用较已用于临床的抗癌药VP-16更强。

Claims (2)

1.川楝素在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物为抗肝癌药物，抗前列腺癌药物，抗中枢神经系统肿瘤药物，抗白血病药物，抗淋巴瘤药物，抗肺癌药物或抗乳腺癌药物。
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