CN114288297A - 千金藤素在制备抗流感病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了医药技术领域的千金藤素在制备抗流感病毒药物中的应用，尤其是甲型流感病毒，如：H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2和H10N8等流感病毒。本发明目的在于提供一种已经上市的白细胞增生药物千金藤素在作为制备抗流感病毒感染药物中的应用，本发明首次发现千金藤素具有抗流感病毒活性，能特异性地破坏流感病毒核糖核蛋白复合物vRNP活性，从而影响流感病毒的复制。千金藤素作为新的抗流感病毒药物和先导化合物，具有毒性低、活性高、价廉易得、机制明确的特点，可以在现有应用条件下发展新型抗流感病毒的药物，具有较好的应用前景。

Description

千金藤素在制备抗流感病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于涉及医药技术领域，具体涉及千金藤素在制备抗流感病毒药物中的应用。

背景技术

流感是威胁人类健康的重大传染性疾病之一，一直以来备受疾病防治领域人员的关注，但是由于流感病毒的抗原具有易转变和漂移的特点，流感的防治形势不容乐观，其中甲型流感病毒因其传染性强、变异速度快、发病率和死亡率高的特点，已经成为严重威胁人类健康和社会安定的病毒之一。目前接种疫苗是预防流感病毒感染的主要手段，但疫苗的更新速度滞后于流感病毒的变异，这使得常规的季节性疫苗不能有效防治病毒。临床现有流感病毒也不断出现耐药，影响现有抗流感病毒药物的治疗效果，因此，开发新型的抗流感病毒药物迫在眉睫。

迄今为止，临床上使用的抗流感药物主要分为两类：M2离子通道抑制剂和神经氨酸酶抑制剂。M2离子通道抑制剂包括金刚烷胺和金刚乙胺，对甲型流感病毒有抗病毒活性，但是对乙型流感病毒无活性，由于甲型流感病毒对其有严重的耐药性，目前已不推荐作为流感的预防性用药使用。目前神经氨酸酶抑制剂是最常用的抗流感病毒的药物，能够特异性抑制甲型和乙型流行性感冒病毒的神经氨酸酶。近年来，也出现了一批针对新靶点的抗流感药物，如Xofluza和Favipiravir，但其远期效果还有待观察。因此，寻找新的抗流感药物对于流感的防治具有重要的意义，尤其是安全有效、简便易得的药物，在应对流感疫情方面极为重要。

甲型流感病毒属正粘科单股负链RNA病毒，由八个全基因组构成，至少编码13种以上蛋白，包括编码蛋白和非编码蛋白。由于甲型流感病毒的表面抗原易发生漂移和转变，人们将抗流感病毒药物的研究聚焦在可选位点多且不易突变的RNA聚合酶上。流感病毒核糖核蛋白复合物vRNP可作为潜在的药物靶点，从该靶点寻找新型抗流感病毒药物，可从源头上阻断病毒的复制。

千金藤素是从防己科植物头花千金藤、地不容中分离提取的双苄基异喹啉生物碱，具有抗肿瘤、抗疟疾、抑菌和调节免疫功能等作用。现代研究提示它还具有刺激网状内皮系统、活化造血组织和促进骨髓组织增生的功能，同时被认为是一种低毒有效的升白细胞药物，在临床上常用于防治肿瘤患者因放、化疗及其它原因所致的白细胞减少症。千金藤素可部分逆转白血病细胞多药耐药性，效果明显优于经典的逆转药维拉帕米，且逆转剂量的细胞毒作用远小于维拉帕米。国外研究也表明，千金藤素对多种耐药细胞均有较好的逆转作用，在体内对巨噬细胞的免疫功能活性也有增强作用；在日本，临床上千金藤素用作升白细胞药物己有多余年的历史，无明显的毒副作用；在国内，临床用于尘肺实验性治疗已多年。以上研究结果均提示千金藤素的临床使用价值很大，但千金藤素在抗流感病毒方面的应用尚未见报道。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供千金藤素在制备抗流感病毒药物中的应用，采取的技术方案为：

千金藤素的结构式如下：

千金藤素在制备抗流感病毒药物中的应用。

进一步地，所述流感病毒为甲型流感病毒；

优选地，所述甲型流感病毒为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2或H10N8。

进一步地，所述千金藤素作用于甲型流感病毒的复制前期而发挥抗病毒作用。

一种预防和/或治疗流感病毒的药物组合物，其活性成分包括千金藤素。

进一步地，所述流感病毒为甲型流感病毒；

优选地，所述甲型流感病毒为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2或H10N8；

优选地，所述药物组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂；

优选地，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

千金藤素在制备靶向抑制流感病毒核糖核蛋白复合物活性的药物中的应用。

一种靶向抑制流感病毒核糖核蛋白复合物活性的药物组合物，其活性成分包括千金藤素。

千金藤素在制备抑制流感病毒NP基因和/或PB2基因表达的药物中的应用；

优选地，千金藤素在制备抑制流感病毒NP基因和/或PB2基因mRNA表达的药物中的应用；

优选地，千金藤素在制备抑制流感病毒NP蛋白和/或PB2蛋白表达的药物中的应用。

一种抑制流感病毒NP基因和/或PB2基因表达的药物组合物，其活性成分包括千金藤素；

优选地，一种抑制流感病毒NP基因和/或PB2基因mRNA表达的药物组合物，其活性成分包括千金藤素；

优选地，一种抑制流感病毒NP蛋白和/或PB2蛋白表达的药物组合物，其活性成分包括千金藤素。

千金藤素在制备抑制流感病毒复制的药物中的应用。

本发明取得的有益效果为：

(1)本发明首次发现千金藤素具有抗流感病毒活性，尤其是抗甲型流感病毒，如：H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2和H10N8等流感病毒，千金藤素能特异性地破坏流感病毒核糖核蛋白复合物vRNP活性，影响流感病毒的复制，从而发挥明显的抗病毒活性，千金藤素进一步开发为抗流感病毒药物，具有广泛的应用前景。

(2)千金藤素能抑制流感病毒对细胞的感染，抑制其在宿主细胞中的复制，具有广谱的抗病毒活性，且千金藤素对细胞的毒性较小，实验结果表明：对MDCK细胞和A549细胞的CC₅₀分别是24.35±0.65μM、32.09±4.02μM。千金藤素对甲型流感病毒H1N1和H3N2的IC₅₀分为2.34±0.68μM，1.08±0.72μM，安全指数分别是10.41和22.54，可作为安全有效的抗流感病毒药物进行开发。

(3)千金藤素作为新的抗流感病毒药物和先导化合物，具有毒性低、活性高、价廉易得、机制明确的特点，可以在现有应用条件下发展新型抗流感病毒的药物，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为千金藤素细胞毒性的检测；(A)为千金藤素对A549细胞的毒性；(B)为千金藤素对MDCK细胞的毒性；

图2为千金藤素抗流感病毒的活性；(A)为千金藤素对不同甲型流感病毒株的抑制活性；(B)为千金藤抑制甲型流感病毒引起的细胞病变；(C)为千金藤抑制甲型流感病毒引起的空斑形成；

图3为千金藤素抑制流感病毒在细胞中的复制；(A)为千金藤抑制甲型流感病毒在A549细胞中NP和PB2蛋白的表达；(B)为千金藤素抑制甲型流感病毒在A549细胞中NP mRNA的表达；(C)为千金藤素降低甲型流感病毒在A549细胞中PB2 mRNA的表达水平；

图4为千金藤素抑制流感病毒的前期复制；

图5为千金藤素对流感病毒核糖核蛋白复合物vRNP的活性的影响。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

本发明所用的细胞、病毒和质粒如下：

犬肾上皮细胞(MDCK细胞)、人肺癌上皮细胞(A549)和293T细胞在含10％胎牛血清、100U/L青霉素、链霉素的DMEM或1640培养基进行培养。

甲型流感病毒A/PR/8/34(H1N1)、H1N1 FM-1和A/Aichi/2/68(H3N2)选择8-9天的鸡胚传代扩增，-80℃保存。

质粒pHW2K-PB1、pHW2K-PB2、pHW2K-PA、pHW2K-NP、pPolI-Flu和hRluc-TK用于mini-replicon试验，其中pHW2K-PB1、pHW2K-PB2、pHW2K-PA、pHW2K-NP在细胞转染后形成RNP复合物。

所有与活病毒相关试验是在生物安全2级设施中进行。

本发明涉及qPCR采用的引物序列和Western blot的抗体选择引用以下相关参考文献：

1.Sang H，Huang Y，Tian Y，Liu M，Chen L，Li L，Liu S，Yang J.Multiple modesof action of myricetin in influenza A virus infection.Phytother Res.2021Jan23.doi:10.1002/ptr.7025.

2.Mao X，Gu S，Sang H，Ye Y，Li J，Teng Y，Zhang F，Ma Q，Jiang P，Yang Z，Huang W，Liu S.Essential Oil-Rich Chinese Formula Luofushan-Baicao OilInhibits the Infection of Influenza A Virus through the Regulation of NF-κBP65 and IRF3 Activation.Evid Based Complement Alternat Med.2021Aug 30；2021:5547424.doi:10.1155/2021/5547424.

实施例1：千金藤素对细胞毒性的检测

千金藤素对细胞毒性的检测采用MTT法，从而确定药物的作用浓度，具体方法如下：

MDCK或A549细胞按1×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱中培养至单层，用不含血清的DMEM或1640(MDCK细胞用DMEM培养基，A549细胞用1640培养基)梯度稀释千金藤素后加入到96孔板中，每孔200μL，继续培养48h。弃培养上清，每孔加入100μL含0.5mg/mL MTT的1640或DMEM培养基，37℃孵育4h。以DMSO作为对照组。采用多功能酶标仪(Genios Pro，Tecan，US)检测570nm处吸光度，以细胞的存活率作为千金藤素对MDCK或A549细胞的毒性的指标。

细胞存活率(％)＝E/N×100

E为药物组的吸光度，N为细胞对照组的吸光度。

试验结果：千金藤素细胞毒性较小，生物安全性高。

结果如图1所示，千金藤素对两种细胞的毒性较小，本发明的实验研究中选用的药物浓度在10μM以内，是在安全无毒性浓度范围内。

实施例2：千金藤素体外抗甲型流感病毒的活性检测

本发明体外抗病毒实验中涉及多种亚型的甲型流感病毒，包括H1N1和H3N2，具体方法如下：

MDCK细胞按2×10⁴/孔接种于96孔板中，在37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100TCID₅₀的H3N2、PR8或WSN感染细胞，每孔100μL，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入DMEM(含1μg/mL TPCK)梯度稀释的千金藤素，每孔200μL，继续培养48h，结合MTT法和空斑实验，检测千金藤素的抗病毒活性。通过观察千金藤素抑制病毒引起的细胞病变现象(CPE)和检测细胞的存活率，计算半数有效浓度IC₅₀。

病毒抑制率(％)＝1-(E/N)/(P-N)×100

E为药物组的吸光度，N为细胞对照组的吸光度，P为病毒组的吸光度。

试验结果：千金藤素可有效抑制甲型流感流感病毒的感染。

图2(A)为千金藤素对不同甲型流感病毒株的半数有效浓度IC₅₀，其表明千金藤素对甲型流感病毒H1N1和H3N2有明显的抑制作用，且存在着明显的剂量关系。对PR8和WSN这两种毒株的半数有效浓度IC₅₀分别为1.08±0.72，2.34±0.86μM，选择性安全指数分别22.54和10.41(见表1)。图2(B)所示，显微镜下观测100TCID₅₀的病毒液在感染细胞48h后能引起明显的细胞病变，千金藤素对细胞能产生保护作用。空斑减少试验图2(C)表明，千金藤素能够浓度依赖性地抑制空斑的形成。

表1千金藤素对不同甲型流感病毒株的抑制活性

实施例3：千金藤素对甲型流感病毒复制的抑制实验

为了评估千金藤素对流感病毒复制的抑制作用，本发明采用q-PCR以及Westernblotting等方法，分别从基因和蛋白的表达水平上检测千金藤素对病毒复制的影响，具体方法如下：

q-PCR及Western blot：A549细胞按4×10⁵/孔接种于6孔板中，在37℃，5％CO₂的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100TCID50的WSN感染细胞，每孔1mL，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入DMEM(含1μg/mL TPCK)梯度稀释的千金藤素，每孔1mL，继续培养24h后，用RNA提取试剂盒(福际生物提供)充分裂解细胞并提取总RNA，样品用于q-PCR；或用75μL含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液冰上裂解细胞并提取总蛋白，样品用于Western blot实验。

试验结果：千金藤素可抑制甲型流感病毒在细胞中的复制。

图3(A)是检测病毒NP和PB2蛋白在A549细胞中的表达情况。从结果可以看出，千金藤素能够显著地降低病毒NP和PB2蛋白的表达水平，且具有浓度依赖性。此外图3(B)和3(C)是采用q-PCR的方法检测病毒NP以及PB2 mRNA的表达情况，与病毒对照组比较，千金藤素能够抑制NP和PB2基因mRNA的表达量，且随着浓度的增加，抑制作用越明显，该结果与Westernblotting结果相一致。每个实验独立重复3次，用One-Way ANOVA的统计学分析方法进行分析。

实施例4：千金藤素对甲型流感病毒转录复制的影响

为了确定千金藤素干扰病毒生命周期中的哪个阶段，本发明通过改变千金藤素作用方式和时间进行研究，具体方法如下：

在病毒单轮复制期间，按照病毒感染细胞后的时间间隔(0-2，2-5，5-8，8-10h)，加入含千金藤素的维持液于细胞中，其他时间加入不含化合物的维持液然后在病毒感染10h后，收集样品，采用Western blot检测病毒NP蛋白及PB2蛋白的表达，千金藤素加入细胞中的时间如图4所示。

试验结果：千金藤素作用于甲型流感病毒的复制前期。

病毒的单轮复制期间(0-10h)的不同时间间隔给药，千金藤素在0-2h能够明显得抑制甲型流感病毒NP蛋白的表达，表明千金藤素作用于甲型流感病毒的复制前期而发挥抗病毒的作用。

实施例5：千金藤素对流感病毒核糖核蛋白复合物vRNP活性的影响

本实验采用反向遗传技术，将PB1、PB2、PA、NP四种构建的质粒在293T细胞进行共转染形成vRNP复合物，验证千金藤素对vRNP活性的影响是否抑制vRNP的活性，具体方法如下：

Mini-replicon实验：293T细胞以2×10⁵个/孔接种于24孔板，待细胞长至90％左右，根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书进行质粒的转染，将25μL含有50ng pHW2K-PB1、pHW2K-PB2、pHW2K-PA、pHW2K-NP和pPolI-Flu以及10ng hRluc-TK的空白DMEM培养基加入到25μL含有1μg Lipofectamine 2000的空白DMEM培养基中，将形成的转染复合物加入到细胞培养上清中，继续培养5h，更换新鲜的含化合物以及10％FBS的DMEM培养液；继续培养24h后，弃培养上清，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行检测，具体的操作如下：每孔加入100μL的被动裂解液，振荡器后取20μL的细胞裂解液到96孔白色荧光素酶检测板中；每孔加入50μL的荧光素酶底物，立即用多功能酶标仪检测萤火虫萤光素酶的荧光值；每孔加入50μL配制好的终止反应液，立即用多功能酶标仪检测海肾萤光素酶的荧光值；RNA聚合酶的活性用萤火虫萤光素酶的荧光值与海肾萤光素酶的荧光值的比值来表示，根据比值计算出化合物对RNA聚合酶的抑制率：

抑制率(％)＝(R_RNP-F_sample)/(F_RNP-F_blank)×100％

试验结果：千金藤素影响流感病毒核糖核蛋白复合物vRNP的活性。

通过对病毒的PB1、PB2、PA以及NP四种蛋白转染293T细胞，本发明发现千金藤素能够抑制流感病毒核糖核蛋白复合物vRNP的活性(如图5所示)，且具有浓度依赖性，说明千金藤素通过抑制流感病毒核糖核蛋白复合物vRNP的活性，从而影响病毒的复制。

综合以上所述的结果，千金藤素具有抗甲型流感病毒的作用，其作用机制是千金藤素抑制流感病毒核糖核蛋白复合物vRNP的活性，从而影响流感病毒的复制。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.千金藤素在制备抗流感病毒药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述流感病毒为甲型流感病毒；

优选地，所述甲型流感病毒为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2或H10N8。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述千金藤素作用于甲型流感病毒的复制前期而发挥抗病毒作用。

4.一种预防和/或治疗流感病毒的药物组合物，其活性成分包括千金藤素。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述流感病毒为甲型流感病毒；

优选地，所述甲型流感病毒为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9、H9N2或H10N8；

优选地，所述药物组合物为注射制剂、口服制剂或外用制剂；

优选地，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。

6.千金藤素在制备靶向抑制流感病毒核糖核蛋白复合物活性的药物中的应用。

7.一种靶向抑制流感病毒核糖核蛋白复合物活性的药物组合物，其活性成分包括千金藤素。

8.千金藤素在制备抑制流感病毒NP基因和/或PB2基因表达的药物中的应用；

优选地，千金藤素在制备抑制流感病毒NP基因和/或PB2基因mRNA表达的药物中的应用；

优选地，千金藤素在制备抑制流感病毒NP蛋白和/或PB2蛋白表达的药物中的应用。

9.一种抑制流感病毒NP基因和/或PB2基因表达的药物组合物，其活性成分包括千金藤素；

优选地，一种抑制流感病毒NP基因和/或PB2基因mRNA表达的药物组合物，其活性成分包括千金藤素；

优选地，一种抑制流感病毒NP蛋白和/或PB2蛋白表达的药物组合物，其活性成分包括千金藤素。

10.千金藤素在制备抑制流感病毒复制的药物中的应用。

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