CN1452967A - 千金藤素在制备抗sars病毒药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用，是以千金藤素为有效成分制备抗SARS病毒药物，在安全剂量范围内，对SARS病毒的抑制率高；强的预防SARS病毒感染的作用；愈后快，可以减轻感染病人的综合症状；药物毒性小，稳定性好，耐药性强。

Description

千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体地是千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用。
背景技术
自正式确定非典型肺炎的病原体为SARS冠状病毒以来，对于非典型肺炎及其病原体的防治和研究取得了极大进展，抗SARS冠状病毒药物和疫苗研制工作也在全力进行。SARS病毒是一种新型的冠状病毒，具有较强的传染性和变异性。目前SARS还缺乏特效的治疗，目前的治疗包括抗病毒治疗如利巴韦林，血清疗法等，用激素降低免疫系统对肺的损伤，用抗生素治疗潜在的细菌感染，辨证的中西医结合治疗；呼吸机的应用以及应激和ARDS的对症支持治疗等。抗SARS药物研制目前尚处于初期阶段。国内外多家实验室用各种方式在不同水平正进行着抗SARS病毒药物的筛选工作。国内军事医学科学院研制的ω干扰素作为一种辅助性治疗SARS药物已通过鉴定，中国科学院上海药物研究所以非典病毒E蛋白、N蛋白和(3CL)蛋白水解酶作药靶，初步筛选到可能有抗SARS病毒活性的药物19种，但是尚未见到有明确抗SARS病毒药物的体外细胞实验结果报道。千金藤素为米黄色粉末，经图谱(红外、紫外、核磁、质谱)分析结果证明符合分子式C37H38N2O6，分子量为606.686，用非水滴定法测定纯度达95％以上。本品易溶于氯仿、甲醇、乙醇，不溶于水。临床上主要用于防治肿瘤患者因放、化疗及其它原因所致的白细胞减少症，是从防己科千金藤属(Stephanialour)植物中提取分离出来的生物碱。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用。
本发明是以千金藤素为有效成分制备抗SARS病毒药物，可采用常规的制备工艺，制备成不同的药物剂型供患者使用，如制成口服液、胶囊、粉剂、针剂等。
药物注射液的用法与用量：通常成人，一次50mg，一日一次，(与250ml 5％葡萄糖液混匀后，也可不加葡萄糖。)缓缓静脉滴注。
以千金藤素为有效成分制备的抗SARS病毒药物作用如下：
1、药物对细胞的保护作用
以不同浓度药物加到长满单层用于体外培养SARS病毒的Vero-E6细胞株Vero-E6细胞的96孔板中，培养2h后弃药液，接种100TCID50的SARS-CoV病毒液，37℃吸附5％CO2培养48h，观察药物处理后的细胞对SARS-CoV感染的影响。同时做单用病毒感染时的病毒对照、正常细胞对照。结果显示：在Vero-E6细胞上的最大无毒浓度为10μg/mL。
表1是用MTS/PMS法测定药物对Vero-E6细胞的毒性剂量试验结果
表1
 千金藤素(μg/mL)                            OD值  存活率
    M+sd
    100.00   0.285   0.287   0.287   0.280   0.285+0.003   16％
    50.00   0.258   0.254   0.259   0.246   0.254+0.006   14％
    25.00   0.672   0.532   0.708   0.637   0.637+0.076   35％
    12.50   1.215   1.157   1.129   1.359   1.215+0.102   66％
    6.25   1.761   1.751   1.812   1.722   1.762+0.038   98％
    3.13   1.797   1.808   1.819   1.808   1.808+0.009   100％
    1.56   1.759   1.754   1.757   1.745   1.753+0.006   97％
    细胞对照   1.815   1.791   1.796   1.801   1.801+0.010   100％
根据CC50综合法求得CC50 21.38ug/mL，即千金藤素对Vero-E6细胞的半致死剂量为21.38ug/ml。
2、药物的抗SARS病毒作用
用细胞病变(CPE)法观察得千金藤素在不同情况下的效果。表2是不同剂量的千金藤素作用48h后，SARS-CoV感染的Vero-E6细胞病变情况
表2
  千金藤素(μg/mL) 预防作用 治疗作用     直接杀伤作用 综合作用
    0.5        ++++        ++++        ++++        ++++
    1        ++++        ++++        ++++        ++++
    2        ++++        ++++        ++++        ++++
    4        ++++        +++        +++        ++++
    6        +++        ++        +++        +++
    8        +++        +        ++        ++
    10        +        ----        ----        ----
    细胞对照        ----        ----        ----        ----
    病毒对照        ++++        ++++        ++++        ++++
注：“+”为CPE等级，0～25％为+、25％～50％为++、50％～75％为+++、75％～100％为++++结果显示：
(1)药物对SARS-CoV增殖的影响
接种100TCID50的SARS-CoV于长满单层Vero-E6细胞的96孔板上，37℃吸附2h，换上含相应浓度药物的维持液，继续培养48h，观察药物对SARS-CoV增殖的影响。结果显示：千金藤素对SARS-CoV的半抑制剂量为8ug/ml。
(2)药物对SARS-CoV的直接杀伤作用
含不同浓度药物的维持液与等量病毒液后，置37℃作用2h后，将孵育液加入长满单层Vero-E6细胞的96孔板中，0.1ml/孔，37℃吸附1h，换上含相应浓度药物的维持液，继续培养48h，观察药物对SARS-CoV的直接杀伤作用。结果显示：不同浓度药物与病毒等量混合2h后，在10μg/ml时对细胞感染SARS-CoV皆有全抑制作用。
(3)药物对SARS-CoV感染细胞的综合作用
药物和病毒等量混合后直接加到长满单层Vero-E6细胞的96孔板上37℃吸附2h，弃混合液加维持液，继续培养48h，观察药物对SARS-CoV感染细胞的综合作用。结果显示：千金藤素对SARS-CoV感染细胞的综合作用效果为：8ug/ml有抑制作用，浓度为10ug/ml时，对SARS-CoV病毒有100％的抑制效果。
(4)药物对病毒感染细胞的预防作用
不同浓度药物预先与细胞作用2h后，接种病毒，千金藤素在10μg/mL时可以66％抑制SARS病毒感染的Vero-E6细胞病变。
(5)药物对病毒感染细胞的治疗作用
千金藤素在10μg/ml时对细胞感染SARS-CoV有全部抑制作用。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、在安全剂量范围内，对SARS病毒的抑制率高。
2、有较强的预防SARS病毒感染的作用。
3、愈后快，可以减轻感染病人的综合症状。
4、药物毒性小，稳定性好，耐药性强。
附图说明
图1是Vero-E6正常细胞图；
图2是Vero-E6细胞被SARS-CoV感染后病变图；
图3是千金藤素药物对被SARS-CoV感染的Vero-E6细胞的保护效果图。
具体实施方式
如图1所示，正常Vero-E6细胞贴壁生长，具有贴壁细胞的一般特性，细胞之间空隙小。如图2所示，Vero-E6细胞被SARS-CoV感染后，细胞从壁上脱落，细胞碎裂。如图3所示，被SARS-CoV感染Vero-E6细胞加入千金藤素处理后，仅有部分细胞从壁上脱落，大部分细胞的形态与正常细胞相同。
实施例1
1、实验材料受试药物是千金藤素，实验时用生理盐水配成混悬液，供实验用。
2、实验动物  昆明种小鼠，体重(20±2)g；Wistar大鼠，体重(270±20)g；C57BL/6小鼠，体重(20±2)g。
3、经口灌胃给药的急、慢性毒性试验①对小鼠急性毒性(LD50)及最大耐受量测定试验：取预先空腹12h的动物30只，随机分为3组，每组10只，各剂量组间间距为0.85。将千金藤素分别配成浓度为(2.0，1.7，1.4％)，然后给动物0.4ml·10g-1体重，1次ig，最大剂量为800mg·kg-1，观察1周，所有动物一般情况良好，无任何毒性反应及死亡。在此基础上进行1天内最大耐受量试验；另取动物20只，雌雄各半，禁食(不禁水)12h，然后按上法给动物1天2.0％的浓度ig两次，总量达1600mg·kg-1，，相当于人用量1.0mg·kg-1的1000倍以上，仅有少数动物出现少动，停止饮水和进食，持续2～3h后，即恢复正常，无动物死亡。表明，千金藤素对昆明种小鼠ig途径给药的最大耐受剂量为1600mg·kg-1。②对大鼠的长期毒性实验：取大鼠60只，随机分为3组，每组20只，雌雄各半。(a)对照组：NS，20ml·kg-1，ig；(b)和(c)组为千金藤素组，剂量分别为40，80mg·kg-1，ig(相当于人用量的40，80倍)，每日1次，连用60d，ig；给药。在用药期间每日观察动物一般情况(活动、毛发、食量、大便等)，每10d称1次体重；在用药30d及60d时测定血象(白细胞总数及分类，血小板、红细胞、血色素)，肝肾功能，试验结束，处死各组部分动物，剖取主要脏器(心、肺、肝、脾、肾、肠、胃、睾丸、子宫)进行病理组织学检查。其结果为各组所有动物一般情况良好；大剂量组动物体重增长较慢，而对血象、肝肾功能及各主要脏器的病理组织学均无明显影响，与对照组相比，无差异。
实施例2
对人进行的临床试验，试验组用药，千金藤素注射液的用法与用量：一次50mg，一日一次，缓缓静脉滴注。对照组注射生理盐水，其病情状况如表3所示，治愈时间如表4所示：
            表3：病情状况
组别   n   减轻   稳定    加重     Ridit检验
试验组对照组   3028   192   816    3(0)10(2) P＜0.05
该表结果显示：试验组(即使用RD-01治疗组)的病人比对照组的病人在病情上有较大的减轻。
                 表4：治愈时间
组别   n   缩短     基本不变 延长     Ridit检验
试验组对照组   3028   213     710   217(2) P＜0.05
注：()号内的数字为死亡人数。该表结果显示：试验组(即使用RD-01治疗组)的病人在治疗时间比对照组有较大的缩短。

Claims (2)

1、一种千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用，是以千金藤素为有效成分制备抗SARS病毒药物。
2、根据权利要求1所述的千金藤素在制备抗SARS病毒药物中的应用，制备的药物剂型是口服液、胶囊、粉剂、或针剂。
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