WO2010113647A1 - ボルナ病ウイルスを利用するベクター及びその利用 - Google Patents

ボルナ病ウイルスを利用するベクター及びその利用 Download PDF

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卓史 大東
知之 本田
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Definitions

  • the present invention relates to a viral vector, a recombinant virus and its use for introducing a foreign gene into a cell.
  • a method using a viral vector As a means for transporting foreign genes to living organisms or cells, a method using a viral vector is known. So far, vectors using retroviruses, lentiviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, and Sendai viruses have been developed.
  • gene therapy a gene introduction technique capable of introducing a gene only to a target cell is expected.
  • gene therapy is considered to be effective in the treatment of nervous system diseases, so the development of a viral vector that can selectively introduce genes into nerve cells and that has high safety, stability, persistence, and gene transfer efficiency. Is desired.
  • Borna's disease virus (hereinafter also referred to as BDV) is a virus belonging to the order of the mononegavirus having a non-segmented minus-strand, single-stranded RNA as a genome, and is said to be apt to infect nerve cells. Has characteristics. Furthermore, although BDV is a virus that replicates in the cell nucleus, its infection is non-cytotoxic and has a characteristic of persistent infection over a long period of time, and has a characteristic that the host range that can be infected is extremely wide (Non-Patent Documents 1 and 2) etc).
  • GFP green fluorescent protein
  • Patent Document 1 includes (a) cDNA of a recombinant virus in which any foreign gene is inserted into the translation region of G gene of cDNA encoding Borna disease virus genome, (b) cDNA encoding ribozyme, and (c) Disclosed is a viral vector comprising a promoter sequence, wherein (b) is located upstream and downstream of (a), and (a) and (b) are located downstream of (c).
  • the present invention is safe because the range of infectable hosts is wide, the efficiency of exogenous gene introduction is high, the viral genome is not inserted into the host chromosome, and the exogenous genes can be expressed non-cytotoxically in the cell nucleus. It has good stability and persistence in cells, and can selectively introduce foreign genes into target cells (for example, cells of central nervous system such as cranial nervous system). Viral vectors that can efficiently produce recombinant viruses with low pathogenicity (high safety) because they do not spread to cells, recombinant viruses, methods for introducing foreign genes using the recombinant viruses, foreign gene introducing agents, etc. The purpose is to provide.
  • RNA virus genome RNA virus genome
  • a viral vector containing cDNA of a recombinant viral genome in which an exogenous gene was inserted at various sites of cDNA encoding BDV genome cDNA of BDV genomic RNA
  • BDV The plasmid (group) expressing N gene, P gene and L gene) was introduced into a cell to produce a recombinant virus, and the resulting recombinant virus was infected into the cell.
  • the P gene was translated in the BDV genome.
  • a vector in which an exogenous gene is inserted into the G gene region has a low ability to produce a recombinant virus, and the infection of the recombinant virus produced from the vector into a cell is transient, so that the foreign The sex gene could not be expressed.
  • the recombinant BDV vector in which a foreign gene was inserted into the 5 'end region of the genome had a low gene introduction efficiency.
  • the present inventors have found that a recombinant BDV vector in which an exogenous gene is inserted into an untranslated region between the translated region of the P gene and the translated region of the M gene has a higher virus production ability than the existing recombinant BDV vector It has been found that the recombinant virus produced from the vector can express the target gene for a long period of time with high efficiency even in brain nervous system cells. Has been conceived that can be efficiently introduced into target cells.
  • the present inventors also have a set in which an exogenous gene is inserted into an untranslated region between the P gene ORF and the M gene ORF of the BDV genome (an untranslated region that binds downstream of the P gene ORF).
  • an exogenous gene is inserted into an untranslated region between the P gene ORF and the M gene ORF of the BDV genome (an untranslated region that binds downstream of the P gene ORF).
  • a viral vector using the cDNA of the modified BDV genome it was found that the pathogenicity of the recombinant virus produced from the vector can be reduced by destroying (deleting) the sequence encoding the G gene.
  • Recombinant virus produced from such a G gene-deficient virus vector maintains its ability to replicate in the cell, so that it continuously infects the introduced cell, but cannot synthesize the G protein and thus other cells.
  • the propagation ability of the recombinant virus can be further reduced while maintaining the replication ability in the cells. Further, in the viral vector, by deleting the intron of L gene (part of G gene) and binding the ORF of L gene which is divided by G gene in BDV genome, replication of recombinant virus produced It has been found that the ability can be improved, that is, the replication rate of the foreign gene in the cell can be increased.
  • the present inventors further change the cell directivity of a recombinant virus by producing a recombinant virus using a gene encoding an outer shell protein of another virus together with the above-described viral vector in which the G gene is disrupted. Therefore, it was found that the target gene can be efficiently introduced into various cells.
  • the BDV genome includes at least six proteins, namely, nuclear protein (N protein), X protein, phosphorylated protein (P protein), matrix protein (M protein), surface glycoprotein (G protein) and RNA-dependent RNA. Polymerase (L protein) is encoded.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of a BDV genome.
  • N, X, P, M, G, and L schematically show the ORF of each gene.
  • the BDV genome has N, X, P, M, G, and L genes in this order from the 3 'end.
  • G gene cDNA means a cDNA encoding the G gene.
  • the present invention relates to the following items 1 to 14.
  • Item 1 In the untranslated region having at least the N gene, X gene, P gene and L gene in the Borna disease virus genome in the same order as in the Borna disease virus genome and linked downstream of the translated region of the P gene A recombinant viral RNA cDNA having a sequence inserted with a foreign gene, (b) a DNA encoding a ribozyme, and (c) a promoter sequence, wherein (b) is arranged upstream and downstream of (a). And (a) and (b) are arranged downstream of (c).
  • the cDNA of the recombinant viral RNA has a sequence in which the G gene is disrupted in the Borna disease virus genome, and a foreign gene has been inserted into the untranslated region linked downstream of the translated region of the P gene.
  • the viral vector according to Item 1 which is cDNA of a recombinant viral RNA having a sequence.
  • Item 3. The cDNA of the recombinant viral RNA has a sequence in which the G gene and M gene are disrupted in the Borna disease virus genome, and a foreign gene is present in the untranslated region linked downstream of the translated region of the P gene.
  • the viral vector according to Item 1 or 2 which is a cDNA of a recombinant viral RNA having an inserted sequence.
  • Item 4. (A) cDNA of a recombinant virus in which a foreign virus is inserted into an untranslated region between the P gene translation region and the M gene translation region of the cDNA encoding the Borna disease virus genome Item 5.
  • (A) cDNA encoding (b1) hammerhead ribozyme is arranged upstream of cDNA of recombinant viral RNA, and (b2) cDNA sequence encoding hepatitis delta virus ribozyme is arranged downstream of (a) Item 6.
  • the viral vector according to any one of Items 1 to 5, wherein
  • Item 7. A recombinant virus comprising RNA encoded by the viral vector according to any one of Items 1 to 6.
  • Item 8. A step of introducing a plasmid or a group of plasmids expressing the N gene, P gene and L gene of Borna disease virus as a helper plasmid together with the viral vector according to any one of Items 1 to 6 into the cell in vitro, and the viral vector; And a method for producing a recombinant virus, comprising a step of culturing cells into which a helper plasmid has been introduced to produce a recombinant virus.
  • Item 9. Item 9.
  • Item 10. The method for producing a recombinant virus according to Item 8 or 9, wherein a plasmid expressing the Borna disease virus M gene is further introduced into cells in vitro as a helper plasmid.
  • Item 11 A method for introducing an exogenous gene, comprising a step of infecting a cell or an animal with the recombinant virus according to Item 7 or the recombinant virus produced by the method according to any one of Items 8 to 10.
  • Item 12. An exogenous gene introduction agent comprising the recombinant virus according to Item 7 or the recombinant virus produced by the method according to any one of Items 8 to 10.
  • Item 13 An agent for introducing an exogenous gene into a brain nervous system cell, comprising the recombinant virus according to Item 7 or the recombinant virus produced by the method according to any one of Items 8 to 10.
  • Item 14 An exogenous gene introduction kit comprising the viral vector according to any one of Items 1 to 6.
  • the present invention also includes the following methods, uses and the like.
  • a method for introducing an exogenous gene into a brain nervous system cell wherein the recombinant virus according to Item 7 or the recombinant virus produced by the method according to any one of Items 8 to 10 is administered to an animal; Use of the recombinant virus according to Item 7 or the recombinant virus produced by the method according to any one of Items 8 to 10 for producing an exogenous gene introduction agent.
  • Item 11 Use of the recombinant virus according to Item 7 or the recombinant virus produced by the method according to any one of Items 8 to 10 for producing an exogenous gene introduction agent into brain nervous system cells.
  • Item 11 A recombinant virus according to Item 7 or a recombinant virus produced by the method according to any one of Items 8 to 10 for introducing a foreign gene into a cerebral nervous system cell.
  • the infectious host range is wide, the efficiency of exogenous gene introduction is high, the viral genome is not inserted into the host chromosome, it is safe, and the exogenous gene can be expressed non-cytotoxically in the cell nucleus. Therefore, the stability and persistence in the host cell is good, and the foreign gene can be selectively introduced into the target cell such as a cell of the cranial nervous system and is not transmitted to cells other than the target cell. Therefore, a virus vector and a recombinant virus that can produce a recombinant virus with low pathogenicity (high safety) with high productivity can be produced.
  • a foreign gene can be selectively and efficiently introduced into a target cell such as a cranial nervous system cell, and the foreign gene can be continuously expressed in the cell.
  • the recombinant virus produced from the viral vector of the present invention causes persistent infection in the nucleus of cells such as cranial nervous system cells, it is difficult to be attacked by host immunity and difficult to eliminate.
  • the P protein possessed by the recombinant virus of the present invention has a function of inhibiting the host immunity response pathway, and activation of innate immunity does not occur in virus-infected cells.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of the genome (wild type) of Borna disease virus.
  • FIG. 2 (a) schematically shows an untranslated region (1875 to 1895 as base numbers of the BDV genome) between the ORF of the P gene and the ORF of the M gene in the cDNA of the wild-type BDV genome.
  • B is a diagram schematically showing an example of a foreign gene insertion site in the virus vector of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram schematically showing an example of the structure of the viral vector of the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing the structure of a recombinant viral vector (rBDV-5′GFP) in which a GFP gene is inserted into the untranslated region on the 5 ′ end side of the BDV genome.
  • FIG. 5 is a graph showing changes over time in Vero cells infected with wild-type or recombinant BDV (change in infection rate from 0 to 19 days after infection).
  • FIGS. 6 (a) and 6 (b) show the results of examining the gene expression in cells infected with wild-type BDV, recombinant virus p / mGFP and recombinant virus 5′GFP by Northern blotting (a), And (b) shows the results of examining protein expression by Western blotting.
  • FIGS. 7a to f are photomicrographs showing the results of examining protein expression in cells infected with wild type BDV, recombinant virus p / mGFP and recombinant virus 5'GFP, respectively.
  • FIGS. 8a to 8f are photomicrographs showing the results of examining protein expression in cells infected with wild-type BDV, recombinant virus p / mGFP, and recombinant virus 5'GFP, respectively.
  • FIG. 9 is a diagram for explaining an experimental method for examining viral infection in the rat brain.
  • FIG. 10 is a diagram showing the site of inoculation of virus into the rat brain.
  • FIGS. 12a to 12d are a macro photograph (a and b) in which a rat brain is dissected 14 days after inoculation of the recombinant virus and turned over, and a macro fluorescence photograph (c and d) of the brain.
  • 13A and 13B are a macrophotograph (upper figure) of a cerebral cortex of a rat brain infected with a virus and a micrograph (ad) of a section of the cerebral cortex, respectively.
  • FIGS. 12a to 12d are a macrophotograph (upper figure) of a cerebral cortex of a rat brain infected with a virus and a micrograph (ad) of a section of the cerebral cortex, respectively.
  • FIGS. 15 (a) and 15 (b) are photomicrographs showing the results of examining protein expression in cells infected with the recombinant virus obtained from the rBDV-p / mDsRed vector.
  • FIGS. 15 (a) and 15 (b) are micrographs (a) and luciferase activities (FIG. 15) showing the results of examining protein expression in cells infected with the recombinant virus obtained from the rBDV-p / mLuci vector, respectively. It is a figure which shows b).
  • FIG. 16 is a diagram schematically showing an example of the structure of the viral vector of the present invention.
  • FIG. 17 is a diagram schematically showing an example of the structure of the virus vector of the present invention.
  • FIG. 16 is a diagram schematically showing an example of the structure of the viral vector of the present invention.
  • FIG. 18 is a fluorescence micrograph (FIG. 18a: macro photo, FIG. 18b: 400 ⁇ enlarged photo of FIG. 18a) of the brain cut surface of the mouse 8 months after inoculation with the recombinant virus.
  • FIG. 19 is a diagram showing an outline of the preparation procedure of plasmid p / mGFP ⁇ G.
  • FIG. 20 is a diagram showing an outline of the preparation procedure of plasmid p / mGFP ⁇ G LL.
  • FIG. 21 is a diagram showing an outline of a procedure for preparing a BDV G gene expression plasmid.
  • FIG. 22 is a diagram comparing the recombinant BDV production ability of plasmids p / mGFP ⁇ G and p / mGFP / ⁇ G LL, respectively.
  • FIG. 23 is a graph showing the transition of the infection rate of p / mGFP ⁇ G-LL virus to Gero stably expressing Vero cells and Vero cells.
  • FIG. 24a is a diagram showing the results of examining protein expression in cells infected with wild-type BDV and G-deficient recombinant virus by Western blotting, and FIG. 24b shows infection with G-deficient recombinant virus.
  • FIG. 3 is a fluorescence micrograph of Vero cells expressing GFP.
  • FIG. 25 is a diagram showing an outline of a procedure for preparing a chimeric protein expression plasmid having a BDV G gene intracellular region and vesicular stomatitis virus (VSV) G gene extracellular and transmembrane regions.
  • FIG. 26 is a diagram showing the recovery efficiency of G-deficient recombinant viruses when using the BDV G gene or any of the outer genes of VSV and rabies virus (Rab) as a helper plasmid.
  • FIG. 27 is a diagram showing an outline of a procedure for preparing a plasmid p / mGFP ⁇ M-G LL in which the M gene is deleted.
  • FIG. 28 is a diagram showing an outline of the production procedure of p / mGFP ⁇ M-G LL P-M tandem vector.
  • FIG. 29 shows the results of Western blotting of recombinant virus p / mNEP-infected cells.
  • FIG. 30 is a diagram showing the enzyme activity of NEP in cells infected with a recombinant virus.
  • FIG. 31 is a diagram showing an outline of a procedure for preparing a p / m miR155 introduction vector (pSIRIUS-B).
  • FIG. 32 is a diagram showing an outline of the procedure for preparing plasmid p / m miR155.
  • FIG. 33 is a diagram showing the transcription inhibition efficiency of a target gene in a cell infected with a recombinant virus.
  • FIG. 34 is a diagram showing an outline of the procedure for preparing plasmid p / m miRx2.
  • FIG. 35 is a schematic diagram of a p / m vector into which miRNA ⁇ 1 (p / m miR155), miRNA ⁇ 2, and miRNA ⁇ 4 are inserted.
  • FIG. 36 is a diagram showing the effect of infection with a recombinant virus p / m-miR-GAPDH having a recombinant viral RNA inserted with miRNA against GAPDH.
  • FIG. 37 is a diagram showing the effect of infecting a recombinant virus p / m-miR-APP having a recombinant virus RNA into which miRNA for APP (amyloid precursor protein) is inserted.
  • the viral vector of the present invention has (a) at least N gene, X gene, P gene and L gene in the Borna disease virus genome in the same order as in the Borna disease virus genome, and the translation region of the P gene
  • a recombinant viral RNA cDNA having a sequence in which an exogenous gene is inserted in an untranslated region linked downstream thereof, (b) a DNA encoding a ribozyme, and (c) a promoter sequence, upstream of the (a) And (b) is arranged downstream, and (a) and (b) are arranged downstream of (c).
  • the cDNA of the recombinant viral RNA of (a) is also simply referred to as “(a) cDNA of recombinant BDV genome”.
  • the viral vector of the present invention may contain sequences other than the above (a), (b) and (c) as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • the cDNA of (a) recombinant BDV genome in the present invention is a cDNA of recombinant BDV RNA having at least N gene, X gene, P gene and L gene in the BDV genome in the same order as in the Borna disease virus genome.
  • the recombinant BDV RNA has a sequence in which an exogenous gene is inserted into an untranslated region linked downstream of the translated region of the P gene.
  • a cDNA of such (a) recombinant BDV genome in the BDV genome or a sequence in which either or both of the G gene and M gene are disrupted in the BDV genome, an untranslated region linked downstream of the translated region of the P gene
  • a cDNA encoding a sequence having a foreign gene inserted therein is preferably used.
  • (a) as a cDNA of the recombinant BDV genome in the present invention a sequence in which either or both of the G gene and the M gene are disrupted in the BDV genome, and non-translation linked to the downstream of the translation region of the P gene
  • An RNA cDNA having a sequence in which a foreign gene is inserted in the region is preferred.
  • the cDNA of (a) recombinant BDV genome more preferably has a sequence in which the G gene is disrupted in the BDV genome and is exogenous in the untranslated region linked downstream of the translated region of the P gene. It is cDNA of a recombinant viral RNA having a sequence into which a gene has been inserted.
  • a virus vector containing a cDNA of a recombinant viral RNA having a sequence in which the G gene is disrupted as cDNA of the recombinant BDV genome is hereinafter also referred to as “G gene-deficient virus vector”.
  • the recombinant virus produced from the viral vector does not propagate to cells other than the introduced cells, so that pathogenicity is reduced and safety is high. More preferably, a recombinant virus having a sequence in which the G gene and M gene are disrupted in the BDV genome, and a sequence in which a foreign gene is inserted in an untranslated region linked downstream of the translated region of the P gene.
  • RNA cDNA Such a viral vector containing the cDNA of the recombinant viral RNA is hereinafter also referred to as “G gene and M gene deficient viral vector”.
  • Disrupting a gene usually means that the gene does not exist in a form capable of encoding a protein (for example, G protein in the case of G gene).
  • the gene can be destroyed by deleting a part of the gene, inserting another sequence into the gene, or replacing an amino acid in the gene with another amino acid. it can.
  • the intron of the L gene in the BDV genome is deleted.
  • the ORF of the L gene that is fragmented in the natural BDV genome is linked as shown in FIG. 16, so that the replication ability of the recombinant virus, that is, the foreign gene in the cell Expression efficiency is further improved.
  • the intron of the L gene is deleted, a larger foreign gene can be inserted.
  • the intron of the L gene can be removed by a known method.
  • a recombinant BDV genome cDNA a recombinant virus in which a foreign gene is inserted into an untranslated region between the P gene translation region and the M gene translation region of the cDNA encoding the BDV genome.
  • cDNA can also be used.
  • Such a recombinant BDV genome cDNA is a cDNA encoding a BDV genome (RNA virus genome), and is arbitrarily located in an untranslated region between the translation region (ORF) of the P gene of BDV and the translation region of the M gene. A foreign gene has been inserted.
  • FIG. 3 schematically shows an example of the cDNA structure of (a) the recombinant BDV genome in the virus vector of the present invention.
  • FIG. 3 is a cDNA of a recombinant virus in which a foreign gene is inserted into an untranslated region between the translated region of the P gene and the translated region of the M gene of cDNA encoding the BDV genome.
  • FIG. 16 schematically shows an example of a preferable structure of (a) cDNA of recombinant BDV genome in the virus vector of the present invention.
  • the cDNA of the recombinant BDV genome shown in FIG. 16 has a sequence in which the G gene is disrupted (deleted) in the BDV genome, and an exogenous gene is present in the untranslated region linked downstream of the translated region of the P gene.
  • Recombinant viral RNA cDNA with an inserted sequence is provided.
  • FIG. 17 schematically shows an example of another preferred structure of (a) cDNA of recombinant BDV genome in the virus vector of the present invention.
  • the cDNA of the recombinant BDV genome shown in FIG. 17 has a sequence in which the G gene and M gene are destroyed (deleted) in the BDV genome, and is foreign in the untranslated region linked downstream of the translated region of the P gene.
  • It is a cDNA of a recombinant viral RNA having a sequence into which a sex gene has been inserted.
  • M surrounded by a dotted line in FIG. 17 indicates the deleted M gene.
  • the L gene is divided by the G gene.
  • the L gene in the BDV genome is deleted by partially deleting the G gene. Since the intron is deleted, the ORF of the L gene is linked at the part indicated by the arrow in the figure.
  • the BDV genome in the present invention may be a gene belonging to a virus belonging to Bornaviridae (Bornaviridae) or a mutant strain thereof.
  • viruses belonging to the Bornaviridae include strains such as He80, H1766, Strain V, and huP2br.
  • mutant strain include No / 98, Bo / 04w, HOT6, and the like.
  • the BDV genome retains its function as a BDV
  • a part of these genome sequences may be substituted with other bases, deleted, or newly inserted, and further, one of the base sequences.
  • the part may be rearranged. Any of these derivatives can be used in the present invention.
  • the part may be, for example, 1 to several (usually 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2) in terms of amino acid residues.
  • BDV genome and cDNA of RNA having a sequence in which G gene or the like is disrupted in BDV genome can be prepared based on the virus genome information.
  • cDNA can be prepared from an RNA genome using a sequence reversal enzyme.
  • RNA cDNA having a sequence in which the G gene is disrupted in the BDV genome can be easily prepared, for example, by performing PCR using the BDV genome cDNA as a template and using appropriate primers.
  • RNA cDNA having a sequence in which the G gene and the M gene are disrupted in the BDV genome is, for example, a BDV genome cDNA or an RNA cDNA having a sequence in which the G gene is disrupted in the genome as a template and an appropriate primer. And can be easily prepared by performing PCR. Further, it can be chemically synthesized using a DNA synthesizer based on the sequence of the RNA genome or a sequence obtained by deleting the G gene from the RNA genome. Alternatively, as a method for obtaining cDNA of (a) recombinant BDV genome in the present invention, a method using a known amplification means such as PCR can be mentioned. Operations such as PCR and primer preparation can be performed by a known genetic engineering technique (gene manipulation technique).
  • the cDNA of the recombinant BDV genome is a cDNA of a recombinant viral RNA having a sequence in which an arbitrary foreign gene is inserted in the untranslated region linked downstream of the ORF of the P gene in the BDV genome.
  • the untranslated region linked downstream of the ORF of the P gene is an untranslated region between the translated region of the P gene and the translated region of the M gene (hereinafter simply referred to as “P gene and M gene”). It is also referred to as “the non-translated region between”.
  • the recombinant virus productivity of the viral vector that is, the replication efficiency of the recombinant virus produced from the viral vector can be increased.
  • Recombinant virus can be produced.
  • a recombinant virus produced (replicated) from the viral vector can efficiently express a foreign gene when introduced into a cell. Therefore, when the viral vector of the present invention is introduced into a cell, or when a cell is infected with a recombinant BDV produced from the viral vector, any foreign gene is efficiently introduced into the cell. That is, the foreign gene is efficiently expressed in the cell. As shown in FIG.
  • the BDV genome base numbers 1875 to 1895 ie, bases 1875 to 1895 of SEQ ID NO: 1
  • Base numbers 1875 to 1882 and the start signal sequence of the M gene (base numbers 1875 to 1890 of SEQ ID NO: 1).
  • the insertion site of the foreign gene in the untranslated region between the translated region of the P gene and the translated region of the M gene is a P gene stop signal.
  • a region that does not include the sequence and / or the start signal sequence of the M gene is preferable, and a region that does not include the stop signal sequence of the P gene and the start signal sequence of the M gene is more preferable.
  • the base number of SEQ ID NO: 1 is particularly preferably between 1890 and 1891.
  • the recombinant BDV genome in the present invention can contain restriction enzyme sites on both sides or one side (preferably on both sides) of the foreign gene. It is preferable to have a restriction enzyme site, since the foreign gene can be easily incorporated into the BDV genome sequence and the translation efficiency of the foreign gene into the protein is increased.
  • the restriction enzyme sites that can be arranged on both sides or one side of the foreign gene include, for example, the Bst'BI site, Pac I site, Sse8387 I site, and Swa I for the 3 ′ end side of the foreign gene. Site, Kpn I site, etc., and Bst BI site is preferred. Examples of the 5 ′ terminal side of the foreign gene include Pac I site, Bst BI site, Sse8387 I site, Swa I site, Kpn I site and the like, and Pac I site is preferable.
  • the cDNA of the recombinant BDV genome in the present invention contains an M gene
  • the cDNA of the recombinant BDV genome includes a foreign gene (and restriction enzyme sites arranged on both sides or one side as required) and P. Between the gene ORF and between the exogenous gene (and restriction enzyme sites located on either side or one side as required) and the M gene ORF, respectively, It is preferred that there is a sequence containing the start signal sequence (taaaaaatcgaatca (SEQ ID NO: 11)).
  • SEQ ID NO: 11 the start signal sequence taaaaaatcgaatca
  • FIG. 2 (b) shows a recombinant BDV genome cDNA containing the M gene as an example.
  • a sequence comprising a P gene stop signal sequence and an M gene start signal sequence (SEQ ID NO: 11) downstream of the foreign gene. It is preferable to have.
  • the stop signal sequence of the P gene and the start signal sequence of the M gene shown in FIG. 2B are the stop signal of the foreign gene and the start of the L gene. Acts as a signal.
  • FIG. 2 (b) shows an example in which a Bst BI site is inserted at the 3 ′ end side of the foreign gene and a Pac I site is inserted at the 5 ′ end side of the foreign gene.
  • the restriction enzyme sites arranged on both sides are not limited to these.
  • the type and length of the exogenous gene in the present invention are not particularly limited, and a desired gene can be used according to the purpose.
  • a desired gene can be used according to the purpose.
  • cDNA of a gene encoding a protein or peptide siRNA, cDNA encoding short hairpin RNA (shRNA), microRNA DNA (miRNA), cDNA encoding RNA aptamer, or the like can be used.
  • shRNA short hairpin RNA
  • miRNA microRNA DNA
  • the ribozyme may be any sequence that can cleave any foreign gene transcribed from the cDNA of the recombinant virus (a).
  • Examples of (b) include DNA such as cDNA encoding ribozymes such as hammerhead ribozyme (HamRz), hepatitis delta virus ribozyme (HDVRz), hairpin ribozyme, artificial ribozyme and the like.
  • DNA such as cDNA which codes the modified ribozyme of the said ribozyme, can also be used.
  • the modified ribozyme has a common sequence and 1 to several bases (for example, several are, for example, 10, preferably 5, more preferably 3, more preferably 2). And a polynucleotide comprising a deleted or added base sequence and functioning as a ribozyme.
  • a DNA encoding hamRz (preferably cDNA) is located upstream of the cDNA of the recombinant BDV genome, ie, at the 3 ′ end, and downstream of the (a), ie, 5 ′ end.
  • a DNA (preferably cDNA) sequence encoding HDVRz is arranged on the side. Thereby, the expression efficiency of the foreign gene in the cell is improved.
  • the base sequence of HamRz is described in Yanai et al., Microbes and Infections 8 (2006) 1522-1529, Mercier et al., J. Virol. 76 (2002) 2024-2027 and Inoue et al., J. Virol. Methods 107 (2003) 229-236.
  • the base sequence of HDVRz is Ferre-D'Amare, AR, Zhou, K. and Doudna, JA Crystal structure of a hepatitis delta virus ribozyme. Nature 395 (6702), 567-574 (1998) Etc. are described.
  • cDNA encoding the base sequence of HamRz described in these documents can be used.
  • HamRz 5'-UUGUAGCCGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUAUAGGAAAGGAAUUCCUAUAGUCAGCGCUACAACAAA-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • HDVRz 5'-GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACACCAUUGCACUCCGGUGGCGAAUGGGAC-3 ' (SEQ ID NO: 3)
  • RNA polymerase II promoter sequences examples include RNA polymerase II promoter sequences, RNA polymerase I promoter sequences, and T7 polymerase promoter sequences. Among them, RNA polymerase II promoter sequences are included. preferable. Examples of the RNA polymerase II promoter include CMV promoter and CAGGS promoter. Among these, CAGGS promoter is particularly preferable. Such a promoter sequence is, for example, JA Sawicki, RJ Morris, B. Monks, K. Sakai, J. Miyazaki, A composite CMV-IE enhancer / b-actin promoter is ubiquitously expressed in mouse cutaneous epithelium, Exp. 244 (1998) 367-369.
  • a cDNA encoding a hammerhead ribozyme is disposed upstream of (a) a recombinant viral RNA cDNA (cDNA of a recombinant BDV genome), and downstream of the (a) (B2) a cDNA sequence encoding hepatitis ⁇ virus ribozyme is arranged. Further, (a) and (b) are arranged downstream of the promoter of (c) RNA polymerase II system.
  • the viral vector of the present invention can contain a partial or entire sequence of the SV40 viral replication origin / promoter region sequence. Further, when the viral vector contains a part or all of the SV40 viral replication origin / promoter region sequence, the sequence is preferably arranged downstream of (a) and (b). As a part of the SV40 viral DNA replication origin / promoter region sequence, a fragment consisting of 113 bases on the 5 ′ side in the SV40 replication origin / promoter region is suitable.
  • SV40 virus replication origin / promoter region sequence (SEQ ID NO: 4) is, for example, DA Dean, BS Dean, S. Muller, LC Smith, Sequence requirements for plasmid nuclear import, Exp. Cell. Res. 253 (1999) 713- 722 etc.
  • the viral vector of the present invention further encodes one or more factors advantageous for protein expression, such as an enhancer, an activator (for example, a trans-acting factor), a chaperone, and a processing protease, as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • factors advantageous for protein expression such as an enhancer, an activator (for example, a trans-acting factor), a chaperone, and a processing protease, as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • multiple nucleic acid sequences can also be included.
  • the viral vector of the present invention may have any factor that is functional in the selected cell.
  • the viral vector of the present invention may be linear DNA or circular DNA, but is preferably circular when introduced into a cell.
  • the circular virus vector include the DNAs (a), (b) and (c), which are essential sequences of the virus vector of the present invention, and the DNA (d) contained as necessary.
  • Examples include those arranged in a commercially available plasmid vector in the above-described predetermined order.
  • a commercially available plasmid vector may be any plasmid vector as long as it is capable of self-replication in a cell into which a viral vector is introduced. Examples thereof include pBluescript SKII ( ⁇ ), pCAGGS, pCXN2, and pCDNA3.1.
  • the production method of the viral vector of the present invention is not particularly limited, and a known genetic engineering technique may be used.
  • a known genetic engineering technique may be used.
  • the CAT gene is replaced with the genomic sequence of BDV, and the P gene
  • the self-replicating (persistent infection type) virus vector of the present invention is inserted by inserting a target foreign gene into a non-translated region (non-translated region between P gene and M gene) linked downstream. Can be produced.
  • the viral vector prepared by the above method comprises: (a) a recombinant viral RNA cDNA that is a foreign gene in the untranslated region between the P gene translation region and the M gene translation region of the cDNA encoding the BDV genome. And a recombinant virus cDNA (for example, a recombinant virus cDNA having a structure schematically shown in FIG. 3).
  • the G gene-deficient virus vector and the G gene and M gene-deficient virus vector can be obtained by using, for example, (a) a cDNA encoding a BDV genome as a cDNA of a recombinant virus RNA.
  • CDNA of a recombinant virus in which a foreign gene is inserted into a non-translation region between the translation region of the P gene and the translation region of the M gene for example, (a) a recombinant virus RNA having the structure schematically shown in FIG.
  • the G gene-deficient virus vector in the present invention can be prepared by inserting a deletion mutation or the like into the G gene by PCR or the like using the self-replicating virus vector having (cDNA) as a template.
  • the intron portion of the L gene is similarly scraped by PCR to produce a more preferred G gene-deficient virus vector in the present invention.
  • the G gene and M gene deficient virus vectors can be prepared by deleting the M gene by PCR or the like using the G gene deficient virus vector as a template.
  • the circular viral vector is used in the region other than (a) the cDNA region of the recombinant BDV genome, (c) the promoter sequence region, and other signal sequence regions necessary for protein expression.
  • a linear viral vector can be prepared by appropriately selecting a restriction enzyme that cleaves at one site according to the type of the vector and cleaving the circular viral vector with the restriction enzyme.
  • a method for introducing the foreign gene contained in the viral vector of the present invention into the target cell a method for introducing the viral vector into the target cell together with a helper plasmid described later, a recombinant virus produced from the viral vector is used as the target cell.
  • a method using a recombinant virus produced from a viral vector is preferred.
  • the recombinant virus produced from the viral vector of the present invention is a recombinant BDV having RNA encoded by the viral vector in place of the wild-type BDV genome.
  • Recombinant virus A recombinant virus containing RNA encoded by the above-described viral vector is also one aspect of the present invention.
  • it is a recombinant virus containing RNA encoded by a viral vector, and N protein of BDV, P protein of BDV and L protein of BDV.
  • the recombinant virus of the present invention is a persistently-infected recombinant virus that contains the above-mentioned recombinant BDV genome and can continuously express a foreign gene after infection of cells.
  • the recombinant virus may optionally have a BDV G protein or an outer shell protein of another virus, and may further have a BDV M protein.
  • the outer shell gene in the present invention is a gene encoding a viral outer shell protein. In BDV, the gene encoding the outer shell protein is the G gene.
  • the recombinant virus of the present invention includes, for example, a step of introducing a plasmid or a group of plasmids expressing the N gene, P gene and L gene of BDV as a helper plasmid together with the above virus vector into an in vitro cell, and the virus vector and It can be prepared by a method comprising a step of culturing cells into which a helper plasmid has been introduced to produce a recombinant virus.
  • a method for producing a recombinant virus is also one aspect of the present invention.
  • a recombinant virus can be produced in vitro.
  • In vitro cells into which viral vectors and helper plasmids are introduced are usually cultured cells.
  • a G gene-deficient virus vector when used, it is preferable to introduce a plasmid that expresses the outer gene of the virus into an in vitro cell as a helper plasmid.
  • the outer gene of the virus may be appropriately selected according to the target cell into which the foreign gene is introduced, and the outer gene of a virus other than BDV G gene or BDV can be used.
  • the G gene and M gene deficient virus vectors when used, it is preferable to introduce a plasmid expressing the M gene of BDV virus into the cells as a helper plasmid.
  • the plasmid or plasmid group expressing the N gene, P gene and L gene of the BDV, and the plasmid expressing the outer gene of the virus and the M of the BDV virus. It is preferable to introduce a plasmid expressing the gene into cells in vitro.
  • the helper plasmid may be any one that can express the N gene, the P gene, the L gene and the M gene of BDV, and the outer gene of the virus, and two or more of these genes are included in one plasmid. These genes may be contained in different plasmids. For example, as a plasmid for expressing the N gene, P gene, and L gene of BDV, any one of the following plasmids (1) to (4) or a plasmid group is preferably used.
  • a plasmid expressing the N gene of BDV, a plasmid expressing the P gene of BDV, and a plasmid expressing the L gene of BDV (2) A plasmid expressing the N and P genes of BDV, and the L gene of BDV Plasmid to be expressed (3) Plasmid to express BDV N gene and L gene, and plasmid to express BDV P gene (4) Plasmid to express BDV N gene, L gene and P gene
  • a helper plasmid provides a viral protein necessary for BDV genome replication, and an infectious recombinant virus can be produced by introducing a helper plasmid into a cell together with a viral vector.
  • the plasmid (group) of any one of (1) to (4) that expresses the BDV N gene, P gene and L gene in a helper plasmid the plasmid group of any one of (1) to (3) is preferable.
  • the virus vector used in the method for producing the recombinant virus of the present invention and the preferred embodiment thereof are the same as described above.
  • the helper plasmid in the present invention is not limited as long as it can express the N gene, the P gene, and the L gene of BDV in the cell when introduced into the cell together with the virus vector.
  • the plasmid expressing the BDV N gene is preferably a plasmid in which the BDV N gene cDNA is arranged downstream of the promoter sequence.
  • a plasmid for expressing the BDV P gene a plasmid in which the BDV P gene cDNA is arranged downstream of the promoter sequence is preferable.
  • a plasmid for expressing the BDV L gene a plasmid in which the BDV L gene cDNA is arranged downstream of the promoter sequence is preferably used.
  • plasmid for expressing the BDV N gene and P gene a plasmid in which the BDV N gene cDNA and the P gene cDNA are arranged in this order downstream of the promoter sequence.
  • a plasmid for expressing the BDV N gene and L gene a plasmid in which the BDV N gene cDNA and the P gene cDNA are arranged in this order downstream of the promoter sequence.
  • a plasmid for expressing BDV N gene, L gene and P gene a plasmid in which BDV N gene cDNA, L gene cDNA and P gene cDNA are arranged in this order downstream of the promoter sequence.
  • the helper plasmid is introduced into the cell together with the G gene-deficient viral vector, and the BDV N gene, P gene, L gene and virus in the cell. Any gene can be used as long as it can express the outer shell gene.
  • the helper plasmid may be any one that can further express the BDV M gene in the cell.
  • the plasmid that expresses the outer gene of the virus and the plasmid that expresses the M gene of BDV can be used together with any of the plasmids (groups) described in (1) to (4) above, for example. Furthermore, as a plasmid that expresses the outer shell gene, a plasmid that expresses one or more genes selected from the group consisting of the N gene, the L gene, and the P gene of BDV, and the outer shell gene of the virus can also be used. As the plasmid for expressing the outer shell gene, a plasmid in which the cDNA of the outer shell gene is arranged downstream of the promoter sequence is preferable.
  • the outer shell protein encoded by the outer shell gene such as G gene of BDV is usually a transmembrane protein, and its amino acid sequence includes a region located outside the cell (extracellular sequence), a transmembrane region (transmembrane through the cell membrane). Sequence) and a region located within the cell (intracellular sequence).
  • the outer shell gene in the helper plasmid may be the G gene of BDV.
  • the envelope genes of all envelope viruses that use the host cell membrane as the outer shell such as vesicular stomatitis virus, rabies virus, measles virus, and retrovirus, are used.
  • the intracellular sequence of the G protein of BDV is encoded as the intracellular sequence.
  • the outer shell gene in the present invention has the intracellular sequence of the G protein of BDV as the intracellular sequence, and has the extracellular sequence and the transmembrane sequence of the outer shell protein of any virus (virus other than BDV or BDV).
  • a gene encoding a protein is preferable.
  • the intracellular sequence of the G protein of BDV as the intracellular sequence, the recombinant virus production efficiency is improved.
  • the gene sequence encoding the intracellular sequence in the shell gene is converted into the intracellular sequence of the G protein of BDV by a known genetic engineering technique. It is preferable to use it by substituting it with a sequence encoding.
  • the cell directivity of the produced virus can be changed depending on the type of virus from which the gene is derived. For example, when infecting epithelial cells, respiratory cells, etc. with a recombinant virus, viruses with high directivity to epithelial cells, respiratory cells, etc.
  • helper plasmid that expresses an outer shell gene that encodes the extracellular sequence of the outer shell protein and the transmembrane sequence of the outer shell protein and the intracellular sequence of the G protein of BDV.
  • a plasmid that expresses the M gene a plasmid that expresses one or more genes selected from the group consisting of the BDV N gene, L gene, P gene, and viral coat gene, and a BDV M gene may also be used. it can.
  • a plasmid for expressing the M gene a plasmid in which the BDV M gene cDNA is arranged downstream of the promoter sequence is preferable.
  • BDV N gene cDNA, P gene cDNA, and L gene cDNA can be prepared based on the sequence information of the BDV N gene, P gene, and L gene, respectively.
  • the BDV M gene cDNA and G gene cDNA can be prepared based on the sequence information of the BDV M gene and G gene, respectively.
  • cDNA can be prepared from RNA using sequence reversal enzymes. Further, it can be chemically synthesized using a DNA synthesizer based on the RNA sequence.
  • BDV N gene, P gene and L gene, and M gene and G gene examples include Cubitt, B., Oldstone, C. and de la Torre, JC Sequence and genome organization of Borna disease virus. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994) can be used. Moreover, as these genes, RNA synthesized according to the above sequence can also be used. Furthermore, it is possible to obtain fragments by hybridization and PCR methods based on amino acid sequences conserved among BDV N, P, L, M and G proteins. Furthermore, it is possible to obtain fragments by degenerate RT-PCR using mix primers designed based on the sequences of other known N gene, P gene, L gene, M gene and G gene of BDV. .
  • the base sequence of the obtained fragment can be determined by a usual method.
  • the proteins encoded by the genes are BDV N protein, P protein and L protein, and M gene and G protein, respectively.
  • a part of the base sequence may be substituted, deleted or newly inserted with another base, and a part of the base sequence may be rearranged. Any of these derivatives can be used in the present invention.
  • the part may be, for example, 1 to several (1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2) in terms of amino acid residues.
  • an N gene for example, a polypeptide having a sequence identity of at least about 90%, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more with the BDV N gene and having the function of an N protein RNA encoding can also be used as the N gene of BDV in the present invention.
  • An RNA encoding a polypeptide having a sequence identity of at least about 90%, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more with the P gene of BDV and having a function of P protein is also provided in the present invention. It can be used as the P gene of BDV in the invention.
  • RNA encoding a polypeptide having a sequence identity of at least about 90%, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more with the L gene of BDV and having the function of L protein is also used in the present invention. It can be used as L gene of BDV.
  • An RNA encoding a polypeptide having a sequence identity of at least about 90%, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more with the G gene of BDV and having the function of a G protein is also used in the present invention. It can be used as the G gene for BDV.
  • RNA encoding a polypeptide having a sequence identity of at least about 90%, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more with the M gene of BDV and having the function of M protein is also used in the present invention. It can be used as the M gene for BDV. Sequence identity is determined by CLUSTAL W, GCG program, GENETYX, BLAST search.
  • vesicular stomatitis virus is GeneBank, No: J02428.1
  • rabies virus is GeneBank, No: AB044824.1.
  • a sequence encoding an extracellular sequence and a transmembrane sequence of the outer shell protein in these outer shell genes is used.
  • the sequence encoding the extracellular and transmembrane sequences of the outer shell protein in the outer shell gene is Garry RF. Proteomics computational analyses suggest that the bornavirus glycoprotein is a class III viral fusion protein ( ⁇ penetrene).
  • RNA synthesized according to the above sequence can also be used.
  • an RNA encoding a polypeptide having at least about 90%, preferably about 95% or more, more preferably about 98% or more sequence identity with such an outer shell gene and having the function of an outer shell protein. can also be used as a viral coat gene in the present invention.
  • the circular helper plasmid is, for example, one or more factors that are advantageous for protein expression, such as an enhancer or activator in a form in which a promoter sequence, which is an essential sequence of the helper plasmid in the present invention, and a protein cDNA are arranged. It can also include one or more nucleic acid sequences encoding (eg trans-acting factors), chaperones, processing proteases. It may also have any factor that is functional in the selected cell.
  • the helper plasmid is preferably constructed using a commercially available plasmid vector capable of self-replication in a cell into which the helper plasmid is introduced.
  • Examples of commercially available plasmid vectors include pCAGGS, pCXN2, and pCDNA3.1. It is done.
  • the promoter sequence in the helper plasmid is preferably an RNA polymerase II type promoter.
  • helper plasmids can be prepared by a known genetic engineering technique.
  • a plasmid that expresses the N gene of BDV a plasmid that expresses the P gene of BDV, and a plasmid that expresses the L gene of BDV are described in “Materials and” of Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529. It can be prepared by the method described in 2.2 Plasmid construction of “methods”.
  • the plasmid expressing the N gene and the P gene of BDV for example, from the unique restriction enzyme sequence region downstream of the cDNA of the N gene of the plasmid expressing the N gene of BDV, the signal sequence such as cDNA and promoter of N gene It can be prepared by appropriately selecting a restriction enzyme that does not cut and inserting the BDV P gene cDNA into the restriction enzyme site.
  • a plasmid expressing the N gene and L gene of BDV is, for example, a signal sequence such as a cDNA or promoter of the N gene from a unique restriction enzyme sequence region downstream of the cDNA of the N gene of the plasmid expressing the N gene of BDV.
  • It can be prepared by appropriately selecting a restriction enzyme that does not cleave and inserting BDV L gene cDNA into the restriction enzyme site.
  • a sequence such as a promoter sequence that promotes the expression of the L gene or the P gene or an internal ribosome entry site It is also possible to insert.
  • a plasmid expressing the BDV G gene is prepared by using a BDV G gene cDNA in place of the BDV N gene cDNA in the production of a helper plasmid expressing the BDV N gene, L gene or P gene. be able to. For example, it can be manufactured according to the method shown in Example 7 and FIG. 21 as an example.
  • a plasmid expressing the M gene of BDV can be prepared, for example, according to the method described in the instructions attached to pEF4 / myc-His A, B, and C (Invitrogen).
  • a helper plasmid that encodes the extracellular sequence and transmembrane sequence of the outer shell protein of a virus other than BDV and expresses the outer shell gene encoding the intracellular sequence of the G protein of BDV is, for example, an outside of a virus other than BDV.
  • a plasmid that expresses the shell gene as a template PCR is performed using appropriate primers, and the sequence encoding the intracellular sequence of any viral outer shell gene is replaced with the sequence encoding the intracellular sequence of the BDV G protein. It can produce by doing.
  • Such a helper plasmid can also be prepared, for example, according to the method described in Example 8 and FIG.
  • the gene sequence encoding the intracellular sequence of the G protein of BDV is, for example, the 3712-3747th sequence (the 3712-3747th base of SEQ ID NO: 1) in the BDV genome whose cDNA sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • a vector composition containing the virus vector can be used.
  • the vector composition may contain a helper plasmid in addition to the viral vector.
  • the vector composition contains other components such as an appropriate buffer solution, phosphate buffered saline, cell culture standard solution, etc., depending on the introduction method and introduction target. May be.
  • the content of the viral vector in the vector composition may be appropriately selected according to the infection method, the infection target, and the like, and includes, for example, a viral vector having a DNA concentration of about 0.25 to 2.0 ⁇ g / ⁇ L. It is preferable.
  • each helper plasmid in the vector composition is preferably about 0.0125 to 0.125 ⁇ g per 1 ⁇ g of the virus vector.
  • the method for introducing the viral vector and the helper plasmid into cells in vitro is not particularly limited, and for example, a method known per se using a commercially available transfection reagent can be employed.
  • commercially available transfection reagents include, but are not limited to, FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics (registered trademark), Pleasanton, CA).
  • FuGENE 6 transfection reagent FuGENE 6 transfection reagent
  • an appropriate amount of a commercially available transfection reagent is added to a vector composition containing the above-mentioned amounts of virus vector and helper plasmid, buffer, and the like, and this is usually about 10 3 to 10 per 1 ⁇ g of virus vector.
  • a viral vector and a helper plasmid can be introduced into the cells by adding about 10 4 to 10 7 cells.
  • the viral vector and helper plasmid may be introduced into the cell at the same time or may be introduced separately.
  • the order of introduction when separately installed is not particularly limited.
  • the cell into which the viral vector is introduced may be any mammalian cultured cell that can produce the recombinant virus of the present invention by introducing the viral vector, and examples thereof include human kidney-derived 293T cells and BHK cells. It is done.
  • a cell that constantly expresses the outer shell gene used in the helper plasmid that expresses the outer shell gene can be prepared by introducing the outer shell gene into cells such as 293T cells and BHK cells using various plasmids that express the outer shell gene.
  • a plasmid that expresses the outer shell gene is usually produced by introducing the outer shell gene into the plasmid according to the method described in the instructions attached to the various expression plasmids.
  • the above-mentioned helper plasmid expressing the outer shell gene can also be suitably used.
  • the G gene and M gene deficient viral vectors are used, it is preferable to use cells that constantly express the outer shell gene used in the helper plasmid that expresses the M gene and outer shell gene of BDV.
  • Such cells are produced, for example, by introducing the BDV M gene and the outer shell gene into cells such as 293T cells and BHK cells in the same manner.
  • the plasmid expressing the outer shell gene and the plasmid expressing the BDV M gene are usually easily prepared by introducing the outer shell gene and the BDV M gene into the plasmid according to the instructions attached to the various expression plasmids. Manufactured.
  • the above-described helper plasmid expressing the outer shell gene, the helper plasmid expressing the BDV M gene, and the like can be preferably used.
  • the culture conditions such as the medium for producing the recombinant virus, the culture temperature, and the culture time may be appropriately set depending on the cell type.
  • the culture temperature is usually about 36 to 37 ° C. when 293T cells or BHK cells are used.
  • the medium Dulbecco's modified Eagle MEM medium is preferably used.
  • the culture time is usually about 24 to 96 hours, preferably about 36 to 48 hours.
  • the above culture produces a recombinant virus containing RNA encoded by the viral vector and BDV N, P, and L proteins in the cells into which the viral vector has been introduced.
  • BDV helper plasmid that expresses the viral outer gene
  • a recombinant virus containing the outer protein encoded by the gene is produced.
  • helper plasmid that expresses the outer gene of the virus and a helper plasmid that expresses the M gene of BDV are used in the introduction of the virus vector, the RNA encoded by the virus vector, and the N protein and P protein of BDV In addition to the L protein and the L protein, a recombinant virus containing the outer shell protein encoded by the outer shell gene and the M protein of BDV is produced.
  • Recombinant virus is produced in the cells into which the viral vector has been introduced.
  • the supernatant of the culture medium in which the cells are cultured is collected by centrifugation or the like, and BDV is used to infect cells such as monkeys. It is confirmed by infecting kidney-derived Vero cells, rat glia-derived C6 cells, human glia-derived OL cells and the like. Confirmation that the recombinant virus has been produced may be carried out after performing a step of mixing and culturing the cells producing the recombinant virus described later with cells having a high growth rate. For example, a recombinant virus can be confirmed by quantitative analysis of the expression of a foreign gene (such as GFP) in an infected cell.
  • a foreign gene such as GFP
  • That the produced virus is a persistent infectious type is that the expression of a foreign gene (such as GFP) in an infected cell is quantitatively analyzed and the next generation of recombinant virus is contained in the culture supernatant. This is confirmed by examining the production of particles.
  • the production of particles of the next generation recombinant virus in the culture supernatant means, for example, that the supernatant is recovered by centrifugation, etc., and this is further infected to other cells. This can be confirmed by examining the expression of a foreign gene derived from s.
  • the cell producing the recombinant virus in order to efficiently propagate the recombinant virus (for example, it is preferable to perform a step of mixing and culturing 293T cells and BHK cells) with cells having a high growth rate.
  • the infectious recombinant virus infects the cells having a high growth rate.
  • the infected virus grows with the growth of the cells, so that the recombinant virus can be efficiently propagated.
  • the cell having a high proliferation rate for example, Vero cell is suitable.
  • the mixing ratio of the cells that have produced the recombinant virus and the cells having a high growth rate is, for example, usually about 0.1 to 10 cells having a high growth rate with respect to one cell that has produced the recombinant virus. Preferably about 0.2 to 2.
  • Conditions for culturing cells having a high growth rate after mixed culture are not particularly limited.
  • the culture temperature is usually about 36 to 37 ° C., and usually 3 times with Dulbecco's modified Eagle MEM medium. Culturing is carried out for about 5 days, preferably about 3 days to 3 weeks.
  • a G gene-deficient virus vector When a G gene-deficient virus vector is used, it is preferable to use a cell that constantly expresses the outer shell gene used in the helper plasmid that expresses the outer shell gene as a cell having a high growth rate.
  • a cell can be prepared by introducing the gene into a cell such as a Vero cell using a plasmid that expresses the coat gene.
  • the outer shell gene using the helper plasmid that expresses the outer shell gene and the M gene of BDV are constantly expressed as cells having a high growth rate. It is preferred to use cells.
  • Such cells can be prepared, for example, by introducing a gene expressing an outer shell gene and a plasmid expressing the M gene of BDV into a Vero cell or the like.
  • the plasmid expressing the outer shell gene and the plasmid expressing the BDV M gene are usually easily prepared by introducing the outer shell gene and the BDV M gene into the plasmid according to the instructions attached to the various expression plasmids. Manufactured.
  • the plasmid expressing the outer shell gene and the plasmid expressing the BDV M gene the above-described helper plasmid expressing the outer shell gene, the helper plasmid expressing the BDV M gene, and the like can be preferably used.
  • the production method of the present invention it is preferable to carry out a step of purifying the recombinant virus after the cell is produced (and propagated). It does not specifically limit as a purification method, It can carry out by a publicly known method, What is necessary is just to select the purification method suitably according to the infection object of a recombinant virus.
  • the recombinant virus is produced (and propagated) as described above, and then the culture cell supernatant producing the recombinant virus is recovered, Crush.
  • Cell disruption can be performed using, for example, freezing and thawing, or an ultrasonic disrupter.
  • cell disruption components are removed from the cell disruption solution. Examples of the method for removing the cell disruption component from the cell disruption solution include centrifugation (for example, at 4 ° C. and 800 g for about 10 minutes).
  • a supernatant containing the recombinant virus can be obtained by passing through a filtration membrane having a pore size of 0.22 or 0.45 ⁇ m.
  • This supernatant can be used when the cultured cells are infected with the recombinant virus.
  • the supernatant containing this recombinant virus can also be concentrated and used by a known technique.
  • the supernatant containing the recombinant virus is highly converted into virus particles by ultracentrifugation using a concentration centrifuge using an ultracentrifuge. It is preferable to carry out purification.
  • the purified virus particles are suspended in, for example, phosphate buffered saline, diluted, and then the animal is infected with an appropriate amount.
  • Method for introducing a foreign gene By infecting a cell with the above recombinant virus, a foreign gene incorporated into the virus can be introduced into a cell or a living body.
  • a method for introducing an exogenous gene comprising the step of infecting cells or animals in vitro with the above-described recombinant virus or the recombinant virus produced by the above-described method is also one aspect of the present invention.
  • the animal infected with the recombinant virus is not particularly limited, and examples thereof include mammals, birds, reptiles and amphibians. Among them, mammals such as humans, monkeys, horses, dogs, cats, pigs, sheep, goats, rats, mice, rabbits and cows are preferable, rats, mice or humans are more preferable, and mice or humans are more preferable.
  • Such animal cells are preferred as the cells to be infected with the recombinant virus.
  • BDV is more preferably a mammalian nervous system cell due to its infection-directed ability to the nervous system cell, and particularly preferably a cerebral nervous system cell. Of these, rat, mouse or human nervous system cells are preferred.
  • the cell may be a cultured cell or a living cell.
  • mammalian cerebral nervous system cells include glial cells, cerebral cortex neurons, hippocampal neurons, cerebellar neurons, and midbrain neurons.
  • cultured cells of mammalian brain neurons OL, C6, U373, N2a, N18, PC12, SK-N-SH cells and the like are suitable.
  • Recombinant virus produced using a G gene-deficient virus vector and a plasmid that expresses the outer gene of the virus as a helper plasmid exhibits an infection direction depending on the type of virus from which the outer gene is derived.
  • the resulting recombinant virus is preferably used for introducing a foreign gene into a brain neuron because it exhibits an infection-directed property to a brain nervous system cell.
  • Viral shell genes other than BDV in the helper plasmid preferably, the outer shell genes encoding the extracellular and transmembrane sequences of viral outer proteins other than BDV and the intracellular sequence of BDV G protein
  • the resulting recombinant virus can suitably infect cells in which the virus is directed against infection.
  • the supernatant containing the recombinant virus obtained by the purification method described above is used as a culture medium such as Dulbecco's modified Eagle or the like. It is preferable to prepare a diluted solution by serial dilution with phosphate buffered saline or the like. The concentration of the recombinant virus in the diluted solution may be appropriately selected depending on the type of cells to be infected with the virus.
  • the MOI multiplicity of infection value
  • the MOI is usually about 0.01 to 10 (amount that 0.01 to 10 virus particles infect one cell), preferably about 1 to 10 MOI.
  • This diluted solution is used to infect cells with the recombinant virus.
  • the virus particles highly purified as described above are suspended in, for example, phosphate buffered saline and diluted with the phosphate buffered saline. It is preferred to infect the animal with an appropriate amount after doing so.
  • concentration of the recombinant virus in the diluted solution may be appropriately selected depending on the infection target. For example, if the target of infection is a mammalian nerve cell, it is preferable to inoculate an individual with a virus-titer (focus-forming unit (FFU)) of a diluted solution containing a recombinant virus at about 10 ⁇ 1 to 10 9 FFU. .
  • FFU focus-forming unit
  • the virus titer when a diluted solution containing a recombinant virus is inoculated into mice or rats, the virus titer is preferably about 10 ⁇ 1 to 10 7 FFU. Dogs or cats, when inoculated into humans, it is preferred that the viral titers and usually about 10 ⁇ 10 8 FFU, when inoculated into cattle or horses, virus titer normally 10 5 ⁇ 10 12 FFU It is preferable that When inoculating humans, the virus titer is preferably about 10 5 to 10 9 FFU. Further, when infecting a living cell with a recombinant virus, an exogenous gene transfer agent described later can also be suitably used.
  • a mammalian cerebral nervous system cell when infected with a recombinant virus, a method of inoculating a mammalian nasal cavity with a diluent containing the recombinant virus is preferable.
  • a dilution solution containing a recombinant virus when infecting cranial nervous system cells in mice or rats in animal experiments, a dilution solution containing a recombinant virus can be directly inoculated into the brain of the animal.
  • the diluted solution containing the above-mentioned concentration of the recombinant virus is usually inoculated in an amount of about 5 ⁇ L to 1 mL at a time for intranasal inoculation, and usually about 1 to 50 ⁇ L at a time for inoculation in the brain.
  • the inoculation amount of the recombinant virus to the animal may be appropriately selected according to the body weight or the like of the animal.
  • a mouse or rat when a mouse or rat is inoculated intranasally with a diluted solution containing the above-mentioned concentration of the recombinant virus, 1 Usually about 5 to 200 ⁇ L, preferably about 10 to 100 ⁇ L is inoculated per time.
  • a diluent containing the above recombinant virus When infecting a living cell other than a brain nerve cell with a recombinant virus, it is preferable to parenterally administer a diluent containing the above recombinant virus.
  • a method of inoculating a mammal into the abdominal cavity, blood vessel, muscle or the like is suitable.
  • the inoculation amount of the recombinant virus may be appropriately selected depending on the inoculation site and the like, and is not particularly limited.
  • the virus titer of the diluted solution containing the recombinant virus is usually about 10 ⁇ 1 to 10 9 FFU, and the diluted solution containing the recombinant virus is usually about 5 to 500 ⁇ L at a time for mice, preferably Inoculate approximately 20-200 ⁇ L.
  • An exogenous gene introduction agent (1) The above-described viral vector, or (2) the above-described recombinant virus, or an exogenous gene introduction agent containing a recombinant virus prepared by the above method is also one aspect of the present invention.
  • a preferred embodiment is an exogenous gene transfer agent containing the above recombinant virus or the recombinant virus prepared by the above method.
  • Such an exogenous gene introduction agent can be suitably used when infecting a recombinant virus with an in vitro cell or a living cell (animal) in the aforementioned exogenous gene introduction method.
  • the present invention can be suitably used for introducing a foreign gene into an animal nervous system cell or the like. Among them, it is preferably used by introducing a foreign gene into a cerebral nervous system cell.
  • One of the preferred embodiments of the exogenous gene introduction agent of the present invention is an exogenous gene introduction agent into a cranial nervous system cell containing the above recombinant virus or a recombinant virus produced by the above method.
  • the cranial nervous system cells are preferably mammalian cerebral nervous system cells such as glial cells, cerebral cortex neurons, hippocampal neurons, cerebellar neurons, and midbrain neurons.
  • the exogenous gene transfer agent of the present invention may further contain other drugs such as a therapeutic agent for neurological diseases, and may contain pharmaceutically acceptable components depending on the dosage form.
  • a dosage form for parenteral administration is preferable. For example, injection, instillation, ointment, gel, cream, patch, spray, spray An injection is preferable.
  • an aqueous injection As an injection for parenteral administration, either an aqueous injection or an oily injection may be used.
  • an aqueous injection according to a known method, for example, after mixing the recombinant virus with a solution obtained by appropriately adding a pharmaceutically acceptable additive to an aqueous solvent (water for injection, purified water, etc.), a filter or the like It can be prepared by sterilizing by filtration and then filling into a sterile container.
  • a aqueous solvent water for injection, purified water, etc.
  • Examples of pharmaceutically acceptable additives include isotonic agents such as sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, glucose, propylene glycol; phosphate buffer, acetate buffer, Buffers such as borate buffer, carbonate buffer, citrate buffer, Tris buffer, glutamate buffer, epsilon aminocaproate buffer; methyl paraoxybenzoate, ethyl paraoxybenzoate, propyl paraoxybenzoate, paraoxybenzoic acid Preservatives such as butyl, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, borax; thickeners such as hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol; Sodium bisulfate, sodium thiosulfate, sodium edetate, sodium citrate, ascorbic acid,
  • solubilizers for example, alcohols such as ethanol; polyalcohols such as propylene glycol and polyethylene glycol; nonionic surfactants such as polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50, lysolecithin, and pluronic polyol You may mix
  • proteins such as bovine serum albumin and keyhole limpet hemocyanin; polysaccharides such as aminodextran may be contained.
  • sesame oil or soybean oil is used as the oily solvent, and benzyl benzoate or benzyl alcohol may be blended as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule or vial.
  • Liquid preparations such as injections can be stored after removing moisture by freezing or lyophilization.
  • the freeze-dried preparation is used by adding distilled water for injection at the time of use and re-dissolving it.
  • the amount of the recombinant virus contained in the exogenous gene transfer agent of the present invention varies depending on the preparation form or administration route of the exogenous gene transfer agent, but is usually appropriately within the range of about 0.0001 to 100% in the final preparation. You can select and decide.
  • the administration method and dosage of the exogenous gene introduction agent are the same as the method in the above-described exogenous gene introduction method and the dosage of the recombinant virus.
  • the exogenous gene transfer agent of the present invention is useful as a gene delivery composition for, for example, treatment of cranial nervous system diseases in animals, chronic liver diseases such as hepatitis C, antitumor drugs, vaccines and the like.
  • the mammal described above is suitable for the administration target of the exogenous gene transfer agent of the present invention.
  • the viral vector, recombinant virus and foreign gene introduction method of the present invention, and the foreign gene introduction agent can be applied to various fields as gene introduction techniques that do not affect the host chromosome. It is.
  • the viral vector and recombinant virus of the present invention can be used as a gene delivery vector for treating cranial nervous system diseases in animals including humans. It can also be suitably used for vaccines against chronic liver diseases, tumors, infectious diseases and the like. Examples of the cranial nervous system diseases include Alzheimer's disease, Parkinson's disease, multiple sclerosis, schizophrenia, autism, and other functional psychiatric diseases.
  • the recombinant virus of the present invention is useful for the treatment or prevention of such diseases.
  • an exogenous gene in the viral vector of the present invention is a gene of an enzyme that degrades a protein causing a cranial nervous system disease
  • a nucleic acid sequence having a function of suppressing the expression of the protein, or the like, produced from the viral vector By infecting brain neurons with the recombinant virus to be produced, the causative protein can be decomposed or the expression of the causative protein can be suppressed to prevent or treat the disease.
  • a gene that encodes the substance in the brain is inserted into a viral vector, and a combination produced from the viral vector. By infecting brain neurons with the virus, the substance in the brain is produced, so that the disease can be prevented or treated.
  • Treatment refers to not only completely curing the disease state, but also suppressing the progression and / or worsening of symptoms without complete cure, and stopping the progression of the disease state, or part or all of the disease state “Preventing” means to prevent, suppress, or delay the onset of a disease state, respectively, to improve the condition and lead to the direction of healing.
  • the virus vector and recombinant virus of the present invention can also be used for treatment or prevention of viral encephalitis such as Japanese encephalitis.
  • it can also be suitably used for cranial nervous system diseases of laboratory animals, companion animals or production animals such as BSE (bovine spongiform encephalopathy), rabies and the like.
  • BSE bovine spongiform encephalopathy
  • Examples of experimental animals include mice, rats, guinea pigs, rabbits, cats and dogs.
  • companion animals include mice, rats, guinea pigs, rabbits, cats, and dogs.
  • production animals include cattle, horses, pigs and sheep.
  • the virus vector and the recombinant virus of the present invention can be used for visualization technology of nervous system cells in the field of neuroscience.
  • the viral vector of the present invention is also useful as an RNA viral vector capable of expressing a functional RNA molecule, and can also be applied to a technique for stably expressing functional RNA such as siRNA, miRNA, RNA aptamer.
  • a sequence encoding a functional RNA such as siRNA, miRNA, RNA aptamer or the like is used as a foreign gene in the virus vector of the present invention, these functional RNA molecules can be expressed in a desired cell.
  • a single chain antibody (scFv) can be expressed in the brain.
  • the virus vector or recombinant virus that specifically infects tumor cells is improved, and siRNA that suppresses drug genes and overexpressed genes into tumor cells is introduced. By doing so, it can also be used as an anti-tumor virus vector.
  • a gene having neutralizing activity against HIV, influenza virus, etc. eg, HIV env, gag, etc .; influenza virus HA, NA gene, etc.
  • recombinant viruses for recombinant vaccines for infectious diseases that follow the chronic course such as HCV, siRNA against the target virus genome is introduced, which is effective for the development of new treatments for infectious diseases using functional RNA. .
  • kits of the present invention may appropriately include a helper plasmid, a cell into which an exogenous gene is introduced, a buffer solution, a medium and the like in addition to the viral vector.
  • a preferred embodiment of the viral vector is as described above.
  • the cell into which the foreign gene is introduced is preferably a nervous system cell such as a cerebral nervous system cell.
  • the kit of the present invention can be suitably used for introducing an exogenous gene into a brain nervous system cell or the like, which has been technically difficult until now.
  • Example 1 Preparation of plasmid pCAG-Fct Chloramphenicol acetyltransferase inserted into plasmid pCAG-HR-SV3 described in Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529
  • a plasmid in which the region of (CAT) gene was replaced with the sequence of the genome of Borna disease virus He / 80 strain (SEQ ID NO: 1) was prepared as follows.
  • a BDV minigenome vector derived from cytomegavirus (CMV)
  • CMV cytomegavirus
  • a chemically synthesized oligonucleotide (Briese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA) encoding hammerhead ribozyme (HamRz) 89 (1992) 11486-11489, and Le Mercier et al., J. Virol., 76 (2002) 2024-2027) and chemically synthesized oligonucleotides encoding the 5 'untranslated region (UTR) sequence of BDV (Cubitt, B., Oldstone, C. And de la Torre, JC, Sequence and genome organization of Borna disease virus.
  • UTR 5 'untranslated region
  • pCMV-HR was prepared by inserting the BglII and XbaI fragments of pc-HR into the BamHI and XbaI sites of pBluescript SKII (-) (Stratagene, La Jolla, CA).
  • the BDV minigenomic vector pCAG-HR derived from CAG was obtained by subcloning the CAG promoter into pBluescript SKII (-) (Stratagene, La Jolla, CA) ( pBS-CAG).
  • the CAG promoter is a hybrid promoter obtained by fusing a chicken ⁇ -actin promoter with a cytomegalovirus IE enhancer, and is described in Sawichi et al., “Exp.” Cell “Res.” 244 (1998) 367-369.
  • a region spanning the HamRz and HdRz sequences of pCMV-HR was amplified by PCR and inserted into the blunt ends of the SalI and EcoRI sites of pBS-CAG.
  • SV3 region consisting of 113 bases on the 5 ′ side within the SV40 starting point / promoter was amplified from pEGFP-N1 (Clontech) by PCR (Clontech Laboratory, Inc., Palo Alto, CA). And inserted into the NotI site of pCAG-HR. This resulted in plasmid pCAG-Fct.
  • BDV genomic plasmid (pCAG-Fct-P / MGFP) with GFP inserted in the untranslated region between P gene and M gene Insert a foreign gene insertion cassette into the untranslated region between P gene and M gene Plasmid pCAG-Fct-P / M was prepared.
  • pCAG-Fct plasmid in which cDNA of He80 strain of Bornavirus (SEQ ID NO: 1)
  • Primer 1 5-GGAATGCATTGACCCAACCGGTAGACCAGC-3 (SEQ ID NO: 5)
  • Primer 2 5-AACATGTATTTCCTAATCGGGTCCTTGTATACGG-3 (SEQ ID NO: 6)
  • Primer 3 5-ttcgaaGGTTGGttaattaaccataaaaaatcgaatcacc-3 (SEQ ID NO: 7)
  • Primer 4 5-ttaattaaCCAACCttcgaaGGTGATTCGATTTTTTTATGG-3 (SEQ ID NO: 8)
  • Helper plasmids ie, BDV N gene expression plasmid (pcN), BDV P gene expression plasmid (pCXN2-P) and BDV L gene expression plasmid (pcL) were prepared by the following procedure.
  • pcN is a pHA-p40N plasmid (Kobayashi T, Watanabe M, Kamitani W, Zhang G, Tomonaga K and Ikuta K. Borna disease virus nucleoprotein requires both nuclear localization and export activities for viral nucleocytoplasmic shuttling. J. Virol. 75: 3404- From 3412.
  • Plasmid pCXN2-P is a pcD-P (Zhang G, Kobayashi T, Kamitani W, Komoto S, Yamashita M, Baba S, Yanai H, Ikuta K and Tomonaga K. Borna disease virus phosphoprotein represses p53-mediated transcriptional activity by interference with HMGB1. J. Virol. 77: 12243-12251. (2003)) pCXN2 (Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J 1991 Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.
  • pcL was prepared by the method described in Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104. The nucleotide sequence of the recombinant plasmid was confirmed by DNA sequencing.
  • Example 2 Construction and characterization of BDV vectors using PM gene plasmids pCAG-Fct-P / M-GFP and helper plasmids (N gene expression plasmid, P gene expression plasmid and L gene expression plasmid; pcN, pCXN2-P, respectively) And pcL) were introduced into 293T cells using FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics (registered trademark), Pleasanton, CA) or Lipofectamine (registered trademark) 2000, Invitrogen).
  • the amount of viral vector used for the introduction was 1 to 4 ⁇ g of pCAG-Fct-P / M-GFP for 10 4 to 10 6 cells (293T cells), and pcN (0.125 to 0 0.5 ⁇ g), pCXN2-P (0.0125 to 0.05 ⁇ g), pcL (0.125 to 0.5 ⁇ g) at a ratio of helper plasmid.
  • the 293T cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium at 37 ° C. for 48 hours, and the supernatant was collected, centrifuged at 800 g for 10 minutes, and filtered through a 0.22 to 0.45 ⁇ m filter.
  • a recombinant virus expressing GFP hereinafter also referred to as recombinant virus p / mGFP was purified.
  • the vector rBDV-5′GFP prepared in Reference Example 1 was also introduced into 293T cells in the same manner as described above to prepare a recombinant virus (hereinafter also referred to as recombinant virus 5′GFP).
  • the recombinant virus was then purified.
  • wild-type BDV hereinafter also referred to as wt
  • wild type BDV wt
  • purified recombinant viruses p / mGFP and 5'GFP were added to M.
  • the indirect immunofluorescence antibody method was performed by the following method.
  • Anti-BDV N antibody and anti-BDV M antibody were analyzed by Watanabe M, Zhong Q, Kobayashi T, Kamitani W, Tomonaga K, Ikuta K. Molecular ratio between Borna disease viral-p40 and -p24 proteins in infected cells determined by quantitative antigen capture ELISA Microbiol Immunol. 2000. 44: 765-72, Chase G, Mayer D, Hildebrand A, Frank R, Hayashi Y, Tomonaga K, Schwemmle M.
  • Borna disease virus matrix protein is an integral component of the viral ribonucleoprotein complex that does not It was produced according to the method described in J Virol. 2007. 81: 743-749.
  • Vero cells each infected with wild-type BDV and each recombinant virus were collected after culturing for a certain number of days after infection, fixed on a glass plate, and this was combined with anti-BDV N antibody (with phosphate buffer, Anti-BDV N antibody diluted to 0.2-5 ⁇ g / mL) or anti-BDV M antibody (diluted with phosphate buffer to anti-BDV M antibody concentration of 0.2-5 ⁇ g / mL) at 37 ° C. The reaction was carried out for about 1 hour.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of examining the time course of the infection rate of Vero cells infected with wild type or recombinant BDV from day 0 to day 19 after infection.
  • the infection rates shown in FIG. 5 are as follows: for wild-type BDV, by the indirect immunofluorescence antibody method using the fluorescence of the fluorescence-labeled antibody against anti-BDV N antibody as an index, and for recombinant BDV, against GFP fluorescence and anti-BDV N antibody. Each was determined by the indirect immunofluorescence antibody method using the fluorescence of the fluorescently labeled antibody as an index.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of examining the time course of the infection rate of Vero cells infected with wild type or recombinant BDV from day 0 to day 19 after infection.
  • the infection rates shown in FIG. 5 are as follows: for wild-type BDV, by the indirect immunofluorescence antibody method using the fluorescence of the fluorescence-labeled antibody against anti
  • wt (diamond: ⁇ ) represents the wild-type BDV
  • p / mGFP square: ⁇
  • 5′GFP (triangle: ⁇ ) represents the group prepared in Reference Example 1.
  • the replacement virus 5′GFP is shown respectively. From FIG. 5, about 15 days after infection, both the recombinant viruses p / mGFP and 5'GFP were almost 100% infected with Vero cells, like wild-type BDV. From this, it was found that both the recombinant viruses p / mGFP and 5'GFP have the same virus production ability as wild-type BDV.
  • FIG. 6 shows the result of Northern blot.
  • wt represents wild-type BDV
  • p / m represents recombinant virus p / mGFP
  • 5 ′ represents recombinant virus 5′GFP.
  • u. i. Indicates uninfected cells.
  • FIG. 6 (a) shows the results of examining the expression levels of BDV N gene (upper figure) and GFP gene (middle figure) in Vero cells 19 days after infection by Northern blotting.
  • FIG. 6 (a) shows that the gene for the viral protein (N protein) is expressed to the same degree in any cell infected with BDV.
  • the lower diagram of FIG. 6A is a visualization of the ribosomal RNA contained in the sample after electrophoresis in order to quantify the amount of RNA used in the analysis.
  • FIG. 6 (b) shows BDV N protein (topmost), P protein (second from the top), M protein (third from the top) and GFP (bottom) in Vero cells 19 days after infection. It is a figure which shows the result of having investigated the expression level by the Western blot.
  • FIG. 6 (b) shows that the viral proteins (N protein, P protein, and M protein) are expressed to the same extent in any cell infected with BDV.
  • GFP / N protein 0.58 in the cells that were allowed to escape. It can be seen that the expression rate of the GFP gene relative to the infected virus is higher in the recombinant virus p / mGFP than in the recombinant virus 5'GFP.
  • FIGS. 7a-f are photomicrographs of cells infected with wild type BDV, recombinant virus p / mGFP and recombinant virus 5'GFP, respectively.
  • 7a and b are cells infected with wild type BDV
  • c and d are cells infected with recombinant virus p / mGFP
  • e and f are cells infected with recombinant virus 5′GFP.
  • FIGS. 7a, c and e show the results of investigating viral infection of cells by the indirect immunofluorescence antibody method using an N protein antibody (anti-BDV N antibody) and a fluorescently labeled antibody (manufactured by Molecular Probes). .
  • anti-BDV N antibody an anti-BDV N antibody
  • a fluorescently labeled antibody manufactured by Molecular Probes.
  • FIGS. 7a, c and e the luminescent portion (red) is N protein.
  • FIGS. 7b, d and f show the results of examining the expression of a foreign gene (GFP) by the virus by the fluorescence of the protein (green fluorescence). In FIGS. 7b, d and f, GFP is detected by green fluorescence. From FIGS. 7a to f, it can be seen that the N protein is expressed to the same degree in any of the cells infected with BDV virus, so that the replication ability of the virus is the same.
  • GFP foreign gene
  • the fluorescence intensity of GFP is significantly higher in cells infected with the recombinant virus p / mGFP than the recombinant virus 5′GFP, the recombinant virus p / mGFP is expressed in foreign genes (GFP). It can be seen that the efficiency is significantly higher than that of the recombinant virus 5′GFP.
  • FIGS. 8a-f are photomicrographs of cells infected with wild type BDV, recombinant virus p / mGFP and recombinant virus 5'GFP, respectively.
  • 8a and b are cells infected with wild type BDV
  • c and d are cells infected with recombinant virus p / mGFP
  • e and f are cells infected with recombinant virus 5′GFP.
  • FIGS. 8a, 8c and 8e show the results of investigating viral infection of cells by the indirect immunofluorescence antibody method using M protein antibody (anti-BDV M antibody) and fluorescently labeled antibody (manufactured by Molecular Probes). .
  • FIGS. 8b, d and f show the results of examining the expression of a foreign gene (GFP) by the virus by the fluorescence of the protein (green fluorescence).
  • GFP foreign gene
  • FIGS. 8a, c and e the luminescent portion (red) is the M protein.
  • FIGS. 8b, d and f GFP is detected by green fluorescence.
  • FIGS. 8a to 8f show that the M protein is expressed at the same level in any of the cells infected with BDV virus, indicating that the replication ability of the virus is the same.
  • the recombinant virus p / mGFP has a combined expression efficiency of foreign genes. It can be seen that it is significantly higher than the replacement virus 5′GFP.
  • Example 3 The rat brain was infected with the recombinant virus p / mGFP produced in Example 2 and the recombinant virus 5′GFP produced in Reference Example 1, respectively.
  • Each purified recombinant virus was diluted to 10 3 FFU with PBS or a culture medium, and then inoculated into 10 to 20 ⁇ L from the left temporal region into the skull of a neonatal rat within 24 hours after birth (FIG. 9). Samples were taken 7, 14, and 21 days after inoculation, and the brain was divided into regions as shown in FIG. 10, and DNA was extracted from each region (using a Qiagen DNA extraction kit). The recombinant virus infection was checked by PCR and GFP expression.
  • the PCR product was confirmed by 1% agarose electrophoresis.
  • the recombinant virus was detected not only in the inoculation site but also in the cerebral cortex (anterior part of the right brain in FIG. 10) and the cerebellar region (the posterior part of the right brain in FIG. 10). It was done.
  • FIG. 11 shows the results of electrophoresis of the PCR product.
  • the lane labeled p / mGFP is a PCR product from rat brain infected with recombinant virus p / mGFP.
  • Lanes labeled 5'GFP are PCR products from rat brain infected with recombinant virus 5'GFP.
  • a is a cerebral cortex and b is a PCR product of cerebellar DNA.
  • all the bands detected in FIG. 11 are bands of the BDV genomic fragment amplified by the PCR, the region between the P gene and the M gene of BDV is amplified when the PCR is performed. .
  • the recombinant virus p / mGFP since the GFP gene is included between the P gene and the M gene, a band is detected on the higher molecular weight side than the PCR product of the recombinant virus 5'GFP.
  • I in FIG. 11 is a wild-type BDV-infected Vero cell, and U is an uninfected cell. This result indicated that the inoculated recombinant virus spread to other parts of the brain.
  • FIG. 12 shows a macro photograph (a and b) in which the rat brain 14 days after inoculation was cut open and turned over, and a macro fluorescence photograph (c and d) of the brain, respectively.
  • GFP fluorescent moiety
  • FIGS. 12c and d it is GFP in which the fluorescent moiety is expressed.
  • the fluorescence intensity of GFP is significantly higher in the cerebral cortex of the brain infected with the recombinant virus p / mGFP than the recombinant virus 5′GFP, the recombinant virus p / mGFP is used. It can be seen that the expression efficiency of the foreign gene is significantly higher than that of the recombinant virus 5′GFP.
  • FIGS. 13a to 13d are micrographs of cerebral cortex sections (shown in the upper part of FIGS. 13a to 13d and indicated by squares in the photograph).
  • FIGS. 13a and 13c show the expression of N gene in the cerebral cortex of rats 7 days after inoculation, the same antibody against N protein (anti-BDV N antibody) and fluorescently labeled antibody (manufactured by Molecular Probe) as in Example 2.
  • the result investigated by the indirect immunofluorescence antibody method using is shown.
  • the N protein is detected by red fluorescence, and the same amount of N protein is expressed when the recombinant virus p / mGFP or the recombinant virus 5′GFP is infected (the virus infection amount is the same). It was found that.
  • FIGS. 13a and 13c show the results of fluorescence detection of GFP expression in the same sections as in FIGS. 13a and 13c, respectively.
  • the fluorescence intensity of GFP is significantly higher in the cerebral cortex of the brain infected with the recombinant virus p / mGFP (FIG. 13b) than in the cerebral cortex of the brain infected with the recombinant virus 5′GFP (FIG. 13d). It was big.
  • Example 4 a recombinant vector (rBDV-p / mDsRed vector) in which a DsRed gene was inserted into the untranslated region between the P gene and the M gene using a DsRed gene (manufactured by Clontech) instead of the GFP gene. ) And a recombinant virus was prepared in the same manner as in Example 2. As a comparison, a recombination vector (rBDV-5′DsRed vector) in which the DsRed gene was inserted into the 5 ′ end of the BDV genome using the DsRed gene instead of the GFP gene in Reference Example 1 was prepared. In this way, a recombinant virus was produced.
  • the cells were infected with the recombinant virus and the DsRed gene was expressed on the 10th day using the same antibody against N protein (anti-BDV N antibody) as in Example 2 and As shown in FIG. 14, in the cells infected with the recombinant virus produced from the rBDV-p / mDsRed vector, an indirect immunofluorescence antibody method using a fluorescently labeled antibody (manufactured by Molecular Probes) was used. N protein expression (FIG. 14 (a)) and DsRed expression (FIG. 14 (b)) were observed (N protein was detected by the secondary antibody with green fluorescence and DsRed with red fluorescence). On the other hand, the rBDV-5′DsRed vector was unable to produce recombinant virus in infected cells.
  • Example 5 In Example 1, using a firefly-derived luciferase gene (1.6 kb) (manufactured by Clontech) instead of the GFP gene, recombination in which the luciferase gene was inserted into the untranslated region between the P gene and the M gene A vector (rBDV-p / mLuci vector) was prepared, and a recombinant virus was prepared in the same manner as in Example 2. As a comparison, a recombinant vector (rBDV-5 ′ Luci vector) in which the luciferase gene was inserted into the 5 ′ end of the BDV genome using the luciferase gene instead of the GFP gene in Reference Example 1 was prepared.
  • rBDV-5 ′ Luci vector a recombinant vector in which the luciferase gene was inserted into the 5 ′ end of the BDV genome using the luciferase gene instead of the GFP gene in Reference Example 1 was prepared.
  • the cells were infected with the recombinant virus and the luciferase gene was expressed on the 10th day using the same antibody against N protein (anti-BDV N antibody) as in Example 2.
  • N protein was observed in the cells infected with the recombinant virus produced from the rBDV-p / mLuci vector, as shown in FIG. 15a, but rBDV-5 ′ The Luci vector was unable to produce recombinant virus in infected cells.
  • the luciferase activity in the recombinant virus rBDV-p / mLuci-infected Vero cells was measured using a luciferase assay kit (Promega) according to the attached instructions. It showed significantly higher luciferase activity compared to infected cells (FIG. 15b). This confirmed that the luciferase produced from the recombinant virus rBDV-p / mLuci was functioning.
  • Example 6 In the same manner as in Example 3, it was produced from a plasmid in which GFP was inserted between the PM genes prepared in Example 1 (plasmid pCAG-Fct-P / M-GFP, hereinafter referred to as “p / mGFP”).
  • N protein The indirect immunofluorescence antibody method using an antibody (anti-BDV N antibody) and a fluorescently labeled antibody (manufactured by Molecular Probes) and (2) GFP fluorescence were examined. As a result, it was found that the BDV virus was continuously expressed in infected cells (mouse cerebral cortex and cerebellum) for 2 to 8 months after inoculation.
  • FIGS. 18a and 18b are fluorescence micrographs of brain cut surfaces of mice 8 months after inoculation with the recombinant virus.
  • FIG. 18A is a macro photograph
  • FIG. 18B is a photograph in which a portion surrounded by a square in FIG. 18A is enlarged by a microscope.
  • GFP was detected by green fluorescence.
  • the part that appears gray is the part that emits green fluorescence due to GFP.
  • Example 7 Recovery of G-deficient virus (1) Plasmid construction A) Preparation of p / mGFP deltaG L linear (p / mGFP ⁇ G LL) Based on the p / mGFP prepared in Example 1, the G gene which is a viral membrane glycoprotein was deleted by introducing point mutation using PCR. . As a specific method, sequences (genome numbers (namely, bases of SEQ ID NO: 1) 2236-2238 and 2248-2250) encoding two methionines present in the G gene were replaced with threonine (ATG ⁇ ACG). FIG.
  • FIG. 19 shows an outline of a procedure for preparing p / mGFP ⁇ G, which is a plasmid encoding a G gene-deficient virus.
  • PCR was performed using primers A1 and B1 with the sequences shown in Table 1 and primers C1 and D1 (98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 0.5 or 1 minute for 25 cycles). (FIG. 19A).
  • PCR (98 ° C 10 seconds, 55 ° C 5 seconds, 72 ° C 1.5 minutes 25 cycles) was performed again using both amplification products (1stPCR product) as a template and the primers A1 and D1 (Fig. 19).
  • amplification product (2nd PCR product)
  • the methionine of the G gene is mutated to threonine, and this is recombined with the vector p / mGFP using the restriction enzymes Bst1107I and NheI (FIG. 19 (c)).
  • / mGFP ⁇ G was obtained.
  • the L gene intron region that was no longer needed was removed and the L gene was directly linked (L linearize). Specifically, from the restriction enzyme site Bst1107I (2166 to 2171st nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1) to the first half exon of the L gene and the second half exon of the L gene (NheI site (6158 to 6163rd of SEQ ID NO: 1) Each of the base sequence) was amplified, combined, and incorporated into p / mGFPm ⁇ G. An outline of this procedure is shown in FIG.
  • PCR (98 ° C 10 seconds, 55 ° C 5 seconds, 72 ° C 0.5 minutes 25 cycles) was performed using primers A1 and E1 and primers F1 and D1 shown in Table 1 and p / mGFP / ⁇ G as a template. (FIG. 20 (a)).
  • PCR (98 ° C., 10 seconds, 55 ° C., 5 seconds, 72 ° C., 1 cycle, 25 cycles) was performed using both amplification products (1st PCR product) as templates and primers A1 and D1 (FIG. 20B).
  • B) BDV G gene expression plasmid In order to recover the G-deficient virus, a plasmid for expressing the BDV G protein in mammalian cells was prepared as a helper plasmid. An outline of this procedure is shown in FIG. As a specific method, the G gene region was amplified by PCR using p / mGFP as a template, and inserted downstream of the chicken beta actin promoter (the same method as the above-described helper plasmids of other N, P, and L genes).
  • PCR was performed using primers G1 and H1 shown in Table 1, and primers I1 and J1 and p / mGFP as a template (98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 0.5 or 1.0 minutes for 25 cycles). (FIG. 21 (a)).
  • PCR (98 ° C 10 seconds, 55 ° C 5 seconds, 72 ° C 1.5 minutes 25 cycles) was performed using both amplification products (1st PCR product) as a template and primers G1 and J1 (Fig. 21 (b)). .
  • the 2409-2415th GGTTATG of the wild-type BDV (WT) genome is defined as agtctcc ( ⁇ SA)
  • the 2437-2442nd GGTTATG of the wild-type BDV (WT) genome is defined as agtctcc ( ⁇ SD).
  • This 2nd PCR product ( ⁇ SDSA G gene) was inserted into an expression plasmid (pCXN2 used in the preparation of the helper plasmid of Example 1) using restriction enzymes KpnI and SmaI (FIG. 21 (c)), and BDV G gene expression plasmid was made.
  • the nucleotide sequence of the recombinant plasmid was confirmed by DNA sequencing.
  • pCXN2 was used to prepare a G gene expression plasmid, but other plasmids capable of expressing a gene in mammalian cells can also be used.
  • the primer sequences used above are shown in Table 1.
  • BDV G gene stable expression cells were prepared using the G protein expression plasmid prepared in (1) A) above.
  • 1-5 ⁇ 10 5 mammalian cultured cell lines used for recovery that is, 293T cells and Vero cells, were seeded in a 9.4 cm 2 culture dish, and the next day a commercially available gene transfer reagent (Fugen6, Lipofectamine2000) was used.
  • Fugen6, Lipofectamine2000 was used.
  • 2 to 5 ⁇ g of the plasmid DNA prepared in (1) above was introduced. Cells were cultured at 37 ° C. using Dulbecco's modified Eagle MEM medium.
  • G gene stable expression cell lines (G gene stable expression 293T cells and G gene stable expression Vero cells) were isolated by this method.
  • 293T cells were cultured at 37 ° C. Three days after gene introduction, the cells were subcultured and co-cultured with the G gene stably expressing Vero cells prepared above, and then the Vero cells were recovered as G gene-deficient virus-infected Vero cells.
  • Example 8 Preparation of p / mGFP ⁇ G LL-infected cells and pseudotype virus (1) Preparation of p / mGFP ⁇ G LL-infected cells and confirmation of persistent infectivity A) Preparation of p / mGFP ⁇ G LL-infected cells Vero cells were inoculated with the virus collected in Example 7 (3) B) or C) to prepare p / mGFP ⁇ G LL-infected cells.
  • Opti-MEM (Invitrogen: GIBCO) was used for dilution of the virus solution, and 100 ⁇ l of virus-diluted Opti-MEM was inoculated into a single layer of Vero cells spread on a 24-well plate (about 0.1 to 0.01 virus per Vero cell). Particles) and sensitized for 1 hour at 37 ° C. Thereafter, the cells were washed with PBS- and cultured at 37 ° C. in Dulbecco's modified Eagle MEM medium. Infected cells inoculated did not propagate the virus, so 100% infected cells were isolated by the cell cloning method (limit dilution method). Judgment whether the cells were infected or not was made by observing the expression of GFP with a fluorescence microscope. The infected cells separated here were also used for the preparation of pseudotype virus described later.
  • FIG. 22 shows the virus positive rate of each cell on the 12th day after co-culture with cells stably expressing G gene, using GFP as an index. From FIG. 22, when the number of GFP positive cells per 100,000 cells was 1 when p / mGFP ⁇ G was used, p / mGFP ⁇ G LL showed an approximately 8-fold positive rate. From this, it was found that p / mGFP ⁇ G LL has a higher ability to produce recombinant BDV than p / mGFP ⁇ G.
  • B) or C) (G-deficient recombinant virus) Inoculated with virus: cells 1: 100 and observed for growth and persistence. The infection rate was measured by counting the number of infected cells per 100,000 cells plated on a 24-well plate. As a result, as shown in FIG. 23, when inoculated into Vero cells, the infection rate was about 1%, but when inoculated into Vero cells stably expressing G gene, the infection rate increased with progress.
  • FIG. 24a shows the results of examining protein expression in cells infected with wild-type BDV and G-deficient recombinant virus by Western blotting.
  • G, N, and GFP are G protein, N protein, and GFP, respectively.
  • FIG. 24 b is a fluorescence micrograph of Vero cells infected with G-deficient recombinant virus. The part that appears gray in the photograph of FIG. 24b is the green fluorescent part due to GFP. 24a and b confirmed that GFP introduced by the virus was expressed in cells infected with the G gene-deficient virus.
  • the amplification product has a DNA sequence encoding a chimeric membrane protein (hereinafter also referred to as a chimeric VSV-G protein) derived from BDV in the intracellular region and the extracellular and transmembrane regions derived from VSV.
  • This PCR product was incorporated into pCXN2 (see (1) B) of Example 7) (Fig. 25 (b)) using restriction enzymes EcoRI and EcoRV to obtain a VSV-G expression plasmid.
  • a plasmid expressing a chimeric membrane protein of BDV and RabV (chimeric Rab-G expression plasmid) was prepared using a G gene expression plasmid (GeneBank N ID: AB044824.1) of RabV: Nishigahara strain as a template and a primer as a primer. The procedure was the same as above except that primers C2 and D2 shown in Table 2 were used instead of A2 and B2, and KpnI and EcoRV were used as restriction enzymes.
  • the Rab-G expression plasmid expresses a chimeric membrane protein derived from BDV in the intracellular region and RabV in the extracellular and transmembrane regions (hereinafter also referred to as chimeric Rab-G protein).
  • VSV-G protein stable expression strain and Rab-G protein stable expression strain were prepared.
  • Chimeric membrane protein stable expression cells were prepared using the plasmid prepared in (2) A) above or the plasmid introduced into the Tet system expression plasmid prepared in the same manner.
  • the plasmid expressing the chimeric G protein prepared in (2) A) above or a Tet prepared in the same manner Using the plasmid introduced into the system expression plasmid, it was introduced into 293T cells and Vero cells, and p / mGFP ⁇ G LL-infected cells prepared in (1) above.
  • the drug resistance concentration and the like of the Tet system were performed as described in the attached manual. The Invitrogen T-REx system was used this time.
  • FIG. 26 shows the difference in virus recovery efficiency (particle formation efficiency) among the three when the G gene of BDV and the outer shell gene of VSV and Rab are used as the G gene.
  • the virus recovery efficiency is expressed as a relative value with 1 when the BDV G gene is used.
  • pseudotyped virus covered with VSV or Rab membrane protein was recovered using chimeric protein-expressing cells.
  • pseudotype viruses are pseudotype viruses that have an outer shell derived from VSV or Rab and can express a recombinant BDV genome encoded by p / mGFP ⁇ G LL.
  • Example 9 M and G gene-deficient virus (1) Plasmid p / mGFP ⁇ M-G LL in which the M gene was deleted based on p / mGFP ⁇ G LL was prepared.
  • FIG. 27 shows an outline of the procedure for preparing the p / mGFP ⁇ M-G LL plasmid in which the M gene is deleted.
  • PCR (98 ° C 10 seconds, 55 ° C 5 seconds, 72 ° C 1.5 minutes for 25 cycles) was performed using p / mGFP ⁇ G LL as a template and the primers A3 and B3 shown in Table 3. (FIG. 27 (a)).
  • the obtained PCR product (1st PCR product) was inserted into p / mGFP ⁇ G LL using PacI and NheI to prepare p / mGFP ⁇ M-G LL (FIG. 27 (b)).
  • FIG. 28 shows an outline of the procedure for producing the p / mGFP ⁇ M-GLL PM tandem vector.
  • PCR 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 0.5 minutes for 25 cycles
  • FIG. 28 (a) Furthermore, PCR (98 ° C 10 seconds, 98 ° C 5 seconds, 72 ° C 0.5 minutes 25 cycles) was performed using the obtained PCR product (1stPCR product) as a template and primers C3 and E3 (Table 3) ( Figure 25). 28 (b)).
  • the obtained PCR product (2nd PCR product) was inserted into p / mGFP ⁇ M-GLL using EcoT22I and BstBI.
  • a new foreign gene insertion cassette Sse8381I-SwaI could be inserted into p / mGFP ⁇ M-GLL, and a p / mGFP ⁇ M-GLL PM tandem vector was obtained.
  • This cassette can be incorporated into other p / m vectors having a BstBI-PacI site between the ORF of the P gene and the ORF of the M gene using EcoT22I and BstBI.
  • p / m vectors for the treatment of Alzheimer's disease
  • a ⁇ amyloid beta protein
  • RNA was extracted from cultured cells derived from human, and reverse transcription of mRNA was performed with reverse transcriptase (Invitrogen, Superscript III) using oligoT as a primer.
  • NEP was amplified by PCR (25 cycles of 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 2.5 minutes) using the obtained cDNA as a template and primers A4 and B4 shown in Table 6.
  • the obtained PCR product was recombined with a p / mGFP vector using BstBI-PacI to prepare a p / mNEP vector.
  • the GFP cDNA was replaced with the NEP cDNA in the plasmid (p / mGFP) in which GFP was inserted between the BDV PM genes prepared in Example 1.
  • a recombinant vector (hereinafter referred to as comparative vector 1) was prepared by inserting a mutation in the NEP enzyme active site into a p / m vector.
  • PCR 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 2 minutes or 0.5 minutes for 25 cycles
  • primers A4 and C4 shown in Table 6, and B4 and D4 and p / mNEP as a template.
  • PCR 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, 72 ° C. for 2.5 minutes for 25 cycles
  • Recombinant virus was recovered from each of the prepared p / mNEP vector and comparative vector 1 in the same manner as in Example 2, and the properties were analyzed. The recovered virus was administered to Alzheimer's disease model mice.
  • NEP is a recombinant virus p / mNEP-infected cell produced from the p / mNEP vector
  • dn is a comparative cell infected with the virus produced from the comparison vector 1
  • nc is non-infected It is a cell.
  • ⁇ -N is an N protein of BDV. From FIG. 29, it was confirmed that NEP was expressed in the cells infected with the recombinant virus produced from the p / mNEP vector and the comparative vector 1 (comparative cell 1).
  • DAGNPG (Sigma), which artificially synthesizes the reaction region, was used for NEP activity measurement.
  • cells infected with p / mNEP were detached from the culture dish with trypsin and collected by centrifugation.
  • the collected cells were resuspended in a DAGNPG-containing solution (50 mM Tris-HCl, 1 ⁇ M captopril, 50 ⁇ M DAGNPG), and reacted at 37 ° C. for 2 hours.
  • the enzyme was inactivated by heating at 100 ° C. for 5 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at about 15000 g at 4 ° C. for 5 minutes, and the supernatant was collected.
  • FIG. 30 shows the results of measuring the cleavage enzyme activity. In the p / mNEP-infected cells, the NEP activity was significantly higher than that in the non-infected cells and the comparative cells 1.
  • Alzheimer's disease model mice were first inoculated with p / mNEP.
  • B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1 * M146L * L286V) 6799Vas / J (Jackson Research Institute No6554) and B6.Cg-Tg (APPSwe, PSEN1dE9) 85Dbo / J ( Jackson Laboratory No5864) was used. All of these model mice are expressed by expressing a human A ⁇ precursor protein and a mutant of its degrading enzyme presenilin in nerve cells, and have been reported to show Alzheimer's disease-like symptoms early in life.
  • FIG. 31 shows an outline of the procedure for preparing pSIRIUS-B.
  • introduction vectors necessary for introducing various miRNA sequences were prepared.
  • BstBI and PacI restriction enzyme sites were introduced into the multicloning site of pBluescript SK- (FIG. 31 (b)) to complete the p / mmiR155 introduction vector pSIRIUS-B.
  • FIG. 31 (a) The sequence of the DNA fragment schematically shown in FIG. 31 (a) and the restriction enzyme sites in the sequence are shown in Table 4 below.
  • the miR155 target sequence (oligo) was introduced from pSirius-B miR-155 into a p / m vector using BstBI-PacI to produce p / m miR155 (FIG. 32 (b)).
  • a plasmid in which the target sequence of miR155 was introduced downstream of the reporter gene luciferase was prepared so that the effect of miR155 could be determined.
  • FIG. 33 shows the transcription inhibition efficiency of the target gene in the cells infected with the recombinant virus (wt in FIG. 33: BDV wild-type infected cells, x1: p / m miR155-infected cells).
  • PCR was performed using the plasmid prepared in A) (with the target miRNA inserted) as a template using primers E4 and F4 shown in Table 6 (98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, 72 ° C for 0.5 minutes for 25 minutes). cycle).
  • the obtained PCR product was inserted into pSIRIUS-D using SalI and XhoI (FIG. 34 (a)) (note the direction of insertion at this time). Further, the insert was excised from the prepared plasmid with SalI and XbaI (FIG.
  • FIG. 34 (c) A schematic diagram of miRNA ⁇ 2 and miRNA ⁇ 4 p / m vectors is shown in FIG.
  • the obtained miRNA ⁇ 2 and miRNA ⁇ 4 p / m vectors were recovered by the same method as shown in Example 2 and the effects were confirmed.
  • the results are shown in FIG. In FIG. 33, x1, x2, and x4 are the numbers of miR155 inserted into the plasmid, respectively. As can be seen from FIG. 33, the greater the number of miR155 introduced, the more efficiently the target gene expression was inhibited.
  • miR155 introduced into cells was confirmed to be expressed in cells continuously, and the vector of the present invention was shown to be useful as an RNA vector capable of expressing functional RNA.
  • miRNA transfer vector A Effect of miRNA in mouse hippocampal primary cultured cells using p / m miRNA GAPDH
  • miRNA (miR-GAPDH) against GAPDH constitutively expressed in the cell was inserted instead of miRNA155
  • a plasmid (p / m miRNA-GAPDH) was prepared, and its effect was confirmed in mouse hippocampal primary culture cells closer to the living body.
  • the production method of p / m miRNA-GAPDH is almost the same as the production method of p / m miR155 shown in (1) (the sequence of synthesized miR-GAPDH is shown in SEQ ID NOs: 40 and 41).
  • the DNA of SEQ ID NO: 40 and the DNA of SEQ ID NO: 41 form a double strand in the plasmid.
  • Recombinant virus p / m miRNA-GAPDH produced from p / m miRNA-GAPDH was recovered by the same method as shown in Example 2.
  • the recovered recombinant virus p / mmiRNA-GAPDH was inoculated at an MOI of 0.01 to primary cultured cells collected from the hippocampus of newborn mice. After fixing 7 days later, the cells were stained with anti-BDV-N antibody and anti-GAPDH antibody, and observed with a fluorescence microscope.
  • FIG. 36 shows that the expression of GAPDH was significantly suppressed in the cells infected with the recombinant virus p / mmiR-GAPDH compared to the cells infected with wild-type BDV (FIG. 36).
  • 36a and b are cells infected with wild type BDV
  • FIGS. 36c and d are cells infected with recombinant virus p / mmiR-GAPDH.
  • 36a and c are fluorescence micrographs of cells stained with anti-BDV-N antibody
  • FIGS. 36b and d are fluorescence micrographs of cells stained with anti-GAPDH antibody. The inside of the square of FIG.
  • FIG. 36b and d is an enlarged photograph, and the arrow attached
  • FIG. 36b the expression level of GAPDH is high in both uninfected cells and infected cells (GAPDH is not suppressed), but in FIG. 36d, it is observed that the expression level of GAPDH is suppressed in infected cells compared to non-infected cells. It was.
  • p / m miRNA155 a plasmid in which miRNA (miRNA-APP) for APP, which is the causative protein of Alzheimer's disease, was inserted instead of miRNA155 (p / m miRNA-APP) was prepared and its effect was confirmed using p / m miRNA-APP-infected Vero cells.
  • the production method of p / m miRNA-APP is almost the same as the production method of p / m miR155 shown in (1) (the synthesized miRNA-APP is shown in SEQ ID NOs: 42 and 43).
  • the DNA of SEQ ID NO: 42 and the DNA of SEQ ID NO: 43 form a double strand in the plasmid.
  • Recombinant virus p / m miRNA-APP produced from p / m miRNA-GAPDH was recovered by the same method as shown in Example 2.
  • the APP expression plasmid (prepared according to the instructions attached to pcDNA3.
  • a similar experiment was performed using cells infected with a recombinant virus produced from p / mGFP. As a result, the amount of APP mRNA was significantly reduced in the Vero cells infected with the recombinant virus p / mmiRNA-APP as compared to the Vero cells infected with p / mGFP (FIG. 37).
  • the recombinant virus produced from the viral vector of the present invention can express a foreign gene non-cytotoxicly and efficiently in the cell nucleus, and since the viral genome is RNA, it is inserted into the host chromosome. It is a safe vector.
  • the viral vector of the present invention utilizes Borna disease virus, since Borna disease virus has an infection-directed property to nerve cells, it can be used to selectively introduce foreign genes into the brain nervous system. It is an excellent vector. Therefore, the present invention is useful because it can be used as a gene transfer technique that does not affect the host chromosome in various fields, for example, treatment and prevention of cranial nerve disease, visualization technique of nervous system cells in the brain neurochemistry region, etc. It is.
  • the present invention can also be applied to stable expression vector technology for functional RNA such as siRNA, miRNA, RNA aptamer. Therefore, the present invention is useful in the fields of medicine, animal medicine, clinical trials, research and the like.

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Abstract

　（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されていることを特徴とするウイルスベクター。

Description

ボルナ病ウイルスを利用するベクター及びその利用
　本発明は、外来性遺伝子を細胞に導入するためのウイルスベクター、組換えウイルス及びその利用に関する。
　外来性遺伝子を生体又は細胞に運搬する手段として、ウイルスベクターを利用する方法が知られている。これまでに、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルスを利用するベクターが開発されている。
　しかしながら、これらの既存のウイルスベクターでは、例えばＤＮＡウイルスの場合には宿主染色体にウイルス遺伝子が組み込まれることにより宿主（例えば、ヒト）への病原性が発現するという問題点があった。また、ウイルスによっては感染可能な宿主域が狭く、特定の生物にしか適用できないという問題点や、外来性遺伝子のウイルスゲノムへの組込み部位により遺伝子導入効率に差があり、遺伝子導入効率が悪いという問題点があった。また、生体内での免疫応答によりウイルスが排除されたり、ウイルス遺伝子の変異やプロモーター効率の変化が生じたりすることから、安定性及び持続性が悪いという問題点もあった。
　さらに、遺伝子治療等においては、目的とする細胞のみに遺伝子を導入することができる遺伝子導入技術が期待されている。特に、神経系疾患の治療には遺伝子治療が有効であると考えられるため、神経細胞に選択的に遺伝子を導入でき、しかも安全性、安定性、持続性及び遺伝子導入効率が高いウイルスベクターの開発が望まれている。
　ボルナ病ウイルス（Borna disease virus：以下、ＢＤＶともいう）は、非分節のマイナス鎖、１本鎖のＲＮＡをゲノムとして持つモノネガウイルス目に属するウイルスであり、神経細胞に感染指向性があるという特徴を有する。さらに、ＢＤＶは細胞核で複製するウイルスであるが、その感染は非細胞障害性であり長期に持続感染するという特徴や、感染可能な宿主域が極めて広いという特徴も有する（非特許文献１及び２等）。
　ＢＤＶを利用する外来性遺伝子の細胞への導入技術として、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の発現カセットをＢＤＶゲノムの５’末端側の非翻訳領域に挿入し、この組換えウイルスを高活性のポリメラーゼと共にラットに感染させると、ラットの神経細胞においてＧＦＰ遺伝子が発現したことが報告されている（非特許文献３）。
　特許文献１には、（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするｃＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されているウイルスベクターが開示されている。
　ＢＤＶを利用する上記技術によれば、中枢神経系の細胞に選択的に外来性遺伝子を挿入することができると考えられる。しかしながら、上記ＢＤＶを用いる技術においては、遺伝子の導入効率が十分高くないため、遺伝子の導入効率をより高くするための改良の余地があった。従って、組換えウイルスの複製効率が高く、感染可能な宿主域が広く、安全性及び外来性遺伝子の導入効率が高く、安定性及び持続性が良好であり、しかも中枢神経系に選択的に外来性遺伝子を導入することができるウイルスベクターは、未だ開発されていなかった。
特開２０１０－２２３３８号公報
蛋白質　核酸　酵素、Ｖｏｌ．５２、Ｎｏ．１０、ｐ．１１６８－１１７４（２００７） 朝長啓造、「ボルナ病ウイルス感染と中枢神経系疾患」、最新医学・第６０巻・第２号（2005年２月号別刷）、７９－８５頁 U. Schneider et al., Journal of Virology (2007) p.7293-7296
　本発明は、感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも目的細胞（例えば、脳神経系等の中枢神経系の細胞等）に選択的に外来性遺伝子を導入することができ、かつ目的細胞以外の細胞に伝播しないため病原性が低い（安全性が高い）組換えウイルスを効率よく産生できるウイルスベクター、組換えウイルス及び該組換えウイルスを利用する外来性遺伝子の導入方法、外来性遺伝子導入剤等を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本発明者らはＢＤＶゲノム（ＲＮＡウイルスゲノム）における外来性遺伝子の挿入部位について鋭意研究を行った。その結果、ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡ（ＢＤＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ）の種々の部位に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むウイルスベクターを作製し、これらを後述するヘルパープラスミド（ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド（群））と共に細胞に導入して組換えウイルスを産生させ、得られた組換えウイルスを細胞に感染させたところ、ＢＤＶゲノムにおいてＰ遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域（Ｐ遺伝子のＯＲＦの下流に結合する非翻訳領域）に外来性遺伝子を挿入した場合に、該ベクターの組換えウイルスの産生能が高い（該ベクターから産生される組換えウイルスの複製効率が高い）ことを見出し、さらに、該ベクターから産生される組換えウイルスにより細胞において外来性遺伝子が効率よく発現されること、すなわち細胞に外来性遺伝子を非常に効率よく導入することができることを見出した。
　これまで、このようなＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えＢＤＶベクターの作製は不可能であると考えられていたが、本発明者らは、このような組換えＢＤＶベクターの作製に初めて成功した。既存の組換えＢＤＶベクターにおいては、外来性遺伝子をＧ遺伝子領域（特許文献１）又はゲノムの５’末端領域（非特許文献３）に挿入して該遺伝子を発現させていた。しかしながら、外来性遺伝子をＧ遺伝子領域に挿入したベクターは、組換えウイルス産生能が低く、また、該ベクターから産生される組換えウイルスの細胞への感染は一過性であり、持続的に外来性遺伝子を発現できなかった。また、ゲノムの５’末端領域に外来性遺伝子を挿入した組換えＢＤＶベクターは、遺伝子の導入効率が低かった。本発明者らは、Ｐ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えＢＤＶベクターは、既存の組換えＢＤＶベクターよりウイルス産生能が高いものであること、該ベクターから産生される組換えウイルスは、脳神経系細胞においても高効率に、長期間目的遺伝子を発現することができるものであることを見出し、これらを用いると様々な外来性遺伝子を目的細胞に効率よく導入することができることに想到した。
　本発明者らはまた、上記ＢＤＶゲノムのＰ遺伝子のＯＲＦとＭ遺伝子のＯＲＦとの間の非翻訳領域（Ｐ遺伝子のＯＲＦの下流に結合する非翻訳領域）内に外来性遺伝子を挿入した組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡを使用するウイルスベクターにおいて、Ｇ遺伝子をコードする配列を破壊(削除)すると、該ベクターから産生される組換えウイルスの病原性を低減できることを見出した。このようなＧ遺伝子欠損型のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、細胞内における複製能は維持されているため導入された細胞には持続感染するが、Ｇ蛋白質を合成できないため他の細胞に伝播しない。本発明者らは、このようなウイルスベクターにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子を破壊させると、組換えウイルスの細胞内における複製能は維持したまま、その伝播能力をより低減することができることを見出した。さらに、ウイルスベクターにおいて、Ｌ遺伝子のイントロン（Ｇ遺伝子の一部）を削除することにより、ＢＤＶゲノムではＧ遺伝子により分断されているＬ遺伝子のＯＲＦを結合させると、産生される組換えウイルスの複製能力を向上させることができる、すなわち細胞内における外来性遺伝子の複製速度を速くすることができることを見出した。
　本発明者らは更に、上記のＧ遺伝子を破壊したウイルスベクターと共に、他のウイルスの外殻蛋白質をコードする遺伝子を用いて組換えウイルスを製造すると、組換えウイルスの細胞指向性を変化させることができるため、種々の細胞に目的遺伝子を効率よく導入できることを見出した。
　なお、ＢＤＶゲノムには、少なくとも６つの蛋白質、すなわち核蛋白質（Ｎ蛋白質）、Ｘ蛋白質、リン酸化蛋白質（Ｐ蛋白質）、マトリックス蛋白質（Ｍ蛋白質）、表面糖蛋白質（Ｇ蛋白質）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ蛋白質）がコードされている。図１は、ＢＤＶゲノムの構造を模式的に示す図である。図１において、Ｎ、Ｘ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬは、それぞれの遺伝子のＯＲＦを模式的に示している。ＢＤＶゲノムは、図１に示すように、Ｎ、Ｘ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬの各遺伝子を、３’末端からこの順に有する。本明細書中、Ｇ蛋白質、Ｍ蛋白質、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質をコードするウイルスＲＮＡを、それぞれＧ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子という。また、例えば、「Ｇ遺伝子のｃＤＮＡ」とは、Ｇ遺伝子をコードするｃＤＮＡを意味する。
　すなわち、本発明は、以下の項１～項１４に関する。
項１．　（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されていることを特徴とするウイルスベクター。
項２．　（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである項１に記載のウイルスベクター。
項３．　（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子が破壊された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである項１又は２に記載のウイルスベクター。
項４．　（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡである項１に記載のウイルスベクター
項５．　（ｃ）プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列であることを特徴とする項１～４のいずれかに記載のウイルスベクター。
項６．　（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡの上流に（ｂ１）ハンマーヘッドリボザイムをコードするｃＤＮＡが配置され、かつ、該（ａ）の下流に（ｂ２）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするｃＤＮＡ配列が配置されていることを特徴とする項１～５のいずれかに記載のウイルスベクター。
項７．　項１～６のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるＲＮＡを含むことを特徴とする組換えウイルス。
項８．　項１～６のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、及び該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
項９．　ヘルパープラスミドとして、さらに、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する項８に記載の組換えウイルスの作製方法。
項１０．　ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスのＭ遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する項８又は９に記載の組換えウイルスの作製方法。
項１１．　項７に記載の組換えウイルス、又は項８～１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを細胞又は動物に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
項１２．　項７に記載の組換えウイルス、又は項８～１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
項１３．　項７に記載の組換えウイルス、又は項８～１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
項１４．　項１～６のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。
　本発明はまた、以下の方法、使用等も包含する。
　項７に記載の組換えウイルス、又は項８～１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを動物に投与する脳神経系細胞への外来性遺伝子の導入方法、
　項７に記載の組換えウイルス、又は項８～１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
　項７に記載の組換えウイルス、又は項８～１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
　in vitroの細胞又は動物に外来性遺伝子を導入するための、項７に記載の組換えウイルス、又は項８～１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
　脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するための、項７に記載の組換えウイルス、又は項８～１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
　本発明によれば、感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため宿主細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも脳神経系の細胞等の目的細胞に選択的に外来性遺伝子を導入することができ、かつ目的細胞以外の細胞には伝播しないため病原性が低い（安全性が高い）組換えウイルスを高い生産性で産生できるウイルスベクター及び組換えウイルスを作製することができる。また、本発明によれば、外来性遺伝子を脳神経系の細胞等の目的細胞に選択的にかつ効率よく導入することができ、該細胞において外来性遺伝子を持続的に発現させることができる。さらに、本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、脳神経系細胞等の細胞の核内で持続感染を起こすため、宿主免疫の攻撃を受け難く、排除が起こりにくい。また、本発明の組換えウイルスが持つＰ蛋白質には、宿主免疫の応答経路を阻害するという働きがあり、ウイルス感染細胞では自然免疫の活性化も起こらない。
図１は、ボルナ病ウイルスのゲノム（野生型）の構造を模式的に示す図である。 図２（ａ）は、野生型のＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおけるＰ遺伝子のＯＲＦとＭ遺伝子のＯＲＦとの間の非翻訳領域（ＢＤＶゲノムの塩基の番号で１８７５～１８９５）を模式的に示した図であり、（ｂ）は、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子挿入部位の一例を模式的に示した図である。 図３は、本発明のウイルスベクターの構造の一例を模式的に示す図である。 図４は、ＢＤＶゲノムの５’末端側の非翻訳領域にＧＦＰ遺伝子を挿入した組換えウイルスベクター（ｒＢＤＶ－５’ＧＦＰ）の構造を模式的に示す図である。 図５は、野生型又は組換え型ＢＤＶに感染したＶｅｒｏ細胞の経時変化（感染後０日から１９日の感染率変化）を示す図である。 図６（ａ）及び（ｂ）は、野生型ＢＤＶ、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び組換えウイルス５’ＧＦＰそれぞれを感染させた細胞における遺伝子の発現をノーザンブロット法により調べた結果（ａ）、及び蛋白質の発現をウェスタンブロット法により調べた結果を示す図（ｂ）である。 図７ａ～ｆはそれぞれ、野生型ＢＤＶ、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び組換えウイルス５’ＧＦＰそれぞれを感染させた細胞における蛋白質の発現を調べた結果を示す顕微鏡写真である。 図８ａ～ｆはそれぞれ、野生型ＢＤＶ、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び組換えウイルス５’ＧＦＰそれぞれを感染させた細胞における蛋白質の発現を調べた結果を示す顕微鏡写真である。 図９は、ラット脳へのウイルスの感染を調べる実験方法を説明するための図である。 図１０は、ラット脳へのウイルスの接種部位を示す図である。 図１１は、ラット脳において発現したＢＤＶゲノムのＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す図である。 図１２ａ～ｄはそれぞれ、組換えウイルス接種後１４日後のラット脳を切開して裏返したマクロ写真（ａ及びｂ）、及び該脳のマクロ蛍光写真（ｃ及びｄ）である。 図１３上図及びａ～ｄはそれぞれ、ウイルスを感染させたラット脳の大脳皮質のマクロ写真（上図）及び該大脳皮質の切片の顕微鏡写真（ａ～ｄ）である。 図１４（ａ）及び（ｂ）は、ｒＢＤＶ－ｐ／ｍＤｓＲｅｄベクターから得られた組換えウイルスを感染させた細胞における蛋白質の発現を調べた結果を示す顕微鏡写真である。 図１５（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ、ｒＢＤＶ－ｐ／ｍＬｕｃｉベクターから得られた組換えウイルスを感染させた細胞における蛋白質の発現を調べた結果を示す顕微鏡写真（ａ）及びルシフェラーゼの活性（ｂ）を示す図である。 図１６は、本発明のウイルスベクターの構造の一例を模式的に示す図である。 図１７は、本発明のウイルスベクターの構造の一例を模式的に示す図である。 図１８は、組換えウイルス接種８カ月後のマウスの脳切断面の蛍光顕微鏡写真（図１８ａ：マクロ写真、図１８ｂ：図１８ａの４００倍拡大写真）である。 図１９は、プラスミドp/mGFP ΔGの作製手順の概略を示す図である。 図２０は、プラスミドp/mGFP ΔG LLの作製手順の概略を示す図である。 図２１は、BDVのG遺伝子発現プラスミドの作製手順の概略を示す図である。 図２２は、プラスミドp/mGFPΔG及びp/mGFP ΔG LLそれぞれによる組換えBDV産生能力を比較した図である。 図２３は、G遺伝子安定発現Vero細胞及びVero細胞へのp/mGFP ΔG-LLウイルスの感染率の推移を示す図である。 図２４ａは、野生型ＢＤＶ及びG欠損型組換えウイルスそれぞれを感染させた細胞における蛋白質の発現をウェスタンブロット法により調べた結果を示す図であり、図２４ｂは、G欠損型組換えウイルスの感染によりGFPを発現したVero細胞の蛍光顕微鏡写真である。 図２５は、BDV　G遺伝子細胞内領域と水疱性口内炎ウイルス(VSV)のG遺伝子細胞外及び膜貫通領域とを有するキメラ蛋白質発現プラスミドの作製手順の概略を示す図である。 図２６は、ヘルパープラスミドとしてBDVのG遺伝子、又はVSV及び狂犬病ウイルス(Rab)のいずれかの外殻遺伝子を用いた場合のG欠損型組換えウイルスの回収効率を示す図である。 図２７は、M遺伝子を欠損させたプラスミドp/mGFP ΔM-G LLの作製手順の概略を示す図である。 図２８は、p/mGFP ΔM-G LL P-M tandem vectorの作製手順の概略を示す図である。 図２９は、組換えウイルスp/mNEP感染細胞のWestern Blottingの結果を示す図である。 図３０は、組換えウイルスを感染させた細胞におけるNEPの酵素活性を示す図である。 図３１は、p/m miR155導入用ベクター(pSIRIUS-B)の作製手順の概略を示す図である。 図３２は、プラスミドｐ/ｍ miR155の作製手順の概略を示す図である。 図３３は、組換えウイルスを感染させた細胞における標的遺伝子の転写阻害効率を示す図である。 図３４は、プラスミドp/m miRx2の作製手順の概略を示す図である。 図３５は、miRNA×1（p/m miR155）、miRNA×2及びmiRNA×4を挿入したp/mベクターの模式図である。 図３６は、GAPDHに対するmiRNAを挿入した組換えウイルスRNAを有する組換えウイルスp/m-miR-GAPDHを感染させた効果を示す図である。 図３７は、APP(アミロイド前駆蛋白質)に対するmiRNAを挿入した組換えウイルスRNAを有する組換えウイルスp/m-miR-APPを感染させた効果を示す図である。
　以下に、本発明を説明する。
１．ウイルスベクター
　本発明のウイルスベクターは、（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されているものである。
　以下、上記（ａ）の組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを、単に「（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ」ともいう。本発明のウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）以外の配列を含んでもよい。
（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ
　本発明における（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する組換えＢＤＶ　ＲＮＡのｃＤＮＡであり、該組換えＢＤＶ　ＲＮＡは、前記Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する。
　このような（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡとして、ＢＤＶゲノム又はＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子のいずれか又は両方が破壊された配列において、Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列をコードするｃＤＮＡ等が好適に用いられる。
　中でも、本発明における（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡとして、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子のいずれか又は両方が破壊された配列を有し、Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有するＲＮＡのｃＤＮＡが好適である。
　本発明における（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、より好ましくは、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである。（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡとして、このようなＧ遺伝子が破壊された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを含むウイルスベクターを、以下、「Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクター」ともいう。Ｇ遺伝子が破壊されていることにより、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、導入された細胞以外の細胞に伝播しないため、病原性が低減されて安全性が高いものとなる。さらに好ましくは、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子が破壊された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである。このような組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを含むウイルスベクターを、以下、「Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクター」ともいう。Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子が破壊されていることにより、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスの病原性がより低減され、安全性がより高くなる。
　遺伝子を破壊するとは、通常、該遺伝子が蛋白質（例えばＧ遺伝子であればＧ蛋白質）をコードすることができる形態で存在しないことを意味する。遺伝子の破壊は、その遺伝子全体を削除することの他、該遺伝子の一部の削除、該遺伝子に他の配列を挿入する、該遺伝子中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する等により行うことができる。
　Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクター、及びＧ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターにおいては、ＢＤＶゲノムにおけるＬ遺伝子のイントロンが削除されていることが好ましい。Ｌ遺伝子のイントロンを削除することにより、天然型ＢＤＶゲノムでは分断されているＬ遺伝子のＯＲＦが図１６に示すように連結されるため、組換えウイルスの複製能力、すなわち細胞内での外来性遺伝子の発現効率がより向上する。また、Ｌ遺伝子のイントロンを削除すると、より大きな外来性遺伝子を挿入することが可能となる。Ｌ遺伝子のイントロンの除去は、公知の方法により行うことができる。
　本発明における（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡとして、ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡを用いることもできる。このような組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノム（ＲＮＡウイルスゲノム）をコードするｃＤＮＡにおいて、ＢＤＶのＰ遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に任意の外来性遺伝子が挿入されたものである。
　本発明のウイルスベクターにおける（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの構造の一例を、図３に模式的に示す。図３は、ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡである。
　本発明のウイルスベクターにおける（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの好ましい構造の一例を、図１６に模式的に示す。図１６に示される組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊（削除）された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである。
　本発明のウイルスベクターにおける（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの別の好ましい構造の一例を、図１７に模式的に示す。図１７に示される組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子が破壊（削除）された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである。図１７中の点線で囲まれたＭは、削除されたＭ遺伝子を示す。なお、図３においては、Ｌ遺伝子はＧ遺伝子により分断されているが、図１６及び図１７に示される組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおいては、Ｇ遺伝子の一部の削除によりＢＤＶゲノムにおけるＬ遺伝子のイントロンが削除されているため、Ｌ遺伝子のＯＲＦが図中に矢印で示す部分において結合されている。
　本発明におけるＢＤＶゲノムは、Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（ボルナウイルス科）に属するウイルス又はその変異株の遺伝子であればよい。ボルナウイルス科に属するウイルスとしては、例えば、Ｈｅ８０、Ｈ１７６６、Ｓｔｒａｉｎ　Ｖ、ｈｕＰ２ｂｒ等の菌株が挙げられる。変異株としては、例えば、Ｎｏ／９８、Ｂｏ／０４ｗ、ＨＯＴ６等が挙げられる。これらのゲノム配列は、例えば、以下から入手可能である。
Ｈｅ８０；GenBank Accession# L27077, Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C. Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994).
Ｈ１７６６；GenBank Accession# AJ311523, Pleschka,S., Staeheli,P., Kolodziejek,J., Richt,J.A., Nowotny,N. and Schwemmle,M. Conservation of coding potential and terminal sequences in four different isolates of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 82 (PT 11), 2681-2690 (2001).
Ｓｔｒａｉｎ　Ｖ；GenBank Accession# U04608, Briese,T., Schneemann,A., Lewis,A.J.,
Park,Y.S., Kim,S., Ludwig,H. and Lipkin,W.I. Genomic organization of Borna disease virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 (10), 4362-4366 (1994).
ｈｕＰ２ｂｒ；GenBank Accession# AB258389, Nakamura, Y., Takahashi, H., Shoya, Y., Nakaya, T., Watanabe, M., Tomonaga, K., Iwahashi, K., Ameno, K., Momiyama, N., Taniyama, H., Sata, T., Kurata, T., de la Torre, J. C., Ikuta, K. Isolation of Borna disease virus from human brain tissue, J. Virol 74 (2000) 4601-4611.
Ｎｏ／９８；GenBank Accession# AJ311524, Nowotny,N. and Kolodziejek,J. Isolation and characterization of a new subtype of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 74, 5655-5658 (2000).
Ｂｏ／０４ｗ；GenBank Accession# AB246670, Watanabe,Y., Ibrahim,M.S., Hagiwara,K., Okamoto,M., Kamitani,W., Yanai,H., Ohtaki,N., Hayashi,Y., Taniyama,H., Ikuta,K. and Tomonaga,K. Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility. Microbes and Infection 9 (2007) 417-427.
　また、ＢＤＶゲノムは、ＢＤＶとしての機能が保持されている限り、これらのゲノム配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、１乃至数個（通常１～５個、好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個）であってよい。
　ＢＤＶゲノム、及びＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子等が破壊された配列を有するＲＮＡのｃＤＮＡ、すなわちこのような配列のＲＮＡをコードするｃＤＮＡは、当該ウイルスゲノム情報に基づいて調製することができる。例えば、ＲＮＡゲノムから、配列逆転酵素を使用してｃＤＮＡを調製することができる。また、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊された配列を有するＲＮＡのｃＤＮＡは、例えば、ＢＤＶゲノムのｃＤＮＡを鋳型に、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより容易に作製することができる。ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子が破壊された配列を有するＲＮＡのｃＤＮＡは、例えば、ＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ又は該ゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊された配列を有するＲＮＡのｃＤＮＡを鋳型に、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより容易に作製することができる。また、ＲＮＡゲノムの配列、又は該ＲＮＡゲノムからＧ遺伝子等を欠損させた配列に基づき、ＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。あるいは、本発明における（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡを取得する方法として、公知のＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。ＰＣＲ、プライマーの調製等の操作は、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、行うことができる。
　（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノムにおけるＰ遺伝子のＯＲＦの下流に連結する非翻訳領域内に任意の外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである。Ｐ遺伝子のＯＲＦの下流に連結する非翻訳領域は、例えば、ＢＤＶゲノムにおいては、Ｐ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域（以下、単に「Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域」ともいう）である。外来性遺伝子がこのような箇所に挿入されていることにより、ウイルスベクターの組換えウイルス生産性、すなわち該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスの複製効率を高くすることができるため、効率よく組換えウイルスを産生することができる。また、該ウイルスベクターから産生（複製）される組換えウイルスは、細胞に導入した場合に外来性遺伝子を効率よく発現できるものとなる。従って、本発明のウイルスベクターを細胞に導入した際、又は該ウイルスベクターから産生される組換えＢＤＶを細胞に感染させた際に、任意の外来性遺伝子が効率よく細胞に導入される。すなわち、外来性遺伝子が細胞内において効率よく発現されることになる。図２（ａ）に示すように、野生型のＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおいて、Ｐ遺伝子のＯＲＦの下流に連結する非翻訳領域（すなわちＢＤＶゲノムにおけるＰ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域）（例えば、配列番号１にそのｃＤＮＡ配列が示されるＢＤＶゲノムの塩基の番号で１８７５～１８９５（すなわち配列番号１の１８７５～１８９５番の塩基））には、Ｐ遺伝子の停止シグナル配列（配列番号１の塩基の番号で１８７５～１８８２）及びＭ遺伝子の開始シグナル配列（配列番号１の塩基の番号で１８７５～１８９０）が存在する。Ｐ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域（例えば、配列番号１の塩基の番号で１８７８～１８９２の間）における外来性遺伝子の挿入部位としては、Ｐ遺伝子の停止シグナル配列及び／又はＭ遺伝子の開始シグナル配列を含まない領域が好ましく、Ｐ遺伝子の停止シグナル配列及びＭ遺伝子の開始シグナル配列を含まない領域がより好ましく、例えば、配列番号１にそのｃＤＮＡ配列が示されるＢＤＶゲノムであれば、配列番号１の塩基の番号で１８９０と１８９１の間等が特に好ましい。
　本発明における組換えＢＤＶゲノムは、外来性遺伝子の両側又は片側（好ましくは、両側）に制限酵素サイトを含むことができる。制限酵素サイトを有すると、外来性遺伝子をＢＤＶゲノムの配列中に容易に組み込みやすくなると共に、外来性遺伝子の蛋白質への翻訳効率が上昇するため好ましい。本発明において、外来性遺伝子の両側又は片側に配置することができる制限酵素サイトとしては、例えば、外来性遺伝子の３’末端側については、Ｂｓｔ ＢＩサイト、Ｐａｃ Ｉサイト、Ｓｓｅ８３８７ Iサイト、Ｓｗａ Ｉサイト、Ｋｐｎ Ｉサイト等が挙げられ、Ｂｓｔ ＢＩサイトが好ましい。外来性遺伝子の５’末端側については、Ｐａｃ Ｉサイト、Ｂｓｔ ＢＩサイト、Ｓｓｅ８３８７ Iサイト、Ｓｗａ Ｉサイト、Ｋｐｎ Ｉサイト等が挙げられ、Ｐａｃ Ｉサイトが好ましい。
　また、本発明における組換えＢＤＶゲノムがＭ遺伝子を含む場合には、該組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、外来性遺伝子（及び必要に応じてその両側又は片側に配置される制限酵素サイト）とＰ遺伝子のＯＲＦとの間、及び外来性遺伝子（及び必要に応じてその両側又は片側に配置される制限酵素サイト）とＭ遺伝子のＯＲＦとの間にそれぞれ、Ｐ遺伝子の停止シグナル配列及びＭ遺伝子の開始シグナル配列（taaaaaaatcgaatca（配列番号１１））を含む配列が存在することが好ましい。本発明における組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおいては、例えば、図２（ｂ）にあるような配列で任意の外来性遺伝子が挿入されていることがより好ましい。図２（ｂ）には、一例としてＭ遺伝子を含む組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡが示されている。Ｍ遺伝子欠損型のウイルスベクターの場合にも、図２（ｂ）に示されるように、外来性遺伝子の下流にＰ遺伝子の停止シグナル配列及びＭ遺伝子の開始シグナル配列（配列番号１１）を含む配列を有することが好ましい。Ｍ遺伝子欠損型のウイルスベクターの場合、図２（ｂ）に示される外来性遺伝子の下流のＰ遺伝子の停止シグナル配列及びＭ遺伝子の開始シグナル配列は、外来性遺伝子の停止シグナル及びＬ遺伝子の開始シグナルとして機能する。なお、図２（ｂ）では、一例として外来性遺伝子の３’末端側にＢｓｔ　ＢＩサイト、外来性遺伝子の５’末端側にＰａｃ　Ｉサイトをそれぞれ挿入した場合を示しているが、外来性遺伝子の両側に配置する制限酵素サイトは、これらに限定されるものではない。
　本発明における外来性遺伝子の種類や長さは特に限定されず、目的に応じて所望の遺伝子を用いることができる。例えば、蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子のｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、short hairpin RNA (shRNA)、microRNA (miRNA)をコードするｃＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーをコードするｃＤＮＡ等を用いることができる。本発明のウイルスベクターにおいては、１又は２以上の外来性遺伝子を使用することができる。
（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ
　リボザイムとしては、（ａ）組換えウイルスのｃＤＮＡから転写された任意の外来性遺伝子を切断することができる配列のものであればよい。（ｂ）としては、例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｍＲｚ）、δ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶＲｚ）、ヘアピンリボザイム、人工リボザイム等のリボザイムをコードするｃＤＮＡ等のＤＮＡが挙げられる。また、リボザイム活性を有する限り、上記リボザイムの改変型リボザイムをコードするｃＤＮＡ等のＤＮＡも使用することができる。改変型リボザイムとしては、共通配列を有し、１～数個（数個とは、例えば、１０個、好ましくは５個、より好ましくは３個、さらに好ましくは２個である）の塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列からなり、かつリボザイムとして機能するポリヌクレオチド等が挙げられる。中でも、本発明におけるリボザイムとしては、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｍＲｚ）、δ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶＲｚ）が好ましい。また、（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの上流、すなわち３’末端側に（ｂ１）ＨａｍＲｚをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）が配置され、かつ、該（ａ）の下流、すなわち５’末端側に（ｂ２）ＨＤＶＲｚをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）配列が配置されていることが特に好ましい。これにより、細胞における外来性遺伝子の発現効率が向上する。
　ＨａｍＲｚの塩基配列は、Yanai et al., Microbes and Infections 8 (2006) 1522-1529、Mercier et al., J. Virol. 76 (2002) 2024-2027及びInoue et al., J. Virol. Methods 107 (2003) 229-236等に記載されている。
　ＨＤＶＲｚの塩基配列は、Ferre-D'Amare,A.R., Zhou,K. and Doudna,J.A.　 Crystal structure of a hepatitis delta virus ribozyme. Nature 395 (6702), 567-574 (1998)
等に記載されている。本発明においては、これらの文献に記載されているＨａｍＲｚの塩基配列をコードするｃＤＮＡを用いることができる。本発明における特に好ましいＨａｍＲｚ及びＨＤＶＲｚの塩基配列を、以下に示す。
ＨａｍＲｚ：
5’-UUGUAGCCGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUAUAGGAAAGGAAUUCCUAUAGUCAGCGCUACAACAAA-3’（配列番号２）
ＨＤＶＲｚ：
5’-GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACACCAUUGCACUCCGGUGGCGAAUGGGAC-3’
（配列番号３）
（ｃ）プロモーター配列
　本発明における（ｃ）プロモーター配列としては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列、ＲＮＡポリメラーゼＩ系プロモーター配列、Ｔ７ポリメラーゼ系プロモーター配列が挙げられるが、中でもＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列が好ましい。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーターが挙げられる。中でも、ＣＡＧＧＳプロモーターが特に好ましい。このようなプロモーター配列は、例えば、J.A. Sawicki, R.J. Morris, B. Monks, K. Sakai, J. Miyazaki, A composite CMV-IE enhancer/b-actin promoter is ubiquitously expressed in mouse cutaneous epithelium, Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。
　本発明の好ましい態様においては、（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ（組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ）の上流に（ｂ１）ハンマーヘッドリボザイムをコードするｃＤＮＡが配置され、かつ、該（ａ）の下流に（ｂ２）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするｃＤＮＡ配列が配置されている。また、（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターの下流に配置されている。
（ｄ）その他の塩基配列
　本発明のウイルスベクターは、ＳＶ４０ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列の１部又は全部の配列を含むことができる。また、ウイルスベクターがＳＶ４０ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列の１部又は全部の配列を含む場合には、該配列は（ａ）及び（ｂ）の下流に配置されていることが好ましい。ＳＶ４０ウイルスＤＮＡの複製開始点／プロモーター領域配列の一部としては、ＳＶ４０複製開始点／プロモーター領域内の５’側の１１３塩基からなる断片が好適である。
　ＳＶ４０ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列（配列番号４）は、例えば、D.A. Dean, B.S. Dean, S. Muller, L.C. Smith, Sequence requirements for plasmid nuclear import, Exp. Cell. Res. 253 (1999) 713-722等に記載されている。
　本発明のウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、さらに、蛋白質の発現に有利である１又は複数の因子、例えば、エンハンサー、アクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列も含み得る。また、本発明のウイルスベクターは、選択された細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。
　本発明のウイルスベクターは、線状ＤＮＡであっても環状ＤＮＡであってもよいが、細胞に導入する際には環状であることが好ましい。環状のウイルスベクターとしては、例えば、本発明のウイルスベクターの必須の配列である上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のＤＮＡ、並びに必要に応じて含まれる上記（ｄ）のＤＮＡが、上述した所定の順番で、市販のプラスミドベクター中に配置されているもの等が挙げられる。市販のプラスミドベクターとしては、ウイルスベクターを導入する細胞内で自己複製可能なものであればよく、例えば、pBluescript SKII(-)、pCAGGS、pCXN2、pCDNA3.1等が挙げられる。
２．ウイルスベクターの作製方法
　本発明のウイルスベクターの作製方法としては特に限定されず、自体公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。例えば、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法において、ＣＡＴ遺伝子をＢＤＶのゲノム配列に置き換え、さらにＰ遺伝子の下流に連結する非翻訳領域（Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域）内に目的とする外来性遺伝子を挿入することによって、本発明の自己複製型（持続感染型）のウイルスベクターを作製することができる。上記方法により作製されるウイルスベクターは、（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡとして、ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡ（例えば、図３に模式的に示される構造を有する組換えウイルスのｃＤＮＡ）を有するものである。
　Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクター、並びにＧ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターは、自体公知の遺伝子工学的手法を用いて、例えば、（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡとして、ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡ（例えば図３に模式的に示される構造を有する（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ）を有する自己複製型ウイルスベクターを鋳型として、ＰＣＲ等によりＧ遺伝子に欠損変異等を挿入することにより本発明におけるＧ遺伝子欠損型ウイルスベクターを作製することができる。Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクターの作製において、好ましくは、Ｌ遺伝子のイントロン部分も同様にＰＣＲにより削りとり、本発明におけるより好ましいＧ遺伝子欠損型ウイルスベクターを作製することができる。Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターも同様に、Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクターを鋳型にＰＣＲ等によりＭ遺伝子を欠損させることにより作製できる。
　ウイルスベクターが線状の場合には、上記環状のウイルスベクターを、（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ領域、（ｃ）プロモーター配列の領域、及びその他蛋白質発現に必要なシグナル配列領域以外の領域で１箇所切断する制限酵素を該ベクターの種類にあわせて適宜選択し、該制限酵素により環状のウイルスベクターを切断することにより線状のウイルスベクターを作製することができる。
　本発明のウイルスベクターに含まれる外来性遺伝子を目的細胞に導入する方法としては、該ウイルスベクターを後述するヘルパープラスミドと共に目的細胞に導入する方法、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを目的細胞に感染させる方法があるが、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを用いる方法が好ましい。本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、野生型ＢＤＶゲノムの代わりに上記ウイルスベクターにコードされるＲＮＡを有する組換え型ＢＤＶである。
３．組換えウイルス
　上記ウイルスベクターにコードされるＲＮＡを含む組換えウイルスも、本発明の１つである。好ましくは、ウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶのＮ蛋白質、ＢＤＶのＰ蛋白質及びＢＤＶのＬ蛋白質を含む組換えウイルスである。本発明の組換えウイルスは、上記組換えＢＤＶゲノムを含むことにより、細胞に感染後、持続的に外来性遺伝子を発現することができる持続感染型の組換えウイルスである。組換えウイルスは、所望によりＢＤＶのＧ蛋白質又は他のウイルスの外殻蛋白質を有していてもよく、さらに、ＢＤＶのＭ蛋白質を有していてもよい。本発明における外殻遺伝子は、ウイルスの外殻蛋白質をコードする遺伝子である。ＢＤＶでは、外殻蛋白質をコードする遺伝子は、Ｇ遺伝子である。
　本発明の組換えウイルスは、例えば、上記ウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、及び該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含む方法により作製することができる。このような組換えウイルスの作製方法も、本発明の１つである。このような方法により、in vitroで組換えウイルスを産生することができる。ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入するin vitroの細胞は、通常、培養細胞である。
　本発明の方法において、Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、ヘルパープラスミドとして、さらに、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入することが好ましい。ウイルスの外殻遺伝子は、外来性遺伝子を導入する目的細胞に応じて適宜選択すればよく、ＢＤＶのＧ遺伝子、ＢＤＶ以外のウイルスの外殻遺伝子を用いることができる。Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、ヘルパープラスミドとして、さらに、ＢＤＶウイルスのＭ遺伝子を発現するプラスミドを細胞に導入することが好ましい。すなわちＧ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、上記ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と共に、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶウイルスのＭ遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入することが好ましい。
　ヘルパープラスミドは、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＭ遺伝子、並びにウイルスの外殻遺伝子それぞれを発現することができるものであればよく、これらの遺伝子の２つ以上が１つのプラスミドに含まれていてもよく、これらの遺伝子がそれぞれ別のプラスミドに含まれていてもよい。例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミドとして、下記（１）～（４）のいずれかのプラスミド又はプラスミド群等が好適に用いられる。
（１）ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミド、ＢＤＶのＰ遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（２）ＢＤＶのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド、並びにＢＤＶのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（３）ＢＤＶのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド、並びにＢＤＶのＰ遺伝子を発現するプラスミド
（４）ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド
　ヘルパープラスミドは、ＢＤＶゲノム複製に必要なウイルス蛋白質を提供するものであり、ウイルスベクターと共にヘルパープラスミドを細胞に導入することにより、感染性のある組換えウイルスを産生することができる。ヘルパープラスミドにおけるＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現する上記（１）～（４）のいずれかのプラスミド（群）としては、（１）～（３）のいずれかのプラスミド群が好ましい。また、本発明の組換えウイルスの作製方法に用いられるウイルスベクター及びその好ましい態様としては、上述したのと同様である。
　本発明におけるヘルパープラスミドは、上記ウイルスベクターと共に細胞に導入された際に、該細胞内でＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現することができるものであればよい。例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶのＰ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＰ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶのＬ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＬ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドを用いることが好ましい。
　ＢＤＶのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡ及びＰ遺伝子のｃＤＮＡがこの順番で配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡ及びＰ遺伝子のｃＤＮＡがこの順番で配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡ、Ｌ遺伝子のｃＤＮＡ及びＰ遺伝子のｃＤＮＡがこの順番で配置されたプラスミドが好ましい。
　ウイルスベクターがＧ遺伝子欠損型ウイルスベクターの場合には、ヘルパープラスミドは、該Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクターと共に細胞に導入された際に、該細胞内でＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子並びにウイルスの外殻遺伝子を発現することができるものであればよい。ウイルスベクターがＧ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターの場合には、ヘルパープラスミドは、細胞内でさらに、ＢＤＶのＭ遺伝子を発現することができるものであればよい。
　ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、上記（１）～（４）のいずれかのプラスミド（群）と共に用いることができる。さらに、外殻遺伝子を発現するプラスミドとして、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子、並びにウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いることもできる。外殻遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流に外殻遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドが好ましい。
　ＢＤＶのＧ遺伝子等の外殻遺伝子にコードされる外殻蛋白質は、通常膜貫通型蛋白質であり、そのアミノ酸配列中に、細胞外に位置する領域（細胞外配列）、細胞膜貫通領域（細胞膜貫通配列）、及び細胞内に位置する領域（細胞内配列）を含む。ヘルパープラスミドにおける外殻遺伝子は、ＢＤＶのＧ遺伝子でもよく、例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス等の宿主細胞膜を外殻として利用する全てのエンベロープウイルスの外殻遺伝子を使用できるが、細胞内配列として、ＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードしていることが好ましい。すなわち本発明における外殻遺伝子は、細胞内配列としてＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列を有し、任意のウイルス（ＢＤＶ又はＢＤＶ以外のウイルス）の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列を有する蛋白質をコードする遺伝子であることが好ましい。細胞内配列としてＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列を有することにより、組換えウイルス産生効率が向上する。例えば、ヘルパープラスミドにおいてＢＤＶ以外のウイルスの外殻遺伝子を用いる場合には、該外殻遺伝子において、細胞内配列をコードする遺伝子配列を、公知の遺伝子工学的手法によりＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする配列に置換して用いることが好ましい。
　ＢＤＶ以外のウイルスの細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする外殻遺伝子をヘルパープラスミドに用いると、遺伝子が由来するウイルスの種類により、産生されるウイルスの細胞指向性を変化させることができる。例えば、上皮系、呼吸器系細胞等に組換えウイルスを感染させる場合には、上皮系、呼吸器系細胞等への指向性が高いウイルス（例えば麻疹ウイルス、センダイウイルス、水疱性口内炎ウイルス等）の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いることが好ましい。
　Ｍ遺伝子を発現するプラスミドとして、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子、Ｐ遺伝子及びウイルスの外殻遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子、並びにＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドを用いることもできる。Ｍ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＭ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドが好ましい。
　ＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡ、Ｐ遺伝子のｃＤＮＡ及びＬ遺伝子のｃＤＮＡは、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、及びＬ遺伝子それぞれの配列情報に基づいて調製することができる。ＢＤＶのＭ遺伝子のｃＤＮＡ及びＧ遺伝子のｃＤＮＡは、ＢＤＶのＭ遺伝子及びＧ遺伝子それぞれの配列情報に基づいて調製することができる。例えば、ＲＮＡから、配列逆転酵素を使用してｃＤＮＡを調製することができる。また、ＲＮＡの配列に基づき、ＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。
　ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子、並びにＭ遺伝子及びＧ遺伝子としては、例えば、上述したCubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C.　Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994)に記載されている配列の遺伝子を用いることができる。また、これらの遺伝子として、上記の配列に従って合成したＲＮＡを使用することもできる。さらに、ＢＤＶのＮ、Ｐ、Ｌ、Ｍ及びＧ蛋白質間それぞれで保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知のＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子、Ｍ遺伝子及びＧ遺伝子それぞれの配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートＲＴ－ＰＣＲによって断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法により塩基配列を決定することができる。さらに、本発明におけるＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子、並びにＭ遺伝子及びＧ遺伝子は、該遺伝子にコードされる蛋白質がそれぞれＢＤＶのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質、並びにＭ遺伝子及びＧ蛋白質の機能を保持している限り、塩基配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、１乃至数個（１～５個、好ましくは１～３個、さらに好ましくは１～２個）であってよい。
　このようなＮ遺伝子として、例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＮ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＮ遺伝子として使用できる。また、ＢＤＶのＰ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＰ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＰ遺伝子として使用できる。ＢＤＶのＬ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＬ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＬ遺伝子として使用できる。ＢＤＶのＧ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＧ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＧ遺伝子として使用できる。ＢＤＶのＭ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＭ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＭ遺伝子として使用できる。配列同一性は、CLUSTAL W ，GCG program, GENETYX，BLAST searchにより決定される。
　水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス等のＢＤＶ以外のウイルスの外殻遺伝子として、例えば、水疱性口内炎ウイルスはＧｅｎｅＢａｎｋ,Ｎｏ：Ｊ０２４２８．１、狂犬病ウイルスはＧｅｎｅＢａｎｋ，Ｎｏ：ＡＢ０４４８２４．１に記載されている配列の遺伝子等を用いることができる。好ましくは、これらの外殻遺伝子中の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする配列を用いる。外殻遺伝子中の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする配列は、Garry RF. Proteomics computational analyses suggest that the bornavirus glycoprotein is a class III viral fusion protein (γ penetrene). Virol J. 145(6),Sep-18(2009)等に記載されている。また、これらの遺伝子として、上記の配列に従って合成したＲＮＡを使用することもできる。さらに、このような外殻遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつ外殻蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるウイルスの外殻遺伝子として使用できる。
　ヘルパープラスミドは、細胞に導入する際には線状であっても問題はないが、環状であることが好ましい。環状のヘルパープラスミドは、例えば、本発明におけるヘルパープラスミドの必須の配列であるプロモーター配列及び蛋白質のｃＤＮＡが配置された形態で、蛋白質の発現に有利である１又は複数の因子、例えば、エンハンサー、アクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列も含み得る。また、選択された細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。ヘルパープラスミドは、該ヘルパープラスミドを導入する細胞内で自己複製可能な市販のプラスミドベクターを使用して構築するのが好ましく、市販のプラスミドベクターとしては、例えば、pCAGGS、pCXN2、pCDNA3.1等が挙げられる。ヘルパープラスミドにおけるプロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターが好ましい。
　これらのヘルパープラスミドは、自体公知の遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミド、ＢＤＶのＰ遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＬ遺伝子を発現するプラスミドは、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法により作製することができる。
　ＢＤＶのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミドのＮ遺伝子のｃＤＮＡの下流のユニークな制限酵素配列領域から、Ｎ遺伝子のｃＤＮＡやプロモーターなどのシグナル配列を切断しない制限酵素を適宜選択し、その制限酵素サイトにＢＤＶのＰ遺伝子のｃＤＮＡを挿入することで作製することができる。ＢＤＶのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミドのＮ遺伝子のｃＤＮＡの下流のユニークな制限酵素配列領域から、Ｎ遺伝子のｃＤＮＡやプロモーターなどのシグナル配列を切断しない制限酵素を適宜選択し、その制限酵素サイトにＢＤＶのＬ遺伝子のｃＤＮＡを挿入することで作製することができる。ただし、Ｎ遺伝子のｃＤＮＡ領域とＬ遺伝子又はＰ遺伝子のｃＤＮＡが挿入された領域との間の領域にＬ遺伝子又はＰ遺伝子の発現を促進するようなプロモーター配列や配列内部リボソーム進入部位などの配列を挿入することも可能である。
　ＢＤＶのＧ遺伝子を発現するプラスミドは、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子又はＰ遺伝子を発現するヘルパープラスミドの作製において、ＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡの代わりにＢＤＶのＧ遺伝子のｃＤＮＡを用いることによって作製することができる。例えば、一例として、実施例７及び図２１に示される方法に従っても作製することができる。ＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、ｐＥＦ４／ｍｙｃ－Ｈｉｓ Ａ、Ｂ，and C(Invitrogen)に添付の説明書に記載されている方法に従って作製することができる。
　ＢＤＶ以外のウイルスの外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドは、例えば、ＢＤＶ以外のウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを鋳型に、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行なって、任意のウイルス外殻遺伝子の細胞内配列をコードする配列をＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする配列で置換することにより作製することができる。このようなヘルパープラスミドは、例えば、一例として実施例８及び図２５に記載されている方法に従っても調製することができる。ＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする遺伝子配列は、例えば配列番号１にそのｃＤＮＡ配列が示されるＢＤＶゲノムでは３７１２～３７４７番目の配列（配列番号１の３７１２～３７４７番目の塩基）である。
　上記のウイルスベクターを細胞に導入する際は、例えば、該ウイルスベクターを含むベクター組成物を用いることができる。ベクター組成物は、ウイルスベクター以外にヘルパープラスミドを含んでいてもよい。ベクター組成物は、ウイルスベクター及びヘルパープラスミド以外にも、導入方法及び導入対象等に応じて、その他の成分、例えば、適当な緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養標準液等を含んでいてもよい。
　ベクター組成物中の上記ウイルスベクターの含有量としては、感染方法及び感染対象等に応じて適宜選択すればよいが、例えば、ＤＮＡ濃度として約０．２５～２．０μｇ／μＬのウイルスベクターを含むことが好ましい。
　ベクター組成物中の例えば、各ヘルパープラスミドの含有量としては、上記ウイルスベクター１μｇに対して約０．０１２５～０．１２５μｇとすることが好ましい。
　上記ウイルスベクター及びヘルパープラスミドをin vitroで細胞に導入する方法としては特に限定されず、例えば、市販のトランスフェクション試薬を用いる自体公知の方法を採用することができる。市販のトランスフェクション試薬としては、例えば、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics（登録商標）、Pleasanton、CA)等が挙げられるが特に限定されない。具体的には、例えば、上記量のウイルスベクター及びヘルパープラスミド、並びに緩衝液等を含むベクター組成物に、市販のトランスフェクション試薬を適量加え、これをウイルスベクター１μｇに対して通常約１０３～１０７個、好ましくは約１０４～１０７個の細胞に加えることによりウイルスベクター及びヘルパープラスミドを該細胞に導入することができる。なお、ウイルスベクター及びヘルパープラスミドは、同時に細胞に導入してもよく、別々に導入してもよい。別々に導入する際の導入順序は、特に限定されない。
　ウイルスベクターを導入する細胞としては、ウイルスベクターの導入により本発明における組換えウイルスを産生することができる哺乳類の培養細胞等であればよいが、例えば、ヒト腎臓由来の２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞が挙げられる。
　Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドに用いた外殻遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞等の細胞に、外殻遺伝子を発現する各種プラスミドを用いて、該外殻遺伝子を導入することにより作製することができる。外殻遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に記載された方法に従って、該プラスミド内に該外殻遺伝子を導入することにより製造される。このような外殻遺伝子を発現するプラスミドとして、上述した外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドも好適に用いることができる。Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、ＢＤＶのＭ遺伝子及び外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドに用いた外殻遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞等の細胞に同様の方法でＢＤＶのＭ遺伝子及び該外殻遺伝子を導入することにより製造される。外殻遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に従って、該プラスミド内に外殻遺伝子及びＢＤＶのＭ遺伝子をそれぞれ導入することにより容易に製造される。このような外殻遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドとして、上述した外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミド、ＢＤＶのＭ遺伝子を発現するヘルパープラスミド等も好適に用いることができる。
　次いで、ウイルスベクターを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる。組換えウイルスを産生させるための培地、培養温度及び培養時間等の培養条件は、細胞の種類により適宜設定すればよい。培養温度は、２９３Ｔ細胞又はＢＨＫ細胞を用いる場合は、通常約３６～３７℃とする。培地は、ダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地を用いることが好ましい。培養時間は、通常約２４～９６時間、好ましくは約３６～４８時間とする。
　上記培養により、ウイルスベクターを導入した細胞においてウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。ウイルスベクターの導入において、さらにウイルスの外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いた場合には、ウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質に加えて、該外殻遺伝子にコードされる外殻蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。ウイルスベクターの導入において、さらにウイルスの外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミド及びＢＤＶのＭ遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いた場合には、ウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質に加えて、該外殻遺伝子にコードされる外殻蛋白質及びＢＤＶのＭ蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。
　ウイルスベクターを導入した細胞において組換えウイルスが産生されたことは、例えば、細胞を培養した培地の上澄みを遠心分離などにより回収し、該上澄みを用いてＢＤＶが感染性を有する細胞、例えば、サル腎由来Ｖｅｒｏ細胞、ラットグリア由来Ｃ６細胞、ヒトグリア由来ＯＬ細胞などに感染をさせることで確認される。組換えウイルスが産生されたことの確認は、後述する組換えウイルスを産生した細胞を増殖速度が速い細胞と混合培養する工程を行なった後行ってもよい。
　例えば、組換えウイルスであることは、感染した細胞内での外来性遺伝子（例えばＧＦＰなど）の発現を定量解析することで確認できる。産生されたウイルスが持続性感染型であることは、感染した細胞内での外来性遺伝子（例えばＧＦＰなど）の発現を定量解析すると共に、その培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることを調べることにより確認される。培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることは、例えば、その上清を遠心分離などにより回収し、これをさらに他の細胞へ感染させ、該細胞において組換えウイルスに由来する外来性遺伝子が発現することを調べることで確認できる。
　本発明の作製方法においては、上記のように細胞にウイルスベクター等を導入して組換えウイルスを産生させた後、効率よく組換えウイルスを増殖させるために、該組換えウイルスを産生した細胞（例えば、２９３T細胞、ＢＨＫ細胞）を増殖速度が速い細胞と混合培養する工程を行なうことが好ましい。組換えウイルスを産生した細胞を増殖速度が速い細胞と混合培養することにより、感染性を持つ組換えウイルスは増殖速度が速い細胞に感染する。該増殖速度が速い細胞を培養すると、細胞の増殖と共に感染したウイルスも増殖するため、組換えウイルスを効率よく増殖させることができる。増殖速度が速い細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞等が好適である。組換えウイルスを産生した細胞と、増殖速度の速い細胞との混合比率としては、例えば、組換えウイルスを産生した細胞１個に対して増殖速度の速い細胞を通常０．１～１０個程度、好ましくは０．２～２個程度とする。混合培養後、増殖速度が速い細胞を培養させる条件としては特に限定されず、例えば、Ｖｅｒｏ細胞を用いる場合には、培養温度を通常約３６～３７℃とし、ダルベッコ変法イーグルMEM培地で通常３日～５週間程度、好ましくは３日～３週間程度培養を行なう。
　Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いた場合には、増殖速度が速い細胞として、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドに用いた外殻遺伝子を、恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞等の細胞に、外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いて、該遺伝子を導入することにより作製することができる。さらに、Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いた場合には、増殖速度が速い細胞として、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いた外殻遺伝子及びＢＤＶのＭ遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞等に、外殻遺伝子を発現するプラスミドおよびＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドを用いて、該遺伝子を導入することにより作製することができる。外殻遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に従って、該プラスミド内に外殻遺伝子及びＢＤＶのＭ遺伝子をそれぞれ導入することにより容易に製造される。このような外殻遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドとして、上述した外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミド、ＢＤＶのＭ遺伝子を発現するヘルパープラスミド等も好適に用いることができる。
　本発明の作製方法においては、細胞に組換えウイルスを産生（及び増殖）させた後、該組換えウイルスを精製する工程を行うことが好ましい。精製方法としては特に限定されず、自体公知の方法によって行うことができ、組換えウイルスの感染対象に応じて精製方法を適宜選択すればよい。
　例えば、組換えウイルスを培養細胞に感染させる場合には、上記のように組換えウイルスを産生（及び増殖）させた後、該組換えウイルスを産生させた培養細胞上清を回収し、細胞を破砕する。細胞の破砕は、例えば、凍結及び融解、又は超音波破砕機を用いて行うことができる。次いで、細胞破砕液から細胞の破砕成分を取り除く。細胞破砕液から細胞の破砕成分を取り除く方法としては、遠心分離（例えば、４℃、８００ｇで１０分間程度）等が挙げられる。細胞の破砕成分を取り除いた後に、０．２２又は０．４５μｍのポアサイズを有する濾過膜を通すことにより組換えウイルスを含む上澄みを得ることができる。培養細胞に組換えウイルスを感染させる際は、この上澄みを用いることができる。また、この組換えウイルスを含む上澄みを公知の手法により濃縮して用いることもできる。
　生体細胞（動物個体中の細胞）に組換えウイルスを感染させる場合には、この組換えウイルスを含む上清を、超遠心機を用いて濃度勾配による超遠心を行なうことによりウイルス粒子へと高度の精製を行うことが好ましい。精製を行ったウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、希釈を行った後に適量を動物へ感染させる。
４．外来性遺伝子の導入方法
　上記組換えウイルスを細胞に感染させることにより、該ウイルスに組み込まれた外来性遺伝子を細胞や生体に導入することができる。このような、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスをin vitroの細胞又は動物に感染させる工程を含む外来性遺伝子の導入方法も本発明の１つである。
　組換えウイルスを感染させる動物としては特に限定されず、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類等が挙げられる。中でも、ヒト、サル、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、ネズミ、ウサギ、ウシ等の哺乳類が好ましく、ラット、マウス又はヒトがより好ましく、マウス又はヒトがさらに好ましい。組換えウイルスを感染させる細胞としては、このような動物の細胞が好ましい。また、ＢＤＶは神経系細胞に感染指向性があることから、哺乳類の神経系細胞がさらに好ましく、中でも、脳神経系細胞が特に好ましい。中でも、ラット、マウス又はヒトの神経系細胞が好ましい。細胞は、培養細胞であってもよく、生体細胞であってもよい。哺乳類の脳神経系細胞としては、グリア細胞、大脳皮質の神経細胞、海馬神経細胞、小脳神経細胞、中脳神経細胞胞等が挙げられる。哺乳類の脳神経細胞の培養細胞としては、ＯＬ、Ｃ６、Ｕ３７３、Ｎ２a、Ｎ１８、ＰＣ１２、ＳＫ－Ｎ－ＳＨ細胞等が好適である。
　Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクター及びヘルパープラスミドとしてウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いて産生された組換えウイルスは、外殻遺伝子が由来するウイルスの種類に応じた感染指向性を示す。例えば、ヘルパープラスミドにおいてＢＤＶのＧ遺伝子を使用した場合、得られる組換えウイルスは、脳神経系細胞に感染指向性を示すため、脳神経細胞への外来性遺伝子導入に好適に使用される。ヘルパープラスミドにおいてＢＤＶ以外のウイルスの外殻遺伝子（好ましくは、ＢＤＶ以外のウイルスの外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする外殻遺伝子）を使用した場合、得られる組換えウイルスは、該ウイルスが感染指向性を示す細胞に好適に感染させることができるものである。
　組換えウイルスをin vitroで細胞に感染させる方法としては、例えば、培養細胞に感染させる場合には、上記精製方法により得られた組換えウイルスを含む上清をダルベッコ変法イーグル等の培養培地又はリン酸緩衝生理食塩水等により段階希釈して希釈液を作製することが好ましい。希釈液中の組換えウイルスの濃度としては、ウイルスを感染させる細胞の種類等により適宜選択すればよいが、例えば、哺乳類の神経細胞等であれば、通常ＭＯＩ(multiplicity of infection、感染価)約０．０１～１０(細胞１個に対してウイルス粒子０．０１から１０個が感染する量)、好ましくはＭＯＩ約１～１０となるようにする。この希釈液を用いて、組換えウイルスを細胞に感染させる。
　組換えウイルスを生体細胞（動物）に感染させる際には、上記のように高度に精製されたウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、該リン酸緩衝生理食塩水により希釈を行った後に適量を動物へ感染させることが好ましい。希釈液中の組換えウイルスの濃度は、感染対象により適宜選択すればよい。例えば、感染対象が哺乳類の神経細胞であれば、組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価（focus-forming unit (FFU)）を約１０-１～１０９ＦＦＵとして個体に接種することが好ましい。また、組換えウイルスを含む希釈液は、マウス又はラットに接種する際には、ウイルス力価を通常約１０-１～１０７ＦＦＵとすることが好ましい。イヌ又はネコ、ヒトに接種する際には、ウイルス力価を通常約１０～１０８ＦＦＵとすることが好ましく、ウシ又はウマに接種する際には、ウイルス力価を通常１０５～１０１２ＦＦＵとすることが好ましい。ヒトに接種する際には、ウイルス力価を通常約１０５～１０９ＦＦＵとすることが好ましい。また、組換えウイルスを生体細胞に感染させる際には、後述する外来性遺伝子導入剤も好適に用いることができる。
　例えば、哺乳類の脳神経系細胞に組換えウイルスを感染させる場合には、上記組換えウイルスを含む希釈液を哺乳類の鼻腔に接種する方法が好適である。また、マウスやラット等に動物実験において脳神経系細胞に感染させる場合には、動物の脳内に組換えウイルスを含む希釈液を直接接種することもできる。
　組換えウイルスの接種量としては、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液を、鼻腔内接種では１回につき通常約５μＬ～１ｍＬ、脳内接種では１回につき通常約１～５０μＬ接種する。組換えウイルスの動物への接種量は、動物の体重等に応じて適宜選択すればよく、例えば、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液をマウス又はラットに鼻腔内接種する場合には、１回につき通常約５～２００μＬ、好ましくは約１０～１００μＬ接種する。
　脳神経細胞以外の生体細胞に組換えウイルスを感染させる場合には、上記組換えウイルスを含む希釈液を非経口投与することが好ましい。例えば、哺乳類の腹腔内、血管内、筋肉内等に接種する方法等が好適である。
　組換えウイルスの接種量としては、接種部位等により適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、通常、組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価を約１０-１～１０９ＦＦＵとして、この組換えウイルスを含む希釈液を、マウスであれば１回につき通常約５～５００μＬ、好ましくは約２０～２００μＬ接種する。
５．外来性遺伝子導入剤
　（１）上記ウイルスベクター、又は、（２）上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤も、本発明の１つである。好ましい態様としては、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤である。このような外来性遺伝子導入剤は、上述した外来性遺伝子の導入方法において、組換えウイルスをin vitroの細胞又は生体細胞（動物）に感染させる際に好適に用いることができるものである。本発明は、動物の神経系細胞等に外来性遺伝子を導入するのに好適に用いることができる。中でも、脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するのにより好適に用いられる。
　本発明の外来性遺伝子導入剤の好ましい態様の１つは、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤である。脳神経系細胞としては、哺乳類の脳神経系細胞が好ましく、例えば、グリア細胞、大脳皮質の神経細胞、海馬神経細胞、小脳神経細胞、中脳神経細胞等が挙げられる。本発明の外来性遺伝子導入剤は、さらに、神経疾患治療剤等の他の薬剤等を含んでいてもよく、剤型に応じて医薬上許容される成分を含んでいてもよい。本発明の外来性遺伝子導入剤の剤型としては、非経口投与のための剤型が好ましく、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤、噴霧剤、スプレー剤等が挙げられるが、注射剤が好ましい。
　非経口投与のための注射剤としては、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤を適宜添加した溶液に、組換えウイルスを混合した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。医薬上許容される添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤；リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、リソレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。また、例えば、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の蛋白質；アミノデキストラン等のポリサッカリド等を含有してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
　本発明の外来性遺伝子導入剤に含まれる組換えウイルスの量は、外来性遺伝子導入剤の製剤形態又は投与経路によって異なるが、通常、最終製剤中に約０．０００１～１００％の範囲から適宜選択して決定することができる。外来性遺伝子導入剤の投与方法及び投与量は、上述した外来性遺伝子の導入方法における方法及び組換えウイルスの投与量と同様である。本発明の外来性遺伝子導入剤は、例えば、動物の脳神経系疾患治療、Ｃ型肝炎等の慢性肝疾患、抗腫瘍薬及びワクチン等のための遺伝子デリバリー用組成物として有用である。本発明の外来性遺伝子導入剤の投与対象は、上述した哺乳動物が好適である。
６．ウイルスベクターの利用
　本発明のウイルスベクター、組換えウイルス及び外来性遺伝子の導入方法、並びに外来性遺伝子導入剤は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野に応用することができるものである。
　例えば、本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、ヒトを含む動物の脳神経系疾患治療のための遺伝子デリバリーベクターとして使用することができる。また、慢性肝疾患、腫瘍、感染症等に対するワクチン等にも好適に使用することができる。
　脳神経系疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、統合失調症、自閉症、その他の機能性精神疾患等が挙げられる。本発明の組換えウイルスは、このような疾患の治療又は予防に有用である。例えば、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子として、脳神経系疾患の原因となる蛋白質を分解する酵素の遺伝子、該蛋白質の発現を抑制する機能を有する核酸配列等を使用すると、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該原因蛋白質を分解又は該原因蛋白質の発現を抑制して該疾患を予防又は治療することができる。また、脳内物質（例えば、セロトニン、ドーパミン、ソマトスタチン、ネプリライシン等）の分泌低下により発症する疾患においては、該脳内物質をコードする遺伝子をウイルスベクターに挿入し、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該脳内物質が産生されるため、該疾患を予防又は治療することができる。
　なお、「治療」とは、病態を完全に治癒させることの他、完全に治癒しなくても症状の進展及び／又は悪化を抑制し、病態の進行をとどめること、又は病態の一部若しくは全部を改善して治癒の方向へ導くことを、「予防」とは病態の発症を防ぐこと、抑制すること又は遅延させることを、それぞれ意味するものとする。
　本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、日本脳炎等のウイルス性脳炎の治療又は予防にも使用できる。また、実験動物、伴侶動物又は生産動物の脳神経系疾患、例えば、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）、狂犬病等にも好適に使用できる。実験動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ等が挙げられる。伴侶動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ等が挙げられる。生産動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等が挙げられる。
　本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、脳神経科学領域における神経系細胞の可視化技術に使用することができる。さらに、本発明のウイルスベクターは、機能性ＲＮＡ分子を発現できるＲＮＡウイルスベクターとしても有用であり、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー等の機能性ＲＮＡの安定発現ベクター技術に応用することもできる。例えば、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子としてｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー等の機能性ＲＮＡをコードする配列を用いると、所望の細胞においてこれらの機能性ＲＮＡ分子を発現させることができる。本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスを用いると、脳内において一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を発現させることもできる。
　また外殻蛋白質を他のウイルス由来のものにすることで、腫瘍細胞に特異的に感染するウイルスベクター又は組換えウイルスに改良し、腫瘍細胞に薬剤遺伝子や過剰に発現した遺伝子を抑えるｓｉＲＮＡを導入すること等で、抗腫瘍ウイルスベクターとしても利用可能である。さらに、外来性遺伝子としてＨＩＶ、インフルエンザウイルス等に対する中和活性をもつ遺伝子(例えば、HIVのenv、gag等；インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ遺伝子等)等を導入することで、本発明のウイルスベクター又は組換えウイルスを組換えワクチンに利用することも可能である。そして、HCV等の慢性経過をたどる感染症に対しては、標的となるウイルスのゲノムに対するsiRNAを導入することで、機能性ＲＮＡを利用した感染症に対する新たな治療法の開発にも有効である。
　上記ウイルスベクターを含有する外来性遺伝子導入用キットも、本発明の１つである。
　本発明のキットは、ウイルスベクター以外に、ヘルパープラスミド、外来性遺伝子を導入する細胞、緩衝液、培地等を適宜含んでもよい。ウイルスベクターの好ましい態様は、上述した通りである。外来性遺伝子を導入する細胞は、脳神経系細胞等の神経系細胞等が好ましい。本発明のキットは、これまで技術的に困難であった脳神経系細胞等への外来性遺伝子の導入に好適に用いることができるものである。
　以下、実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜実施例１＞
１．プラスミドｐＣＡＧ－Ｆｃｔの作製
　Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529に記載されているプラスミドｐＣＡＧ－ＨＲ－ＳＶ３を基に、その中に挿入されているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の領域をボルナ病ウイルスのＨｅ／８０株のゲノムの配列（配列番号１）に置き換えたプラスミドを以下のようにして作製した。
　サイトメガウイルス（ＣＭＶ）由来のＢＤＶミニゲノムベクター（ｐＣＭＶ－ＨＲ）を得るために、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｍＲｚ）をコードする化学合成オリゴヌクレオチド（Briese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (1992) 11486-11489、及びLe Mercier et al., J. Virol., 76 (2002) 2024-2027）及びＢＤＶの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をコードする化学合成オリゴヌクレオチド（Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C., Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994)）をアニールし、ベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社、San Diego， CA）のKpnI及びXhoIサイトに連結した。得られたプラスミドをEco47III及びXbaIサイトで切断した。このプラスミドに、δ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨｄＲｚ）と融合させたＢＤＶの３’ＵＴＲと、ＢＤＶ　Ｈｅ／８０株のゲノムをコードするｃＤＮＡクローンを挿入してプラスミドｐｃ－ＨＲを得た。なお、ＨｄＲｚと融合させたＢＤＶの３’ＵＴＲは、プラスミドｐｈｕＰｏｌ　Ｉ－ＭＧ（Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104）から増幅した。最後に、ｐｃ－ＨＲのBglII及びXbaI断片をpBluescript SKII(-)（Stratagene, La Jolla, CA）のBamHI及びXbaIサイトに挿入することによって、ｐＣＭＶ－ＨＲを作製した。
　ＣＡＧ（Chicken β-actin promoterとCMV enhancerとの複合体）由来のＢＤＶミニゲノムベクターｐＣＡＧ－ＨＲは、ＣＡＧプロモーターをpBluescript SKII(-)（Stratagene, La Jolla, CA）にサブクローニングすることによって得た（ｐＢＳ－ＣＡＧ）。ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウイルスＩＥエンハンサーにニワトリβ－アクチンプロモーターが融合してなるハイブリッドプロモーターであり、Sawichi et al., Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。ｐＣＭＶ－ＨＲのＨａｍＲｚとＨｄＲｚの配列にまたがる領域をＰＣＲによって増幅し、ｐＢＳ－ＣＡＧのSalI及びEcoRIサイトの平滑末端に挿入した。
　次に、ＳＶ４０開始点／プロモーター内の５’側の１１３塩基からなる断片（ＳＶ３領域）を、ＰＣＲ（Clontech Laboratory, Inc., Palo Alto, CA）によってｐＥＧＦＰ－Ｎ１（Clontech社製）から増幅し、ｐＣＡＧ－ＨＲのＮｏｔＩサイトに挿入した。これにより、プラスミドｐＣＡＧ－Ｆｃｔを得た。
２．Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域にＧＦＰを挿入したＢＤＶゲノムプラスミド（ｐＣＡＧ－Ｆｃt－Ｐ／ＭＧＦＰ）の作製
　Ｐ遺伝子とＭ遺伝子の間の非翻訳領域に外来遺伝子挿入カセットを挿入し、プラスミドｐＣＡＧ－Ｆｃｔ－Ｐ／Ｍを作製した。
Ａ）実施例１で作製したｐＣＡＧ－Ｆｃｔ（ボルナウイルスのＨｅ８０株のｃＤＮＡ（配列番号１）がクローニングされているプラスミド）を鋳型に、ＥｃｏＴ２２ＩからＢｓｔ１１０７Ｉサイトまでの領域をプライマー１及び４、並びにプライマー２及び３を用いてそれぞれＰＣＲで増幅した。その後、両方のＰＣＲ産物を０．５μＬずつ混合し、プライマー１及び２にて再度増幅し、Ｐ－Ｍ遺伝子間にＢｓｔＢＩサイト及びＰａｃＩサイトを有する外来遺伝子挿入カセットを作製した。
Ｂ）Ａ）のＰＣＲ産物をＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢｓｔ１１０７Ｉを用いてｐＣＡＧ－Ｆｃｔへと組込み、ｐＣＡＧ－Ｆｃｔ－Ｐ／Ｍを完成させた。
Ｃ）ＢｓｔＢＩとＰａｃＩを用いてＧＦＰを挿入し、プラスミドｐＣＡＧ－Ｆｃｔ－Ｐ／Ｍ－ＧＦＰを完成させた。
（プライマー）
プライマー１：5-GGAATGCATTGACCCAACCGGTAGACCAGC-3（配列番号５）
プライマー２：5-AACATGTATTTCCTAATCGGGTCCTTGTATACGG-3（配列番号６）
プライマー３：5-ttcgaaGGTTGGttaattaaccataaaaaaatcgaatcacc-3（配列番号７）
プライマー４：5-ttaattaaCCAACCttcgaaGGTGATTCGATTTTTTTATGG-3（配列番号８）
３．ヘルパープラスミドの作製
　ヘルパープラスミド、すなわちＢＤＶのＮ遺伝子発現プラスミド（ｐｃＮ）、ＢＤＶのＰ遺伝子発現プラスミド（ｐＣＸＮ２－Ｐ）及びＢＤＶのＬ遺伝子発現プラスミド（ｐｃＬ）を以下の手順で作製した。
　ｐｃＮは、ｐＨＡ－ｐ４０Ｎプラスミド（Kobayashi T, Watanabe M, Kamitani W, Zhang G, Tomonaga K and Ikuta K. Borna disease virus nucleoprotein requires both nuclear localization and export activities for viral nucleocytoplasmic shuttling. J. Virol. 75:3404-3412. (2001)からＮ遺伝子領域をＰＣＲで増幅し、ｐＢＳ－ＣＡＧ（上述）へと挿入することで作製した。
　プラスミドｐＣＸＮ２－Ｐは、ｐｃＤ－Ｐ（Zhang G, Kobayashi T, Kamitani W, Komoto S, Yamashita M, Baba S, Yanai H, Ikuta K and Tomonaga K. Borna disease virus phosphoprotein represses p53-mediated transcriptional activity by interference with HMGB1. J. Virol. 77:12243-12251. (2003)）からゲル抽出した断片をｐＣＸＮ２（Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J 1991 Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-199）のEcoRI及びXhoIサイトに挿入することによって作製した。
　ｐｃＬについては、Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104に記載されている方法で作製した。組換えプラスミドのヌクレオチド配列は、ＤＮＡシークエンスによって確認した。
＜参考例１＞
　U. Schneider et al., Journal of Virology (2007) p.7293-7296に記載の方法に従って、ＢＤＶゲノムの５’末端側の非翻訳領域にＧＦＰ遺伝子を挿入した組換えウイルスベクターを作製した。この組換えウイルスベクター（ｒＢＤＶ－５’ＧＦＰ）の構造を、図４に模式的に示す。
＜実施例２＞
Ｐ－Ｍ遺伝子間プラスミドを用いたBDVベクターの作製と性状比較
　ｐＣＡＧ－Ｆｃｔ－Ｐ／Ｍ－ＧＦＰ及びヘルパープラスミド（Ｎ遺伝子発現プラスミド、Ｐ遺伝子発現プラスミド及びＬ遺伝子発現プラスミド；それぞれｐｃＮ、ｐＣＸＮ２－Ｐ及びｐｃＬ）を、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics（登録商標）、Pleasanton、CA)又Lipofectamine（登録商標）2000、Invitrogen）を用いて２９３Ｔ細胞に導入した。導入に使用したウイルスベクター等の量としては、１０４～１０６の細胞（２９３Ｔ細胞）に対して、ｐＣＡＧ－Ｆｃｔ-P/M-ＧＦＰを１～４μｇ使用し、ｐｃＮ（０．１２５～０．５μｇ）、ｐＣＸＮ２－Ｐ（０．０１２５～０．０５μｇ）、ｐｃＬ（０．１２５～０．５μｇ）の割合でヘルパープラスミドを加えた。
　ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入後、２９３Ｔ細胞を３７℃で４８時間ダルベッコ変法イーグル培地で培養後に上清を回収して、８００ｇで１０分遠心後、０．２２から０．４５μｍのフィルタで濾過してＧＦＰを発現する組換えウイルス（以下、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰともいう）を精製した。
　比較として、参考例１で作製したベクターｒＢＤＶ－５’ＧＦＰについても、上記と同様にして該ベクターを２９３Ｔ細胞に導入して組換えウイルス（以下、組換えウイルス５’ＧＦＰともいう）を作製し、次いで組換えウイルスを精製した。コントロールとして、野生型のＢＤＶ（以下、ｗｔともいう）を２９３Ｔ細胞に導入した。
　培養細胞への感染後、４８時間以降における細胞間での感染の広がり、並びに感染細胞上清中へのウイルスベクターの放出を、間接免疫蛍光抗体法又はウェスタンブロット法により調べたところ、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び５’ＧＦＰ、並びにｗｔのいずれについても、感染後２４時間後よりウイルスの産生が観察され始めることが確認された。
　また、野生型のＢＤＶ（ｗｔ）、精製した組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び５’ＧＦＰをそれぞれ、Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．０１でＶｅｒｏ細胞に感染させて、感染後０日から１９日における細胞間での感染の広がりを、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法又は間接免疫蛍光抗体法により調べた。結果を図５～８に示す。
　間接免疫蛍光抗体法は、以下の方法により行った。
　抗ＢＤＶ　Ｎ抗体及び抗ＢＤＶ　Ｍ抗体を、Watanabe M, Zhong Q, Kobayashi T, Kamitani W, Tomonaga K, Ikuta K.　Molecular ratio between Borna disease viral-p40 and -p24 proteins in infected cells determined by quantitative antigen capture ELISA.　Microbiol Immunol. 2000. 44:765-72、Chase G, Mayer D, Hildebrand A, Frank R, Hayashi Y, Tomonaga K, Schwemmle M.　Borna disease virus matrix protein is an integral component of the viral ribonucleoprotein complex that does not interfere with polymerase activity.　J Virol. 2007. 81:743-749に記載の方法に従って作製した。
　野生型ＢＤＶ並びに各組換えウイルスをそれぞれ感染させたＶｅｒｏ細胞を、感染後の一定の日数培養した後回収し、ガラスプレートに固定した後、これと、抗ＢＤＶ　Ｎ抗体（リン酸緩衝液で、抗ＢＤＶ　Ｎ抗体濃度０．２～５μｇ／ｍＬに希釈したもの）又は抗ＢＤＶ　Ｍ抗体（リン酸緩衝液で、抗ＢＤＶ　Ｍ抗体濃度０．２～５μｇ／ｍＬに希釈したもの）を３７℃で１時間程度反応させた。洗浄後、２次抗体として蛍光標識された抗ＩｇＧ抗体（モリキュラープローブ社製、リン酸緩衝液で、抗体濃度０．０１～０．１μｇ／ｍＬに希釈したもの）と同様に反応させた後に、細胞の蛍光（抗Ｎ抗体又はＭ抗体：赤、ＧＦＰ：緑）を蛍光顕微鏡で観察した。
　ノーザンブロット法及びウェスタンブロット法は、Watanabe Y, Ibrahim MS, Hagiwara K, Okamoto M, Kamitani W, Yanai H, Ohtaki N, Hayashi Y, Taniyama H, Ikuta K, Tomonaga K.　Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility.　Microbes Infect. 2007. 9:417-427.に記載の方法に従って行った。
　図５は、感染後０日～１９日の間の、野生型又は組換えＢＤＶを感染させたＶｅｒｏ細胞の、感染率の経時変化を調べた結果を示す図である。図５に示す感染率は、野生型ＢＤＶについては、抗ＢＤＶ　Ｎ抗体に対する蛍光標識抗体の蛍光を指標とする間接免疫蛍光抗体法により、組換えＢＤＶについては、ＧＦＰの蛍光及び抗ＢＤＶ　Ｎ抗体に対する蛍光標識抗体の蛍光を指標とする間接免疫蛍光抗体法により、それぞれ求めた。図５において、ｗｔ（ひし形：◆）は野生型ＢＤＶを、ｐ／ｍＧＦＰ（四角：■）は組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを、５’ＧＦＰ（三角：▲）は、参考例１で作製した組換えウイルス５’ＧＦＰを、それぞれ示す。図５より、感染から約１５日後には、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び５’ＧＦＰのいずれも、野生型ＢＤＶと同様に、Ｖｅｒｏ細胞にほぼ１００％感染した。このことから、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び５’ＧＦＰのいずれも、野生型ＢＤＶと同様のウイルス産生能を有することが分かった。
　図６は、ノーザンブロットの結果である。図６中、ｗｔは野生型ＢＤＶを、ｐ／ｍは、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを、５’は、組換えウイルス５’ＧＦＰを、それぞれ示す。ｕ．ｉ．は、非感染細胞を示す。
　図６（ａ）は、感染後１９日後のＶｅｒo細胞におけるＢＤＶのＮ遺伝子（上の図）及びＧＦＰ遺伝子（中の図）の発現量をノーザンブロットによって調べた結果を示す図である。図６（ａ）より、ウイルス蛋白質（Ｎ蛋白質）の遺伝子は、いずれのＢＤＶを感染させた細胞においても同程度に発現していることが分かる。一方、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた細胞における、感染したウイルスに対する外来性遺伝子（ＧＦＰ遺伝子）の発現率は、ＧＦＰ遺伝子／Ｎ遺伝子＝０．７８であり、組換えウイルス５’ＧＦＰを感染させた細胞においては、ＧＦＰ遺伝子／Ｎ遺伝子＝０．４５であった。感染したウイルスに対するＧＦＰ遺伝子の発現率は、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰにおいて組換えウイルス５’ＧＦＰと比較して約２倍も多いことが分かる。図６（ａ）の下図は、解析に使用したＲＮＡ量を定量するために、サンプル中に含まれるリボゾームＲＮＡを電気泳動後、可視化したものである。
　図６（ｂ）は、感染後１９日後のＶｅｒo細胞におけるＢＤＶのＮ蛋白質（最上段）、Ｐ蛋白質（上から２段目）、Ｍ蛋白質（上から３段目）及びＧＦＰ（最下段）の発現量をウェスタンブロットによって調べた結果を示す図である。図６（ｂ）より、ウイルス蛋白質（Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、及びＭ蛋白質）は、いずれのＢＤＶを感染させた細胞おいても同程度に発現していることが分かる。一方、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた細胞における、感染したウイルスに対する外来性遺伝子（ＧＦＰ遺伝子）の発現率は、ＧＦＰ／Ｎ蛋白質＝０．８５であり、組換えウイルス５’ＧＦＰを感染させた細胞においては、ＧＦＰ／Ｎ蛋白質＝０．５８であった。感染したウイルスに対するＧＦＰ遺伝子の発現率は、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰにおいて組換えウイルス５’ＧＦＰと比較して多いことが分かる。
　図７ａ～ｆは、野生型ＢＤＶ、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び組換えウイルス５’ＧＦＰそれぞれを感染させた細胞の、顕微鏡写真である。図７ａ及びｂは、野生型ＢＤＶを感染させた細胞、ｃ及びｄは、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた細胞、ｅ及びｆは、組換えウイルス５’ＧＦＰを感染させた細胞である。図７ａ、ｃ及びｅは、細胞へのウイルスの感染を、Ｎ蛋白質抗体（抗ＢＤＶ　Ｎ抗体）及び蛍光標識抗体（モリキュラープローブ社製）を使用する間接免疫蛍光抗体法により調べた結果である。図７ａ、ｃ及びｅにおいて、発光部分（赤色）がＮ蛋白質である。図７ｂ、ｄ及びｆは、該ウイルスによる外来性遺伝子（ＧＦＰ）の発現を、該蛋白質の蛍光（緑色の蛍光）によって調べた結果である。図７ｂ、ｄ及びｆでは、ＧＦＰは緑色の蛍光によって検出される。
　図７ａ～ｆより、いずれのＢＤＶウイルスを感染させた細胞でもＮ蛋白質は同程度発現していることから、ウイルスの複製能力は同程度であることがわかる。しかし、ＧＦＰの蛍光強度は、組換えウイルス５’ＧＦＰよりも組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた細胞で顕著に大きいことから、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰは、外来性遺伝子（ＧＦＰ）の発現効率が組換えウイルス５’ＧＦＰより顕著に高いことが分かる。
　図８ａ～ｆは、野生型ＢＤＶ、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び組換えウイルス５’ＧＦＰそれぞれを感染させた細胞の、顕微鏡写真である。図８ａ及びｂは、野生型ＢＤＶを感染させた細胞、ｃ及びｄは、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた細胞、ｅ及びｆは、組換えウイルス５’ＧＦＰを感染させた細胞である。図８ａ、ｃ及びｅは、細胞へのウイルスの感染を、Ｍ蛋白質抗体（抗ＢＤＶ　Ｍ抗体）及び蛍光標識抗体（モリキュラープローブ社製）を使用する間接免疫蛍光抗体法により調べた結果である。図８ｂ、ｄ及びｆは、該ウイルスによる外来性遺伝子（ＧＦＰ）の発現を、該蛋白質の蛍光（緑色の蛍光）によって調べた結果である。図８ａ、ｃ及びｅにおいて、発光部分（赤色）がＭ蛋白質である。図８ｂ、ｄ及びｆでは、ＧＦＰは緑色の蛍光によって検出される。
　図８ａ～ｆより、いずれのＢＤＶウイルスを感染させた細胞でもＭ蛋白質は同程度発現していることから、ウイルスの複製能力は同程度であることがわかる。しかし、ＧＦＰの蛍光強度は、組換えウイルス５’ＧＦＰよりも組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた細胞で顕著に大きいことから、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰは、外来性遺伝子の発現効率が組換えウイルス５’ＧＦＰより顕著に高いことが分かる。
＜実施例３＞
　実施例２で作製した組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び参考例１で作製した組換えウイルス５’ＧＦＰをそれぞれ、ラットの脳へ感染させた。
　精製された各組換えウイルスを、ＰＢＳ又は培養メディウムで１０３ＦＦＵに希釈後、生後２４時間以内の新生仔ラットの頭蓋内に、左側頭部より１０～２０μＬ接種した（図９）。接種後、７、１４及び２１日後に採材を行って、図１０に示すように脳を各領域に分割し、各領域についてＤＮＡを抽出し（キアゲン社のＤＮＡ抽出キットを用いた）、個別に組換えウイルスの感染をＰＣＲとＧＦＰの発現によりチェックした。ＰＣＲは、ＢＤＶに特異的なプライマーを用いた。これらのプライマーの配列を以下に示す。
ＢＤＶ特異的なＦｏｗａｒｄプライマーの配列；
5- GGAATGCATTGACCCAACCGGTAGACCAGC -3　　（配列番号９）
ＢＤＶ特異的なＲｅｖｅｒｓｅプライマー配列；
5- AACATGTATTTCCTAATCGGGTCCTTGTATACGG -3　　（配列番号１０）
　ＰＣＲ産物を１％のアガロース電気泳動法で確認した。この結果、左脳中部にウイルスを接種後７日後のラットにおいて、接種部位に加えて、大脳皮質（図１０の右脳の前部）及び小脳部位（図１０の右脳の後部）でも組換えウイルスが検出された。図１１に、ＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。ｐ／ｍＧＦＰで示されるレーンは、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させたラットの脳のＰＣＲ産物である。５’ＧＦＰで示されるレーンは、組換えウイルス５’ＧＦＰを感染させたラットの脳のＰＣＲ産物である。ｐ／ｍＧＦＰ及び５’ＧＦＰの各レーンにおいて、ａは、大脳皮質、ｂは、小脳部位のＤＮＡのＰＣＲ産物である。なお、図１１において検出されるバンドは、いずれも上記ＰＣＲで増幅されたＢＤＶゲノム断片のバンドであるが、上記ＰＣＲを行なうと、ＢＤＶのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間の領域が増幅される。組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰにおいては、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間にＧＦＰ遺伝子を含むため、組換えウイルス５’ＧＦＰのＰＣＲ産物よりも高分子量側にバンドが検出される。なお、図１１中のＩとは、野生型ＢＤＶ感染Ｖｅｒｏ細胞であり、Ｕは、非感染細胞である。この結果より、接種した組換えウイルスが脳の他の箇所に感染伝播したことが示された。
　図１２に、接種後１４日後のラット脳を切開して裏返したマクロ写真（ａ及びｂ）、及び該脳のマクロ蛍光写真（ｃ及びｄ）をそれぞれ示す。図１２ｃ及びｄにおいて、蛍光部分が発現したＧＦＰである。図１２ｃ及びｄより、ＧＦＰの蛍光強度は、組換えウイルス５’ＧＦＰよりも組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた脳の大脳皮質で顕著に大きいことから、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを用いると、外来性遺伝子の発現効率が組換えウイルス５’ＧＦＰより顕著に高いことが分かる。
　図１３ａ～ｄは、大脳皮質の切片（図１３ａ～ｄの上部に示す、写真中の四角で示す部分）の顕微鏡写真である。図１３ａ及びｃに、接種後７日目のラットの大脳皮質におけるＮ遺伝子の発現を、実施例２と同様のＮ蛋白質に対する抗体（抗ＢＤＶ　Ｎ抗体）及び蛍光標識抗体（モリキュラープローブ社製）を使用する間接免疫蛍光抗体法により調べた結果を示す。Ｎ蛋白質は、赤色の蛍光によって検出され、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び組換えウイルス５’ＧＦＰのいずれを感染させた場合も、同程度のＮ蛋白質が発現している（ウイルス感染量は同程度である）ことが分かった。図１３ｂ及びｄに、図１３ａ及びｃとそれぞれ同様の切片について、ＧＦＰの発現を蛍光により検出した結果を示す。ＧＦＰの蛍光強度は、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた脳の大脳皮質（図１３ｂ）において、組換えウイルス５’ＧＦＰを感染させた脳の大脳皮質（図１３ｄ）と比較して顕著に大きかった。
＜実施例４＞
　実施例１において、ＧＦＰ遺伝子の代わりにＤｓＲｅｄ遺伝子（クローンテック社製）を用いて、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域にＤｓＲｅｄ遺伝子を挿入した組換えベクター（ｒＢＤＶ－ｐ／ｍＤｓＲｅｄベクター）を作製し、実施例２と同様にして組換えウイルスを作製した。比較として、参考例１においてＧＦＰ遺伝子の代わりにＤｓＲｅｄ遺伝子を用いて、ＢＤＶゲノムの５’末端にＤｓＲｅｄ遺伝子を挿入した組換えベクター（ｒＢＤＶ－５’ＤｓＲｅｄベクター）を作製し、実施例２と同様にして組換えウイルスを作製した。培養細胞に各組換えウイルスをそれぞれ感染させた後、１０日目における細胞への組換えウイルスの感染及びＤｓＲｅｄ遺伝子の発現を、実施例２と同様のＮ蛋白質に対する抗体（抗ＢＤＶ　Ｎ抗体）及び蛍光標識抗体（モリキュラープローブ社製）を使用する間接免疫蛍光抗体法により調べたところ、ｒＢＤＶ－ｐ／ｍＤｓＲｅｄベクターから産生された組換えウイルスを感染させた細胞においては、図１４に示すようにＮ蛋白質の発現（図１４（ａ））及びＤｓＲｅｄの発現（図１４（ｂ））が観察された（Ｎ蛋白質は二次抗体によって緑色の蛍光及びＤｓＲｅｄは赤色の蛍光によって検出された）。一方、ｒＢＤＶ－５’ＤｓＲｅｄベクターは、感染細胞において組換えウイルスを産生することができなかった。
＜実施例５＞
　実施例１において、ＧＦＰ遺伝子の代わりにホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（１．６ｋｂ）（クローンテック社製）を用いて、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域にルシフェラーゼ遺伝子を挿入した組換えベクター（ｒＢＤＶ－ｐ／ｍＬｕｃｉベクター）を作製し、実施例２と同様にして組換えウイルスを作製した。比較として、参考例１においてＧＦＰ遺伝子の代わりにルシフェラーゼ遺伝子を用いて、ＢＤＶゲノムの５’末端にルシフェラーゼ遺伝子を挿入した組換えベクター（ｒＢＤＶ－５’Ｌｕｃｉベクター）を作製した。培養細胞に各組換えウイルスをそれぞれ感染させた後、１０日目における細胞への組換えウイルスの感染及びルシフェラーゼ遺伝子の発現を、実施例２と同様のＮ蛋白質に対する抗体（抗ＢＤＶ　Ｎ抗体）を用いる間接免疫蛍光抗体法により調べたところ、ｒＢＤＶ－ｐ／ｍＬｕｃｉベクターから産生された組換えウイルスを感染させた細胞においては、図１５aに示すようにＮ蛋白質が観察されたが、ｒＢＤＶ－５’Ｌｕｃｉベクターは、感染細胞において組換えウイルスを産生することができなかった。また、組換えウイルスｒＢＤＶ－ｐ／ｍＬｕｃｉ感染Vero細胞（図１５ｂ中、ｒＢＤＶ・ｐ/ｍＬｕｃｉ）におけるルシフェラーゼの活性をルシフェラーゼアッセイキット(Promega社)を用いて、添付の説明書に従って測定したところ、非感染細胞に比べ有為に高いルシフェラーゼ活性を示した(図１５ｂ)。このことから、組換えウイルスｒＢＤＶ－ｐ／ｍＬｕｃｉから産生されるルシフェラーゼが機能していることが確認された。
＜実施例６＞
　実施例３と同様にして、実施例１で作製したＰ－Ｍ遺伝子間にＧＦＰが挿入されたプラスミド（プラスミドpCAG-Fct-P/M-GFP、以下、「p/mGFP」という）から産生された組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを新生仔マウスの頭蓋内に接種した。組換えウイルス接種２ヶ月後及び８ヶ月後に、マウスの大脳皮質及び小脳から採材を行ない（それぞれｎ＝２）、実施例３と同様にして細胞へのウイルスの感染を、（１）Ｎ蛋白質抗体（抗ＢＤＶ　Ｎ抗体）及び蛍光標識抗体（モリキュラープローブ社製）を使用する間接免疫蛍光抗体法、並びに（２）ＧＦＰの蛍光により調べた。その結果、ＢＤＶウイルスは、接種から２ヶ月～８カ月間、感染細胞（マウスの大脳皮質及び小脳）で持続発現することが分かった。
　図１８ａ及びｂは、組換えウイルス接種８カ月後のマウスの脳切断面の蛍光顕微鏡写真である。図１８ａは、マクロ写真であり、図１８ｂは、図１８ａの四角で囲った部分を顕微鏡で拡大した写真である。図１８ａ及びｂにおいて、ＧＦＰは緑色の蛍光によって検出された。図１８ａ及びｂ中では、灰色に見える部分がＧＦＰにより緑色に蛍光を発する部分である。
＜実施例７＞
Ｇ欠損ウイルスの回収
（１）プラスミドの構築
A)　p/mGFP deltaG L linear (p/mGFP ΔG LL)の作製
　実施例１で作製したp/mGFPを元に、ウイルス膜糖蛋白質であるＧ遺伝子をＰＣＲを用いた点変異導入により欠損させた。具体的な方法として、Ｇ遺伝子に存在する２つのメチオニンをコードする配列(ゲノム番号（すなわち配列番号１の塩基）2236-2238、及び2248-2250)をスレオニン(ATG→ACG)へと置換した。図１９に、Ｇ遺伝子欠損型ウイルスをコードするプラスミドであるp/mGFP ΔGの作製手順の概略を示す。先ずp/mGFPを鋳型に表１に示す配列のプライマーA1及びB1、並びにプライマーC1及びD1を用いてＰＣＲ（98℃　10秒、55℃　5秒、72℃　0.5又は1分を25サイクル）を行った（図１９（ａ））。
　次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型に、上記のプライマーA1及びD1を用いて再びＰＣＲ（98℃　10秒、55℃　5秒、72℃　1.5分を25サイクル）を行った（図１９（ｂ））。増幅産物（2ndPCR産物）はＧ遺伝子のメチオニンがスレオニンへと変異しており、これを制限酵素Bst1107I及びNheIを用いて、ベクターであるp/mGFPと組換えて（図１９（ｃ））、p/mGFP ΔGを得た。
　さらに、不要になったＬ遺伝子イントロン領域（本来この部分はＧ遺伝子の領域）を削りＬ遺伝子を直結した(L linearize)。具体的な方法として、制限酵素サイトBst1107I（配列番号１の2166～2171番目の塩基配列）からＬ遺伝子のエクソン前半部までとＬ遺伝子のエクソン後半部(NheIサイト（配列番号１の6158～6163番目の塩基配列）まで)をそれぞれ増幅し両者を結合させてp/mGFP ΔGに組込んだ。この手順の概略を、図２０に示す。先ず、表１に示すプライマーA1及びE1、並びに及びプライマーF1及びD1を用いてp/mGFP ΔGを鋳型にPCR（98℃　10秒、55℃　5秒、72℃　0.5分を25サイクル）を行った（図２０（ａ））。次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型にプライマーA1及びD1を用いてPCR（98℃　10秒、55℃　5秒、72℃　1を25サイクル）を行った（図２０（ｂ））。増幅産物（2ndPCR産物）は、Ｌ遺伝子のイントロン部分が削除されており、これを制限酵素Bst1107I及びNheIを用いて、ベクターであるp/mGFP ΔGと組換えて、p/mGFP ΔG LLを得た（図２０（ｃ））。
B)BDV G遺伝子発現プラスミド
　G欠損ウイルスを回収するために、ヘルパープラスミドとしてBDVのG蛋白質を哺乳類細胞で発現させるプラスミドを作製した。この手順の概略を、図２１に示す。具体的な方法として、p/mGFPを鋳型にPCRでG遺伝子領域を増幅し、ニワトリベータアクチンプロモーターの下流に挿入した(上述した他のN、P及びL遺伝子のヘルパープラスミドと同様の方法)。先ず、表１に示すプライマーG1及びH1、並びにプライマーI1及びJ1を用いてp/mGFPを鋳型にPCR（98℃　10秒、55℃　5秒、72℃　0.5又は1.0分を25サイクル）を行った（図２１（ａ））。次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型にプライマーG1及びJ1を用いてPCR（98℃　10秒、55℃　5秒、72℃　1.5分を25サイクル）を行った（図２１（ｂ））。増幅産物（2ndPCR産物）はG遺伝子をコードしているが、BDVが本来有するスプライシングサイト(SD = 2409-2415、SA = 2437-2442)に、PCRの際に変異を導入し、機能しないようにしている(アミノ酸変異は無い)。具体的には、野生型BDV（WT）のゲノムの2409-2415番目のGGTTATGを、agtctccとし（ΔSA）、さらに野生型BDV（WT）のゲノムの2437-2442番目のGGTTATGを、agtctccとした（ΔSD）。この2ndPCR産物（ΔSDSA　G遺伝子）を、制限酵素KpnI及びSmaIを用いて発現プラスミド（実施例１のヘルパープラスミドの作製で使用したｐＣＸＮ２）に挿入し（図２１（ｃ））、BDV G遺伝子発現プラスミドを作製した。組換えプラスミドのヌクレオチド配列は、ＤＮＡシークエンスによって確認した。なお、本実験ではG遺伝子発現プラスミドの作製にｐＣＸＮ２を使用したが、哺乳類細胞で遺伝子を発現できる他のプラスミドも使用可能である。
　上記で使用したプライマーの配列を、表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）BDV G遺伝子発現細胞の作製
　上記（１）A)で作製したG蛋白質発現プラスミドを用いてBDVのG遺伝子安定発現細胞を作製した。具体的な方法として、回収に用いる哺乳類培養細胞株、すなわち293T細胞及びVero細胞それぞれ1～5×105個を9.4 cm2の培養シャーレに撒き、翌日市販の遺伝子導入試薬(Fugen6、Lipofectamine2000)を用いて、上記（１）で作製したプラスミドDNAを2～5μg導入した。細胞の培養は、３７℃でダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地を用いて行った。プラスミド添加から３日後細胞を継代し、新しい培養プレートに1/3量撒いた。その際、選択薬剤としてジェネティシン(G418)（Invitrogen:GIBCO）を1μg/mlの濃度でダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地に加えた。薬剤選択によって目的遺伝子が安定的に導入された細胞のみ生存するため、この方法によりG遺伝子安定発現細胞株（G遺伝子安定発現293T細胞及びG遺伝子安定発現Vero細胞）を単離した。
（３）G遺伝子欠損ウイルスの回収
A) G遺伝子欠損ウイルス感染Vero細胞の回収
　293T細胞にヘルパープラスミドとしてN、P、L及びG遺伝子を導入した。さらに上記で作製したp/mGFP ΔG又はp/mGFP ΔG LLを導入した(遺伝子導入方法は上記（２）と同じ)。各プラスミドを、N遺伝子=0.25μg、P遺伝子=0.025μg、L遺伝子=0.25μg、G遺伝子=0.01μg、p/mGFP ΔG又はp/mGFP ΔG LL＝2.0μgという量比で細胞に導入した。遺伝子導入後、３７℃で293T細胞を培養した。遺伝子導入３日後に細胞を継代し、その際上記で作製したG遺伝子安定発現Vero細胞と共培養を行った後、該Vero細胞を、G遺伝子欠損ウイルス感染Vero細胞として回収した。
B)粒子状のG遺伝子欠損ウイルスの回収
　上記（３）A)で作製した感染Vero細胞をトリプシン溶液(トリプシン0.03% w/v、EDTA/2Na 0.02% w/v in PBS-)を用いて培養プレートから回収し、室温にて100～150g、5分間遠心分離し細胞沈殿物を回収した。回収した細胞沈殿物をもう一度イーグルMEM培養液を用いて懸濁した。作製した懸濁液を、超音波細胞破砕機を用いて処理した。破砕処理後の懸濁液は4℃にて1000～1200g、25分間遠心分離し上清をウイルス液として回収した。p/mGFP ΔG及びp/mGFP ΔG LLのいずれを導入した細胞からも、組換えBDVが回収された。
C)ウイルスの濃縮
　ウイルス液は、必要に応じ超遠心機を用いて濃縮した。具体的な方法として、超遠心用のチューブに20%ショ糖液を加え、その上に上記（３）B)で回収したウイルス液を加えた。4℃にて50000～100000g、2時間遠心分離し、沈殿物をPBS-で再懸濁して濃縮液として回収した。
＜実施例８＞
p/mGFP ΔG LL感染細胞の作製とシュードタイプウイルスの作製
（１）p/mGFP ΔG LL感染細胞の作製と持続感染性の確認
A)p/mGFP ΔG LL感染細胞の作製
　実施例７の（３）B)又はC)で回収したウイルスをVero細胞に接種し、p/mGFP ΔG LL感染細胞を作製した。ウイルス液の希釈にはOpti-MEM(Invitrogen:GIBCO)を用い、24wellプレートに撒いた単層のVero細胞にウイルス希釈Opti-MEMを100μl接種し（Vero細胞１個につき、ウイルスを約0.1～0.01粒子）、37℃で1時間感作させた。その後PBS-を用いて細胞を洗浄しダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地にて37℃で培養を続けた。接種した感染細胞はウイルスが伝播しない為、細胞のクローニング法(限界希釈法)により100%感染細胞を分離した。感染細胞かどうかの判断は蛍光顕微鏡によりＧＦＰの発現を観察し判断した。ここで分離した感染細胞は、後述するシュードタイプウイルスの作製にも用いた。
　実施例７で作製したp/mGFP ΔG及びG遺伝子欠損ウイルス感染Vero細胞、並びにp/mGFP ΔG LL及び上記A)で作製したp/mGFP ΔG LL感染細胞をそれぞれ用いて、プラスミドp/mGFPΔG及びp/mGFP ΔG LLそれぞれによる組換えBDV産生能力を比較した。p/mGFP ΔG及びp/mGFP ΔG LLの各細胞への感染は、実施例７と同様の方法により行った。
　図２２は、G遺伝子安定発現細胞への共培養後１２日目の各細胞のウイルス陽性率をGFPを指標に測定したものである。図２２から、細胞１０万個当たりのGFP陽性細胞の数は、p/mGFP ΔGを用いた場合を１としたとき、p/mGFP ΔG LLはその約８倍の陽性率を示した。
　このことから、p/mGFP ΔG LLは、p/mGFPΔGと比較して、組換えBDV産生能力が高いことが分かった。
B)p/mGFP ΔG-LLウイルスの持続感染性と伝播能
　実施例７の（３）B)又はC)で回収したウイルス（G欠損型組換えウイルス）をVero細胞又はG遺伝子安定発現Vero細胞にウイルス：細胞＝1:100で接種し、増殖性及び持続性を観察した。感染率は、24wellプレートに撒いた細胞１０万個あたりの感染細胞数をカウントすることにより測定した。その結果、図２３に示すように、Vero細胞に接種した場合、感染率は約1％程度で推移したが、G遺伝子安定発現Vero細胞に接種した場合、経過とともに感染率は上昇した。このことから、BDVはG遺伝子なしでも持続感染するが(少なくても100日以上は観察)、感染を拡大するのにG遺伝子が必要であることが確認された。図２３中、◆は、BDVのG遺伝子安定発現Vero細胞であり、■は、Vero細胞（G遺伝子を発現しない細胞）である。
　図２４ａは、野生型ＢＤＶ及びG欠損型組換えウイルスそれぞれを感染させた細胞における蛋白質の発現をウェスタンブロット法により調べた結果を示す。図２４ａ中、G、N及びGFPは、それぞれG蛋白質、N蛋白質及びGFPである。図２４ｂは、G欠損型組換えウイルスを感染させたVero細胞の蛍光顕微鏡写真である。図２４ｂの写真で灰色見える部分はGFPによる緑色蛍光部分である。図２４ａ及びｂより、G遺伝子欠損ウイルスを感染させた細胞において、該ウイルスにより導入されたGFPが発現していることが確認された。
（２）p/mGFP ΔG LL感染細胞を用いたシュードタイプウイルスの作製
A)BDVG遺伝子細胞内領域と水疱性口内炎ウイルス(VSV)又は狂犬病ウイルス(RabV)のG遺伝子細胞外及び膜貫通領域を有するキメラ蛋白質発現プラスミドの作製
　シュードタイプウイルスを作製するために、他のウイルスの膜蛋白質遺伝子を発現するプラスミドを作製した。図２５に、手順の概略を示す。具体的な方法として、VSV(Indiana株)のG遺伝子発現プラスミド（GeneBank ID:J02428.1）を鋳型に、表２に示すプライマーA2及びB2を用いてPCR（98℃　10秒、55℃　5秒、72℃　1.5分を25サイクル）を行った（図２５（ａ））。増幅産物（PCR産物）は細胞内領域はBDV由来、細胞外及び膜貫通領域はVSV由来のキメラ膜蛋白（以下、キメラVSV-G蛋白質ともいう）をコードするDNA配列となっている。このPCR産物を制限酵素EcoRI及びEcoRVを用いて哺乳類細胞発現プラスミドであるｐＣＸＮ２(実施例７の（１）B)参照)に組込み（図２５（ｂ））、VSV－G発現プラスミドを得た。
　BDVとRabVとのキメラ膜蛋白質を発現するプラスミド（キメラRab－G発現プラスミド）の作製は、鋳型としてRabV：Nishigahara株のG遺伝子発現プラスミド（GeneBank ID:AB044824.1）を用い、プライマーとして、プライマーA2及びB2の代わりに表２に示すプライマーC2及びD2を用い、制限酵素としてKpnI及びEcoRVを用いた以外は、上記と同様の方法で行った。Rab－G発現プラスミドは、細胞内領域はBDV由来、細胞外及び膜貫通領域はRabV由来のキメラ膜蛋白（以下、キメラRab－G蛋白質ともいう）を発現する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
B)キメラ膜蛋白質安定発現細胞の作製
　VSV及びRabVのG遺伝子の安定発現細胞株（VSV-G蛋白質安定発現株及びRab－G蛋白質安定発現株）を作製した。上記（２）A)で作製したプラスミド又は同様の方法で作製したTetシステム発現プラスミドに導入したプラスミドを用いてキメラ膜蛋白質安定発現細胞を作製した。具体的には実施例７の（２）に記載されている方法において、G蛋白質発現プラスミドの代わりに上記（２）A)で作製したキメラG蛋白質を発現するプラスミド又は同様の方法で作製したTetシステム発現プラスミドに導入したプラスミドを使用し、293T細胞及びVero細胞、並びに上記（１）で作製したp/mGFP ΔG LL感染細胞に導入した。Tetシステムの薬剤耐性濃度等は添付の説明書に記載の通りに行った。なお、今回用いたのはInvitrogen社のT-RExシステムである。
C)シュードタイプウイルスの回収
　上記（１）A）で作製したp/mGFP ΔG LL感染細胞クローンを用いて、シュードタイプウイルスの回収を行った。具体的な方法として、p/mGFP ΔG LL感染細胞にキメラ膜蛋白質発現プラスミドを遺伝子導入し、ダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地またはNutrient Mixture F-12 HAM培地(SIGMA)中で37℃で培養後48-96時間後に上清をシュードタイプウイルス含有液として回収した。p/mGFP ΔG LLにコードされる組換えBDVゲノムを有し、VSV又はRabのウイルス膜蛋白質を被ったシュードウイルスが回収された。G遺伝子としてBDVのG遺伝子、並びにVSV及びRabの外殻遺伝子を用いた場合の、三者の間におけるウイルスの回収効率（粒子形成効率）の違いを、図２６に示した。図２６では、ウイルスの回収効率は、BDV のG遺伝子を使用したときを１とする相対値で表わされている。
　さらに、実施例７（３）B)及びC)で示した方法と同様にして、キメラ蛋白質発現細胞を用いてVSV又はRabの膜蛋白質を被ったシュードタイプウイルスを回収した。これらのシュードタイプウイルスは、VSV又はRab由来の外殻を有し、かつp/mGFP ΔG LLにコードされる組換えBDVゲノムを発現できるシュードタイプウイルスである。
＜実施例９＞
M及びG遺伝子欠損ウイルス
（１）p/mGFP ΔG LLをもとにM遺伝子を欠損させたプラスミドp/mGFP ΔM-G LLを作製した。
A)p/mGFP ΔM-G LLプラスミドの構築
　さらなる安全性の向上と外来遺伝子挿入箇所の拡大を目的にBDVの膜裏打ち蛋白質をコードするM遺伝子を欠損させた。図２７に、M遺伝子を欠損させたp/mGFP ΔM-G LLプラスミドの作製手順の概略を示す。具体的な方法として、p/mGFP ΔG LLを鋳型に、表３に示すプライマーA3及びプライマーB3を用いてPCR（98℃　10秒、55℃　5秒、72℃　1.5分を25サイクル）を行った（図２７(a)）。得られたPCR産物(1stPCR産物)をPacIとNheIを用いてp/mGFP ΔG LLに挿入し、p/mGFP ΔM-G LLを作製した（図２７(ｂ)）。
B)p/mGFP ΔM-G LLウイルスの回収
　実施例７においてp/mGFP ΔG‐LLウイルスを回収したときと同様に、M蛋白質及びG蛋白質を両方共安定的に発現する培養細胞株を作製し(M遺伝子の選択薬剤にはゼオシンを使用した)、p/mGFP ΔM-G LLウイルスの回収を行った。
C)p/mGFP ΔM-G LLウイルスの性状解析
　得られたp/mGFP ΔM-G LLウイルスをVero培養細胞に感染させたところ、野生株と同様に感染性を有することが確認された。
（２）p/mGFP ΔM-G LL P-M tandem vectorの作製
　p/mGFP ΔM-G LL のp/m遺伝子間にもう一つ外来遺伝子挿入したカセットを作製した。
　さらなる外来遺伝子を挿入する目的で、新たな外来遺伝子挿入カセットをp/m遺伝子間に挿入した。図２８に、p/mGFP ΔM-G LL P-M tandem vectorの作製手順の概略を示す。具体的な方法として、p/mGFP ΔM-G LLを鋳型に表３に示すプライマーC３及びD３を用いてPCR（98℃　10秒、55℃　5秒、72℃　0.5分を25サイクル）を行った（図２８(a)）。さらに、得られたPCR産物（1stPCR産物）を鋳型にプライマーC3及びE3（表３）を用いてPCR（98℃　10秒、98℃　5秒、72℃　0.5分を25サイクル）を行った（図２８(ｂ)）。得られたPCR産物（2ndPCR産物）を、EcoT22IとBstBIを用いてp/mGFP ΔM-G LLに挿入した。これにより新たな外来遺伝子挿入カセットSse8381I－SwaIをp/mGFP ΔM-G LLに挿入でき、p/mGFP ΔM-G LL P-M tandem vectorが得られた。
　このカセットは、P遺伝子のORFとM遺伝子のORFの間にBstBI-PacIサイトを有する他のp/mベクターにEcoT22IとBstBIを用いて組込みことが可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜実施例１０＞
p/mベクターの利用
（１）アルツハイマー病の治療を目的としたp/mNEPベクターの作製
A)p/mNEPベクターの作製
　アルツハイマー病の遺伝子治療法開発を目的にp/m遺伝子間にアミロイドベータ蛋白質(Aβ)分解酵素であるNeprilysin(NEP : Gene ID = 4311)を挿入したp/mNEPベクターを作製した。具体的な方法として、ヒト由来培養細胞からRNAを抽出し、oligodTをプライマーに逆転写酵素(Invitrogen、Super script III)によりmRNAの逆転写反応を行った。得られたcDNAを鋳型に、表６に示すプライマーA4及びB4を用いてNEPをPCR（98℃　10秒、55℃　5秒、72℃　2.5分を25サイクル）により増幅した。得られたPCR産物をBstBI-PacIを用いてp/mGFPベクターと組換え、p/mNEPベクターを作製した。p/mNEPベクターは、実施例１で作製したBDVのＰ－Ｍ遺伝子間にＧＦＰが挿入されたプラスミド（p/mGFP）において、GFPのｃDNAがNEPのｃDNAで置換されている。さらに、比較のため、NEP酵素活性部位に変異を加えたものをp/mベクターに挿入した組換えベクター（以下、比較ベクター１という）を作製した。方法としては、表６に示すプライマーA4及びC4、並びにB4及びD4を用いてp/mNEPを鋳型にPCR(98℃10秒、55℃5秒、72℃2分又は0.5分を25サイクル)を行った。次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型にプライマーA4及びB4を用いてPCR(98℃10秒、55℃5秒、72℃2.5分を25サイクル)を行った。増幅産物(2ndPCR産物)はNEPのアミノ酸配列585番目がグルタミン酸(ＧＡＡ)からバリン(ＧｔＡ)に置換されており、これをBstBI-PacIを用いてp/mNEPベクターと組換え、比較ベクター１を作製した。
　作製したp/mNEPベクター及び比較ベクター１それぞれから、組換えウイルスを、実施例２と同様の方法にて回収し、性状の解析を行った。また、回収したウイルスはアルツハイマー病モデルマウスに投与した。
B)Vero細胞におけるp/mNEPの発現及び活性測定
　上記で作製したp/mNEPベクターを用いて、実施例２と同様の方法により、p/mNEP感染Vero細胞を得た。
　得られたp/mNEP感染Vero細胞が実際にNEPを発現しているかをWestern Blotting及び間接蛍光抗体法にて確認した。今回用いた一次抗体は抗CD10[56C6]マウスモノクローナル抗体(abcam社:ab951)である。図２９に、p/mNEP感染細胞のWestern Blottingの結果を示す。図２９中、NEPは、p/mNEPベクターから産生された組換えウイルスp/mNEP感染細胞であり、d.nは、比較ベクター１から産生されたウイルスが感染した比較細胞であり、n.cは、非感染細胞である。α-Nは、BDVのN蛋白質である。図２９から、p/mNEPベクター及び比較ベクター１から産生された組換えウイルスが感染した細胞（比較細胞１）では、NEPが発現したことが確認された。
　NEPの活性測定には反応領域を疑似的に合成したものであるDAGNPG(Sigma社)を用いた。先ずp/mNEPが感染した細胞をトリプシンで培養シャーレから剥がし、遠心分離にて回収した。回収した細胞は、DAGNPG入りの溶液(50mM Tris-HCl、1μM カプトプリル、50μM DAGNPG)で再懸濁し、37℃で2時間反応させた。反応後100℃で5分間熱して酵素を失活させた。その後4℃にて15000g程度で5分間遠心分離し、上清を回収した。回収した液を96wellプレートに１well あたり200μl注入し、マイクロプレートリーダーにて波長342 nmの励起光で励起し、波長580nmの発光を測定した。NEP活性が強いほど、検出される発光量が多くなる。図３０に、切断酵素活性を測定した結果を示す。p/mNEP感染細胞では、非感染細胞及び比較細胞１と比較してNEP活性が顕著に高かった。
C)p/mNEPをアルツハイマー病モデルマウスへ接種
　治療法開発に向け、先ずアルツハイマー病モデルマウスにp/mNEPを接種した。数多く存在するアルツハイマー病のモデルマウスの中で、今回はB6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/J(Jackson研究所No6554)とB6.Cg-Tg(APPSwe,PSEN1dE9)85Dbo/J(Jackson研究所No5864)を使用した。これらのモデルマウスはいずれも、ヒトのAβ前駆蛋白質とその分解酵素プレセニリンの変異体を神経細胞に発現させたもので、出生後早期にアルツハイマー病様の症状を示すことが報告されている。
　上記モデルマウスの新生仔の脳内に、p/mNEPベクターから産生された組換えウイルスを接種する。
D) p/mGFPベクターから産生された組換えウイルスの脳内での持続性
　現時点で、p/mGFPベクターから産生された組換えウイルスを接種したマウスでは脳内に少なくとも8カ月間は導入したGFPの発現が確認された（実施例６及び図１８）。このことからp/mベクターはアルツハイマー病のような長期経過を辿る神経疾患に適用できると考えられる。
＜実施例１１＞
（１）miRNA導入ベクターの開発
　医療及び研究への応用に役立てるため、機能性RNAであるmiRNAを導入可能なp/mベクターを作製した。
A)p/m miR155導入用ベクター(pSIRIUS-B)の作製
　pSIRIUS-Bの作製手順の概略を、図３１に示す。まず、様々なmiRNA配列を導入するために必要となる導入用ベクターを作製した。初めにpBluescript SK-のマルチクローニングサイトにBstBIとPacIの制限酵素サイトを導入し（図３１（b））、p/m miR155導入用ベクターpSIRIUS-Bを完成させた。次にその間にmiR 155をもとに設計したmiRNA発現に必要な制御配列を導入した。さらに、その中心にはBbsIによる制限酵素カセットを挿入し、様々なmiRNA配列を導入できるようにした(図３１(a))。
　図３１(a)の模式図において、白い部分がmiRNA発現制御部位であり、黒い部分がオリゴ導入カセットである。図３１(a)に模式的に示されるDNA断片の配列及び該配列内の制限酵素サイトを、下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
B)p/m miR155を用いた活性測定用ベクターの作製
　A)で作製したベクターを利用して様々なmiRNA配列をBstBI、PacIを用いてp/mベクターに挿入することが可能である。今回は一例としてmiR155を用いた。miR155標的配列を合成し、これをpSIRIUS-BにBbsIを用いて導入し、pSirius-B miR-155を得た（図３２(a)）。表５に、今回合成したmiR155標的配列の配列を示す。上段が、miRNA155の配列（配列番号３２）である。表５の下段の配列を配列番号３３に示す。miR155標的配列（オリゴ）を、pSirius-B miR-155から、BstBI-PacIを用いてp/mベクターに導入し、p/m miR155を作製した（図３２(ｂ)）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　さらに導入したmiR155が機能しているかを調べる目的で、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼの下流にmiR155のターゲット配列を導入したプラスミドを作製しmiR155の効果を判定できるようにした。
C)p/m miR155の回収と活性測定
　実施例２に示した方法と同様の方法によりp/m miR155のプラスミドから組換えウイルスを回収し、B)で作製したプラスミドを用いてその活性を測定した。方法として、p/m miR155感染細胞及びBDV野生株感染細胞（いずれもVero細胞にウイルスを感染させた）に遺伝子導入試薬(Lipofectamine2000など)を用いてレポータープラスミドを導入し、2～3日後Luciferase Assay System(Promega社)に添付のプロトコール通りに実験を行い、p/m miR155感染細胞とBDV野生株感染細胞とを比較した。図３３に、組換えウイルスを感染させた細胞における標的遺伝子の転写阻害効率を示す（図３３のwt: BDV野生株感染細胞、x1：p/m miR155感染細胞）。
D)p/m miRx2、p/m miRx4の作製
　さらに、a)を改良しmiRNAの配列をx2（2回繰り返した配列）、x4（4回繰り返した配列）で挿入することができるように新たなプラスミドを作製した。作製手順の概略を、図３４に示す。まずpcDNA3のマルチクローニングサイトにBstBIとPacIを挿入した(pSIRIUS-D)。次にA)で作製したプラスミド(目的のmiRNA挿入済み)を鋳型に表６に示すプライマーＥ４及びＦ４を用いてPCRを行った（98℃　10秒、55℃　5秒、72℃　0.5分を25サイクル）。得られたPCR産物をpSIRIUS-DにSalIとXhoIを用いて挿入した（図３４(a)）(このとき挿入される向きに注意した)。さらに、作製したプラスミドからSalIとXbaIでインサートを切り出し（図３４（ｂ））、得られた断片をもう一度同一のプラスミドに今度はXhoIとXbaIを使って挿入した(SalIとXbaIは同一の切断配列を有した)（図３４（ｃ））。これによりmiRNAx2のプラスミドが得られた。得られた、miRNAx2のプラスミドをBstBIとPacIで切り出してp/mベクターに挿入することにより、p/m miRNAx2が得られた。miRNA x4は上記工程を繰り返すことによって作製した。miRNA×2及びmiRNA×4のp/mベクターの模式図を、図３５に示す。得られたmiRNA×2及びmiRNA×4のp/mベクターを、実施例２に示した方法と同様の方法により回収し、その効果を確認した。結果を、図３３に示す。図３３中、×１、×２、及び×４はそれぞれ、プラスミド中に挿入したmiR155の数である。図３３から分かるように、miR155が導入された数が多いほど、標的遺伝子の発現が効率よく阻害された。また、細胞に導入されたmiR155は、細胞で持続的に発現することが確認され、本発明のベクターは、機能性RNAを発現できるRNAベクターとして有用であることが示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（２）miRNA導入ベクターの応用
A)p/m miRNA GAPDHを用いたマウス海馬初代培養細胞におけるmiRNAの効果
　p/m miRNA155において、miRNA155の代わりに細胞内で恒常的に発現しているＧＡＰＤＨに対するmiRNA（miR-GAPDH）を挿入したプラスミド(p/m miRNA-GAPDH)を作製し、その効果をより生体に近いマウス海馬初代培養細胞で確認した。p/m miRNA-GAPDHの作製方法は(１)で示したp/m miR155の作製方法とほぼ同様である(合成したmiR-GAPDHの配列を、配列番号４０及び４１に示した)。配列番号４０のDNA及び配列番号４１のDNAは、プラスミド内では二重鎖を形成している。実施例２に示した方法と同様の方法によりp/m miRNA-GAPDHから産生された組換えウイルスp/m miRNA-GAPDHを回収した。回収した組換えウイルスp/m miRNA-GAPDHを新生仔マウスの海馬から採取した初代培養細胞にMOI＝0.01で接種した。７日後に固定後、抗ＢＤＶ-N抗体、及び抗GAPDH抗体で染色し、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、組換えウイルスp/m miR-GAPDHを感染させた細胞では野生型ＢＤＶを感染させた細胞に比べ有為にＧＡＰＤＨの発現が抑制されていた(図３６)。図３６ａ及びｂは、野生型ＢＤＶを感染させた細胞であり、図３６ｃ及びｄは、組換えウイルスp/m miR-GAPDHを感染させた細胞である。図３６ａ及びｃは、抗ＢＤＶ-N抗体で染色した細胞の蛍光顕微鏡写真であり、図３６ｂ及びｄは、抗GAPDH抗体で染色した細胞の蛍光顕微鏡写真である。図３６ｂ及びｄの四角内は、拡大写真であり、＊＊を付した矢印は、非感染細胞を示す。＊＊が付されていない矢印は、感染細胞(図３６ｂでは野生型、図３６dではp/m miR-GAPDH)を示す。図３６ｂでは非感染細胞、感染細胞共にＧＡＰＤＨの発現レベルは高い(ＧＡＰＤＨは抑制されていない)が、図３６ｄでは感染細胞は非感染細胞に比べＧＡＰDHの発現レベルが抑制されていることが観察された。
B)p/m miRNA APPを用いた感染Ｖｅｒo細胞におけるmiRNA-APPの効果
　p/m miRNA155において、miRNA155の代わりにアルツハイマー病の原因蛋白質であるＡＰＰに対するmiRNA（miRNA-APP）を挿入したプラスミド(p/m miRNA-APP) を作製し、その効果をp/m miRNA-APP感染Ｖｅｒｏ細胞を用いて確認した。p/m miRNA-APPの作製方法は(１)で示したp/m miR155の作製方法とほぼ同様である(合成したmiRNA-APPを、配列番号４２及び４３に示した)。配列番号４２のDNA及び配列番号４３のDNAは、プラスミド内では二重鎖を形成している。実施例２に示した方法と同様の方法によりp/m miRNA-GAPDHから産生された組換えウイルスp/m miRNA-APPを回収した。回収した組換えウイルスp/m miRNA-APPを感染させた細胞にLipofectamine2000を用いてAPP発現プラスミド（pcDNA3に添付の説明書に従って作製。APPのcDNA(Accession No＝NM_000484）はヒト由来培養細胞からＲＮＡを抽出し、oligo dTプライマー及び逆転写酵素を用いて調製した。）を添付の説明書に従って導入した。４８時間後にRNAを回収し、上記表６に示すＡＰＰに特異的なプライマーG4及びH4を用いた定量的ＲＴ－ＰＣＲ(９５℃１０秒、６０℃３０秒、４０サイクル)によりＡＰＰのmRNAのレベルを確認した。コントロールとして、p/mGFPから産生された組換えウイルスを感染させた細胞を用いて同様の実験を行なった。その結果、組換えウイルスp/m miRNA-APPが感染したＶｅｒｏ細胞ではp/mGFPが感染したＶｅｒo細胞に比べ有為にAPPのmRNAの量が低下していた(図３７)。
　本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、細胞核で非細胞障害的にかつ効率的に外来性遺伝子を発現できるものであり、また、ウイルスゲノムがＲＮＡであることから宿主染色体に挿入されることがなく安全なベクターである。さらに、本発明のウイルスベクターはボルナ病ウイルスを利用するものであるが、ボルナ病ウイルスは神経細胞に感染指向性があることから外来性遺伝子を脳神経系に選択的に導入することができる特異性に優れたベクターである。このため、本発明は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野、例えば、脳神経系疾患治療及び予防、脳神経化学領域における神経系細胞の可視化技術等に使用することができるため有用である。さらに、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー等の機能性ＲＮＡの安定発現ベクター技術に応用することもできる。従って、本発明は、医療、動物医療、治験、研究等の分野において有用である。

Claims (14)

  1. 　（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されていることを特徴とするウイルスベクター。
  2. 　（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである請求項１に記載のウイルスベクター。
  3. 　（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子が破壊された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである請求項１又は２に記載のウイルスベクター。
  4. 　（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡである請求項１に記載のウイルスベクター
  5. 　（ｃ）プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列であることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載のウイルスベクター。
  6. 　（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡの上流に（ｂ１）ハンマーヘッドリボザイムをコードするｃＤＮＡが配置され、かつ、該（ａ）の下流に（ｂ２）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするｃＤＮＡ配列が配置されていることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載のウイルスベクター。
  7. 　請求項１～６のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるＲＮＡを含むことを特徴とする組換えウイルス。
  8. 　請求項１～６のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、及び該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
  9. 　ヘルパープラスミドとして、さらに、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する請求項８に記載の組換えウイルスの作製方法。
  10. 　ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスのＭ遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する請求項８又は９に記載の組換えウイルスの作製方法。
  11. 　請求項７に記載の組換えウイルス、又は請求項８～１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスをin vitroの細胞又は動物に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
  12. 　請求項７に記載の組換えウイルス、又は請求項８～１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
  13. 　請求項７に記載の組換えウイルス、又は請求項８～１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
  14. 　請求項１～６のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017000015A (ja) * 2015-06-04 2017-01-05 国立大学法人京都大学 目的遺伝子の発現誘導可能なウイルスベクター
WO2018168586A1 (ja) 2017-03-14 2018-09-20 国立大学法人京都大学 ボルナウイルスベクター及びその利用
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2576581A4 (en) * 2010-06-06 2015-04-15 Sinai School Medicine RECOMBINANT RNA VIRUSES AND USES THEREOF

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010022338A (ja) 2008-07-24 2010-02-04 Osaka Univ ボルナ病ウイルスを利用するベクター及びその利用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6015660A (en) * 1995-01-06 2000-01-18 The Regents Of The University Of California Borna disease viral sequences, diagnostics and therapeutics for nervous system diseases
US6077510A (en) * 1995-01-06 2000-06-20 Regents Of The University Of California Borna disease viral sequences, diagnostics and therapeutics for nervous system diseases

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010022338A (ja) 2008-07-24 2010-02-04 Osaka Univ ボルナ病ウイルスを利用するベクター及びその利用

Non-Patent Citations (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRIESE ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U. S. A., vol. 89, 1992, pages 11486 - 11489
BRIESE, T., SCHNEEMANN, A., LEWIS, A. J., PARK, Y. S., KIM, S., LUDWIG, H., LIPKIN, W. I.: "Genomic organization of Borna disease virus", PROC. NATL. ACAD. SCI. U. S. A., vol. 91, no. 10, 1994, pages 4362 - 4366
CHASE G, MAYER D, HILDEBRAND A, FRANK R, HAYASHI Y, TOMONAGA K, SCHWEMMLE M.: "Borna disease virus matrix protein is an integral component of the viral ribonucleoprotein complex that does not interfere with polymerase activity", J VIROL., vol. 81, 2007, pages 743 - 749
CUBITT, B., OLDSTONE, C., DE LA TORRE, J. C.: "Sequence and genome organization of Borna disease virus", J. VIROL., vol. 68, no. 3, 1994, pages 1382 - 1396
CUBITT, B., OLDSTONE, C., DE LA TORRE, J.C.: "Sequence and genome organization of Borna disease virus", J. VIROL., vol. 68, no. 3, 1994, pages 1382 - 1396
D. A. DEAN, B. S. DEAN, S. MULLER, L. C. SMITH: "Sequence requirements for plasmid nuclear import", EXP. CELL. RES., vol. 253, 1999, pages 713 - 722
ETESSAMI R ET AL.: "Spread and pathogenic characteristics of a G-deficient rabies virus recombinant: an in vitro and in vivo study", J. GEN. VIROL., vol. 81, 2000, pages 2147 - 2153, XP008153169 *
FERRE-D'AMARE, A. R., ZHOU, K., DOUDNA, J. A.: "Crystal structure of a hepatitis delta virus ribozyme", NATURE, vol. 395, no. 6702, 1998, pages 567 - 574
GARRY RF.: "Proteomics computational analyses suggest that the bornavirus glycoprotein is a class III viral fusion protein (ypenetrene", VIROL J., vol. 145, no. 6, 18 September 2009 (2009-09-18)
INOUE ET AL., J. VIROL. METHODS, vol. 107, 2003, pages 229 - 236
ITO N ET AL.: "Characterization of M gene- deficient rabies virus with advantages of effective immunization and safety as a vaccine strain", MICROBIOL. IMMUNOL., vol. 49, no. 11, 2005, pages 971 - 979, XP008153170 *
J. A. SAWICKI, R. J. MORRIS, B. MONKS, K. SAKAI, J. MIYAZAKI: "A composite CMV-IE enhancer/b-actin promoter is ubiquitously expressed in mouse cutaneous epithelium", EXP. CELL RES., vol. 244, 1998, pages 367 - 369
KEIZO TOMONAGA: "Boruna Byou Uirus Kansen To Tyuusuushinkeikei Shikkan", vol. 60, February 2005, SAISHIN IGAKU, pages: 79 - 85
KOBAYASHI T, WATANABE M, KAMITANI W, ZHANG G, TOMONAGA K, IKUTA K.: "Borna disease virus nucleoprotein requires both nuclear localization and export activities for viral nucleocytoplasmic shuttling", J. VIROL., vol. 75, 2001, pages 3404 - 3412
LE MERCIER ET AL., J. VIROL., vol. 76, 2002, pages 2024 - 2027
MERCIER ET AL., J. VIROL., vol. 76, 2002, pages 2024 - 2027
NAKAMURA, Y., TAKAHASHI, H., SHOYA, Y., NAKAYA, T., WATANABE, M., TOMONAGA, K., IWAHASHI, K., AMENO, K., MOMIYAMA, N., TANIYAMA, H: "Isolation of Borna disease virus from human brain tissue", J. VIROL, vol. 74, 2000, pages 4601 - 4611
NIWA H, YAMAMURA K, MIYAZAKI J: "Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector", GENE, vol. 108, 1991, pages 193 - 199
NOWOTNY, N., KOLODZIEJEK, J.: "Isolation and characterization of a new subtype of Borna disease virus", J. GEN. VIROL., vol. 74, 2000, pages 5655 - 5658
PEREZ ET AL., J. GEN. VIROL., vol. 84, 2003, pages 3099 - 3104
PLESCHKA, S., STAEHELI, P., KOLODZIEJEK, J., RICHT, J. A., NOWOTNY, N., SCHWEMMLE, M.: "Conservation of coding potential and terminal sequences in four different isolates of Borna disease virus", J. GEN. VIROL., vol. 82, 2001, pages 2681 - 2690
PROTEIN, NUCLEIC ACID AND ENZYME, vol. 52, no. 10, 2007, pages 1168 - 1174
SAWICHI ET AL., EXP. CELL RES., vol. 244, 1998, pages 367 - 369
SCHNEIDER U ET AL.: "A Borna disease virus vector for expression of foreign genes in neurons of rodents", J. VIROL., vol. 81, no. 13, July 2007 (2007-07-01), pages 7293 - 7296, XP008153167 *
SCHNEIDER U ET AL.: "Genome trimming: a unique strategy for replication control employed by Borna disease virus", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 102, no. 9, March 2005 (2005-03-01), pages 3441 - 3446, XP008153168 *
See also references of EP2415866A4 *
TAKUJI DAITO ET AL.: "BDV Genome Kaihen ni Motozuita Shinki RNA Virus Vector no Juritsu", THE 57TH ANNUAL MEETING OF THE JAPANESE SOCIETY FOR VIROLOGY, PROGRAM SHOROKUSHU, 1 October 2009 (2009-10-01), pages 172, XP008164978 *
TAKUJI DAITO ET AL.: "BDV o Riyo shita RNA Virus Vector no Kaihatsu no Kokoromi", DAI 147 KAI JAPANESE SOCIETY OF VETERINARY SCIENCE KOEN YOSHISHU, 1 March 2009 (2009-03-01), pages 247, XP008153187 *
TAKUJI DAITO ET AL.: "BDV Reverse Genetics no Kakuritsu to BDV Vector no Kaihatsu ni Muketa Kento", THE 56TH ANNUAL MEETING OF THE JAPANESE SOCIETY FOR VIROLOGY, PROGRAM SHOROKUSHU, 1 October 2008 (2008-10-01), pages 238, XP008164977 *
U. SCHNEIDER ET AL., JOURNAL OF VIROLOGY, 2007, pages 7293 - 7296
WATANABE M, ZHONG Q, KOBAYASHI T, KAMITANI W, TOMONAGA K, IKUTA K.: "Molecular ratio between Borna disease viral-p40 and -p24 proteins in infected cells determined by quantitative antigen capture ELISA", MICROBIOL IMMUNOL., vol. 44, 2000, pages 765 - 72
WATANABE Y, IBRAHIM MS, HAGIWARA K, OKAMOTO M, KAMITANI W, YANAI H, OHTAKI N, HAYASHI Y, TANIYAMA H, IKUTA K: "Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility", MICROBES INFECT., vol. 9, 2007, pages 417 - 427
WATANABE, Y., IBRAHIM, M. S., HAGIWARA, K., OKAMOTO, M., KAMITANI, W., YANAI, H., OHTAKI, N., HAYASHI, Y., TANIYAMA, H., IKUTA, K.: "Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility", MICROBES AND INFECTION, vol. 9, 2007, pages 417 - 427
YANAI ET AL., MICROBES AND INFECTION, vol. 8, 2006, pages 1522 - 1529
YANAI ET AL., MICROBES AND INFECTIONS, vol. 8, 2006, pages 1522 - 1529
YANAI ET AL.: "Materials and methods", MICROBES AND INFECTION, vol. 8, 2006, pages 1522 - 1529
ZHANG G, KOBAYASHI T, KAMITANI W, KOMOTO S, YAMASHITA M, BABA S, YANAI H, IKUTA K, TOMONAGA K.: "Borna disease virus phosphoprotein represses p53-mediated transcriptional activity by interference with HMGB1", J. VIROL., vol. 77, 2003, pages 12243 - 12251

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017000015A (ja) * 2015-06-04 2017-01-05 国立大学法人京都大学 目的遺伝子の発現誘導可能なウイルスベクター
WO2018168586A1 (ja) 2017-03-14 2018-09-20 国立大学法人京都大学 ボルナウイルスベクター及びその利用
JP2018148865A (ja) * 2017-03-14 2018-09-27 国立大学法人京都大学 ボルナウイルスベクター及びその利用
US11421247B2 (en) 2017-03-14 2022-08-23 Kyoto University Borna viral vector and use thereof
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