CN105457029A

CN105457029A - 抑制酪蛋白激酶2活性在促进i型干扰素表达的应用

Info

Publication number: CN105457029A
Application number: CN201510617485.3A
Authority: CN
Inventors: 肖晖; 杜旻; 刘晶华; 谢亚栋; 钟劲; 向禹
Original assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Current assignee: Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority date: 2014-09-29
Filing date: 2015-09-24
Publication date: 2016-04-06
Also published as: WO2016050203A1

Abstract

本发明提供了一种抑制酪蛋白激酶2活性在促进I型干扰素表达的应用。具体地，本发明涉及一种酪蛋白激酶2(Casein？kinase？2，CK2)抑制剂的用途，(i)用于制备促进I型干扰素(I-IFN)和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白表达的药物组合物；和/或(ii)用于制备治疗I型干扰素缺乏相关疾病的药物组合物。实验证明，CK2的抑制能够有效诱导、促进I型干扰素的产生，并激活I型干扰素下游基因的表达，从而对I型干扰素缺乏导致的相关疾病具有良好的治疗作用。

Description

抑制酪蛋白激酶2活性在促进I型干扰素表达的应用

技术领域

本发明涉及免疫学治疗领域。具体地，本发明涉及酪蛋白激酶2抑制剂在促进I型干扰素及其下游基因表达中的新用途。

背景技术

I型干扰素包括IFNα和IFNβ两种，它们与细胞表面的干扰素受体结合后激活蛋白激酶Jak1和Tyk2，随后活化转录因子STAT1或/和STAT2，诱导上百种基因的表达(干扰素诱导基因，ISGs)，包括MX1、MX2、Rsad2/Viperine、CXCL10/IP-10等。

干扰素诱导的这些基因在细胞的繁殖和凋亡、血管生成、T细胞免疫反应等过程中起着重要的生理作用。因此I型干扰素在免疫相关性疾病中的应用得到了广泛的研究。

I型干扰素的表达是受模式识别受体(PRRs，PatternRecognitionReceptors)及其介导的信号通路所诱导的。这些模式识别受体包括Toll样受体(Toll-likereceptors/TLRs)、NOD样受体(NOD-likereceptors/NLRs)、RIG-I样受体(RIG-I-likereceptors/RLRs)和胞浆内DNA受体(cytosolicDNAsensors，CDSs)通过识别组织中死亡的细胞所分泌的RNA和DNA等“模式分子”(PAMPs，Pathogen-AssociatedMolecularPatterns)，激活复杂的信号通路(包括蛋白激酶TBK1、IKKα/β和MAPkinases)，活化关键性的转录因子IRF3、NFκB和AP-1等，诱导I型干扰素、细胞因子和趋化因子的表达，激活天然免疫和适应性免疫反应，实施宿主防御和组织修复等生理功能。

但是I型干扰素表达过量或异常也会引起疾病，特别是系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病，因此体内往往存在调控I型干扰素的负调节机制，以避免干扰素的异常表达。这些调控机制往往导致在病理状态下，I型干扰素也不能有效的表达，从而导致各种免疫反应不足的相关性疾病。因此如何在病理状态下，突破机体调控I型干扰素表达的机制，从而有效地治疗免疫相关性疾病，是基础和临床医学领域研究的一个重要课题。

因此，本领域迫切需要开发一种提高人体自身I型干扰素表达，提高人体免疫功能的有效方法，以治疗多种感染性和非感染性的人类疾病。

发明内容

本发明提供了一种CK2抑制剂在促进I型干扰素表达中的应用。

本发明第一方面，提供了一种酪蛋白激酶2(Caseinkinase2，CK2)抑制剂的用途，(i)用于制备促进I型干扰素(IFNα/β)和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白表达的药物组合物；和/或(ii)用于制备治疗和/或预防I型干扰素缺乏相关疾病的药物组合物。

在另一优选例中，所述的CK2来源于哺乳动物，较佳地，来源于人、小鼠、大鼠。

在另一优选例中，所述的I型干扰素缺乏是指在疾病发生前和或/疾病发生后，I型干扰素表达量和/或活性的降低。

在另一优选例中，所述的I型干扰素缺乏相关疾病是指缺乏I型干扰素会导致疾病的发生和/或加重、且提高I型干扰素的表达量和/或活性后能够对所述疾病起到治疗和/或预防作用的疾病。

在另一优选例中，所述的抑制剂包括CK2的反义核酸、抑制性microRNA、抗体或小分子化合物。

在另一优选例中，所述的抗体包括小分子多肽。

在另一优选例中，所述的抑制剂为CK2基因的siRNA、shRNA。

在另一优选例中，所述的CK2基因的shRNA如(SEQIDNO.:1-2所示)

Forward(SEQIDNO.:1):

5’CCGGCCGAGTTGCTTCTCGATATTTCTCGAGAAATATCGAGAAGCAACTCGGTTTTTG3’；

Reverse(SEQIDNO.:2):

5’AATTCAAAAACCGAGTTGCTTCTCGATATTTCTCGAGAAATATCGAGAAGCAACTCGG3’。

在另一优选例中，所述的CK2蛋白的氨基酸序列的Genbank登录号为NP_031814.2(小鼠)和NP_808227.1(人)。

在另一优选例中，所述的CK2蛋白的编码核苷酸序列的Genbank登录号如NM_007788.3(小鼠)和NM_177559(人)所示。

在另一优选例中，所述的I型干扰素缺乏相关疾病包括：病毒感染性疾病、恶性肿瘤、多发性硬化。

在另一优选例中，所述的病毒感染性疾病包括感染了以下的病毒的疾病：单纯疱疹病毒(HSV)、水泡病毒(VSV)、卡波希氏瘤疱疹病毒(KSHV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、手足口病病毒(肠道病毒EV71和CA16)乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类获得性免疫缺陷病毒/艾滋病病毒(HIV)；和/或

所述的恶性肿瘤包括以下肿瘤：多毛细胞白血病(hairycellleukaemia)、慢性髓性白血病(CML)、淋巴瘤(lymphoma)、骨髓瘤(myeloma)、黑色素瘤(melanoma)、肾细胞癌与膀胱癌(renalcellandbladdercellcarcinoma)、卡波希氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma)。

在另一优选例中，所述的病毒为感染细胞后能够激活模式识别受体的病毒。

在另一优选例中，所述的抑制剂还用于抑制病毒和/或肿瘤细胞的免疫逃逸。

在另一优选例中，所述CK2抑制剂还用于抑制病毒的复制和组装。

在另一优选例中，所述的I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白的表达包括诱导产生和/或提高I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白的表达量和/或活性。

在另一优选例中，所述的抑制剂为小分子化合物，较佳地，包括四溴苯三唑(TBB)、CX-4945(Silmitasertib)、DMAT(2-二甲氨基-4,5,6,7-四溴-1H-苯并咪唑)、山奈酚、酪氨酸磷酸化抑制剂AG114(TyrphostinAG114)、四溴肉桂酸、3-[[5-(4-甲苯基)噻吩[2,3-d]嘧啶-4-yl]硫基]丙酸(TTP22)、CX-5011、鞣花酸(EllagicAcid)、3-甲基-1,6,8-三氢蒽醌(emodin)、4',5,7-三羟基黄酮(apigenin)。

在另一优选例中，所述的I型干扰素诱导基因或其蛋白包括CXCL10/IP-10、STAT1、MX1、MX2、Rsad2/Viperine、磷酸激酶TBK1、干扰素调节因子3(IRF3)。

在另一优选例中，所述的I型IFN包括IFN-α、IFN-β。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括作为活性成分的CK2抑制剂，和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的CK2抑制剂的有效浓度为1-1000μM，较佳地，为20-100μM。

在另一优选例中，所述的CK2抑制剂对I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白的促进作用呈剂量依赖性。

本发明第二方面，提供了一种体外非治疗性的促进细胞表达I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白和/或体外非治疗性的抑制I型干扰素缺乏相关病毒细胞和/或肿瘤细胞生长的方法，包括步骤：在CK2抑制剂的存在下，培养细胞，从而促进细胞表达I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白抑制I型干扰素缺乏相关病毒细胞和/或肿瘤细胞生长。

在另一优选例中，所述的细胞包括肿瘤细胞、或为DNA或RNA病毒感染的细胞。

在另一优选例中，所述的方法还可用于制备I型干扰素或其诱导蛋白，例如收集并纯化细胞培养体系中获得的I型干扰素或其诱导蛋白。

本发明第三方面，提供了一种筛选能够抑制CK2的化合物的方法，包括步骤：

(a)在试验组中，向细胞培养体系加入待测化合物，并测定I型干扰素的表达量和/或活性；在对照组中，向细胞培养体系不加入待测化合物，并测定I型干扰素的表达量和/或活性；

其中，若试验组中I型干扰素的表达量和/或活性显著高于对照组，则说明所述的候选化合物为能够抑制CK2的化合物和/或

(a2)在试验组中，向病毒感染的细胞培养体系中加入待测化合物，并测定细胞培养体系中病毒的滴度；在对照组中，向病毒感染的细胞培养体系中加入待测化合物，并测定细胞培养体系中的病毒滴度；

其中，若试验组病毒的滴度显著低于对照组，则说明所述的候选化合物为能够抑制CK2的化合物。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：

(b)对(a)中的化合物进一步测试其对酪蛋白激酶2或I型干扰素诱导基因或其蛋白的促进作用。

本发明第四方面，提供了一种制备I型干扰素的方法，包括步骤：

(i)在CK2抑制剂的存在下培养细胞；

(ii)收集、分离并纯化细胞培养液中的I型干扰素。

在另一优选例中，在L929细胞中加入CK2抑制剂，在非感染条件下培养12-48小时或者在病毒感染条件下培养12-24小时。收集上清，利用HPLC纯化I型干扰素。

在另一优选例中，所述的细胞还包括成纤维细胞、或巨噬细胞。

本发明第五方面，提供了一种CK2基因或其蛋白的用途，用于制备降低I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白表达的药物组合物。

本发明第六方面，提供了一种治疗病毒性感染的方法，向需要治疗的对象施用CK2抑制剂，从而治疗病毒性感染。

在另一优选例中，所述需要治疗的对象为哺乳动物，较佳地，为人。

本发明第七方面，提供了一种(i)治疗I型干扰素缺乏相关疾病；和/或(ii)促进I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白表达的药物组合物，所述的药物组合物包括作为活性成分的CK2抑制剂，和药学上可以接受的载体。

本发明第八方面，提供了一种判断CK2抑制剂是否对肿瘤或病毒有效的方法，包括步骤：

(a)向肿瘤细胞或病毒感染细胞培养体系中加入CK2抑制剂；

(b)观察加入CK2抑制剂前后所述培养体系中I型干扰素的表达量和/或活性；

其中，当加入CK2抑制剂后I型干扰素的表达量和/或活性I1较加入之前的表达量和/或活性I0有显著升高，则说明CK2抑制剂对该肿瘤或病毒具有抑制作用。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了CK2抑制Toll样受体信号所诱导的I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白，但不影响炎症因子TNFα的表达。

图2显示了CK2抑制Toll样受体信号所诱导的TBK1和IRF3活化，但不影响MAPkinases的激活。

图3显示了CK2抑制胞浆内识别RNA和DNA的模式识别受体所诱导的信号通路以及I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白的表达。

图4显示了HSV感染时，CK2抑制小鼠巨噬细胞系Raw表达I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白，而随着I型干扰素及其靶基因产物的大量表达，HSV病毒的复制、组装和释放受到显著的抑制，在CK2α敲降的Raw264.7细胞培养液中检测到的HSV病毒滴度比对照组的要低接近10倍。

图5显示了仙台病毒感染时，CK2抑制小鼠成纤维细胞系L929表达I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白。

图6显示了VSV病毒感染时，CK2抑制小鼠成纤维细胞系L929表达I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白。

图7显示了CK2的激酶活性在抑制病毒诱导的I型干扰素表达中起关键性的作用。

图8显示了CK2抑制剂TBB在小鼠成纤维细胞系L929中诱导TBK1的活化和I型干扰素以及I型干扰素诱导基因或其蛋白的表达。

图9显示了CK2抑制剂TBB在成纤维细胞系L929中抑制VSV病毒的感染和复制。

图10显示了CK2抑制剂TBB在人胚胎肾细胞系293中诱导TBK1的活化和I型干扰素以及I型干扰素诱导基因或其蛋白的表达，并抑制VSV的感染。

图11显示了HCV感染人肝细胞系Hu7.5前，CK2抑制剂TBB预处理诱导I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白表达并阻止HCV感染。

图12显示了HCV感染人肝细胞系Hu7.5后，CK2抑制剂TBB可以有效地抑制病毒复制。

图13显示了CK2抑制剂TBB在人原髓细胞白血病细胞(Humanpromyelocyticleukemiacells)HL-60中诱导I型干扰素以及I型干扰素诱导基因或其蛋白的表达。

图14显示了CK2抑制剂TBB在人肾癌细胞OS-RC-2中诱导I型干扰素以及I型干扰素诱导基因或其蛋白的表达。

图15A-15B显示了经CK2抑制剂TBB对EV71病毒感染具有预防和治疗作用，且二者在高浓度下的效果更显著。

图16A-16B显示CK2抑制剂TBB有效地激活小鼠组织中诱导I型干扰素表达的关键性激酶TBK1，并抑制了HSV病毒的复制、组装和释放，而TBB处理组小鼠血液、脾脏中检测到的HSV病毒滴度显著低于对照组。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在复杂的人体免疫机制中，CK2蛋白参与调节多种模式识别受体信号通路，控制TBK1和IRF3的活化，限制I型干扰素的表达。实验证明，CK2的抑制能够有效诱导、促进I型干扰素的产生，并激活多种I型干扰素诱导基因或其蛋白的表达，从而改善人体的免疫防卫体系，能够有效阻止I型干扰素相关疾病，例如与I型干扰素相关的病毒、肿瘤，或治疗多发性硬化等疾病，成为一种新的提高人体免疫、治疗病毒感染性疾病和一些非感染性疾病的策略。在此基础上，完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“I型干扰素缺乏”指的是在疾病发生前和/或疾病发生后，I型干扰素的表达量和/或活性的降低。例如，I型干扰素的表达量降低会导致多发性硬化和肿瘤等疾病的发生，或肿瘤或病毒的免疫逃逸抑制了正常I型干扰素的表达，从而进一步加重肿瘤或病毒等疾病的发生。

如本文所用，术语“I型干扰素缺乏相关疾病”指的是缺乏I型干扰素会导致疾病的发生和/或加重、且提高I型干扰素的表达量和/或活性后能够对所述疾病起到治疗和/或预防作用的疾病。通常，本发明所指的“I型干扰素缺乏相关疾病”指的是I型干扰素缺乏相关的病毒感染性疾病、多发性硬化或恶性肿瘤，应理解，与“I型干扰素缺乏”无关的病毒性感染疾病或恶性肿瘤并不在本术语范围内。通常，判断该疾病(如肿瘤或病毒)是否与I型干扰素相关可以采用本领域常规技术，例如敲除或抑制I型干扰素后观察该疾病的预后(包括细胞生长)是否与I型干扰素的表达相关。

酪蛋白激酶2(CK2)

CK2(又称酪蛋白激酶2/Caseinkinase2)是普遍存在于真核细胞内的一种丝氨酸和苏氨酸激酶，主要以四聚体——包含两个催化亚基(α和/或α′)和两个调节亚基β的形式发挥功能。本发明所述的CK2来源于哺乳动物，通常来源于人、小鼠或大鼠。

一种优选的CK2蛋白的氨基酸序列的Genbank登录号为NP_808227.1(小鼠)和NP_031814.2(人)所示，其编码的核苷酸序列Genbank登录号为NM_007788.3(小鼠)和NM_177559(人)所示。CK2基因序列GenbankIDNo.:12995(小鼠)和GenbankIDNo.:1457(人)所示。

目前，各种研究成果表明，CK2在调节细胞生长、肿瘤发生发展中具有重要作用。在肿瘤中，CK2的表达和活性往往异常增高。因此，有报道认为而抑制CK2的表达或活性能有效地抑制肿瘤细胞的生长、并诱导肿瘤细胞的坏死。CK2的抑制剂CX-4945已经进入临床II期，并显示了较好的抗肿瘤效果。然而，CK2抑制剂对肿瘤的治疗作用也具有一定的选择性表现。由于CK2的作用底物和机制比较多，目前尚无法获知CK2抑制剂在每一种肿瘤治疗中的具体作用机制，因此，目前也无法获得该选择性表现的解决方法。

本发明通过实验首次发现，CK2参与调节多种模式识别受体信号通路，控制TBK1和IRF3的活化，以此限制I型干扰素的表达。实验证明，抑制CK2能够提高I型干扰素及其诱导基因的表达，并对抑制病毒感染、多发性硬化和肿瘤具有良好的效果。

具体地，本发明不仅从理论上揭示CK2是负调节TBK1和I型干扰素表达的关键分子，而且通过实验证明，利用小分子化合物抑制CK2的激酶活性可以有效地诱导I型干扰素产生，并由此对病毒感染、多发性硬化和肿瘤细胞的生长起到抑制和杀伤作用。

模式识别受体与I型干扰素表达的相关性

模式识别受体(PRRs，PatternRecognitionReceptors)通过识别死亡细胞或病毒分泌的RNA和DNA等“模式分子”(PAMPs，Pathogen-AssociatedMolecularPatterns)，激活复杂的信号通路，诱导I型干扰素和细胞因子、趋化因子的表达，实施宿主防御和组织修复等生理功能。

位于细胞膜上的Toll样受体TLR4识别病毒表面的糖蛋白，转运入内吞体(endosome)；位于内吞体中的TLR3识别病毒双链DNA；TLR3/TLR4在内吞体中通过接头分子TRIF和TRAM，随后活化磷酸激酶TBK1(TANK-bindingkinase1)，引起下游的转录因子IRF3的活化，从而诱导I型干扰素的表达。

病毒产生的RNA或者机体的损伤细胞所释放的RNA能被细胞质中的RIG-I样受体RIG-I(retinoicacidinduciblegene-I)和MDA5(melanomadifferentiation-associatedgene5)识别，通过接头分子MAVS/VISA在线粒体上活化磷酸激酶TBK1和转录因子IRF3，也能诱导I型干扰素的表达。病毒或者损伤细胞释放的双链DNA(dsDNA)被细胞质中的多种DNA感受因子(DNAsensors)，如cGAS、DDX41和IFI16等识别，通过接头分子STING激活TBK1和IRF3，诱导I型干扰素的表达。这些天然免疫受体也通过激活转录因子NFκB和AP1，诱导IL-6、TNFα和IL-1等促炎症因子和趋化因子的表达。

例如，部分病毒感染或者机体细胞的死亡能引起模式识别受体信号通路激活，从而诱导I型干扰素IFNα/β表达。IFNα/β与干扰素受体结合后激活Jak1和Tyk2，活化转录因子STAT1，诱导上百种I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白的表达，包括MX1、MX2、Rsad2/Viperine、CXCL10/IP-10等，实施宿主防御的功能，清除入侵的病毒和被感染的细胞，或者对组织损伤进行修复，清除病变或癌变的细胞。但是在长期进化的过程中，病毒也获得拮抗模式识别受体信号通路，抑制I型干扰素表达的能力，以逃避宿主的防御功能。例如，丙肝病毒HCV编码的蛋白酶NS3/4A能切割TLR3/4的接头分子Trif和RIG-I/MDA5的接头分子MAVS/VISA，导致它们不能激活下游的TBK1和IRF3。肠道病毒EV71既能通过蛋白酶2A(pro)切割MAVS，又能通过3C蛋白切割Trif，从而抑制I型干扰素的表达。水泡病毒VSV的F蛋白和流感病毒的NS1通过抑制RIG-I的功能，也能干扰宿主表达I型干扰素。人类获得性免疫缺陷病毒/艾滋病病毒(HIV)在复制过程中，可以利用细胞的Trex1和SamHD1等分子降解或抑制反转录的双链DNA，阻碍I型干扰素的产生。通过这些机制，病毒对宿主的免疫反应产生逃逸现象，导致了病毒在宿主细胞中的急性或慢性感染，从而使宿主产生严重病变。此外，在多发性硬化和肿瘤形成过程中，机体抑制I型干扰素表达的机制也可能造成I型干扰素不表达，从而导致疾病的恶化。

CK2抑制剂

如本文所用，术语“本发明活性成分”、“本发明抑制剂”、“本发明CK2抑制剂”可互换使用，均指能够降低CK2基因或蛋白表达量和/或活性的物质。

本发明实验证明，CK2抑制剂能够有效地阻断CK2的表达量和/或活性，从而诱导或促进I型干扰素、TBK1、IRF3的表达，以达到治疗病毒性感染、多发性硬化和肿瘤的目的。

可用于本发明的CK2抑制剂没有特殊限制，可以为任何降低CK2基因或蛋白表达量和/或活性的物质。代表性的例子包括CK2基因的反义核酸、抑制CK2表达的microRNA(siRNA)、CK2蛋白的抗体、抑制CK2对TBK1作用的多肽或对CK2表达量和/或活性具有抑制作用的小分子化合物。

通常，根据CK2基因序列，本领域技术人员可以通过常规技术手段设计并合成具有CK2基因抑制作用的反义核酸或miRNA。而具有CK2抑制功能的小分子化合物则可从市售或人工合成制备获得。优选的例子有四溴苯三唑(TBB，购自Tocris)、DMAT(2-dimethylamino-4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzimidazol，购自MedChemExpress)、山奈酚、酪氨酸磷酸化抑制剂AG114(TyrphostinAG114，购自AlexisBiochemicals)、CX-4945(Silmitasertib，购自Selleck)、四溴肉桂酸、3-[[5-(4-甲苯基)噻吩[2,3-d]嘧啶-4-yl]硫基]丙酸(TTP22，购自Tocris)、CX-5011、鞣花酸(EllagicAcid，购自MedChemExpress)、3-甲基-1,6,8-三氢蒽醌(emodin，购自Sigma)、4',5,7-三羟基黄酮(apigenin，购自上海化成工业发展有限公司)。

优选地，本发明CK2抑制剂还包括含有CK2抑制活性的shRNA的表达载体，其可通过常规方法制备获得。一种优选的具有CK2抑制活性的shRNA序列如下：

Forward(SEQIDNO.:1):

5’CCGGCCGAGTTGCTTCTCGATATTTCTCGAGAAATATCGAGAAGCAACTCGGTTTTTG3’

Reverse(SEQIDNO.:2):

5’AATTCAAAAACCGAGTTGCTTCTCGATATTTCTCGAGAAATATCGAGAAGCAACTCGG3’

可用于本发明的CK2抑制剂的有效治疗浓度范围可以根据本领域常用的有效浓度筛选方法进行筛选，从而获得安全有效的施用剂量，通常，CK2抑制剂的有效浓度为1-1000μM，较佳地为20-100μM。

I型干扰素

I型干扰素包括IFNα和IFNβ两种，它们与细胞表面的干扰素受体结合后激活蛋白激酶Jak1和Tyk2，随后活化转录因子STAT1或/和STAT2，诱导上百种基因的表达(干扰素诱导基因，ISGs)，包括MX1、MX2、Rsad2/Viperine、CXCL10/IP-10等。干扰素诱导的这些基因在抗病毒感染、调节细胞的繁殖和凋亡、血管生成、T细胞免疫反应等过程中起着重要的生理作用。因此I型干扰素在治疗病毒性感染、免疫相关性疾病和肿瘤中的应用得到了广泛的研究。

目前，明确在接受I型干扰素治疗后有效的适应症包括多种病毒感染，例如乙型和丙型肝炎病毒的感染，多发性硬化和十几种肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、黑色素瘤、肾细胞瘤、膀胱瘤和卡波西氏肉瘤等。干扰素抑制多发性硬化的机制可能涉及到其对NLRP3介导的炎症小体的活性的抑制，而干扰素抑制肿瘤的机制涉及到激活抗肿瘤免疫、抑制肿瘤细胞的繁殖，诱导肿瘤细胞的凋亡等。因此，本领域技术人员可以合理预期，利用本发明CK2抑制剂促进I型干扰素的表达后，可以治疗各种与I型干扰素缺乏的疾病，例如，上述的病毒感染、多发性硬化和肿瘤等等。

I型干扰素诱导基因或其蛋白

如本文所用，术语“I型干扰素诱导基因或其蛋白”指的是当I型干扰素表达改变时，在I型干扰素上、下游中与I型干扰素表达量成相关性的基因或其蛋白，通常为感染、免疫相关的炎症因子或抗病毒因子。优选地，所述的I型干扰素诱导基因或其蛋白包括活化磷酸激酶(TBK1)、干扰素调节因子3(IRF3)、MX1、MX2、Rsad2/Viperine、或CXCL10/IP-10等各种免疫调节因子和炎症趋化因子。

病毒性感染

如本文所用，术语“病毒性感染”、“病毒感染性疾病”可互换使用，均指在感染细胞后能够激活模式识别受体的病毒感染相关疾病。

本发明抑制剂可针对各种病毒引起的病毒性感染，包括多种DNA或RNA病毒。例如，单纯疱疹病毒(HSV)、水泡病毒(VSV)、卡波希氏瘤疱疹病毒(KSHV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、手足口病病毒(肠道病毒EV71和CA16)乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类获得性免疫缺陷病毒/艾滋病病毒(HIV)。

病毒感染机体后，通过激活多种模式识别受体，启动复杂的信号转导通路(包括蛋白激酶TBK1、IKKα/β和MAPkinases)，活化关键性的转录因子IRF3、NFκB和AP-1等，诱导I型干扰素、细胞因子和趋化因子的表达，激活天然免疫和适应性免疫反应，实施宿主防御和组织修复等生理功能。例如，I型干扰素能直接引起被感染细胞的凋亡、炎症病毒复制、组装和释放。此外，杀伤性的NK和NKT细胞、CD8T细胞，均在抗病毒效果中起到了各种不同的作用。

可用于本发明的病毒为多种能够在感染状态下抑制I型干扰素表达的病毒，例如，病毒包括乙型和丙型肝炎病毒、肠道病毒EV71、人类获得性免疫缺陷病毒/艾滋病病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、水泡病毒(VSV)、卡波希氏瘤疱疹病毒(KSHV)、呼吸道合胞病毒(RSV)等。

应用

目前，本发明利用相应的小分子化合物在体内逐步诱导适量的干扰素表达，将成为治疗这些拮抗干扰素表达的病毒性疾病的理想方案。还有这些病毒在复制过程中往往很容易产生病毒基因突变，因此一些针对病毒基因产物设计的抗病毒药物虽然暂时有效，但广泛应用后会很快导致抗性毒株的出现。而针对宿主蛋白设计的小分子药物则不会遇到类似的问题。因此同目前一些针对HCV和HIV病毒设计的药物相比，针对宿主蛋白设计的诱导I型干扰素表达的策略更为理想。

因此，利用CK2抑制剂对I型干扰素的促进作用，可将CK2抑制剂应用于各种治疗或非治疗性的与I型干扰素缺乏相关的病毒感染、多发性硬化或肿瘤中。

本发明可以利用CK2抑制剂在体外来诱导或促进I型干扰素的表达，收集或纯化细胞培养体系中所获得的I型干扰素，从而提供一种制备I型干扰素的方法。通常在细胞培养体系中产生了I型干扰素后，对I型干扰素的收集、纯化的方法均为本领域技术人员已知的常规实验方法。

此外，还可以利用CK2抑制剂来筛选、识别I型干扰素缺乏相关疾病的候选药物；本发明还可以采用CK2抑制剂与I型干扰素之间的关系来判断特定的肿瘤、多发性硬化或病毒是否具有抑制作用(敏感性测定)。

在体内，可向所需的对象施用CK2抑制剂来减少所感染病毒的复制、组装从而降低I型干扰素相关性病毒的感染，或减少I型干扰素相关性的多发性硬化和肿瘤的发生和发展。

当然，利用本发明发现的CK2与I型干扰素的相关性，还可以利用CK2本身建立抑制I型干扰素的动物模型等。

药物组合物及施用方法

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明有益效果

本发明发现，CK2参与调节多种模式识别受体信号通路，控制TBK1和IRF3的活化，以此限制I型干扰素的表达。实验证明过TBB等小分子化合物抑制CK2的激酶活性可以有效地诱导I型干扰素产生，从而阻止I型干扰素相关性疾病的发生和发展，为多发性硬化、病毒或肿瘤免疫逃逸提供了新的治疗方法。而针对宿主的内源性提高I型干扰素的方法，能够克服外源注射干扰素难以控制使用量而造成严重毒副作用的缺陷，使该治疗方法更有效、更安全。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1蛋白激酶CK2参与调控多种模式识别受体诱导的I型干扰素表达

方法：利用Lenti-viral载体pLKO.1构建表达对照shRNA或针对CK2α的shRNA的重组病毒载体，然后将它们分别转染巨噬细胞系(Raw264.7)和成纤维细胞系(L929)，建立了CK2α低表达的稳转细胞系。

首先根据NCBIgenebank中的CK2基因序列设计针对CK2α的shRNA寡核苷酸序列：

Forward(SEQIDNO.:1):

CCGGCCGAGTTGCTTCTCGATATTTCTCGAGAAATATCGAGAAGCAACTCGGTTTTTG,

Reverse(SEQIDNO.:2):

AATTCAAAAACCGAGTTGCTTCTCGATATTTCTCGAGAAATATCGAGAAGCAACTCGG

利用Addgene公司的商业化pLKO.1–TRCCloningVector载体(Addgene质粒商品号10878)及其标准操作流程，构建表达对照shRNA或针对CK2α的shRNA的质粒pLKO.1-shRNA。将10μg/ml对照shRNA或针对CK2α的shRNA质粒pLKO.1-shRNA分别与2.5μg/mlpMD2.G(Addgene质粒商品号12259)、7.5μg/mlpsPAX2(Addgene质粒商品号12260)一起通过磷酸钙(125mMCacl2/1xHEPES)转化法在HEK293细胞中包装，48小时后收集细胞上清液，得到对照shRNA或针对CK2α的shRNA的重组病毒载体(HEK293细胞培养基为：DMEM完全培养基，含10％FBS和1％青霉素/链霉素)。

使用对照shRNA或针对CK2α的shRNA的重组病毒载体，以50％的浓度分别转染70％丰度的巨噬细胞系(Raw264.7购自美国ATCC)或者成纤维细胞系(L929购自美国ATCC)，Raw264.7和L929细胞培养基为DMEM完全培养基。转染4小时后去除重组病毒载体，继续培养直至细胞丰度达到95％。以1:5的比例进行细胞传代，由于对照shRNA或针对CK2α的shRNA均带有puromycin抗性位点，传代后使用含有4μg/mlpuromycin的DMEM完全培养基进行抗性细胞筛选。筛选3-4代(约7-10天)即可获得CK2α基因敲降的阳性稳转细胞系和对照细胞系。

将对照和CK2α敲降的Raw264.7稳转细胞系以10⁶个/ml分别接种到6孔板中，每孔接种2ml。分别用LPS(100nM,购自Invivogen)、polyI:C(50μg/ml,购自Invivogen)处理细胞，分别激活TLR4或TLR3信号通路(图1和图2)。刺激4小时后收集细胞，提取RNA(图1)；或刺激15分钟至4小时后，于不同的时间点收集细胞，制备蛋白抽提液(图2)。

将对照和CK2α敲降的L929稳转细胞系以10⁶个/ml分别接种到6孔板中，每孔接种2ml。分别用脂质体lipofectamine2000(购自Invitrogen)转染polydA:dT(1μg/ml,购自Invivogen)、polyI:C(1μg/ml,购自Invivogen)细胞，分别激活RIG-I/Mda5和cGAS/STING信号通路(图3)。或者用DMXAA(100μg/ml,购自Selleck)直接处理细胞激活STING信号通路(图3)。刺激6小时后收集细胞，提取RNA(图3A)；或刺激3小时后，收集细胞，制备蛋白抽提液或胞浆、胞核蛋白抽提液(图3B和3C)。

利用TRIZOL(Invitrogen)方法提取Raw264.7和L929的RNA,并用SuperScript^TMIIIReverseTranscriptaseKit(Invitrogen)分别反转录1μgRNA合成第一链cDNA，用于实时定量PCR检测基因表达水平。实时定量PCR引物详见表1。运用ΔΔct方法计算所测基因相对于GAPDH的相对表达量。利用裂解缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.4)、150mMNaCl、1mMEDTA、1％TritonX-100、蛋白酶抑制剂complete(Roche)、1mMPMSF、1mMNaF、1mMNa3VO4)于冰上裂解细胞20分钟后，4℃离心(13000rpm,15分钟)去除不溶物质，制备细胞总蛋白抽提液。制备胞浆和胞核蛋白抽提液的方案如下：首先用低渗缓冲液(10mMHEPES(pH7.6)、1.5mMMgCl2、10mMKCl、1mMEDTA，蛋白酶抑制剂complete(Roche)、1mMPMSF、1mMNaF、1mMNa3VO4)裂解细胞，用匀浆器Douncer来回处理10-15次，然后于冰上孵育20分钟。4℃低速离心(3000rpm,5分钟)后，将上清取出，再经过高速离心去除不溶物质后即为胞浆蛋白抽提液。低速离心后的沉淀经过高盐缓冲液(20mMHEPES(pH7.6)、500mMNaCl、1.5mMMgCl2、1mMEDTA、蛋白酶抑制剂complete(Roche)、1mMPMSF、1mMNaF、1mMNa3VO4)裂解，高速离心去除不溶物质后，即为细胞核蛋白抽提液。通过Western杂交检测TBK1、IRF3、IκBα、STAT1、JNK、ERK、p38等蛋白的磷酸化。Tubulin、GAPDH、LaminB1等作为总蛋白、胞浆蛋白或核蛋白抽提液的总蛋白量的参照分子。

表1、实时定量PCR引物序列

结果：实时定量PCR结果显示，在CK2α敲降的Raw264.7细胞中，LPS和polyI:C诱导的IFNβ和Cxcl10的表达明显比对照细胞中高(图1)。相应的，在LPS和polyI:C处理的CK2α敲降的Raw264.7细胞中，IFNβ诱导的靶基因Mx1和Mx2的表达量也大大增高了(图1)。相反，炎症因子TNFα和趋化因子CXCL1的表达与对照组相比没有显著性的差别(图1)，表明CK2选择性地抑制I型干扰素及其I型干扰素诱导的基因表达。通过特异性识别蛋白磷酸化的抗体，利用Western杂交检测LPS诱导的TLR4信号通路中信号分子的活化，发现在CK2α敲降的Raw264.7细胞中，参与I型干扰素诱导的关键性信号分子TBK1和IRF3的磷酸化明显增高，但是MAPKinasesJNK、ERK、p38的磷酸化则没有明显的变化(图2)。相反，IκBα的磷酸化反而下降了(图2)。这些数据显示CK2一方面抑制TBK1和IRF3的活化，另一方面正调节IKKα/β和NFκB的活化，因此CK2在TLR信号通路中针对不同的信号分子，具有不同的调节作用。

同样，在CK2敲降的L929细胞中，转化入胞浆的polyI:C、polydA:dT和DMXAA通过激活RIG-I/MDA5或者cGAS/STING信号通路，诱导更多的IFNα、IFNβ、Cxcl10、Mx1和Mx2(图3A)。表明CK2也参与调节胞浆内的RNA和DNA等模式识别受体所诱导的I型干扰素及其I型干扰素诱导的基因表达。同样通过Western杂交，发现转化的polyI：C在CK2敲降的L929细胞内激活更多的TBK1和IRF3,相应地，I型干扰素激活的p-STAT1在CK2敲降的L929细胞也明显比对照细胞中要高(图3B)。在DMXAA刺激的CK2敲降的L929细胞核中，不仅p-TBK1上升，而且IRF3的核转移也明显上调(图3C)。相反，NFκBp65的核转移并没有显著增加(图3C)。进一步证明CK2特异性的抑制TBK1和IRF3的活化，以此调节多种模式识别受体介导的I型干扰素及其I型干扰素诱导基因的表达。

实施例2蛋白激酶CK2参与调控多种病毒感染诱导的I型干扰素表达

方法：将对照和CK2α敲降的稳转细胞系以10⁶个/ml分别接种到6孔板中，每孔接种2ml。分别感染DNA病毒HSV-1(1×10⁷pfu/ml)、RNA病毒水泡病毒VSV(2.5×10⁵TCID₅₀/ml)和仙台病毒SeV(1×10⁸HA/ml)。感染病毒6小时后，收集细胞用于RNA抽提制备。感染HSV病毒6小时后,换液、继续培养66小时收集细胞上清液用于HSV病毒滴度测定。利用TRIZOL(Invitrogen)方法提取Raw264.7和L929的RNA,并用SuperScript^TMIIIReverseTranscriptaseKit(Invitrogen)分别反转录1μgRNA合成第一链cDNA，用于实时定量PCR检测基因表达水平。实时定量PCR引物详见附件表格1。运用ΔΔct方法计算所测基因相对于GAPDH的相对表达量。用经典病毒滴度测定法检测细胞上清液中HSV的病毒滴度，具体方案为：以5×10⁴个/ml分别接种Vero细胞到24孔板中，每孔接种0.5ml，待细胞丰度达到30％时，分别加入不同浓度梯度的细胞上清液(原液、1:10¹、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶、1:10⁷、1:10⁸、1:10⁹、1:10¹⁰)和空白对照培养4小时。4小时后，去除上清液，每孔加入0.8％的琼脂-MEM培养液400μl，常温静置1小时待培养基凝固后，继续倒置培养67小时。培养结束后，每孔加入500μl结晶紫溶液，常温静置2小时。抽掉琼脂，计数空斑的数目，计算病毒滴度(pfu/ml,plaqueformingunit/ml)。

结果：实时定量PCR结果显示，在CK2α敲降的Raw264.7细胞中，HSV诱导的IFNα、IFNβ和Cxcl10的表达明显比对照细胞中高(图4)。相应的，IFNα/β的靶基因Mx1和Mx2的表达也在CK2α敲降的Raw264.7细胞中大大增高了(图4)。随着I型干扰素及其靶基因产物的大量表达，HSV病毒的复制、组装和释放受到显著的抑制，在CK2α敲降的Raw264.7细胞培养液中检测到的HSV病毒滴度比对照组的要低接近10倍(图4)。同样，与对照细胞相比，在CK2敲降的L929细胞中，VSV和SeV诱导的IFNα、IFNβ、Cxcl10、Mx1和Mx2等基因的表达也极其显著地上调(图5和图6)。因此在多种病毒感染状态下，下调CK2的表达均能显著增强不同类别细胞表达I型干扰素的能力。这些结果表明CK2是负调控I型干扰素表达的关键性分子。

实施例3CK2的激酶活性在调控I型干扰素表达中起着关键性的作用

方法：在lenti-viral载体pCDH上分别克隆编码小鼠CK2α野生型和激酶失活的突变体(K68M)的cDNA，然后将它们转导入L929细胞系，通过puromycin筛选得到对照细胞株，分别表达野生型和突变型CK2α的细胞株。通过Western杂交验证了野生型和突变型CK2α的表达(图7A)。

将表达野生型和突变型CK2α的细胞株以10⁶个/ml分别接种到6孔板中，每孔接种2ml。VSV(2.5×10⁵TCID₅₀/ml)感染6小时后，利用TRIZOL(Invitrogen)法抽提制备细胞中的RNA。用SuperScript^TMIIIReverseTranscriptaseKit(Invitrogen)分别反转录1μgRNA合成第一链cDNA，用于实时定量PCR检测I型干扰素基因表达水平，运用ΔΔct方法计算所测基因相对于GAPDH的相对表达量。

结果：实验表明，在高表达野生型CK2α的细胞中，IFNα、IFNβ和Cxcl10等基因的表达量比对照细胞低(图7B)。相反，在高表达无激酶活性的CK2α突变体细胞中，这些基因的表达量与对照细胞比没有明显差别(图7B)。这些结果表明上调CK2的表达能降低细胞诱导I型干扰素的能力，而且CK2的激酶活性在调节I型干扰素表达中是必不可少的。

实施例4抑制CK2激酶活性促进细胞表达I型干扰素，阻止水泡病毒感染

4.1方法：将小鼠成纤维细胞L929以10⁶个/ml分别接种到6孔板中，每孔接种2ml，待细胞丰度达到70％时，使用不同浓度CK2激酶抑制剂—小分子化合物TBB或DMSO(对照)处理该细胞6小时或12小时后，利用裂解缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.4)、150mMNaCl、1mMEDTA,1％TritonX-100，蛋白酶抑制剂Complete(Roche)、1mMPMSF、1mMNaF、1mMNa3VO4)提取并制备细胞的蛋白裂解液，通过Western杂交检测NFκBp65和TBK1的磷酸化。

结果：图8A的结果表明20μMTBB处理L929细胞6小时后，CK2的激酶活性被抑制，它所介导的p65磷酸化明显降低。但总体而言，100μMTBB处理12小时能更有效地抑制CK2的活性，而且能最有效地激活诱导I型干扰素表达的关键性激酶TBK1(图8A)。

4.2方法：同法使用TBB(100μM)或DMSO(对照)处理L929细胞12小时后，利用TRIZOL(Invitrogen)法抽提制备细胞中的RNA。用SuperScript^TMIIIReverseTranscriptaseKit(Invitrogen)分别反转录1μgRNA合成第一链cDNA，用于实时定量PCR检测I型干扰素基因表达水平，运用ΔΔct方法计算所测基因相对于GAPDH的相对表达量。

结果：发现TBB处理促进细胞合成IFNα、IFNβ、Cxcl10、Mx1和Mx2等基因的表达(图8B)，因此可能建立了一个抗病毒感染的状态。果然，用0、20、50、100μM的TBB分别处理L929细胞12小时后，再接种VSV病毒(2.5×10⁵TCID₅₀/ml，表达GFP，因此可以利用荧光显微镜检测被感染的细胞)；24小时后，利用荧光显微镜检测VSV感染的效率。发现TBB预处理的细胞呈现出对VSV感染的抗性，而且随着TBB浓度的增加，抗VSV感染的能力也变强。需要特别指出的是，100μMTBB处理后的L929细胞几乎完全不被VSV感染，具备了抵御病毒感染的能力(图9)。

4.3在人胚胎肾细胞HEK293T中，验证了抑制CK2的激酶活性对细胞表达I型干扰素的影响以及在阻止水泡病毒感染中的作用。

方法：将人胚胎肾细胞HEK293T以10⁶个/ml分别接种到6孔板中，每孔接种2ml，待细胞丰度达到70％时，使用TBB或DMSO(对照)处理细胞。同法提取细胞的蛋白裂解液用于Western检测，提取RNA用于I型干扰素相关基因表达水平的检测，荧光显微镜检测VSV感染的效率。

结果：实验发现，在人胚胎肾细胞HEK293T中，TBB处理12或24小时后，TBK1也被明显地激活(图10A)，并促进了IFNα、IFNβ、Mx1和Mx2等基因的表达(图10B)。更重要的是，TBB处理后的HEK293细胞抵抗VSV感染的能力也极大地增强(图10C)。这些结果说明TBB在小鼠和人细胞中均能诱导I型干扰素的表达，建立抗病毒感染的防御状态，有效地抵抗VSV病毒的感染。

实施例5CK2抑制剂TBB阻止HCV感染

HCV感染导致的慢性肝炎在中国和世界范围内都呈增加的趋势。在人肝癌细胞Hu7.5中，HCV病毒可以非常有效地感染和复制，但不能诱导I型干扰素的表达。因此，外源给予干扰素治疗对一部分HCV慢性感染病人有较好的效果，但干扰素价格昂贵，且副作用明显。所以，探究能否利用TBB来诱导宿主自体产生I型干扰素，以达到治疗HCV感染的效果。

方法：将Hu7.5细胞以5×10⁴个/ml分别接种到6孔板中，每孔接种2ml，使用的培养基是DMEM完全培养基。待细胞丰度达到30％时，100μMTBB或DMSO(对照)处理24小时后，MOI(multiplicityofinfection)＝0.01或者MOI＝0.1的HCV感染8小时后，换液、继续培养64小时。收集细胞分别用于RNA分析和HCV感染的效率，收集细胞上清液用于HCV病毒滴度测定。用经典病毒滴度测定法检测细胞上清液中HCV的病毒滴度，具体方案为：以5×10⁴个/ml分别接种Hu7.5细胞到96孔板中，每孔接种200μl，待细胞丰度达到30％时，分别加入不同浓度梯度的细胞上清液(原液、1:10¹、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶、1:10⁷、1:10⁸、1:10⁹、1:10¹⁰)，继续培养72小时，收集细胞，多聚甲醛固定后免疫荧光化学法标记HCV特异性抗体，荧光显微镜检测已被HCV感染并带有荧光标记的Hu7.5细胞个数，计算病毒滴度(ffu/ml,fluorescenceformingfoci/ml)。

结果：同法提取分析细胞中的RNA与I型干扰素相关基因的表达水平，定量PCR结果表明，在TBB预处理的细胞中，IFNα、IFNβ、Mx1和Mx2等I型干扰素相关基因的表达较高；同时，TBB预处理也提升了细胞中炎症因子IL-6的表达(图11A)。相反，Hcv基因的表达量则非常少(图11A)。细胞经4％多聚甲醛固定30分钟，PBS磷酸缓冲液洗涤，应用免疫荧光化学法标记HCV特异性抗体，荧光显微镜检测HCV感染效率。发现未受处理的细胞大量感染HCV，但TBB处理后仅仅有极少的细胞被HCV感染(图11B)。HCV的病毒滴度检测结果显示，TBB预处理后，细胞上清液中HCV病毒的滴度明显降低(图11C)。以上研究结果综合表明TBB预处理能促进肝脏细胞Hu7.5产生I型干扰素，阻止HCV的感染和复制。

实施例6TBB抑制HCV复制、清除HCV感染

方法：将Hu7.5细胞以5×10⁴个/ml分别接种到6孔板中，每孔接种2ml，待细胞丰度达到30％时，首先用MOI(multiplicityofinfection)＝0.01或者MOI＝0.1的HCV感染细胞，24小时后，HCV已经进入细胞并开始复制，再使用100μMTBB或DMSO(对照)处理感染后的Hu7.5细胞。48小时后，同法收获细胞并制备RNA，通过定量PCR检测细胞和病毒基因的表达量。

结果：HCV感染后，Hu7.5细胞并不能诱导I型干扰素的表达。但加入TBB后，细胞开始大量表达I型干扰素、I型干扰素诱导的基因MX1和MX2，以及一些促炎症因子，像IL-6和TNFα(图12A)。随着I型干扰素及其靶基因产物的大量表达，HCV病毒的复制、组装和释放受到显著的抑制，在TBB处理的细胞培养液中检测到的HCV病毒滴度比未处理的要低10-100倍(图12B)。这些结果表明TBB可以用来治疗慢性HCV感染的病人。

实施例7TBB调节肿瘤细胞中I型干扰素的表达

方法：人原髓细胞白血病细胞(Humanpromyelocyticleukemiacells)HL-60(购自ATCC)和人肾癌细胞OS-RC-2在RPMI-1640培养基中培养，并补加10％的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和抗生素。将HL-60或OS-RC-2细胞以5×10⁴个/ml分别接种到6孔板中，每孔接种2ml，待细胞丰度达到30％时，加100μMTBB或DMSO(对照)处理。12小时后，收集细胞，用Trizol(Sigma)制备RNA。用SuperScript^TMIIIReverseTranscriptaseKit(Invitrogen)分别反转录1μgRNA合成第一链cDNA，用于实时定量PCR检测I型干扰素基因表达水平，运用ΔΔct方法计算所测基因相对于GAPDH的相对表达量。

结果：定量PCR结果表明，在TBB预处理的人原髓细胞白血病细胞HL-60和人肾癌细胞OS-RC-2细胞中，IFNα、IFNβ、Cxcl10、Mx1和Mx2等I型干扰素相关基因的表达比未处理的对照细胞明显增高(图13和图14)，表明TBB也能在肿瘤细胞中诱导I型干扰素的表达。

实施例8CK2抑制剂TBB抑制EV71感染

方法：将Vero细胞以3×10⁴个/ml分别接种到24孔板中，每孔接种0.5ml，待Vero细胞丰度达到70％时，按照TBB预防组与TBB治疗组分别处理Vero细胞。TBB预防组：20、50、和100μMTBB或DMSO(对照)分别处理细胞2小时后，分别感染肠道病毒EV712*10²TCID₅₀/ml4小时后，换液、继续用添加20、50和100μMTBB或DMSO(对照)的培养基分别培养24小时。换液，用未添加TBB或DMSO的培养基继续培养48小时，收集细胞上清液用于EV71病毒滴度测定。TBB治疗组：感染肠道病毒EV712*10²TCID₅₀/ml4小时后，换液、用添加20、50和100μMTBB或DMSO(对照)的培养基分别培养72小时，收集细胞上清液用于EV71病毒滴度测定。用经典病毒滴度测定法TCID₅₀(半数组织细胞感染量)检测细胞上清液中EV71的病毒滴度，具体方案为：以3×10⁴个/ml分别接种Vero细胞到96孔板中，每孔接种0.1ml，待细胞丰度达到70％时，分别加入不同浓度梯度的细胞上清液(原液、1:10¹、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶、1:10⁷、1:10⁸、1:10⁹、1:10¹⁰)和空白对照培养4小时。4小时后，去除上清液，换液、继续培养68小时。培养结束后，光学显微镜观察细胞受感染程度，计数超过半数感染的孔板的数目，计算病毒滴度(TCID₅₀/ml,tissuecultureinfectivedose/ml)。

结果：不同剂量TBB预防组处理Vero细胞，EV71感染后，TBB预防组处理的细胞培养液中检测到的EV71病毒滴度低于未处理组，并呈现一定的浓度相关性。预防组中，使用TBB的浓度越高，细胞培养液中检测到的EV71病毒滴度越低(图15A)。先感染EV71，再使用TBB的治疗组细胞培养液中检测到的EV71病毒滴度比未处理组要低10-100倍(图15B)，高浓度使用TBB(100μM)能够显著地抑制EV71病毒的复制、组装和释放，最终检测到的EV71病毒滴度降低达到百倍(图15B)。

实施例9动物感染模型中TBB抑制疱疹病毒HSV的感染

9.1TBB激活小鼠体内诱导I型干扰素表达的关键性激酶TBK1

方法：6-8周龄B6小鼠，雌雄各半，分别依照小鼠体重腹腔注射2.5、10、25mg/kgTBB或葵花籽油(对照组)，24小时后按照动物福利法处死小鼠，取肝脏与脾脏测定组织样本中与I型干扰素合成相关的细胞因子TBK1的激活程度。称取单位重量的组织样本，加入裂解缓冲液(50mMTris-HCl(pH7.4)、150mMNaCl、1mMEDTA,1％TritonX-100，蛋白酶抑制剂Complete(Roche)、1mMPMSF、1mMNaF、1mMNa3VO4)匀浆，提取并制备组织样本的蛋白裂解液，通过Western杂交检测TBK1的磷酸化。

结果：图16A的结果表明，腹腔注射10mg/kgTBB24小时可以有效地激活肝脏中诱导I型干扰素表达的关键性激酶TBK1，腹腔注射2.5或者10mg/kgTBB24小时均可以有效地激活脾脏中诱导I型干扰素表达的关键性激酶TBK1。同时，根据Western检测的结果，我们采用10mg/kg的TBB作为后续小鼠动物感染模型腹腔注射实施例的剂量。

9.2TBB抑制小鼠体内HSV的感染

方法：6-8周龄B6小鼠，雌雄各半，分别依照小鼠体重腹腔注射10mg/kgTBB或葵花籽油(对照组)，6小时后分别依照小鼠体重尾静脉注射5*10⁷pfu/gHSV。注射HSV12小时后同法给予第二次TBB，注射HSV24小时后按照动物福利法处死小鼠，取血液与脾脏测定组织样本中HSV的病毒滴度。用经典病毒滴度测定法检测小鼠组织样本中HSV的病毒滴度，具体方案为：称取1g组织样本，加入1mlPBS，匀浆得到组织匀浆液。以5×10⁴个/ml分别接种Vero细胞到24孔板中，每孔接种0.5ml，待细胞丰度达到30％时，分别加入不同浓度梯度的组织样本匀浆液(原液、1:10¹、1:10²、1:10³、1:10⁴、1:10⁵、1:10⁶、1:10⁷、1:10⁸)和空白对照(PBS)培养4小时。4小时后，去除匀浆液，每孔加入0.8％的琼脂-MEM培养液400μl，常温静置1小时待培养基凝固后，继续倒置培养67小时。培养结束后，每孔加入500μl结晶紫溶液，常温静置2小时。抽掉琼脂，计数空斑的数目，计算病毒滴度(pfu/g,plaqueformingunit/g)。

结果：由于腹腔注射10mg/kgTBB可以有效激活小鼠组织中诱导I型干扰素表达的关键性激酶TBK1(图16A)，从而使HSV病毒的复制、组装和释放受到显著的抑制。HSV感染24小时后，TBB处理组小鼠血液、脾脏中检测到的HSV病毒滴度显著低于对照组(图16B)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.酪蛋白激酶2(Caseinkinase2，CK2)抑制剂的用途，其特征在于，(i)用于制备促进I型干扰素(I-IFN)和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白表达的药物组合物；和/或(ii)用于制备治疗和/或预防I型干扰素缺乏相关疾病的药物组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂包括CK2的反义核酸、抑制性microRNA、抗体或小分子化合物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的I型干扰素缺乏相关疾病包括：病毒感染性疾病、恶性肿瘤、多发性硬化(MultipleSclerosis)。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的病毒感染性疾病包括感染了以下的病毒的疾病：单纯疱疹病毒(HSV)、水泡病毒(VSV)、卡波希氏瘤疱疹病毒(KSHV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、手足口病病毒(肠道病毒EV71和CA16)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、或人类获得性免疫缺陷病毒/艾滋病病毒(HIV)；和/或

所述的恶性肿瘤包括以下肿瘤：多毛细胞白血病(hairycellleukaemia)、慢性髓性白血病(CML)、淋巴瘤(lymphoma)、骨髓瘤(myeloma)、黑色素瘤(melanoma)、肾细胞癌(renalcellcarcinoma)、膀胱癌(bladdercellcarcinoma)、或卡波希氏肉瘤(Kaposi’ssarcoma)。

5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂为抑制I型干扰素表达和/或活性的小分子化合物，较佳地，包括四溴苯三唑(TBB)、CX-4945(Silmitasertib)、DMAT(2-二甲氨基-4,5,6,7-四溴-1H-苯并咪唑)、山奈酚、酪氨酸磷酸化抑制剂AG114(TyrphostinAG114)、四溴肉桂酸、3-[[5-(4-甲苯基)噻吩[2,3-d]嘧啶-4-yl]硫基]丙酸(TTP22)、CX-5011、鞣花酸(EllagicAcid)、3-甲基-1,6,8-三氢蒽醌(emodin)、4',5,7-三羟基黄酮(apigenin)。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的I型干扰素诱导基因或其蛋白包括CXCL10/IP-10、STAT1、MX1、MX2、Rsad2/Viperine、磷酸激酶TBK1、干扰素调节因子3(IRF3)。

7.一种体外非治疗性的促进细胞表达I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白和/或体外非治疗性的抑制I型干扰素缺乏相关病毒细胞和/或肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，包括步骤：在CK2抑制剂的存在下，培养细胞，从而促进细胞表达I型干扰素和/或I型干扰素诱导基因或其蛋白和/或抑制I型干扰素缺乏相关病毒细胞和/或肿瘤细胞生长。

8.一种筛选能够抑制CK2的化合物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a1)在试验组中，向细胞培养体系加入待测化合物，并测定I型干扰素的表达量和/或活性；在对照组中，向细胞培养体系不加入待测化合物，并测定I型干扰素的表达量和/或活性；

其中，若试验组中I型干扰素的表达量和/或活性显著高于对照组，则说明所述的候选化合物为能够抑制CK2的化合物；和/或

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括步骤：

(b)对(a)中的化合物进一步测试其对酪蛋白激酶2基因或其蛋白的促进作用。

10.一种制备I型干扰素的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)在CK2抑制剂的存在下培养细胞；

(ii)收集、分离并纯化细胞培养液中的I型干扰素。