JPWO2008129971A1 - 改良された持続感染型センダイウイルスベクター - Google Patents
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Abstract
非持続感染型センダイウイルスのＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンに置換されたアミノ酸配列をコードするように変換された遺伝子を用いて、持続感染型ウイルスベクターを作製するとともに、さらに、Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子の１種以上を欠損ないしは欠失させて、非伝播性持続感染型ウイルスベクターを作製する。これらは細胞障害性がなく、長期間持続する遺伝子発現を実現でき、安全で、有用なウイルスベクターである。
Description
本発明は遺伝子治療等に有用な、安定して長期間外来遺伝子を発現し、あるいはさらに非伝播性で安全なウイルスベクター及び該ベクターを構築するための遺伝子材料に関する。
遺伝性代謝疾患等の遺伝子治療においては、導入した外来遺伝子の発現が長期間持続することが望まれている。これまでは、レトロウイルスベクターを用いて宿主の染色体に遺伝情報を組み込むことによってこの目標を達成してきたが、組み込んだ遺伝子の影響で細胞がガン化した臨床例が報告され、安全性が問題視されている。このため、染色体とは独立にかつ安定に存在できる遺伝情報発現系の開発が提唱されているが、未だに実現していない。
センダイウイルスはパラミクソウイルス科に属するマイナス一本鎖RNAウイルスで、ヒトに対する病原性がない点、転写や複製は細胞質内で行われ宿主の遺伝情報に影響を与えない点、および遺伝子発現活性が高くて種特異性が低い点等の特徴を持っているため、遺伝子治療用のベクターの素材として注目されている。
センダイウイルスはパラミクソウイルス科に属するマイナス一本鎖RNAウイルスで、ヒトに対する病原性がない点、転写や複製は細胞質内で行われ宿主の遺伝情報に影響を与えない点、および遺伝子発現活性が高くて種特異性が低い点等の特徴を持っているため、遺伝子治療用のベクターの素材として注目されている。
現在のところ、ワクシニアウイルスベクター、もしくはプラスミドベクターを用いてT7 RNA polymeraseを強制発現した培養細胞に、T7 RNA polymeraseによってセンダイウイルスの全長ゲノムRNAの相補鎖が発現する発現ベクターと、センダイウイルスの転写複製に関与するNP、P、Lの各遺伝子の発現ベクターをトランスフェクションすることによって組換え体センダイウイルスを作製する方法が確立されている。この方法を用いて、外来遺伝子を挿入したセンダイウイルス作製用ベクターから組換え体センダイウイルスが作製されており、またその応用として、センダイウイルスのF、M、HNの各遺伝子を欠損させた組換え体センダイウイルスも作製されている。また、目的のタンパク質をこれらの組換え体センダイウイルスに発現させることによって、タンパク質生産系としての応用も検討されている。
これらのセンダイウイルス作製用ベクターから作製された組換え体センダイウイルスを用いて、染色体とは独立に存在できる遺伝情報発現系として、遺伝子治療への応用が多くの研究グループによって試行されている。しかし、これらのセンダイウイルスベクターは細胞障害性のあるZ株をベースにしたものであり、その細胞障害性を抑制させるために該ウイルスの遺伝子を欠損させたものであり、一代で死滅するため、安全性は向上しているものの遺伝子発現の持続する期間は限られている。
一方、センダイウイルスには種々の性質を有する株が知られており、この中で、温度感受性株として、38℃で殆どウイルス粒子を産生せず、32℃では複製サイクルが働きウイルス粒子を産生する、温度感受性変異株Cl.151株が、現・広島大学の吉田哲也教授らによって1979年に報告されている。
本発明者らは上記センダイウイルス温度感受性変異体Cl.151株が38℃で殆どウイルス粒子を産生せず持続感染を起こす点に着目し、長期間持続する遺伝子発現を実現するセンダイウイルスベクターを構築するために、上記Cl.151株とその親株である名古屋株の全長ゲノムcDNAをクローニングした。上記の２株の全長遺伝子（＋）鎖ｃＤＮＡを各制限酵素で切り出した断片を種々組み合わせて、ウイルスを再構成し、各組み合わせにおいて温度感受性を示すか、及び持続感染能を有するか否かを調べた結果、Cl.151株のＭ遺伝子とＦ遺伝子に存在する、Ｍタンパク質の６９、１１６及び１８３番目のアミノ酸残基が、それぞれ、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）及びセリン（Ｓ）に、また、Ｆタンパク質の６、１１５及び１３７番目アミノ酸残基が、それぞれアルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）及びスレオニン（Ｔ）になる変異のうちの複数の変異が持続感染能に必要であるということを明らかにした。
さらに、この全長ゲノムcDNAに外来遺伝子発現カセットを挿入し、そこから得られる、組換え体センダイウイルスによる外来遺伝子発現の持続性を検討した。その結果、培養細胞における発現は、Z株由来センダイウイルスベクターを用いた場合、感染細胞が死滅するために短期間であるのに対し、Cl.151株由来センダイウイルスベクターを用いた場合、4か月以上発現が持続した。また、ラットの大腸に感染させた場合、Z株由来センダイウイルスベクターでは約２週間で発現が確認されなくなるのに対し、Cl.151株由来センダイウイルスベクターを用いた場合、大腸上皮細胞において２か月以上発現が持続した。
以上の知見から、Cl.151株由来センダイウイルスベクターは生体内を含めて、持続的に導入遺伝子を発現させることができるベクターとして非常に有用であることは明らかになったが、持続感染機構については明らかになっておらず、また、ベクターの安全性を向上させるために、持続性を維持したまま、感染性粒子を放出しない非伝播性のベクターに改良することが望まれている。
以上の知見から、Cl.151株由来センダイウイルスベクターは生体内を含めて、持続的に導入遺伝子を発現させることができるベクターとして非常に有用であることは明らかになったが、持続感染機構については明らかになっておらず、また、ベクターの安全性を向上させるために、持続性を維持したまま、感染性粒子を放出しない非伝播性のベクターに改良することが望まれている。
そこで、本発明の課題は、細胞障害性がなく、長期間持続する遺伝子発現を実現でき、さらに安全性を高めるために非伝播性に改良した、遺伝子治療用ベクター等の用途において極めて有用な新規ウイルスベクターを提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため、新たな遺伝子治療用ベクターの開発に当たって、まず、安定して持続感染するセンダイウイルスゲノム構造の探索を行った。
Cl.151株のM、Fタンパク質上の変異が持続感染には重要であるという知見は得られていたが、M、Fタンパク質はCl.151株由来、それ以外の部分は名古屋株由来のキメラcDNAから作製した組換えセンダイウイルス（rNa151MF）は感染後、数日経った後に細胞障害性が確認された。このことから、さらにCl.151株由来の変異を加える必要があると考えられ、そこで、新たにキメラcDNAから組換えセンダイウイルスを作製して解析した結果、M、F、Lタンパク質がCl.151由来で、それ以外の部分が名古屋株由来のcDNAから作製した組換えセンダイウイルス（rNa151MFL）が安定して持続感染したことから、M、Fタンパク質に加え、Lタンパク質上の変異が持続感染には重要であるという知見を得た。さらに、Lタンパク質上のCl.151株特異的な変異（１０８８番目のアラニンがセリン、１６１８番目のロイシンがバリン）の内のどちらが持続感染に関与するか解析した結果、M、Fタンパク質の変異に加えて、Lタンパク質の１６１８番目のアミノ酸の変異を加えれば持続感染が成立することを明らかにした。
Cl.151株のM、Fタンパク質上の変異が持続感染には重要であるという知見は得られていたが、M、Fタンパク質はCl.151株由来、それ以外の部分は名古屋株由来のキメラcDNAから作製した組換えセンダイウイルス（rNa151MF）は感染後、数日経った後に細胞障害性が確認された。このことから、さらにCl.151株由来の変異を加える必要があると考えられ、そこで、新たにキメラcDNAから組換えセンダイウイルスを作製して解析した結果、M、F、Lタンパク質がCl.151由来で、それ以外の部分が名古屋株由来のcDNAから作製した組換えセンダイウイルス（rNa151MFL）が安定して持続感染したことから、M、Fタンパク質に加え、Lタンパク質上の変異が持続感染には重要であるという知見を得た。さらに、Lタンパク質上のCl.151株特異的な変異（１０８８番目のアラニンがセリン、１６１８番目のロイシンがバリン）の内のどちらが持続感染に関与するか解析した結果、M、Fタンパク質の変異に加えて、Lタンパク質の１６１８番目のアミノ酸の変異を加えれば持続感染が成立することを明らかにした。
Cl.151株のLタンパク質上の変異が、持続感染にどのように関与しているかを明らかにするために、まず名古屋株の全長cDNAの中のLタンパク質の１６１８番目のアミノ酸のみCl.151株由来に変異させたcDNAから組換えセンダイウイルス（rNa(L1618pi)）を作製し、その性質検討を行った。その結果、Lタンパク質の１６１８番目のアミノ酸の変異によって、センダイウイルスの細胞障害性は減弱し、インターフェロンの発現誘導も低下することを明らかにした。また、インターフェロンの発現誘導の低下の原因の一つとして、アンチゲノムRNAのコピー数の減少、すなわち、ゲノムRNAの３’末端から転写され、リーダーRNA以降までreadthroughして転写されるRNAのコピー数の減少が関与していることが示唆され、実際にそのようなウイルス由来インターフェロン誘導RNAの発現を低下させるように改変した組換えセンダイウイルス（r(+E)Na）は、インターフェロン誘導能が低下していた。
以上の結果から、インターフェロンの発現誘導を減少させることがウイルスの持続感染性には重要であり、Lタンパク質の１６１８番目のアミノ酸の変異によって、そのような発現誘導の低下が起こるということが明らかになった。
以上の結果から、インターフェロンの発現誘導を減少させることがウイルスの持続感染性には重要であり、Lタンパク質の１６１８番目のアミノ酸の変異によって、そのような発現誘導の低下が起こるということが明らかになった。
次に、効率良く組換えセンダイウイルスを作製するために、T7 RNA polymeraseを恒常的に発現する細胞株の樹立を試みた。アミノ酸配列は変えずに、ヒト型のコドンを用いるように塩基配列を変換したT7 RNA polymerase（ヒト型T7 RNA polymerase）を恒常的に発現する細胞株を分離した結果、その細胞株（BHK/T7細胞）では従来のバクテリア型のT7 RNA polymeraseを発現する細胞株（BSR-T7-5細胞）と比較して、顕著にT7 RNA polymerase発現量が増加していた。また、BHK/T7細胞を用いて組換えセンダイウイルスを作製した結果、BSR-T7-5細胞よりも効率良く作製することが可能であった。以上の結果から、BHK/T7細胞を用いることによって、細胞障害性のあるT7 RNA polymerase発現ワクシニアウイルスを用いることなく、効率良く組換えセンダイウイルスを作製することが可能になったので、以後のウイルスベクター作製にはBHK/T7細胞を用いた。
ブラストサイジン耐性遺伝子発現カセットを挿入した持続感染型センダイウイルス作成用ベクターを、上記のBHK/T7細胞にNP、P、Lタンパク質発現ベクターとともにトランスフェクションした結果、ブラストサイジンによって組換えセンダイウイルス産生細胞を選択することが可能になった。このことから、新たな組換えセンダイウイルス作製方法として、薬剤耐性遺伝子を用いて持続感染型ウイルスベクターを単離する方法を確立することに成功した。このようにベクターに薬物耐性遺伝子が搭載されることにより、ベクターのタイターが低い場合も、ベクターを導入した標的細胞のみを選択的に増やすことによって十分量のベクター導入細胞を得ることが可能となる。また、その過程で、rNa151MFLを骨格とした場合が、最も効率良く組換えセンダイウイルスを作製することができるということも明らかにした。
次に上記の組換えセンダイウイルス作製系を用いて、ウイルス遺伝子を全長cDNAから欠損させることによって非伝播性にした組換えウイルスの作製を試みた。その結果、Mタンパク質発現BHK/T7細胞を用いて、M遺伝子を欠損させた持続感染型センダイウイルス作成用ベクターからM欠損組換えセンダイウイルスの作製に成功した。同様の方法でF遺伝子、HN遺伝子欠損組換えセンダイウイルスの作製にも成功した。各々の組換えセンダイウイルスは持続的に感染したことから、M、F、HNタンパク質を各々欠損させても持続感染は可能であるということが示唆された。さらに、これらの遺伝子欠損型センダイウイルスは、欠損遺伝子を補わない限り、ウイルス産生細胞から感染性粒子を放出せず、非伝播性であることも明らかにした。
同様の方法でM、F、HN遺伝子のうち、２つもしくは３つすべてを欠損させた組換えセンダイウイルスの作製にも成功し、また、これらの数多くの遺伝子欠損型組換えセンダイウイルスについて、感染細胞からのウイルスゲノムの脱落を調べた結果、いくつかの構造を除いて、基本的に遺伝子を欠損させても持続感染能は維持されているということも明らかにした。これらの結果から、センダイウイルスゲノム複製に最低限必要だと考えられるNP、P、Lタンパク質のみをコードするcDNAから、非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターの作製は可能であるということが明らかになった。また、各非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターが感染している細胞から放出されるウイルス粒子量を定量した結果、３遺伝子を欠損させることによってウイルス粒子の放出はほぼ完全に抑制されていた。このことから３遺伝子欠損ベクターはより安全性が高いベクターであることが確認された。
非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターに、リソソーム病の一種であるファブリー病の原因遺伝子であり、タンパク補充療法にも用いられるα-galactosidase A遺伝子の発現カセットを挿入した。そのベクターの感染細胞からのα-galactosidase Aタンパク質産生量を定量した結果、非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターを用いることによって、従来法以上の産生量を、より簡便に得ることができた。さらに、慢性肉芽種症（CGD）の治療用遺伝子であるgp91phoxの発現カセットを挿入した非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターを作製した結果、gp91phoxを持続的に発現させることに成功した。また、マウスやヒトから分離した造血幹細胞に非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターを感染させたところ、in vitroにおける培養において、マウスでは少なくとも２週間以上、ヒトでは７週間以上の長期にわたってベクターが持続感染していることを確認した。以上の結果から、このベクターは医療の分野でも、安全性が高く、安定して外来遺伝子を高発現させることができるベクターとして応用が可能であるという知見を得て、本発明を完成させるに至ったものである。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）センダイウイルスのＬタンパク質の少なくとも一部をコードし、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスの細胞障害性を減弱させるために用いる遺伝子材料であって、少なくとも、該Ｌタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、上記遺伝子材料。
（２）細胞障害性の減弱が、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスによるインターフェロンの発現誘導の抑制に基づくものである上記（１）に記載の遺伝子材料。
（３）細胞障害性の減弱が、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのゲノムＲＮＡの３’末端から転写されるＲＮＡのコピー数の減少に基づくものである請求項１に記載の遺伝子材料。
（４）センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されていることを特徴とする、インターフェロンの発現誘導を抑制するために用いられる遺伝子材料。
（５）上記（１）に記載の遺伝子材料と、少なくとも以下１）〜６）のアミノ酸変異を有するタンパク質をコードする遺伝子とからなることを特徴とする、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスに、持続感染性を付与するために用いる遺伝子材料。
１）６９Ｅ、２）１１６Ａ、３）１８３Ｓ、４）６Ｒ、５）１１５Ｌ、６）１３７Ｔ
（但し、上記１）〜３）中の数字は、センダイウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列における位置番号を、４）〜６）中の数字は、同Ｆタンパク質のアミノ酸配列における位置番号をそれぞれ表し、１）〜６）中、アルファベットは該位置における変異したアミノ酸残基を表す。）
（６）センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されている遺伝子材料を含むことを特徴とする、上記（５）に記載の遺伝子材料。
（７）プラス鎖ｃＤＮＡからなることを特徴とする、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の遺伝子材料。
（８）非持続感染型センダイウイルスの遺伝子が、Ｌタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンに置換されたタンパク質をコードするように変換されていることを特徴とする、センダイウイルス遺伝子。
（９）さらに、非持続感染型センダイウイルス遺伝子が、少なくとも以下のアミノ酸変異を有するタンパク質をコードするように変換されていることを特徴とする、上記（８）に記載のセンダイウイルス遺伝子。
１）６９Ｅ、２）１１６Ａ、３）１８３Ｓ、４）６Ｒ、５）１１５Ｌ、６）１３７Ｔ
（但し、上記１）〜３）中の数字は、センダイウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列における位置番号を、４）〜６）中の数字は、同Ｆタンパク質のアミノ酸配列における位置番号をそれぞれ表し、１）〜６）中、アルファベットは該位置における変異したアミノ酸残基を表す。）
（１０）さらに、センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されていることを、特徴とする、上記（８）又は（９）に記載のセンダイウイルス遺伝子。
（１１）Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上を欠損させたことを特徴とする上記（８）または（９）に記載のセンダイウイルス遺伝子。
（１２）Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上の欠損が、これら各遺伝子に対するマーカー遺伝子の挿入によるものである、上記（１１）に記載のセンダイウイルス遺伝子。
（１３）非持続感染性センダイウイルスのＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンに置換されたタンパク質をコードするように変換された変異Ｌ遺伝子と、ＮＰ及びＰ遺伝子とからなることを特徴とする、センダイウイルス遺伝子。
（１４）さらに、センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されていることを特徴とする、上記（１１）〜（１３）に記載のセンダイウイルス遺伝子。
（１５）プラス鎖ｃＤＮＡからなることを特徴とする、上記（８）〜（１４）のいずれかに記載のセンダイウイルス遺伝子。
（１６）上記（８）〜（１０）のいずれかに記載のセンダイウイルス遺伝子ｃＤＮＡからなることを特徴とする、持続感染型組換えウイルス作成用遺伝子材料。
（１７）上記（１１）〜（１４）のいずれかに記載のセンダイウイルス遺伝子ｃＤＮＡからなることを特徴とする、非伝播性持続感染型ウイルス作成用遺伝子材料。
（１８）ベクターに、上記（１７）に記載の組換えウイルス作成用遺伝子材料が導入されていることを特徴とする、持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
（１９）ベクターに、上記（１８）に記載の組換えウイルス作成用遺伝子材料が導入されていることを特徴とする、非伝播性持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
（２０）外来遺伝子ＤＮＡが導入されていることを特徴とする、上記（１８）に記載の持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
（２１）外来遺伝子が、生理活性ペプチドあるいはタンパク質をコードするものである、上記（２０）に記載の組換えウイルス作成用ベクター。
（２２）外来遺伝子ＤＮＡが導入されていることを特徴とする、上記（１９）に記載の非伝播性持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
（２３）Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上が欠損している請求項２２に記載の非伝播性持続感染型ウイルスベクターであって、外来遺伝子がＭ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上に挿入されていることを特徴とする、上記（２２）に記載の非伝播性持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
（２４）外来遺伝子が、生理活性ペプチドあるいはタンパク質をコードするものである、上記（２２）または（２３）に記載の組換えウイルス作成用ベクター。
（２５）上記（２０）または（２１）のいずれかに記載の組換えウイルス作成用ベクターが導入されていることを特徴とする細胞。
（２６）上記（２２）〜（２４）のいずれかに記載の組換えウイルス作成用ベクターが導入されていることを特徴とする細胞。
（２７）上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の組換えウイルス作成用ベクターを複数導入した細胞であって、該ベクターはそれぞれ異なる外来遺伝子を担持し、複数の外来遺伝子が同時に発現していることを特徴とする細胞。
（２８）上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の組換えウイルス作成用ベクターと、ウイルス粒子形成のために不足する遺伝子を有する他の組換えベクターとが導入されていることを特徴とする細胞。
（２９）ウイルス粒子形成のために不足する遺伝子がＦ遺伝子であって、該Ｆ遺伝子が、Ｆタンパク質の１１２〜１１６番目のアミノ酸配列において、アルギニン−アルギニン−Ｘ−リジン又はアルギニン−アルギニンで表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に変換されていることを特徴とする、上記（２８）に記載の細胞（但し上記アミノ酸配列中Ｘは、任意のアミノ酸残基を表す。）。
（３０）ヒト型コドンに変換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が導入されていることを特徴とする上記（２５）〜（２９）のいずれかに記載の細胞。
（３１）上記（２６）に記載の細胞内で再構成されたセンダイウイルスＲＮＰ複合体。
（３２）上記（２５）〜（２９）のいずれかに記載の細胞を培地に培養することを特徴とする、外来遺伝子産物の製造方法。
（３３）上記（２５）〜（２９）のいずれかに記載の細胞を培地に培養することを特徴とする、外来遺伝子を保持したセンダイウイルスの粒子の製造方法。
（３４）上記（２５）〜（２９）のいずれかに記載の細胞を培地に培養することにより得られた、外来遺伝子を保持したセンダイウイルス粒子。
（３５）非持続感染型センダイウイルスの全長遺伝子のうち、Ｌ遺伝子がＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンになるように置換したタンパク質をコードするように変換されていることを特徴とする、ウイルス粒子。
（３６）非持続感染型センダイウイルスの全長遺伝子のうち、Ｌ遺伝子がＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンに置換したタンパク質をコードするように変換され、かつＭおよびＦ遺伝子が、以下１）〜６）の変異を含むアミノ酸配列をコードするように変換されていることを特徴とする、ウイルス粒子。
１）６９Ｅ、２）１１６Ａ、３）１８３Ｓ、４）６Ｒ、５）１１５Ｌ、６）１３７Ｔ
（但し、上記１）〜３）中の数字は、センダイウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列における位置番号を、４）〜６）中の数字は、同Ｆタンパク質のアミノ酸配列における位置番号をそれぞれ表し、１）〜６）中、アルファベットは該位置における変異したアミノ酸残基を表す。）
（３７）非持続感染型センダイウイルスの全長遺伝子のうち、Ｌ遺伝子が、Ｌタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンに置換したタンパク質をコードするように変換されているとともに、Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上が欠損している遺伝子をゲノムとして有するウイルス粒子であって、該ウイルス粒子形成において不足するＭ、Ｆ及びＨＮタンパク質のいずれか１種以上が、上記ゲノム以外の遺伝子発現系により補われていることを特徴とする、ウイルス粒子。
（３８）非持続感染型センダイウイルスのＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンに置換したタンパク質をコードするように変換された変異Ｌ遺伝子、並びにＮＰ遺伝子及びＰ遺伝子をゲノムとして少なくとも有するとともに、Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のうちいずれか１種以上をゲノムとして有しないウイルス粒子であって、ウイルス粒子形成において不足する上記Ｍ、Ｆ、ＨＮタンパク質のいずれか１種以上が、上記ゲノム以外の遺伝子発現系により補われていることを特徴とする、ウイルス粒子。
（３９）ウイルス粒子形成において不足するタンパク質が少なくともＦタンパク質であって、該Ｆタンパク質の１１２〜１１６番目のアミノ酸配列がアルギニン−アルギニン−Ｘ−リジンまたはアルギニン−アルギニンで表される配列に変換されていることを特徴とする、請求項３７または３８に記載のウイルス粒子（但し上記アミノ酸配列中Ｘは、任意のアミノ酸残基を表す。）。
（４０）さらに、センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されていることを、特徴とする、上記（３４）〜（３９）に記載のウイルス粒子。
（４１）上記（３４）〜（４０）に記載のウイルス粒子に外来遺伝子が導入されていることを特徴とする、組換えウイルス。
（４２）上記（４１）に記載の組換えウイルスを有効成分として含有することを特徴とする、遺伝子治療用薬剤。
（１）センダイウイルスのＬタンパク質の少なくとも一部をコードし、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスの細胞障害性を減弱させるために用いる遺伝子材料であって、少なくとも、該Ｌタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、上記遺伝子材料。
（２）細胞障害性の減弱が、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスによるインターフェロンの発現誘導の抑制に基づくものである上記（１）に記載の遺伝子材料。
（３）細胞障害性の減弱が、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのゲノムＲＮＡの３’末端から転写されるＲＮＡのコピー数の減少に基づくものである請求項１に記載の遺伝子材料。
（４）センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されていることを特徴とする、インターフェロンの発現誘導を抑制するために用いられる遺伝子材料。
（５）上記（１）に記載の遺伝子材料と、少なくとも以下１）〜６）のアミノ酸変異を有するタンパク質をコードする遺伝子とからなることを特徴とする、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスに、持続感染性を付与するために用いる遺伝子材料。
１）６９Ｅ、２）１１６Ａ、３）１８３Ｓ、４）６Ｒ、５）１１５Ｌ、６）１３７Ｔ
（但し、上記１）〜３）中の数字は、センダイウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列における位置番号を、４）〜６）中の数字は、同Ｆタンパク質のアミノ酸配列における位置番号をそれぞれ表し、１）〜６）中、アルファベットは該位置における変異したアミノ酸残基を表す。）
（６）センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されている遺伝子材料を含むことを特徴とする、上記（５）に記載の遺伝子材料。
（７）プラス鎖ｃＤＮＡからなることを特徴とする、上記（１）〜（６）のいずれかに記載の遺伝子材料。
（８）非持続感染型センダイウイルスの遺伝子が、Ｌタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンに置換されたタンパク質をコードするように変換されていることを特徴とする、センダイウイルス遺伝子。
（９）さらに、非持続感染型センダイウイルス遺伝子が、少なくとも以下のアミノ酸変異を有するタンパク質をコードするように変換されていることを特徴とする、上記（８）に記載のセンダイウイルス遺伝子。
１）６９Ｅ、２）１１６Ａ、３）１８３Ｓ、４）６Ｒ、５）１１５Ｌ、６）１３７Ｔ
（但し、上記１）〜３）中の数字は、センダイウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列における位置番号を、４）〜６）中の数字は、同Ｆタンパク質のアミノ酸配列における位置番号をそれぞれ表し、１）〜６）中、アルファベットは該位置における変異したアミノ酸残基を表す。）
（１０）さらに、センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されていることを、特徴とする、上記（８）又は（９）に記載のセンダイウイルス遺伝子。
（１１）Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上を欠損させたことを特徴とする上記（８）または（９）に記載のセンダイウイルス遺伝子。
（１２）Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上の欠損が、これら各遺伝子に対するマーカー遺伝子の挿入によるものである、上記（１１）に記載のセンダイウイルス遺伝子。
（１３）非持続感染性センダイウイルスのＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンに置換されたタンパク質をコードするように変換された変異Ｌ遺伝子と、ＮＰ及びＰ遺伝子とからなることを特徴とする、センダイウイルス遺伝子。
（１４）さらに、センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されていることを特徴とする、上記（１１）〜（１３）に記載のセンダイウイルス遺伝子。
（１５）プラス鎖ｃＤＮＡからなることを特徴とする、上記（８）〜（１４）のいずれかに記載のセンダイウイルス遺伝子。
（１６）上記（８）〜（１０）のいずれかに記載のセンダイウイルス遺伝子ｃＤＮＡからなることを特徴とする、持続感染型組換えウイルス作成用遺伝子材料。
（１７）上記（１１）〜（１４）のいずれかに記載のセンダイウイルス遺伝子ｃＤＮＡからなることを特徴とする、非伝播性持続感染型ウイルス作成用遺伝子材料。
（１８）ベクターに、上記（１７）に記載の組換えウイルス作成用遺伝子材料が導入されていることを特徴とする、持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
（１９）ベクターに、上記（１８）に記載の組換えウイルス作成用遺伝子材料が導入されていることを特徴とする、非伝播性持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
（２０）外来遺伝子ＤＮＡが導入されていることを特徴とする、上記（１８）に記載の持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
（２１）外来遺伝子が、生理活性ペプチドあるいはタンパク質をコードするものである、上記（２０）に記載の組換えウイルス作成用ベクター。
（２２）外来遺伝子ＤＮＡが導入されていることを特徴とする、上記（１９）に記載の非伝播性持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
（２３）Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上が欠損している請求項２２に記載の非伝播性持続感染型ウイルスベクターであって、外来遺伝子がＭ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上に挿入されていることを特徴とする、上記（２２）に記載の非伝播性持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
（２４）外来遺伝子が、生理活性ペプチドあるいはタンパク質をコードするものである、上記（２２）または（２３）に記載の組換えウイルス作成用ベクター。
（２５）上記（２０）または（２１）のいずれかに記載の組換えウイルス作成用ベクターが導入されていることを特徴とする細胞。
（２６）上記（２２）〜（２４）のいずれかに記載の組換えウイルス作成用ベクターが導入されていることを特徴とする細胞。
（２７）上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の組換えウイルス作成用ベクターを複数導入した細胞であって、該ベクターはそれぞれ異なる外来遺伝子を担持し、複数の外来遺伝子が同時に発現していることを特徴とする細胞。
（２８）上記（２０）〜（２４）のいずれかに記載の組換えウイルス作成用ベクターと、ウイルス粒子形成のために不足する遺伝子を有する他の組換えベクターとが導入されていることを特徴とする細胞。
（２９）ウイルス粒子形成のために不足する遺伝子がＦ遺伝子であって、該Ｆ遺伝子が、Ｆタンパク質の１１２〜１１６番目のアミノ酸配列において、アルギニン−アルギニン−Ｘ−リジン又はアルギニン−アルギニンで表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に変換されていることを特徴とする、上記（２８）に記載の細胞（但し上記アミノ酸配列中Ｘは、任意のアミノ酸残基を表す。）。
（３０）ヒト型コドンに変換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が導入されていることを特徴とする上記（２５）〜（２９）のいずれかに記載の細胞。
（３１）上記（２６）に記載の細胞内で再構成されたセンダイウイルスＲＮＰ複合体。
（３２）上記（２５）〜（２９）のいずれかに記載の細胞を培地に培養することを特徴とする、外来遺伝子産物の製造方法。
（３３）上記（２５）〜（２９）のいずれかに記載の細胞を培地に培養することを特徴とする、外来遺伝子を保持したセンダイウイルスの粒子の製造方法。
（３４）上記（２５）〜（２９）のいずれかに記載の細胞を培地に培養することにより得られた、外来遺伝子を保持したセンダイウイルス粒子。
（３５）非持続感染型センダイウイルスの全長遺伝子のうち、Ｌ遺伝子がＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンになるように置換したタンパク質をコードするように変換されていることを特徴とする、ウイルス粒子。
（３６）非持続感染型センダイウイルスの全長遺伝子のうち、Ｌ遺伝子がＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンに置換したタンパク質をコードするように変換され、かつＭおよびＦ遺伝子が、以下１）〜６）の変異を含むアミノ酸配列をコードするように変換されていることを特徴とする、ウイルス粒子。
１）６９Ｅ、２）１１６Ａ、３）１８３Ｓ、４）６Ｒ、５）１１５Ｌ、６）１３７Ｔ
（但し、上記１）〜３）中の数字は、センダイウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列における位置番号を、４）〜６）中の数字は、同Ｆタンパク質のアミノ酸配列における位置番号をそれぞれ表し、１）〜６）中、アルファベットは該位置における変異したアミノ酸残基を表す。）
（３７）非持続感染型センダイウイルスの全長遺伝子のうち、Ｌ遺伝子が、Ｌタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンに置換したタンパク質をコードするように変換されているとともに、Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上が欠損している遺伝子をゲノムとして有するウイルス粒子であって、該ウイルス粒子形成において不足するＭ、Ｆ及びＨＮタンパク質のいずれか１種以上が、上記ゲノム以外の遺伝子発現系により補われていることを特徴とする、ウイルス粒子。
（３８）非持続感染型センダイウイルスのＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンに置換したタンパク質をコードするように変換された変異Ｌ遺伝子、並びにＮＰ遺伝子及びＰ遺伝子をゲノムとして少なくとも有するとともに、Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のうちいずれか１種以上をゲノムとして有しないウイルス粒子であって、ウイルス粒子形成において不足する上記Ｍ、Ｆ、ＨＮタンパク質のいずれか１種以上が、上記ゲノム以外の遺伝子発現系により補われていることを特徴とする、ウイルス粒子。
（３９）ウイルス粒子形成において不足するタンパク質が少なくともＦタンパク質であって、該Ｆタンパク質の１１２〜１１６番目のアミノ酸配列がアルギニン−アルギニン−Ｘ−リジンまたはアルギニン−アルギニンで表される配列に変換されていることを特徴とする、請求項３７または３８に記載のウイルス粒子（但し上記アミノ酸配列中Ｘは、任意のアミノ酸残基を表す。）。
（４０）さらに、センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されていることを、特徴とする、上記（３４）〜（３９）に記載のウイルス粒子。
（４１）上記（３４）〜（４０）に記載のウイルス粒子に外来遺伝子が導入されていることを特徴とする、組換えウイルス。
（４２）上記（４１）に記載の組換えウイルスを有効成分として含有することを特徴とする、遺伝子治療用薬剤。
本発明によれば、外来遺伝子を持続的に発現し、さらに、非伝播性の組換えセンダイウイルスベクターを提供できる。これにより、従来の遺伝子治療用ベクターでは不可能であった、染色体とは独立に存在可能で、かつ安全性の高い遺伝情報発現系を実現することが可能となり、遺伝子治療用薬剤を導入するためのベクターとして有用である。また、本発明の組換えウイルスベクターの作成に用いた手法は、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子やベクター遺伝子の遺伝子配列を変えることによって、様々なウイルスベクターに応用可能である。さらに、本発明に記載の持続感染関連変異（Lタンパク質の１６１８番目のアミノ酸の変異）は、他の持続感染能を持たない組換えベクター、ウイルスに導入置換すれば、細胞障害性を減弱させ、発現持続性を付与することができると考えられることから、有用な遺伝子材料になりうる。
本発明は、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスを、細胞障害性がなく、持続感染型に変換するための遺伝子材料、該遺伝子を用いた、持続感染型あるいはさらに非伝播性の組換えウイルスを作成するために用いる遺伝子材料、該遺伝子材料に外来遺伝子を導入した組換えウイルス作成用ベクター、及び外来遺伝子を保持したウイルス粒子、該ウイルス粒子を有効成分とする遺伝子治療用薬剤等に関する。なお、本願明細書において、遺伝子あるいは遺伝子材料というとき、マイナス鎖ＲＮＡまたはｃＤＮＡ、及びこれと相補のプラス鎖ＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。すなわち転写あるいは逆転写により、上記いずれかの遺伝子あるいは遺伝子材料を合成しうるものは本発明に含まれる。また上記非持続感染型センダイウイルスとしては、例えばセンダイウイルス名古屋株、Ｚ株、Hamamatsu株等が挙げられ、その類縁ウイルスとしては麻疹ウイルス等が挙げられる。
センダイウイルスは、ＮＰ、Ｐ／Ｃ／Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｌの各遺伝子からなり、全長約15kbのマイナス１本鎖ゲノムＲＮＡを有するＲＮＡウイルスであり、上記各遺伝子は、それぞれＮＰ、Ｐ／Ｃ／Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｌタンパク質をコードする。
センダイウイルスには種々の性質の異なる株が知られ、その中で温度感受性株、特にセンダイウイルスCl.151株は、38℃ではほとんどウイルス粒子を産生せず、32℃では複製サイクルが働き、ウイルス粒子を産生する温度感受性株である。したがって、ヒトをはじめとする哺乳動物の体温ではほとんど細胞障害性を発揮しない。
センダイウイルスには種々の性質の異なる株が知られ、その中で温度感受性株、特にセンダイウイルスCl.151株は、38℃ではほとんどウイルス粒子を産生せず、32℃では複製サイクルが働き、ウイルス粒子を産生する温度感受性株である。したがって、ヒトをはじめとする哺乳動物の体温ではほとんど細胞障害性を発揮しない。
上記Cl.151株のゲノムＲＮＡ、対応する全長遺伝子（＋）鎖ｃＤＮＡの塩基配列及び該ｃＤＮＡがコードするＮＰ〜Ｌタンパク質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１及び２に示され、その親株である名古屋株のゲノムＲＮＡ、対応する全長遺伝子（＋）鎖ｃＤＮＡの塩基配列及び該ｃＤＮＡがコードするＮＰ〜Ｌタンパク質の各アミノ酸配列は、同配列番号３〜１０に示される。なお、配列番号５〜１１は、上記名古屋株の各タンパク質のアミノ酸配列が１から始まるように表記したものである。
上記のCl.151株の持続感染原因変異がどの遺伝子上に起こったものかを明らかにするために、Cl.151株とその親株である名古屋株の全長遺伝子（＋）鎖ｃＤＮＡを各制限酵素で切り出した断片を種々組み合わせて、ウイルスを再構成し、各組み合わせにおいて持続感染能を有するか否かを調べた結果を図２に示している。これによれば、M、F、Lタンパク質がCl.151株由来であると、その組換えウイルスは細胞障害性が最も低く持続感染する。
また、Lタンパク質上に存在するCl.151株由来変異のうち、１６１８番目のロイシンがバリンに変わる変異が持続感染に重要であり（図４）、該変異を持つ組換えセンダイウイルスは細胞障害性が著しく減弱し（図６）、インターフェロン誘導能が著しく減弱しており（図８）、その原因として、ウイルスアンチゲノムRNAのコピー数の低下が考えられた（図９）。このことから、安定した持続感染を実現する組換えセンダイウイルスベクターの作製のためには、上記のLタンパク質上の変異をベクターcDNAに導入したり、インターフェロン誘導能を減弱させる変異を導入したり、ウイルス感染によって産生されるRNAのコピー数を減弱させる変異を導入することが重要である。実際に、ウイルスアンチゲノムRNAの転写を抑制するために、leader RNAの３’末端に、人工的にセンダイウイルスの転写終結配列を挿入した組換えセンダイウイルスを作製したところ、アンチゲノムRNAの転写が低下するとともに、インターフェロン誘導能が低下した（図１０）。
したがって、本発明における第１の遺伝子材料は、少なくともＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンであるように変更した遺伝子（以下変異Ｌ遺伝子という場合がある。）を有する。該遺伝子は、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスの全長遺伝子の対応部分と置き換えることにより、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスの細胞障害性を減弱させ、上記変異遺伝子は、このような細胞障害性のない、持続感染型センダイウイルスを作成するための遺伝子材料として有用である。
このような変異Ｌ遺伝子としては、上記変異を含むＬタンパク質コード領域からなるかあるいは該コード領域を含む塩基配列を有するものを挙げられるが、該コード領域に対応する配列を全て含む必要は必ずしもなく、上記バリンになるように置換した領域を少なくとも含めば良い。
また、本発明者は先に持続感染性を付与するための、センダイウイルスのＭ遺伝子及びＦ遺伝子を変異させた遺伝子（以下、変異Ｍ、Ｆ遺伝子という場合がある。）について明らかにしており（特開２００６−１８０７８０号公報）、上記変異Ｌ遺伝子と組み合わせた遺伝子材料は、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスの全長遺伝子の対応部分と置き換えることにより、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスをより良好な持続感染型に変換させることができる。
また、本発明者は先に持続感染性を付与するための、センダイウイルスのＭ遺伝子及びＦ遺伝子を変異させた遺伝子（以下、変異Ｍ、Ｆ遺伝子という場合がある。）について明らかにしており（特開２００６−１８０７８０号公報）、上記変異Ｌ遺伝子と組み合わせた遺伝子材料は、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスの全長遺伝子の対応部分と置き換えることにより、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスをより良好な持続感染型に変換させることができる。
上記変異Ｍ、Ｆ遺伝子は、センダイウイルスのＭタンパク質およびＦタンパク質における以下の１）〜６）の変異部分を少なくとも含むアミノ酸配列をコードする遺伝子である。
１）６９Ｅ、２）１１６Ａ、３）１８３Ｓ、４）６Ｒ、５）１１５Ｌ、６）１３７Ｔ
（但し、上記１）〜３）中の数字は、センダイウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列における位置番号を、４）〜６）中の数字は、同Ｆタンパク質のアミノ酸配列における位置番号をそれぞれ表し、１）〜６）中、アルファベットは該位置における変異したアミノ酸残基を表す。）
１）６９Ｅ、２）１１６Ａ、３）１８３Ｓ、４）６Ｒ、５）１１５Ｌ、６）１３７Ｔ
（但し、上記１）〜３）中の数字は、センダイウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列における位置番号を、４）〜６）中の数字は、同Ｆタンパク質のアミノ酸配列における位置番号をそれぞれ表し、１）〜６）中、アルファベットは該位置における変異したアミノ酸残基を表す。）
これらの変異体遺伝子としては、例えばセンダイウイルスCl.151株（＋）鎖全長遺伝子３８７４〜５２７４番目の塩基配列を有するＲＮＡまたはそのｃＤＮＡ、あるいはこれらと相補のＲＮＡあるいはＤＮＡが挙げられるが、非持続型センダイウイルスのＭおよびＦ遺伝子を、上記１）〜６）の変異を有するタンパク質をコードするように置換して、上記変異体遺伝子としても良い。この変異体遺伝子もＭタンパク質からＦタンパク質に亘るコード領域の全て含む必要はなく、上記１）〜６）の変異部分を少なくとも含む領域をコードするものであればよい。なお、上記変異Ｍ、Ｆ遺伝子としては、上記１）〜６）の変異を有するＭ〜Ｆタンパク質のコード領域からなるかあるいはこれらコード領域を含む塩基配列を有するものでも良いことは当然である。
一方、本願発明における第２の遺伝子材料は、変異Ｌ遺伝子を用いて非持続感染型センダイウイルスの全長遺伝子において、そのＬ遺伝子と置換し、さらに非持続感染型センダイウイルスのＭ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか一種以上を欠損させたものであり、該遺伝子材料は、該ウイルスに非持続感染性に加えて非伝播性を付与することを可能にする。
このようなＭ、Ｆ及びＨＮ遺伝子の欠損は、例えば、これらの遺伝子に薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を挿入することにより行うことができる。これにより、これらの欠損遺伝子を含むセンダイウイルスをベクターとして使用する場合において、該ベクターが導入された標的細胞のスクリーニングを対応する薬剤等を含有する選択培地で容易に行うことができる。
このようなＭ、Ｆ及びＨＮ遺伝子の欠損は、例えば、これらの遺伝子に薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を挿入することにより行うことができる。これにより、これらの欠損遺伝子を含むセンダイウイルスをベクターとして使用する場合において、該ベクターが導入された標的細胞のスクリーニングを対応する薬剤等を含有する選択培地で容易に行うことができる。
さらに、これらの遺伝子欠損は、上記マーカー遺伝子の挿入に限らず、他の遺伝子あるいは単にＤＮＡ断片の挿入によっても良く、当然、生体内あるいは細胞内において発現させようとする外来遺伝子の挿入によっても良い。このような外来遺伝子の挿入による遺伝子欠損手法によれば極めて効率がよく対象遺伝子を欠損させることができる。また、例えば、Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子の１種をマーカー遺伝子の挿入により、また他を外来遺伝子の挿入により欠損させることも可能である。
また、このような欠損型のセンダイウイルス遺伝子材料においても、欠損させる遺伝子としてＭ遺伝子あるいはＦ遺伝子を選択しない場合には、残したＭ遺伝子あるいはＦ遺伝子は、上記変異Mあるいは変異F遺伝子であることが望ましい。さらに、本発明における非伝播性の付与は、上記のようなマーカー遺伝子等の挿入によるＭ、ＦあるいはＨＮ遺伝子の欠損に限らず、これら遺伝子を欠失させ、センダイウイルスのＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子及び変異Ｌ遺伝子のみから構成することによっても可能である。
また、このような欠損型のセンダイウイルス遺伝子材料においても、欠損させる遺伝子としてＭ遺伝子あるいはＦ遺伝子を選択しない場合には、残したＭ遺伝子あるいはＦ遺伝子は、上記変異Mあるいは変異F遺伝子であることが望ましい。さらに、本発明における非伝播性の付与は、上記のようなマーカー遺伝子等の挿入によるＭ、ＦあるいはＨＮ遺伝子の欠損に限らず、これら遺伝子を欠失させ、センダイウイルスのＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子及び変異Ｌ遺伝子のみから構成することによっても可能である。
このようなセンダイウイルスの全長遺伝子におけるＭ、ＦあるいはＨＮ遺伝子の欠損あるいは欠失を有する遺伝子は、Ｃｌ．１５１株のウイルス粒子産生温度である３２℃においても、細胞中においてそれ自体では感染性のある完全なウイルス粒子を形成できず、ＲＮＰ複合体（ヌクレオカプシド）が形成されるのみであるため、完全に非伝播性で安全性が高く、かつ変異Ｌ遺伝子を有するため、細胞障害性がなく持続感染性を有している。
本発明の上記第１及び第２の遺伝子材料は、ファージDNA等のクローニングベクターに挿入して、組換えセンダイウイルス作成用ベクターとする。該組換えセンダイウイルス作成用ベクターには外来遺伝子を導入し、得られた組換えセンダイウイルス作成用ベクターを用いて細胞を形質転換する。形質転換細胞は、第１の遺伝子材料を含む組換えセンダイウイルス作成用ベクター使用の場合、３２℃でセンダイウイルス粒子を形成するが、第２の遺伝子材料を含む組換えセンダイウイルス作成用ベクターの場合、上記したように細胞中では、３２℃でも感染性のウイルス粒子は形成されず、非伝播性である。したがって、上記形質転換細胞を培地で培養することにより、導入した外来遺伝子由来のタンパク質をインビトロでより安全に製造できる。
また、上記形質転換細胞は、培地に培養してウイルス粒子を形成させるが、上記第２の遺伝子材料を含む組換えセンダイウイルス作成用ベクターを使用する場合には、センダイウイルスが保持する遺伝子はゲノムとして不完全であり、複製は可能であるが、その発現タンパク質のみでは完全なウイルス粒子を形成できず、感染性を有しないため、生体内に導入することが困難となる。したがって、上記欠損させた遺伝子の発現系が別途に必要であり、上記形質転換細胞には、上記欠損乃至欠失遺伝子（Ｍ、Ｆ、ＨＮ遺伝子）を保持する他の組換えベクターを導入しておく。これにより、上記第２の遺伝子材料を使用した形質転換細胞であっても培地に培養することによりウイルス粒子が形成される（図１７）。
このように、調製された本願発明のウイルス粒子は、上記第１あるいは第２の遺伝子材料及び外来遺伝子を保有し、遺伝子治療等の薬剤として生体に導入して使用することができる。これらは生体組織中では、細胞障害性がなく、長期間持続感染し、外来遺伝子由来の薬剤タンパク質を持続的に産生しに薬効を保つ。第１の遺伝子材料を有するウイルス粒子であっても、通常の体温ではウイルス粒子を再形成せず安全ではあるが、上記第２の遺伝子材料を保有するウイルス粒子は、生体組織、細胞においては、いかなる温度領域においても全くウイルス粒子を再形成することができず、非伝播性であるので、安全性は高い。
以下に、上記変異Ｌ遺伝子を用いた持続感染型組換えセンダイウイルスベクターの作製手順にしたがって、本願発明を順次さらに具体的に説明する。
本発明の変異Ｌ遺伝子は、非持続感染型センダイウイルスのＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンをコードするように置換したものであり、同変異Ｍ遺伝子は、非持続感染型センダイウイルスのＭタンパク質の６９，１１６および１８３番目のアミノ酸残基がそれぞれ、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）及びセリン（Ｓ）をコードするように置換し、同変異Ｆ遺伝子は、非持続感染型センダイウイルスのＦタンパク質の６，１１５及び１３７番目のアミノ酸残基がそれぞれアルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）及びスレオニン（Ｔ）をコードするように置換したものである。これらの置換は、常法により行えばよく、例えば非持続型センダイウイルスｃＤＮＡを鋳型として変異ＰＣＲ法によって行うことができ、またこれらの変異領域を含むＤＮＡを合成し、該ＤＮＡにより非持続感染型センダイウイルスの対応部位を置換する手法によってもよい。
本発明の変異Ｌ遺伝子は、非持続感染型センダイウイルスのＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンをコードするように置換したものであり、同変異Ｍ遺伝子は、非持続感染型センダイウイルスのＭタンパク質の６９，１１６および１８３番目のアミノ酸残基がそれぞれ、グルタミン酸（Ｅ）、アラニン（Ａ）及びセリン（Ｓ）をコードするように置換し、同変異Ｆ遺伝子は、非持続感染型センダイウイルスのＦタンパク質の６，１１５及び１３７番目のアミノ酸残基がそれぞれアルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）及びスレオニン（Ｔ）をコードするように置換したものである。これらの置換は、常法により行えばよく、例えば非持続型センダイウイルスｃＤＮＡを鋳型として変異ＰＣＲ法によって行うことができ、またこれらの変異領域を含むＤＮＡを合成し、該ＤＮＡにより非持続感染型センダイウイルスの対応部位を置換する手法によってもよい。
一方、本発明の第２の遺伝子材料は、さらに、センダイウイルスのM、F、HN遺伝子ｃＤＮＡのうちのいずれか、もしくはそのうちの複数の遺伝子が発現しないように、他の遺伝子（図１６中ではM遺伝子がブラストサイジン耐性遺伝子）に置換するなどの変異を導入する必要がある。ウイルス遺伝子の発現を欠損させるためには上記のように他の遺伝子に置換する以外に、ストップコドンを導入したり、完全に欠失させることによって、発現を欠損させることも可能である。
このようにして得られた、本発明の第１、第２の遺伝子材料には、外来遺伝子をさらに組み込むことも可能であり、外来遺伝子は、センダイウイルスの遺伝子ｃＤＮＡがコードされていない部分に挿入することができるが、上記したように、第２の遺伝子材料の場合には、外来遺伝子を欠損させたい上記遺伝子に挿入することもできる。
センダイウイルスの遺伝子発現には、ゲノムＲＮＡの3’末端に近い遺伝子ほど強く発現するという極性効果があるため、ＮＰ遺伝子の上流側に挿入した場合最も発現が強く、Ｌ遺伝子の下流に挿入した場合最も発現が弱くなる。
挿入する際、外来遺伝子の下流側には、外来遺伝子の転写をストップさせる終結配列と、それに続くセンダイウイルス遺伝子の転写を開始させる開始配列を設ける。外来遺伝子としては特に制限はなく、遺伝子治療に用いられているものを使用でき、例えば患者においてその産生が不足あるいは欠損している、酵素、ホルモン、その他の生理活性ペプチドあるいはタンパク質が挙げられる。この外来遺伝子は、このように予め第１、２の遺伝子材料に挿入しておいてもよいが、以下に示す第１，第２の遺伝子材料を組込後の組換えセンダイウイルス作成用ベクターに導入してもよい。
挿入する際、外来遺伝子の下流側には、外来遺伝子の転写をストップさせる終結配列と、それに続くセンダイウイルス遺伝子の転写を開始させる開始配列を設ける。外来遺伝子としては特に制限はなく、遺伝子治療に用いられているものを使用でき、例えば患者においてその産生が不足あるいは欠損している、酵素、ホルモン、その他の生理活性ペプチドあるいはタンパク質が挙げられる。この外来遺伝子は、このように予め第１、２の遺伝子材料に挿入しておいてもよいが、以下に示す第１，第２の遺伝子材料を組込後の組換えセンダイウイルス作成用ベクターに導入してもよい。
また、薬剤耐性遺伝子等の外来遺伝子を本発明の第１、２の遺伝子材料に挿入することによって、組換えベクター産生細胞を容易に選択することが可能となる。第２の遺伝子材料を使用する場合には、上記したようにＭ、Ｆ、ＨＮ遺伝子に挿入することにより、これら遺伝子を欠損させることができ、効率的である。
本発明の持続感染型あるいはさらに非伝播性に改変した組換えセンダイウイルス作成用ベクターを得るには、上記第１あるいは第２の遺伝子材料ｃＤＮＡを、細胞内で(+)鎖のゲノムRNAが生合成されるように、例えば、λDASHII等のクローニングベクターに組み込むとともに、全長cDNAの上流（ゲノムRNAにおける3’末端側）にT7プロモーター配列、3個のグアニジン残基をこの順で配置し、全長cDNAの下流（ゲノムRNAにおける5’末端側）にタバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム配列、T7 RNA polymerase終止配列をこの順で配置する。
なお、T7プロモーター配列はT7 RNA polymeraseによってゲノムRNAにおける3’末端側から(+)鎖ゲノムRNAが生合成されるように、3個のグアニジン残基はT7 RNA polymeraseによるRNA転写効率を上昇させるように（S. Leyrer et al. (1998) J. Virol.
Methods 75; 47-58）、タバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム配列は転写された(+)鎖ゲノムRNAが末端で正確に切断されるように、T7 RNA polymerase終止配列はT7 RNA polymeraseによるRNA転写を正確に終結させるために付加するものである。
Methods 75; 47-58）、タバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム配列は転写された(+)鎖ゲノムRNAが末端で正確に切断されるように、T7 RNA polymerase終止配列はT7 RNA polymeraseによるRNA転写を正確に終結させるために付加するものである。
このように作成された外来遺伝子を有する持続感染型あるいはさらに非伝播性に改変した組換えセンダイウイルス作成用ベクターは、ウイルス産生用細胞に導入するが、この際、ウイルスタンパク質の形成を補い、ウイルス粒子を効率的に産生させるために、ＮＰ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子および欠損遺伝子を有する発現ベクターも細胞に導入するのが好ましい。
さらにT7 RNA polymeraseも供給する必要があり、給源として、例えば、T7 RNA polymerase発現ワクシニアウイルスを感染させた細胞を用いることもできるし、T7 RNA polymeraseを恒常的に発現するようにクローニングした細胞株を用いることもできる。
ヒト型T7 RNA polymeraseを恒常的に発現する細胞株（BHK/T7細胞）では従来のバクテリア型のT7 RNA polymeraseを発現する細胞株（BSR-T7-5細胞）と比較して、顕著にT7 RNA polymerase発現量が増加しており、この細胞を用いて組換えウイルスの産生を行った結果、効率良く組換えウイルスが回収された（図１２）。効率良く組換えウイルスを産生するためにT7 RNA polymerase発現量を増強させた細胞株を用いることが有効である。
ヒト型T7 RNA polymeraseを恒常的に発現する細胞株（BHK/T7細胞）では従来のバクテリア型のT7 RNA polymeraseを発現する細胞株（BSR-T7-5細胞）と比較して、顕著にT7 RNA polymerase発現量が増加しており、この細胞を用いて組換えウイルスの産生を行った結果、効率良く組換えウイルスが回収された（図１２）。効率良く組換えウイルスを産生するためにT7 RNA polymerase発現量を増強させた細胞株を用いることが有効である。
この例においては、該組換えセンダイウイルス作成用ベクターが導入されたウイルス産生細胞においては、ベクターDNAがT7 RNA polymeraseによってT7プロモーター以降がRNAに転写されるが、その際、産生するRNA分子はヘアピンリボザイム配列によって、それ以降の配列が切断されて削除され、外来遺伝子DNAに対応するRNAを挿入した組換えセンダイウイルスのアンチゲノムRNA分子にNP、P、L遺伝子産物が結合したRNP複合体が形成される。
次いで、このようにして形質転換され、外来遺伝子DNAに対応するRNAを挿入した組換えセンダイウイルスのアンチゲノムRNA分子を含むRNP複合体を含有する細胞を、ウイルス粒子産生温度である32℃で培養する。細胞においてはRNP複合体が鋳型となって、ウイルスRNAポリメラーゼにより（−）鎖に転写され、組換えセンダイウイルスベクターが再構成される。該ベクターは持続感染能を持つことから、ベクター産生細胞は上記のように薬物耐性遺伝子を挿入することによって選択が可能であるし、それ以外にも、EGFP遺伝子などのマーカー遺伝子を指標にして分取することも可能である。
上記のようにして得られたベクター産生細胞においては、第１の遺伝子材料を使用した組換えセンダイウイルス作成用ベクターを導入した細胞は、ウイルス粒子を産生することが可能ではあるが、非伝播性にするためにＭ，Ｆ及びＨＮ遺伝子の１種以上を欠損あるいは欠失させた組換えセンダイウイルス作成用ベクターを導入した細胞は、そのままではウイルス粒子を形成せず生体組織に感染させることができない。そこで、本発明においては、欠損あるいは欠失させた上記遺伝子由来のウイルスタンパク質（図１５中ではMタンパク質）の発現系を別途当該細胞に導入する。このような発現系としては、Ｍ、ＦあるいはＨＮ遺伝子をそれぞれ導入したベクター、あるいは不足する遺伝子を複数導入したベクターが挙げられ、これらは、上記ベクター産生細胞に導入することによって、ベクター産生細胞の培養上清からウイルス粒子を回収することが可能になる。
このようにして得られたウイルス粒子は、ゲノムとして非持続感染型センダイウイルスの全長遺伝子のうち、Ｌ遺伝子が、Ｌタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンに置換したタンパク質をコードするように変換されているとともに、Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上が欠損しているか、若しくはＮＰ、Ｐおよび変異Ｌ遺伝子をゲノムとして有するが、Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子が全て存在しないか、あるいはそのうちいずれか１種乃至２種が存在しないウイルス粒子であって、該ウイルス粒子形成において不足するＭ、Ｆ、ＨＮタンパク質すべてが、上記ゲノム以外の遺伝子発現系により補われているものである。
一方、本発明の組換えセンダイウイルスベクターは、いずれもトリプシン処理により感染性を持たせることによって、目的の細胞や組織に導入することが可能であり、これらの組織中でも外来遺伝子を持続的に発現する。
また、欠損遺伝子としてFタンパク質を補う際に、トリプシン処理をせずに細胞内のプロセシング経路によって容易に開裂して活性型になるように、開裂部位周辺に変異を導入（H. Taira et al. (1995) Arch. Virol. 140; 187-194）したFタンパク質（開裂型Fタンパク質）の発現系を、組換えセンダイウイルスベクター産生細胞にさらに導入すると、より高い感染効率を持つ上記センダイウイルスベクターを得ることができる（図３０）。
また、欠損遺伝子としてFタンパク質を補う際に、トリプシン処理をせずに細胞内のプロセシング経路によって容易に開裂して活性型になるように、開裂部位周辺に変異を導入（H. Taira et al. (1995) Arch. Virol. 140; 187-194）したFタンパク質（開裂型Fタンパク質）の発現系を、組換えセンダイウイルスベクター産生細胞にさらに導入すると、より高い感染効率を持つ上記センダイウイルスベクターを得ることができる（図３０）。
このような開裂型Ｆタンパク質としては、Ｆタンパク質の１１２〜１１６番目のアミノ酸配列がアルギニン−アルギニン−Ｘ−リジンまたはアルギニン−アルギニンで表される配列（配列番号６７）に変換されている変異体タンパク質（Ｘは任意のアミノ酸残基を表す。）が挙げられ、上記変異領域の具体例としてはアルギニン−アルギニン−グルタミン−リジン−アルギニンの配列（配列番号６８）が挙げられる。このような変異体タンパク質を、組換えセンダイウイルスベクター産生細胞において発現させるためには、該変異体タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに導入し、得られた組換えベクターを上記組換えセンダイウイルスベクター産生細胞に導入する。このような変異を導入するＦ遺伝子としては、持続感染型センダイウイルスのＦ遺伝子あるいは非持続感染型センダイウイルスのＦ遺伝子のいずれでもよい。
このように、欠損遺伝子を補う際に、変異等を入れた遺伝子をセンダイウイルスベクター産生細胞に導入することによって感染性を操作することが可能になる。
このように、欠損遺伝子を補う際に、変異等を入れた遺伝子をセンダイウイルスベクター産生細胞に導入することによって感染性を操作することが可能になる。
本発明の第２の遺伝子材料の作製におけるM、F、HN遺伝子のうちの欠損させる遺伝子の組合せとしては、どの組合せの欠損型組換えセンダイウイルスも作製可能であり、これらのうち大部分の組合せでは、薬剤選択を行わない条件下でも欠損型組換えセンダイウイルスの持続感染能は維持されていた（図２３）。
一方、F、HN遺伝子を欠損させたセンダイウイルスにおいては、他の組換えセンダイウイルスとゲノムの脱落のし易さにおいて差がみられたが、このようにゲノムの脱落しやすい構造を元にベクター設計をすることにより、ある程度の期間持続発現させた後にゲノムが脱落して外来遺伝子発現が消失するという、発現持続性を調節した持続感染型センダイウイルスベクターの作製も可能である。レトロウイルス等の染色体への組込みによる持続発現では、一度導入した遺伝子を抜くことは不可能であるので、このように持続発現に用いたベクターを人為的に脱落させることも重要な技術になると予想される。
また、違う薬剤耐性遺伝子を搭載したベクターを各々用意し、同時に感染させた後に、両方の薬剤で選択することによって、２つのベクターを持続的に保持する細胞を分離することが可能であった（図２９）。この方法を用いることによって、１つの細胞に複数のベクターを多重感染させ、多数の遺伝子を同時に導入することが可能であると考えられる。
一方、F、HN遺伝子を欠損させたセンダイウイルスにおいては、他の組換えセンダイウイルスとゲノムの脱落のし易さにおいて差がみられたが、このようにゲノムの脱落しやすい構造を元にベクター設計をすることにより、ある程度の期間持続発現させた後にゲノムが脱落して外来遺伝子発現が消失するという、発現持続性を調節した持続感染型センダイウイルスベクターの作製も可能である。レトロウイルス等の染色体への組込みによる持続発現では、一度導入した遺伝子を抜くことは不可能であるので、このように持続発現に用いたベクターを人為的に脱落させることも重要な技術になると予想される。
また、違う薬剤耐性遺伝子を搭載したベクターを各々用意し、同時に感染させた後に、両方の薬剤で選択することによって、２つのベクターを持続的に保持する細胞を分離することが可能であった（図２９）。この方法を用いることによって、１つの細胞に複数のベクターを多重感染させ、多数の遺伝子を同時に導入することが可能であると考えられる。
なお、本発明は、これら例示中に示したものに限らず、種々の遺伝子工学的材料、手段を使用できる。
以下に、本発明の実施例を示す。但し本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
以下に、本発明の実施例を示す。但し本発明はこれら実施例により限定されるものではない。
〔実施例１〕組換えセンダイウイルス（rNa151MFL、rNa151MF）の作製
（１）組換えセンダイウイルス作成用ベクターの作製
センダイウイルスCl.151株もしくは名古屋株の全長cDNAのクローニングによって得られたcDNAを3断片に分け、SeV: 1-2875を含むもの（pBSK/Na(3’-E) [名古屋株由来]、pBSK/151(3’-E) [Cl.151株由来]）の配列の内、センダイウイルスcDNAを含む配列のすぐ上流にT7プロモーター配列、3塩基のグアニジン残基を、この順で挿入した （pBSK/Na(3’+X+3G)、pBSK/151(3’+X+3G)）。SeV: 10479-15384を含むもの（pBSK/Na(E-5’)、 pBSK/151(E-5’)）から、SeV: 15351-15384の部分を切り出し、そのすぐ下流に、タバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム配列、T7 RNA polymerase終止配列をこの順で挿入した形で、pET30a(+) (Novagen)にクローニングし直し（pET/Na(5’+HrD)、 pET/151(5’+HrD)）、さらに、このSeV: 15351-15384〜T7 RNA polymerase終止配列をpBSK/Na(E-5’)、pBSK/N151(E-5’)に挿入した（pBSK/Na(E-5’)’ 、 pBSK/151(E-5’)’）。SeV: 2870-10484を含むもの（pBSK/Na(E-E)、 pBSK/151(E-E)）からSeV: 9015-10479を含む断片を、pBSK/Na(E-5’)’、 pBSK/151(E-5’)’のSeV: 10479-15384のすぐ上流に挿入した（pBSK/Na(V-5’)’ 、 pBSK/151(V-5’)’）。
（１）組換えセンダイウイルス作成用ベクターの作製
センダイウイルスCl.151株もしくは名古屋株の全長cDNAのクローニングによって得られたcDNAを3断片に分け、SeV: 1-2875を含むもの（pBSK/Na(3’-E) [名古屋株由来]、pBSK/151(3’-E) [Cl.151株由来]）の配列の内、センダイウイルスcDNAを含む配列のすぐ上流にT7プロモーター配列、3塩基のグアニジン残基を、この順で挿入した （pBSK/Na(3’+X+3G)、pBSK/151(3’+X+3G)）。SeV: 10479-15384を含むもの（pBSK/Na(E-5’)、 pBSK/151(E-5’)）から、SeV: 15351-15384の部分を切り出し、そのすぐ下流に、タバコリングスポットウイルスのヘアピンリボザイム配列、T7 RNA polymerase終止配列をこの順で挿入した形で、pET30a(+) (Novagen)にクローニングし直し（pET/Na(5’+HrD)、 pET/151(5’+HrD)）、さらに、このSeV: 15351-15384〜T7 RNA polymerase終止配列をpBSK/Na(E-5’)、pBSK/N151(E-5’)に挿入した（pBSK/Na(E-5’)’ 、 pBSK/151(E-5’)’）。SeV: 2870-10484を含むもの（pBSK/Na(E-E)、 pBSK/151(E-E)）からSeV: 9015-10479を含む断片を、pBSK/Na(E-5’)’、 pBSK/151(E-5’)’のSeV: 10479-15384のすぐ上流に挿入した（pBSK/Na(V-5’)’ 、 pBSK/151(V-5’)’）。
以上によって得られた各プラスミドのうち、pBSK/Na(3’+X+3G)もしくはpBSK/151(3’+X+3G)からT7プロモーター配列〜SeV: 1-2875を、pBSK/151(E-E)からSeV: 2870-6303（EcoR I-Blp I）を、pBSK/Na(E-E)からSeV: 6300-9598（Blp I-Nco I）を、pBSK/Na(V-5’)’もしくはpBSK/151(V-5’)’からSeV: 9593-15384〜T7 RNA polymerase終止配列を切り出して、λDASHII (STRATAGENE)にこの順番でクローニングし直した。この際、9593-15384〜T7 RNA polymerase終止配列にpBSK/Na(V-5’)’からのDNA断片を用いることによってλ/Na151MFを、pBSK/151(V-5’)’からのDNA断片を用いることによってλ/Na151MFLを作製した（図１）。
（２）組換えウイルス作成用ベクターからのセンダイウイルスの再構成
LLCMK2細胞を1 x 106 cells / wellで6-wellプレートに蒔き、24時間培養後T7 RNA polymeraseを発現する弱毒性ワクシニアウイルス（MVAGKT7）をM.O.I.=1.0で1時間、37℃で感染させた。細胞を洗浄した後、上記のλDASHIIにクローニングした組換えウイルス作成用ベクター（センダイウイルス全長cDNA）、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/Lをそれぞれ5μg、2μg、1μg、2μgの量比でOptiMEM（GIBCO） 300μlに懸濁し、10μlのLipofectamine 2000（Invitrogen）を含む300μlのOptiMEMと混合し、20分間室温放置後、細胞に添加して4時間培養した。その後、20% 血清、80μg/μl シトシンアラビノシドC（AraC）を含んだ培地を等量加えてさらに32℃で48時間培養した。
LLCMK2細胞を1 x 106 cells / wellで6-wellプレートに蒔き、24時間培養後T7 RNA polymeraseを発現する弱毒性ワクシニアウイルス（MVAGKT7）をM.O.I.=1.0で1時間、37℃で感染させた。細胞を洗浄した後、上記のλDASHIIにクローニングした組換えウイルス作成用ベクター（センダイウイルス全長cDNA）、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/Lをそれぞれ5μg、2μg、1μg、2μgの量比でOptiMEM（GIBCO） 300μlに懸濁し、10μlのLipofectamine 2000（Invitrogen）を含む300μlのOptiMEMと混合し、20分間室温放置後、細胞に添加して4時間培養した。その後、20% 血清、80μg/μl シトシンアラビノシドC（AraC）を含んだ培地を等量加えてさらに32℃で48時間培養した。
これらの細胞を回収し、ぺレットを500μlのPBSで懸濁し、凍結融解を4回繰り返した。これらを10日間孵卵させた鶏卵に100μl接種し、32℃で5日間孵卵させた後に漿尿液を回収した。ワクシニアフリーにするためにこれら回収した漿尿液をさらに10-4〜10-8希釈して鶏卵に再接種し、同様に回収し、分注して-80℃にストックした。再構成したウイルスのタイターは、組換えセンダイウイルスを含んだ漿尿液に対して赤血球凝集活性を調べることによって確認した。組換えセンダイウイルスを含んだ漿尿液約20 mlを15,000 rpmで30分間遠心し、沈澱をBSSで洗浄した後、1 mlのBSSに懸濁し、ウイルス懸濁液とした。λ/Na151MFから作製した組換えウイルスをrNa151MF、λ/Na151MFLから作製した組換えウイルスをrNa151MFLと名付けた。
〔実施例２〕組換えセンダイウイルスの細胞への持続感染性の確認
CV-1細胞もしくはLLCMK2細胞を12-wellプレートに蒔き、24時間培養後、上記のウイルス懸濁液をM.O.I.=100になるように培地で希釈してウェルに分注し、37℃で感染させた。24時間後、細胞を洗浄した後、ウイルスを含まない培地を加えて37℃で培養しながら感染細胞の生死を観察し、また、細胞への感染をセンダイウイルスに対する抗体を用いて蛍光抗体法で確認した。
CV-1細胞もしくはLLCMK2細胞を12-wellプレートに蒔き、24時間培養後、上記のウイルス懸濁液をM.O.I.=100になるように培地で希釈してウェルに分注し、37℃で感染させた。24時間後、細胞を洗浄した後、ウイルスを含まない培地を加えて37℃で培養しながら感染細胞の生死を観察し、また、細胞への感染をセンダイウイルスに対する抗体を用いて蛍光抗体法で確認した。
図２に示すように、rNa151MF感染CV-1細胞では、感染後４日後くらいには遅れて細胞障害性が現れるのに対し、rNa151MFL感染CV-1細胞ではCl.151株感染CV-1細胞と同様に、細胞障害性が見られなかった。また、rNa151MF感染CV-1細胞では感染１０日後には、感染細胞からのウイルスの顕著な脱落が確認された。さらに、Cl.151株感染CV-1細胞でも感染４５日後には同様の感染の脱落が確認されたことから、感染持続性はrNa151MFL＞Cl.151＞rNa151MFの順になることが明らかになった。このようなCl.151株の感染脱落は、LLCMK2細胞ではほとんど確認されないことから、細胞特異性があると考えられた。 以上の結果から、持続感染にはM、F、Lタンパク質上のCl.151株由来の変異が必要であり、rNa151MFL株はCl.151株よりも安定持続感染するということが明らかになった。
〔実施例３〕外来遺伝子挿入rNa151MFL株の作製（１）外来遺伝子挿入部位の組み込み
pBSK/Na(3’+X+3G)に対し、外来遺伝子挿入部位作製用プライマーとして、5’-GCCAAAGTTCACGCGGCCGCAGATCTTCACGATGGCCGGGTTGT-3’（配列表の配列番号１１（センス鎖））
5’-ACAACCCGGCCATCGTGAAGATCTGCGGCCGCGTGAACTTTGGC-3’
（同配列番号１２（アンチセンス鎖））を用いて、Quikchange Site-directed Mutagenesis II (STRATAGENE) によってNot I 認識配列をSeV: 119の後ろに挿入した（pBSK/Na(3’+Not)）。
pBSK/Na(3’+X+3G)に対し、外来遺伝子挿入部位作製用プライマーとして、5’-GCCAAAGTTCACGCGGCCGCAGATCTTCACGATGGCCGGGTTGT-3’（配列表の配列番号１１（センス鎖））
5’-ACAACCCGGCCATCGTGAAGATCTGCGGCCGCGTGAACTTTGGC-3’
（同配列番号１２（アンチセンス鎖））を用いて、Quikchange Site-directed Mutagenesis II (STRATAGENE) によってNot I 認識配列をSeV: 119の後ろに挿入した（pBSK/Na(3’+Not)）。
（２）外来遺伝子（EGFP遺伝子）の導入
EGFP遺伝子挿入用プライマーとして、
5’-ACTTGCGGCCGCTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’（同配列番号１３（N末端側））
5’-ACTTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTAGACGGCCGCTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’（同配列番号１４（C末端側））の２本のプライマーを用いてpEGFP-C1（Clontech）上からEGFP遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNot Iで切断し、pBSK/Na(3’+Not)のNot I部位に挿入することによって、pBSK/Na(3’+GFP)を得た。
EGFP遺伝子挿入用プライマーとして、
5’-ACTTGCGGCCGCTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’（同配列番号１３（N末端側））
5’-ACTTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTAGACGGCCGCTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’（同配列番号１４（C末端側））の２本のプライマーを用いてpEGFP-C1（Clontech）上からEGFP遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNot Iで切断し、pBSK/Na(3’+Not)のNot I部位に挿入することによって、pBSK/Na(3’+GFP)を得た。
（３）rNa151MFL-GFPの作製
pBSK/Na(3’+X+3G)の代わりに pBSK/Na(3’+GFP)を用いる以外は〔実施例１〕と同様の方法を用いて、λ/Na151MFL-GFP（図１）を作製し、その組換えウイルス作成用ベクターを用いて〔実施例２〕と同様の方法で組換えセンダイウイルス（rNa151MFL-GFP）を作製した。
図３に示すように、rNa151MFL-GFPはCl.151株由来GFP発現センダイウイルス（r151-GFP）と同じように、培養細胞中でGFP遺伝子を持続して発現した。
pBSK/Na(3’+X+3G)の代わりに pBSK/Na(3’+GFP)を用いる以外は〔実施例１〕と同様の方法を用いて、λ/Na151MFL-GFP（図１）を作製し、その組換えウイルス作成用ベクターを用いて〔実施例２〕と同様の方法で組換えセンダイウイルス（rNa151MFL-GFP）を作製した。
図３に示すように、rNa151MFL-GFPはCl.151株由来GFP発現センダイウイルス（r151-GFP）と同じように、培養細胞中でGFP遺伝子を持続して発現した。
〔実施例４〕Lタンパク質点変異組換えセンダイウイルス（rNa151MF(L1618pi)）の作製、持続感染性の確認
pBSK/Na(V-5’)’に対し、Lタンパク質の１６１８番目のロイシンがバリンに変異するように設計した点変異導入用プライマー、5’-GCATACCTATGCAGCGTGGCAGAGATATCT-3’（同配列番号１５（センス鎖））5’-AGATATCTCTGCCACGCTGCATAGGTATGC-3’（同配列番号１６（アンチセンス鎖））を用いて、変異を導入した（pBSK/Na(V-5’;L1618pi)）。
pBSK/Na(V-5’)’の代わりに pBSK/Na(V-5’;L1618pi)を用いる以外は〔実施例１〕と同様の方法を用いて、λ/Na151MF(L1618pi)を作製し、そのcDNAを用いて〔実施例２〕と同様の方法で組換えセンダイウイルス（rNa151MF(L1618pi)）を作製した。
pBSK/Na(V-5’)’に対し、Lタンパク質の１６１８番目のロイシンがバリンに変異するように設計した点変異導入用プライマー、5’-GCATACCTATGCAGCGTGGCAGAGATATCT-3’（同配列番号１５（センス鎖））5’-AGATATCTCTGCCACGCTGCATAGGTATGC-3’（同配列番号１６（アンチセンス鎖））を用いて、変異を導入した（pBSK/Na(V-5’;L1618pi)）。
pBSK/Na(V-5’)’の代わりに pBSK/Na(V-5’;L1618pi)を用いる以外は〔実施例１〕と同様の方法を用いて、λ/Na151MF(L1618pi)を作製し、そのcDNAを用いて〔実施例２〕と同様の方法で組換えセンダイウイルス（rNa151MF(L1618pi)）を作製した。
図４に示すように、rNa151MF(L1618pi)感染細胞においては、感染後４日経過しても、rNa151MFLと同様に細胞障害性は確認されなかった。この結果から、Lタンパク質上の持続感染関連変異は１６１８番目のロイシンがバリンに変わる変異であり、その変異にM、Fタンパク質の変異に加えれば持続感染が成立することを明らかにした。
〔実施例５〕Lタンパク質変異組換えセンダイウイルス（rNa151L, rNa(L1618pi)）の作製
pBSK/Na(3’+X+3G)からT7プロモーター配列〜SeV: 1-2875を、pBSK/Na(E-E)からSeV: 2870-10484（EcoR I-EcoR I）を、pBSK/151(V-5’)’もしくはpBSK/Na(V-5’;L1618pi)からSeV: 10479-15384〜T7 RNA polymerase終止配列を切り出して、λDASHII (STRATAGENE)にこの順番でクローニングし直した。この際、10479-15384〜T7 RNA polymerase終止配列にpBSK/151(V-5’)’からのDNA断片を用いることによってλ/Na151Lを、pBSK/Na(V-5’;L1618pi)からのDNA断片を用いることによってλ/Na(L1618pi)を作製した（図５）。そして、上記の組換えウイルス作成用ベクターを用いて〔実施例２〕と同様の方法で組換えセンダイウイルス（rNa151L, rNa(L1618pi)）を作製した。
pBSK/Na(3’+X+3G)からT7プロモーター配列〜SeV: 1-2875を、pBSK/Na(E-E)からSeV: 2870-10484（EcoR I-EcoR I）を、pBSK/151(V-5’)’もしくはpBSK/Na(V-5’;L1618pi)からSeV: 10479-15384〜T7 RNA polymerase終止配列を切り出して、λDASHII (STRATAGENE)にこの順番でクローニングし直した。この際、10479-15384〜T7 RNA polymerase終止配列にpBSK/151(V-5’)’からのDNA断片を用いることによってλ/Na151Lを、pBSK/Na(V-5’;L1618pi)からのDNA断片を用いることによってλ/Na(L1618pi)を作製した（図５）。そして、上記の組換えウイルス作成用ベクターを用いて〔実施例２〕と同様の方法で組換えセンダイウイルス（rNa151L, rNa(L1618pi)）を作製した。
〔実施例６〕Lタンパク質変異組換えセンダイウイルスの細胞障害性の比較
LLCMK2細胞を96-wellプレートに蒔き、24時間培養後、Cl.151株, rNa151L, rNa(L1618pi), 名古屋株のウイルス懸濁液をM.O.I.=5（Cl.151株の場合はM.O.I.=100）になるように培地で希釈して各ウェルに分注し、37℃で感染させた。24時間後、細胞を洗浄した後、フェノールレッドを含まない培地を加えて37℃でさらに24時間培養し、その後Cell Death Detection Kit (LDH)(Roche)を用いてLactate dehydrogenase（LDH）の放出を指標に、各ウイルスの細胞障害性を比較した。
LLCMK2細胞を96-wellプレートに蒔き、24時間培養後、Cl.151株, rNa151L, rNa(L1618pi), 名古屋株のウイルス懸濁液をM.O.I.=5（Cl.151株の場合はM.O.I.=100）になるように培地で希釈して各ウェルに分注し、37℃で感染させた。24時間後、細胞を洗浄した後、フェノールレッドを含まない培地を加えて37℃でさらに24時間培養し、その後Cell Death Detection Kit (LDH)(Roche)を用いてLactate dehydrogenase（LDH）の放出を指標に、各ウイルスの細胞障害性を比較した。
図６に示すように、名古屋株と比較してrNa151LやrNa(L1618pi)では顕著な細胞障害性の低下が確認された。この結果から、Lタンパク質の変異により、センダイウイルスの細胞障害性が減弱することが明らかになった。ただし、Cl.151株と比較すると、rNa151LやrNa(L1618pi)も細胞障害性が高いことから、Lタンパク質の変異のみでは持続感染が成立しないということも明らかになった。
〔実施例７〕組換えセンダイウイルスによるインターフェロン誘導活性測定
（１）インターフェロン誘導活性測定用レポータープラスミド（pIV3）の作製
pGL3-IFNβ-promoter-luc（京都大学下遠野先生より分与）のヒトインターフェロンβ（IFNβ）のプロモーターを含む配列をpGL4.12（Promega）のKpn I-Hind III間に挿入し、インターフェロン誘導活性測定用レポータープラスミド（pIV3）を得た。
（１）インターフェロン誘導活性測定用レポータープラスミド（pIV3）の作製
pGL3-IFNβ-promoter-luc（京都大学下遠野先生より分与）のヒトインターフェロンβ（IFNβ）のプロモーターを含む配列をpGL4.12（Promega）のKpn I-Hind III間に挿入し、インターフェロン誘導活性測定用レポータープラスミド（pIV3）を得た。
（２）インターフェロン誘導活性測定用細胞株（LLCMK2/pIV3）の樹立
LLCMK2細胞にpIV3とハイグロマイシン耐性遺伝子発現ベクター（pRSVHyg（Roche））をDOTAP transfection regent（Roche）を用いてトランスフェクションし、２日後に細胞をハイグロマイシン40μg/mlを含む培地に移し、ハイグロマイシン耐性細胞を分離した。単離した細胞にセンダイウイルスZ株を感染させることによって、インターフェロン誘導に応じたルシフェラーゼ発現を確認した結果、LLCMK2/pIV3#16細胞（図７）が最も誘導効率が高かったので、以後のインターフェロン誘導活性測定に用いた。
LLCMK2細胞にpIV3とハイグロマイシン耐性遺伝子発現ベクター（pRSVHyg（Roche））をDOTAP transfection regent（Roche）を用いてトランスフェクションし、２日後に細胞をハイグロマイシン40μg/mlを含む培地に移し、ハイグロマイシン耐性細胞を分離した。単離した細胞にセンダイウイルスZ株を感染させることによって、インターフェロン誘導に応じたルシフェラーゼ発現を確認した結果、LLCMK2/pIV3#16細胞（図７）が最も誘導効率が高かったので、以後のインターフェロン誘導活性測定に用いた。
（３）インターフェロン誘導活性測定
上記のLLCMK2/pIV3#16細胞を12-wellプレートに蒔き、24時間培養後、Cl.151株, rNa151L, rNa(L1618pi), 名古屋株のウイルス懸濁液をM.O.I.=5（Cl.151株の場合はM.O.I.=100）になるように培地で希釈してウェルに分注し、37℃で感染させた。感染4, 8, 12, 18, 24, 48時間後に細胞を回収し、Luciferase assay kit (Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。インターフェロン誘導活性は非感染細胞のルシフェラーゼ活性に対する比で表した。
上記のLLCMK2/pIV3#16細胞を12-wellプレートに蒔き、24時間培養後、Cl.151株, rNa151L, rNa(L1618pi), 名古屋株のウイルス懸濁液をM.O.I.=5（Cl.151株の場合はM.O.I.=100）になるように培地で希釈してウェルに分注し、37℃で感染させた。感染4, 8, 12, 18, 24, 48時間後に細胞を回収し、Luciferase assay kit (Promega)を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。インターフェロン誘導活性は非感染細胞のルシフェラーゼ活性に対する比で表した。
図８に示すように、名古屋株感染細胞においてはインターフェロンの発現が強く誘導されるのに対し、rNa151L感染細胞やrNa(L1618pi)感染細胞においては、Cl.151株感染細胞と同様にほとんど発現が誘導されなかった。この結果から、Lタンパク質に変異が入ることによって、インターフェロンの発現誘導が抑制されることが明らかになった。
〔実施例８〕感染細胞中の組換えセンダイウイルス関連RNA分子コピー数の定量
ウイルス由来のRNAとしては図９に示すように、ゲノムRNA、各遺伝子の mRNA、リーダーRNA、ゲノムRNAの３’末端から転写され、リーダーRNA以降までreadthroughして転写されるRNA（アンチゲノムRNA）がある。それらを定量するために以下のようにプローブを作製して定量した。
（１）S１ヌクレアーゼアッセイ用プローブのクローニング
5’-CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGG-3’（同配列番号１７（3’末端側））
5’-CCAAACAGCCATTCTGTGGT-3’（同配列番号１８（5’末端側））の２本のプライマーを用いてpBSK/Na(3’+X+3G)上からSeV: 1-526を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をBamH I、Xba Iで切断し、pBluescript II SK(+) (STRATAGENE)にクローニングした（pBSK/Na(3’-NP)）。pBSK/Na(3’-NP)から切り出したXho I-Nco I断片（SeV: 1-359）をNP mRNA、アンチゲノムRNA用プローブとして使用した。
5’-CGCTCTAGAAGCTGCTGACTCCTGTTTCA-3’（同配列番号１９（3’末端側））
5’-CGCGGATCCATAGCTCAAGGTCCACATCC-3’（同配列番号２０（5’末端側））の２本のプライマーを用いてpBSK/151(V-5’)’上からSeV: 12385-12795を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をBamH I、Xba Iで切断し、pBluescript II SK(+)にクローニングした（pBSK/151(L)）。pBSK/151(L)から切り出したXho I-Spe I断片（SeV: 12471-12795）をゲノムRNA用プローブとして使用した。
ウイルス由来のRNAとしては図９に示すように、ゲノムRNA、各遺伝子の mRNA、リーダーRNA、ゲノムRNAの３’末端から転写され、リーダーRNA以降までreadthroughして転写されるRNA（アンチゲノムRNA）がある。それらを定量するために以下のようにプローブを作製して定量した。
（１）S１ヌクレアーゼアッセイ用プローブのクローニング
5’-CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGG-3’（同配列番号１７（3’末端側））
5’-CCAAACAGCCATTCTGTGGT-3’（同配列番号１８（5’末端側））の２本のプライマーを用いてpBSK/Na(3’+X+3G)上からSeV: 1-526を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をBamH I、Xba Iで切断し、pBluescript II SK(+) (STRATAGENE)にクローニングした（pBSK/Na(3’-NP)）。pBSK/Na(3’-NP)から切り出したXho I-Nco I断片（SeV: 1-359）をNP mRNA、アンチゲノムRNA用プローブとして使用した。
5’-CGCTCTAGAAGCTGCTGACTCCTGTTTCA-3’（同配列番号１９（3’末端側））
5’-CGCGGATCCATAGCTCAAGGTCCACATCC-3’（同配列番号２０（5’末端側））の２本のプライマーを用いてpBSK/151(V-5’)’上からSeV: 12385-12795を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をBamH I、Xba Iで切断し、pBluescript II SK(+)にクローニングした（pBSK/151(L)）。pBSK/151(L)から切り出したXho I-Spe I断片（SeV: 12471-12795）をゲノムRNA用プローブとして使用した。
LLCMK2細胞から抽出した全RNAからSuperScript III First-strand synthesis system for RT-PCR (Invitrogen)による逆転者反応で１本鎖cDNAを作製した。それに対し、5’-CGCGGATCCATCGTGGGGCGCCCCAGGCACCAGGGCGTGAT-3’（同配列番号２１（5’末端側））5’-CGCTCTAGAAGGAGCCACACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGT-3’（同配列番号２２（3’末端側））の２本のプライマーを用いてβ-actin mRNAの127-319を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をBamH I、Xba Iで切断し、pBluescript II SK(+)にクローニングした（pBSK/act）。pBSK/actから切り出したXho I-Bgl II断片（β-actin mRNA: 127-277）をβ-actin RNA用プローブとして使用した。
（２）S１ヌクレアーゼアッセイ LLCMK2細胞にrNa151L, rNa(L1618pi), 名古屋株を感染させ、感染４、８、１２、１８、２４、４８時間後に細胞を回収し、ISOGEN（Nippon Gene）を用いて細胞の全RNAを抽出した。
pBSK/Na(3’-NP)、pBSK/actから切り出したS１ヌクレアーゼアッセイ用プローブの5’末端を[γ-32P]ATPで標識し、2 fmolのNP mRNA用標識プローブ、2 fmolのβ-actin mRNA用標識プローブと5μgの感染細胞全RNAを、10μlのハイブリダイゼーションバッファー(3 M sodium trichloroacetate, 50 mM PIPES-NaOH, 5 mM EDTA，pH 7)中で４５℃の条件下でハイブリダイゼーションさせ、 １６時間後にS1 nucleaseを加えて３７℃で２時間処理した。５％アクリルアミド-８％尿素ゲルでこのS1 nuclease切断産物を分離し、NP mRNA、アンチゲノムRNA、β-actin mRNAに対応するシグナルの強度をSTORM 830（Molecular Dynamics）で定量した。β-actin mRNAのシグナル強度に対するNP mRNA、アンチゲノムRNAのシグナルの強度の比を算出し、各条件について比較した。同様にゲノムRNA用標識プローブとβ-actin mRNA用標識プローブを用いて、β-actin mRNAのシグナル強度に対するゲノムRNAのシグナルの強度の比を算出した。
pBSK/Na(3’-NP)、pBSK/actから切り出したS１ヌクレアーゼアッセイ用プローブの5’末端を[γ-32P]ATPで標識し、2 fmolのNP mRNA用標識プローブ、2 fmolのβ-actin mRNA用標識プローブと5μgの感染細胞全RNAを、10μlのハイブリダイゼーションバッファー(3 M sodium trichloroacetate, 50 mM PIPES-NaOH, 5 mM EDTA，pH 7)中で４５℃の条件下でハイブリダイゼーションさせ、 １６時間後にS1 nucleaseを加えて３７℃で２時間処理した。５％アクリルアミド-８％尿素ゲルでこのS1 nuclease切断産物を分離し、NP mRNA、アンチゲノムRNA、β-actin mRNAに対応するシグナルの強度をSTORM 830（Molecular Dynamics）で定量した。β-actin mRNAのシグナル強度に対するNP mRNA、アンチゲノムRNAのシグナルの強度の比を算出し、各条件について比較した。同様にゲノムRNA用標識プローブとβ-actin mRNA用標識プローブを用いて、β-actin mRNAのシグナル強度に対するゲノムRNAのシグナルの強度の比を算出した。
図９に示すように、NP mRNA、ゲノムRNAについてはrNa151L, rNa(L1618pi), 名古屋株の３株間においてコピー数の変化に大きな違いはないが、アンチゲノムRNAについては、名古屋株と比較してrNa151L, rNa(L1618pi)感染細胞においてコピー数があまり増加していないことが明らかになった。この結果から、Lタンパク質の変異によってアンチゲノムRNAのコピー数が増加しないことがインターフェロン誘導の低下に関与していることが示唆された。
〔実施例９〕ウイルスアンチゲノムRNA転写抑制組換えセンダイウイルスの作製と性質検討
（１）リーダーRNA３’末端への転写終結配列挿入 pBSK/Na(3’+X+3G)に対し、転写終結配列挿入プライマーとして、5’- CACGCTCGAGTAATACGACTCACTATAGGGACCAAACAAGAGAAGAAACATGTATGGAATATATAATGAAGTTTAAGAAAAACTTAGGGTCAAAGTATCC-3’（配列表の配列番号６９（3’末端側））
5’- ACTCCCATGGCGTAACTCCATAGTG-3’（同配列番号７０（5’末端側））２本のプライマーを用いてpBSK/Na(3’+X+3G)上から、leader RNA３’末端に転写終結配列を挿入したSeV: 1-1135を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をXho I、Sph Iで切断し、pBSK/Na(3’-Mp+NN)（後述）の同様の部位にクローニングした（pBSK/Na(3’-NP+EI)）。
（１）リーダーRNA３’末端への転写終結配列挿入 pBSK/Na(3’+X+3G)に対し、転写終結配列挿入プライマーとして、5’- CACGCTCGAGTAATACGACTCACTATAGGGACCAAACAAGAGAAGAAACATGTATGGAATATATAATGAAGTTTAAGAAAAACTTAGGGTCAAAGTATCC-3’（配列表の配列番号６９（3’末端側））
5’- ACTCCCATGGCGTAACTCCATAGTG-3’（同配列番号７０（5’末端側））２本のプライマーを用いてpBSK/Na(3’+X+3G)上から、leader RNA３’末端に転写終結配列を挿入したSeV: 1-1135を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をXho I、Sph Iで切断し、pBSK/Na(3’-Mp+NN)（後述）の同様の部位にクローニングした（pBSK/Na(3’-NP+EI)）。
（２）転写終結配列挿入組換えセンダイウイルス（r(+E)Na）の作製
pBSK/Na(3’-NP+EI)からT7プロモーター配列〜SeV: 1-2875を、pBSK/Na(E-E)からSeV: 2870-10484（EcoR I-EcoR I）を、pBSK/Na(V-5’)からSeV: 10479-15384〜T7 RNA polymerase終止配列を切り出して、λDASHIIにこの順番でクローニングし直した（λ/(+E)Na）（図５）。そして、上記の組換えウイルス作成用ベクターを用いて〔実施例２〕と同様の方法で組換えセンダイウイルス（r(+E)Na）を作製した。
pBSK/Na(3’-NP+EI)からT7プロモーター配列〜SeV: 1-2875を、pBSK/Na(E-E)からSeV: 2870-10484（EcoR I-EcoR I）を、pBSK/Na(V-5’)からSeV: 10479-15384〜T7 RNA polymerase終止配列を切り出して、λDASHIIにこの順番でクローニングし直した（λ/(+E)Na）（図５）。そして、上記の組換えウイルス作成用ベクターを用いて〔実施例２〕と同様の方法で組換えセンダイウイルス（r(+E)Na）を作製した。
（３）S1ヌクレアーゼアッセイによるウイルスRNAの定量
〔実施例８〕と同様な方法で、名古屋株もしくはr(+E)Naが感染したLLCMK2細胞中のNP mRNA、アンチゲノムRNA量を定量した。その結果、NP mRNAの転写開始配列の前に転写終結配列を挿入することによって、アンチゲノムRNAの転写が選択的に抑制されていることが明らかになった（図１０）。
〔実施例８〕と同様な方法で、名古屋株もしくはr(+E)Naが感染したLLCMK2細胞中のNP mRNA、アンチゲノムRNA量を定量した。その結果、NP mRNAの転写開始配列の前に転写終結配列を挿入することによって、アンチゲノムRNAの転写が選択的に抑制されていることが明らかになった（図１０）。
（４）インターフェロン誘導活性測定
〔実施例７〕と同様な方法で、LLCMK2/pIV3#16細胞に名古屋株もしくはr(+E)Naを感染させ、各々のインターフェロン誘導活性を測定した。その結果、アンチゲノムRNA量の低下に伴って、r(+E)Naはインターフェロン誘導活性が低下していることが明らかになった（図１０）。
〔実施例７〕と同様な方法で、LLCMK2/pIV3#16細胞に名古屋株もしくはr(+E)Naを感染させ、各々のインターフェロン誘導活性を測定した。その結果、アンチゲノムRNA量の低下に伴って、r(+E)Naはインターフェロン誘導活性が低下していることが明らかになった（図１０）。
〔実施例１０〕組換えセンダイウイルス作製用ヒト型T7 RNA polymerase発現細胞株の作製（１）ヒト型T7 RNA polymerase発現プラスミド（pIP2）の作製
GenScript Corporation (120 Centennial Ave. Piscataway, NJ 08854, USA)に委託して、原核生物由来のT7 RNA polymerase遺伝子のcDNAについて、アミノ酸配列は変えずにヒト型のコドンを用いるように配列を変換した。上記のヒト型T7 RNA polymerase cDNAをCAGプロモーターの下流にクローニングし直し、ヒト型T7 RNA polymerase発現プラスミド（pIP2）を得た。
GenScript Corporation (120 Centennial Ave. Piscataway, NJ 08854, USA)に委託して、原核生物由来のT7 RNA polymerase遺伝子のcDNAについて、アミノ酸配列は変えずにヒト型のコドンを用いるように配列を変換した。上記のヒト型T7 RNA polymerase cDNAをCAGプロモーターの下流にクローニングし直し、ヒト型T7 RNA polymerase発現プラスミド（pIP2）を得た。
（２）BHK/T7細胞の作製 BHK-21細胞にpIP2とピューロマイシン耐性遺伝子発現ベクター（pRSVpuro）をLipofectamine 2000 を用いてトランスフェクションし、２日後に細胞をピューロマイシン30μg/mlを含む培地に移し、ピューロマイシン耐性細胞を分離した。単離した細胞について抗T7 RNA polymerase抗体を用いて蛍光抗体法でT7 RNA polymeraseの発現を確認し、発現細胞数、発現量ともに高かったBHK/T7#2-4-14-13細胞（図１１）を以後の組換えセンダイウイルスベクター作製用細胞として用いた。
（３）BHK/T7細胞を用いた組換えセンダイウイルス作製
BHK/T7細胞を5 x 105 cells / wellで6-wellプレートに蒔き、24時間培養後細胞を洗浄した後、組換えウイルス作成用ベクター、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/Lをそれぞれ5μg、2μg、1μg、2μgの量比でOptiMEM 300μlに懸濁し、10μlのLipofectamine 2000を含む300μlのOptiMEMと混合し、20分間室温放置後、細胞に添加して4時間培養し、細胞を洗浄した後、10% 血清を含んだDMEM培地を加えてさらに32℃で48時間培養した。
BHK/T7細胞を5 x 105 cells / wellで6-wellプレートに蒔き、24時間培養後細胞を洗浄した後、組換えウイルス作成用ベクター、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/Lをそれぞれ5μg、2μg、1μg、2μgの量比でOptiMEM 300μlに懸濁し、10μlのLipofectamine 2000を含む300μlのOptiMEMと混合し、20分間室温放置後、細胞に添加して4時間培養し、細胞を洗浄した後、10% 血清を含んだDMEM培地を加えてさらに32℃で48時間培養した。
これらの細胞を回収し、ぺレットを500μlのPBSで懸濁し、凍結融解を4回繰り返した。これらを10日間孵卵させた鶏卵に100μl接種し、32℃で5日間孵卵させた後に漿尿液を回収し、分注して-80℃にストックした。再構成したウイルスのタイターは、組換えセンダイウイルスを含んだ漿尿液に対して赤血球凝集活性を調べることによって確認した。
図１２に示したように、従来用いられてきた原核生物由来のT7 RNA polymerase発現細胞BSR-T7-5とBHK/T7細胞を用いて、Z株cDNA（pSeV(+)）からセンダイウイルスを再構成した結果、BSR-T7-5細胞からはワクシニアウイルス（MVAGKT7）感染によってさらにT7 RNA polymeraseの発現を追加しないと再構成ウイルスが回収されないのに対し、BHK/T7細胞からはワクシニアウイルスを感染させなくても再構成ウイルスが回収された。このことから、BHK/T7細胞は従来のT7 RNA polymerase発現細胞よりも再構成効率の良い、組換えセンダイウイルス作製用細胞であることが明らかになった。
図１２に示したように、従来用いられてきた原核生物由来のT7 RNA polymerase発現細胞BSR-T7-5とBHK/T7細胞を用いて、Z株cDNA（pSeV(+)）からセンダイウイルスを再構成した結果、BSR-T7-5細胞からはワクシニアウイルス（MVAGKT7）感染によってさらにT7 RNA polymeraseの発現を追加しないと再構成ウイルスが回収されないのに対し、BHK/T7細胞からはワクシニアウイルスを感染させなくても再構成ウイルスが回収された。このことから、BHK/T7細胞は従来のT7 RNA polymerase発現細胞よりも再構成効率の良い、組換えセンダイウイルス作製用細胞であることが明らかになった。
〔実施例１１〕ブラストサイジン耐性遺伝子発現組換えセンダイウイルスcDNAの作製
（１）pBSK/151(Nhe-Not)の作製
〔実施例３〕と同様の方法でpBSK/151(3’+X+3G)にNot Iサイトを導入して得られたpBSK/151（3'+Not）のNot I サイトの直前５塩基目のＴ、３塩基目Ｃ、２塩基目Aを下記のプライマーを用いてPCRを行うことにより、それぞれＣ、A、Ｇに置換して、Nhe I認識配列の導入を行った。
始めに、M13リバースプライマー5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’（同配列番号２３（N末端側））と
Nhe I認識配列導入用プライマー１；
5’-CTGCGGCCGCGCTAGCTTTGGCAGCAAAGAA-3’（同配列番号２４（C末端側））あるいはNhe I認識配列導入用プライマー２；
5’-AAGCTAGCGCGGCCGCAGATCTTC-3’（同配列番号２５（N末端側））
NP C末側プライマー；
5’-CCGGAATTCGTATGATCCTAGATTCCTCCT-3’（同配列番号２６（C末端側））
の２種類のプライマーセットを用い、pBSK/151(3’+Not)を鋳型として、それぞれPCRを行った。生じたPCR産物を混合し、M13リバースプライマーとNP C末側プライマーとで再度PCRを行い、Nhe I認識配列が導入されたCl.151株の3’DNA断片を得た。このPCR産物を制限酵素Sac Iで切断し、同酵素で切断したpBSK/151(3' +Not)に組み込み、pBSK/151(Nhe-Not)を得た。
（１）pBSK/151(Nhe-Not)の作製
〔実施例３〕と同様の方法でpBSK/151(3’+X+3G)にNot Iサイトを導入して得られたpBSK/151（3'+Not）のNot I サイトの直前５塩基目のＴ、３塩基目Ｃ、２塩基目Aを下記のプライマーを用いてPCRを行うことにより、それぞれＣ、A、Ｇに置換して、Nhe I認識配列の導入を行った。
始めに、M13リバースプライマー5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’（同配列番号２３（N末端側））と
Nhe I認識配列導入用プライマー１；
5’-CTGCGGCCGCGCTAGCTTTGGCAGCAAAGAA-3’（同配列番号２４（C末端側））あるいはNhe I認識配列導入用プライマー２；
5’-AAGCTAGCGCGGCCGCAGATCTTC-3’（同配列番号２５（N末端側））
NP C末側プライマー；
5’-CCGGAATTCGTATGATCCTAGATTCCTCCT-3’（同配列番号２６（C末端側））
の２種類のプライマーセットを用い、pBSK/151(3’+Not)を鋳型として、それぞれPCRを行った。生じたPCR産物を混合し、M13リバースプライマーとNP C末側プライマーとで再度PCRを行い、Nhe I認識配列が導入されたCl.151株の3’DNA断片を得た。このPCR産物を制限酵素Sac Iで切断し、同酵素で切断したpBSK/151(3' +Not)に組み込み、pBSK/151(Nhe-Not)を得た。
（２）pBSK-N/151(E-C+NN)の作製 Cl.151株のSeV: 2870-5335までがクローニングされているベクター、pBSK-N/151(E-C)に対して、M遺伝子開始コドンの前にNhe I、Not I配列が挿入されるように設計した変異導入用プライマー、5’-GAAAGAAATTTCACCGCTAGCGCGGCCGCATGCTAACACGGCGCAATG-3’（同配列番号２７（センス鎖））5’-CATTGCGCCGTGTTAGCATGCGGCCGCGCTAGCGGTGAAATTTCTTTC-3’（同配列番号２８（アンチセンス鎖））を用いて変異を導入した（pBSK-N/151(E-C+NN)）。
（３）センダイウイルスcDNAへのブラストサイジン耐性遺伝子発現カセットの挿入
ブラストサイジン耐性遺伝子挿入用プライマーとして、
5’-ACTAGCTAGCAGAATATATGAAAACATTTAACATTTCTCA-3’（同配列番号２９（N末端側））5’-ACTTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTAGGTAAAACTTTTAATTTCGGGTATATTTGA-3’（同配列番号３０（C末端側））の２本のプライマーを用いてpCX-Bsr（Clontech）上からブラストサイジン耐性遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Not Iで切断し、pBSK/151(Nhe-Not)、pBSK-N/151(E-C+NN)のNhe I-Not I間に挿入することによって、pBSK/151(3’+Bsr)、pBSK-N/151(E-C:Mp+Bsr)を得た。
（３）センダイウイルスcDNAへのブラストサイジン耐性遺伝子発現カセットの挿入
ブラストサイジン耐性遺伝子挿入用プライマーとして、
5’-ACTAGCTAGCAGAATATATGAAAACATTTAACATTTCTCA-3’（同配列番号２９（N末端側））5’-ACTTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTAGGTAAAACTTTTAATTTCGGGTATATTTGA-3’（同配列番号３０（C末端側））の２本のプライマーを用いてpCX-Bsr（Clontech）上からブラストサイジン耐性遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Not Iで切断し、pBSK/151(Nhe-Not)、pBSK-N/151(E-C+NN)のNhe I-Not I間に挿入することによって、pBSK/151(3’+Bsr)、pBSK-N/151(E-C:Mp+Bsr)を得た。
（４）ブラストサイジン耐性遺伝子発現組換えセンダイウイルス作成用ベクターの作製
pBSK-N/151(E-C:Mp+Bsr)のSeV: 5335以降にCl.151株由来のSeV: 5336-10484の配列を挿入してpBSK-N/151(E-E:Mp+Bsr)を作製し、さらに、pBSK-N/151(E-E:Mp+Bsr)のSeV: 6300-10484の配列を名古屋株由来に変えて、pBSK-N/Na151MF(E-E:Mp+Bsr)を得た。 上記のクローニングされたブラストサイジン耐性遺伝子発現カセットを挿入した組換えセンダイウイルスcDNAを用いて、〔実施例１〕と同様の方法で組換えセンダイウイルス作成用ベクター（λ/151-Bsr、λ/151(Mp+Bsr)、λ/Na151(Mp+Bsr)、λ/Na151MFL(Mp+Bsr)）をクローニングした（図１３）。
pBSK-N/151(E-C:Mp+Bsr)のSeV: 5335以降にCl.151株由来のSeV: 5336-10484の配列を挿入してpBSK-N/151(E-E:Mp+Bsr)を作製し、さらに、pBSK-N/151(E-E:Mp+Bsr)のSeV: 6300-10484の配列を名古屋株由来に変えて、pBSK-N/Na151MF(E-E:Mp+Bsr)を得た。 上記のクローニングされたブラストサイジン耐性遺伝子発現カセットを挿入した組換えセンダイウイルスcDNAを用いて、〔実施例１〕と同様の方法で組換えセンダイウイルス作成用ベクター（λ/151-Bsr、λ/151(Mp+Bsr)、λ/Na151(Mp+Bsr)、λ/Na151MFL(Mp+Bsr)）をクローニングした（図１３）。
〔実施例１２〕ブラストサイジンを用いた組換えセンダイウイルス産生細胞選択系の構築
〔実施例１０〕で得られたBHK/T7細胞を5 x 105 cells / wellで6-wellプレートに蒔き、24時間培養後細胞を洗浄した後、組換えセンダイウイルス作成用ベクター、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/Lをそれぞれ5μg、2μg、1μg、2μgの量比でOptiMEM 300μlに懸濁し、10μlのLipofectamine 2000を含む300μlのOptiMEMと混合し、20分間室温放置後、細胞に添加して4時間培養し、細胞を洗浄後10% 血清を含んだDMEM培地を加えてさらに32℃で ３日間培養した。その後、ブラストサイジン１０μg/mlを含む培地に細胞を移して培養を続け、ブラストサイジン耐性細胞を組換えセンダイウイルス産生細胞として分離した。センダイウイルスに対する抗体を用いて蛍光抗体法で染色することにより、組換えセンダイウイルス産生細胞におけるウイルス再構成を確認した。また、ウイルス再構成の効率はブラストサイジン耐性細胞のコロニー数を計測することにより比較した。
〔実施例１０〕で得られたBHK/T7細胞を5 x 105 cells / wellで6-wellプレートに蒔き、24時間培養後細胞を洗浄した後、組換えセンダイウイルス作成用ベクター、pGEM/NP、pGEM/P、pGEM/Lをそれぞれ5μg、2μg、1μg、2μgの量比でOptiMEM 300μlに懸濁し、10μlのLipofectamine 2000を含む300μlのOptiMEMと混合し、20分間室温放置後、細胞に添加して4時間培養し、細胞を洗浄後10% 血清を含んだDMEM培地を加えてさらに32℃で ３日間培養した。その後、ブラストサイジン１０μg/mlを含む培地に細胞を移して培養を続け、ブラストサイジン耐性細胞を組換えセンダイウイルス産生細胞として分離した。センダイウイルスに対する抗体を用いて蛍光抗体法で染色することにより、組換えセンダイウイルス産生細胞におけるウイルス再構成を確認した。また、ウイルス再構成の効率はブラストサイジン耐性細胞のコロニー数を計測することにより比較した。
図１４に示すように、λ/151-Bsr＜λ/151(Mp+Bsr)＜λ/Na151(Mp+Bsr)＜λ/Na151MFL(Mp+Bsr)の順で再構成効率が上昇した。このことから、rNa151MFLを骨格としたcDNAを元にセンダイウイルスベクターを作製した場合が、最も効率良く再構成できるということを明らかにした。
〔実施例１３〕M、F、HN各遺伝子欠損センダイウイルスcDNAの構築
（１）M遺伝子欠損cDNAの作製
pBSK/151(E-C)に対して、Nhe I認識配列導入用プライマーセット、5’-AAAGAAATTTCAGCTAGCACGGCGCAATGG-3’（同配列番号３１（センス鎖））5’-CCATTGCGCCGTGCTAGCTGAAATTTCTTT-3’（同配列番号３２（アンチセンス鎖））、Mlu I認識配列導入用プライマーセット、5’-CTGTAAATGTGCACGCGTCAGAGACCTGCA-3’（同配列番号３３（センス鎖））5’-TGCAGGTCTCTGACGCGTGCACATTTACAG-3’（同配列番号３４（アンチセンス鎖））を用いてNhe I 認識配列をSeV: 3655の後ろに、Mlu I 認識配列をSeV: 4722の後ろに挿入した（pBSK/151(E-C+NM)）。
そして、5’-ACTAGCTAGCAGAATATATGAAAACATTTAACATTTCTCA-3’（同配列番号２９（N末端側））5’-GGTCCACGCGTTTTAATTTCGGGTATATTTGA-3’（同配列番号３５（C末端側））の２本のプライマーを用いてpCX-Bsr上からブラストサイジン耐性遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Mlu Iで切断し、pBSK-N/151(E-C+NN)のNhe I-Mlu I間に挿入することによって、pBSK/151(E-C; ΔM+Bsr)を得た。さらに、pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr) のSeV: 5335以降にSeV: 5336-6299がCl.151株由来、SeV: 6300-10484が名古屋株由来の配列を挿入することによって、pBSK/Na151F(E-E; ΔM+Bsr)を得た。
（１）M遺伝子欠損cDNAの作製
pBSK/151(E-C)に対して、Nhe I認識配列導入用プライマーセット、5’-AAAGAAATTTCAGCTAGCACGGCGCAATGG-3’（同配列番号３１（センス鎖））5’-CCATTGCGCCGTGCTAGCTGAAATTTCTTT-3’（同配列番号３２（アンチセンス鎖））、Mlu I認識配列導入用プライマーセット、5’-CTGTAAATGTGCACGCGTCAGAGACCTGCA-3’（同配列番号３３（センス鎖））5’-TGCAGGTCTCTGACGCGTGCACATTTACAG-3’（同配列番号３４（アンチセンス鎖））を用いてNhe I 認識配列をSeV: 3655の後ろに、Mlu I 認識配列をSeV: 4722の後ろに挿入した（pBSK/151(E-C+NM)）。
そして、5’-ACTAGCTAGCAGAATATATGAAAACATTTAACATTTCTCA-3’（同配列番号２９（N末端側））5’-GGTCCACGCGTTTTAATTTCGGGTATATTTGA-3’（同配列番号３５（C末端側））の２本のプライマーを用いてpCX-Bsr上からブラストサイジン耐性遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Mlu Iで切断し、pBSK-N/151(E-C+NN)のNhe I-Mlu I間に挿入することによって、pBSK/151(E-C; ΔM+Bsr)を得た。さらに、pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr) のSeV: 5335以降にSeV: 5336-6299がCl.151株由来、SeV: 6300-10484が名古屋株由来の配列を挿入することによって、pBSK/Na151F(E-E; ΔM+Bsr)を得た。
（２）HN遺伝子欠損cDNAの作製
pBSK/151(B-E)（Cl.151株由来のSeV: 5913-10484を含む）に対して、Nhe I認識配列導入用プライマーセット、5’-GCGGTATTTTAGCTAGCATCTCAAACAAGC-3’（同配列番号３６（センス鎖））5’-GCTTGTTTGAGATGCTAGCTAAAATACCGC-3’（同配列番号３７（アンチセンス鎖））、Mlu I認識配列導入用プライマーセット5’-TAACTGACTAGCACGCGTGTCGGCTTTGCT-3’（同配列番号３８（センス鎖））5’-AGCAAAGCCGACACGCGTGCTAGTCAGTTA-3’（同配列番号３９（アンチセンス鎖））を用いてNhe I 認識配列をSeV: 3655の後ろに、Mlu I 認識配列をSeV: 4722の後ろに挿入した（pBSK/151(B-E+NM)）。M遺伝子欠損の場合と同様にNhe I-Mlu I間にブラストサイジン耐性遺伝子を挿入後、SeV: 6303以前にCl.151株由来のSeV: 2871-6303の配列を加えて、pBSK/151(E-E; ΔHN+Bsr)を得た。
pBSK/151(B-E)（Cl.151株由来のSeV: 5913-10484を含む）に対して、Nhe I認識配列導入用プライマーセット、5’-GCGGTATTTTAGCTAGCATCTCAAACAAGC-3’（同配列番号３６（センス鎖））5’-GCTTGTTTGAGATGCTAGCTAAAATACCGC-3’（同配列番号３７（アンチセンス鎖））、Mlu I認識配列導入用プライマーセット5’-TAACTGACTAGCACGCGTGTCGGCTTTGCT-3’（同配列番号３８（センス鎖））5’-AGCAAAGCCGACACGCGTGCTAGTCAGTTA-3’（同配列番号３９（アンチセンス鎖））を用いてNhe I 認識配列をSeV: 3655の後ろに、Mlu I 認識配列をSeV: 4722の後ろに挿入した（pBSK/151(B-E+NM)）。M遺伝子欠損の場合と同様にNhe I-Mlu I間にブラストサイジン耐性遺伝子を挿入後、SeV: 6303以前にCl.151株由来のSeV: 2871-6303の配列を加えて、pBSK/151(E-E; ΔHN+Bsr)を得た。
（３）F遺伝子欠損cDNAの作製
pBSK/151(E-A)（Cl.151株由来のSeV: 2871-7000を含む）に対して、Bgl II認識配列導入用プライマーセット、5’-GGGATAAAGTCCCTTAGATCTGCTTGGTTGCAAAA-3’（同配列番号４０（センス鎖））5’-TTTTGCAACCAAGCAGATCTAAGGGACTTTATCCC-3’（同配列番号４１（アンチセンス鎖））を用いてBgl II認識配列をSeV: 3655の後ろに挿入した（pBSK/151(E-A+Bgl)）。
そして、5’-CGCGGATCCGAAGAATATATGAAAACATT-3’（同配列番号４２（N末端側））5’-CGCGGATCCTTAATTTCGGGTATATTTGA-3’（同配列番号４３（C末端側））の２本のプライマーを用いてpCX-Bsr上からブラストサイジン耐性遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をBamH Iで切断し、pBSK/151(E-A+Bgl)のBgl II-Bgl II間（SeV: 3655-6612）に挿入することによって、pBSK/151(E-A; ΔF+Bsr)を得た。さらにSeV: 6303以降にCl.151株由来のSeV: 6304-10484の配列を加えて、pBSK/151(E-E; ΔF+Bsr)を得た。
pBSK/151(E-A)（Cl.151株由来のSeV: 2871-7000を含む）に対して、Bgl II認識配列導入用プライマーセット、5’-GGGATAAAGTCCCTTAGATCTGCTTGGTTGCAAAA-3’（同配列番号４０（センス鎖））5’-TTTTGCAACCAAGCAGATCTAAGGGACTTTATCCC-3’（同配列番号４１（アンチセンス鎖））を用いてBgl II認識配列をSeV: 3655の後ろに挿入した（pBSK/151(E-A+Bgl)）。
そして、5’-CGCGGATCCGAAGAATATATGAAAACATT-3’（同配列番号４２（N末端側））5’-CGCGGATCCTTAATTTCGGGTATATTTGA-3’（同配列番号４３（C末端側））の２本のプライマーを用いてpCX-Bsr上からブラストサイジン耐性遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をBamH Iで切断し、pBSK/151(E-A+Bgl)のBgl II-Bgl II間（SeV: 3655-6612）に挿入することによって、pBSK/151(E-A; ΔF+Bsr)を得た。さらにSeV: 6303以降にCl.151株由来のSeV: 6304-10484の配列を加えて、pBSK/151(E-E; ΔF+Bsr)を得た。
（４）組換えセンダイウイルス作成用ベクターの構築
上記の各遺伝子欠損型cDNAを用いて、〔実施例１〕と同様の方法で組換えセンダイウイルス作成用ベクター（λ/Na151FL(ΔM+Bsr)、λ/Na151(ΔF+Bsr)、λ/Na151(ΔHN+Bsr)）をクローニングした（図１４）。
上記の各遺伝子欠損型cDNAを用いて、〔実施例１〕と同様の方法で組換えセンダイウイルス作成用ベクター（λ/Na151FL(ΔM+Bsr)、λ/Na151(ΔF+Bsr)、λ/Na151(ΔHN+Bsr)）をクローニングした（図１４）。
〔実施例１４〕M、F、HN各遺伝子発現プラスミドの構築
5’-CCGGAATTCGGCGCAATGGCAGATATCTA-3’（同配列番号４４（N末端側））
5’-ACTTGCGGCCGCGGTGCACATTTACAGCTTTC-3’（同配列番号４５（C末端側））の２本のプライマーを用いてpBSK/Na(E-E)もしくはpBSK/151(E-E)からM遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をEcoR I、Not Iで切断し、pMKIT-neoのEcoR I-Not I間に挿入してMタンパク質発現プラスミド（pMKIT-NaM 、pMKIT-151M）を得た。
同様に、5’-CCGGAATTCGAAACATGACAGCATATATC-3’（同配列番号４６（N末端側））
5’-ACTTGCGGCCGCGTCGTGATCATCTTTTCT -3’（同配列番号４７（C末端側））の２本のプライマーを用いてF遺伝子を増幅し、Fタンパク質発現プラスミド（pMKIT-NaF 、pMKIT-151F）を得た。
さらに、5’-CCGGAATTCTCATGGATGGTGATAGGGGC-3’（同配列番号４８（N末端側））
5’-ACTTGCGGCCGCTTAAGACTCGGCCTTGCA-3’（同配列番号４９（C末端側））の２本のプライマーを用いてHN遺伝子を増幅し、HNタンパク質発現プラスミド（pMKIT-NaHN、pMKIT-151HN）を得た。
5’-CCGGAATTCGGCGCAATGGCAGATATCTA-3’（同配列番号４４（N末端側））
5’-ACTTGCGGCCGCGGTGCACATTTACAGCTTTC-3’（同配列番号４５（C末端側））の２本のプライマーを用いてpBSK/Na(E-E)もしくはpBSK/151(E-E)からM遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をEcoR I、Not Iで切断し、pMKIT-neoのEcoR I-Not I間に挿入してMタンパク質発現プラスミド（pMKIT-NaM 、pMKIT-151M）を得た。
同様に、5’-CCGGAATTCGAAACATGACAGCATATATC-3’（同配列番号４６（N末端側））
5’-ACTTGCGGCCGCGTCGTGATCATCTTTTCT -3’（同配列番号４７（C末端側））の２本のプライマーを用いてF遺伝子を増幅し、Fタンパク質発現プラスミド（pMKIT-NaF 、pMKIT-151F）を得た。
さらに、5’-CCGGAATTCTCATGGATGGTGATAGGGGC-3’（同配列番号４８（N末端側））
5’-ACTTGCGGCCGCTTAAGACTCGGCCTTGCA-3’（同配列番号４９（C末端側））の２本のプライマーを用いてHN遺伝子を増幅し、HNタンパク質発現プラスミド（pMKIT-NaHN、pMKIT-151HN）を得た。
また、Z株のFタンパク質遺伝子を組み込んだプラスミドpUC-Fを鋳型にして、
5’-GGGCTTGGGAAACATGACAGC-3’（同配列番号５０（N末端側））
5’-GAAGAATCTCTTCTGGCGACGACCGGC-3’（同配列番号５１（C末端側））の２本のプライマーを用いて、１１２番目から１１６番目のアミノ酸（APQSR）をRRQKRに変換したFZ遺伝子のN末側のPCR産物を得た。このPCR産物をN末側のプライマーとして、pUC-Fを鋳型にC末側プライマー
5’-GACATCCTGATAATGGTCGTGATC
-3’（同配列番号５２（C末端側））とで開裂型Fタンパク質遺伝子を増幅し、EcoRI部位を平滑化発現プラスミドpSRDに組み込み開裂型Fタンパク質発現プラスミド（pSRD-FZmut）を得た。
5’-GGGCTTGGGAAACATGACAGC-3’（同配列番号５０（N末端側））
5’-GAAGAATCTCTTCTGGCGACGACCGGC-3’（同配列番号５１（C末端側））の２本のプライマーを用いて、１１２番目から１１６番目のアミノ酸（APQSR）をRRQKRに変換したFZ遺伝子のN末側のPCR産物を得た。このPCR産物をN末側のプライマーとして、pUC-Fを鋳型にC末側プライマー
5’-GACATCCTGATAATGGTCGTGATC
-3’（同配列番号５２（C末端側））とで開裂型Fタンパク質遺伝子を増幅し、EcoRI部位を平滑化発現プラスミドpSRDに組み込み開裂型Fタンパク質発現プラスミド（pSRD-FZmut）を得た。
〔実施例１５〕ブラストサイジンを用いた欠損型組換えセンダイウイルス産生細胞の分離
〔実施例１３〕で得られた組換えセンダイウイルス作成用ベクターから、〔実施例１２〕と同様な方法で欠損型組換えセンダイウイルスを作製した。この際、〔実施例１４〕で作製した欠損遺伝子発現プラスミドを同時にトランスフェクションした。（図１６）
図１７に示すように、M、F、HN各遺伝子について欠損型組換えセンダイウイルス産生細胞の分離に成功した。また、ウイルス産生細胞はブラストサイジン添加培地中で２ヶ月間生育したことから、これらの欠損型組換えセンダイウイルスは持続感染能を維持しているということが明らかになった。
〔実施例１３〕で得られた組換えセンダイウイルス作成用ベクターから、〔実施例１２〕と同様な方法で欠損型組換えセンダイウイルスを作製した。この際、〔実施例１４〕で作製した欠損遺伝子発現プラスミドを同時にトランスフェクションした。（図１６）
図１７に示すように、M、F、HN各遺伝子について欠損型組換えセンダイウイルス産生細胞の分離に成功した。また、ウイルス産生細胞はブラストサイジン添加培地中で２ヶ月間生育したことから、これらの欠損型組換えセンダイウイルスは持続感染能を維持しているということが明らかになった。
〔実施例１６〕欠損型組換えセンダイウイルスの回収、感染
〔実施例１５〕で得られた欠損型組換えセンダイウイルス産生細胞に〔実施例１４〕で作製した欠損遺伝子発現プラスミドをLipofectamine 2000を用いてトランスフェクションし、24時間後に細胞を洗浄した後、10%血清を含んだDMEM培地を加えてさらに32℃で３日間培養した。その後、培養上清を回収し、0.45μmのフィルターで濾過後、7.5μg/mlのトリプシンを加えて、新たな標的細胞の培地に加え、32℃で２日間培養した。その後、ブラストサイジン10μg/mlを含む培地に細胞を移して培養を続け、ブラストサイジン耐性細胞を組換えセンダイウイルス導入細胞として分離した（図１６）。培養上清中の欠損型組換えセンダイウイルスのタイターは、ブラストサイジン耐性細胞のコロニー数を計測することにより比較した。
〔実施例１５〕で得られた欠損型組換えセンダイウイルス産生細胞に〔実施例１４〕で作製した欠損遺伝子発現プラスミドをLipofectamine 2000を用いてトランスフェクションし、24時間後に細胞を洗浄した後、10%血清を含んだDMEM培地を加えてさらに32℃で３日間培養した。その後、培養上清を回収し、0.45μmのフィルターで濾過後、7.5μg/mlのトリプシンを加えて、新たな標的細胞の培地に加え、32℃で２日間培養した。その後、ブラストサイジン10μg/mlを含む培地に細胞を移して培養を続け、ブラストサイジン耐性細胞を組換えセンダイウイルス導入細胞として分離した（図１６）。培養上清中の欠損型組換えセンダイウイルスのタイターは、ブラストサイジン耐性細胞のコロニー数を計測することにより比較した。
図１８に示すように、欠損型組換えセンダイウイルスは産生細胞培養上清から回収が可能であり、他の細胞、組織に感染可能であることが明らかになった。また、発現プラスミドから欠損遺伝子を補わない限りウイルスは産生されないことから、欠損型組換えセンダイウイルスは非伝播性であるということが明らかになった。
〔実施例１７〕外来遺伝子挿入M遺伝子欠損センダイウイルスベクターの作製
（１）外来遺伝子挿入部位の組み込み
pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr)のSeV: 3655に挿入したNhe I認識配列の直前に、5’-AGGGTGAAAGAAATGCGGCCGCTTGCTAGCAGAATATA-3’（同配列番号５３（センス鎖））
5’-TATATTCTGCTAGCAAGCGGCCGCATTTCTTTCACCCT-3’（同配列番号５４（アンチセンス鎖））を用いてNot I 認識配列を挿入した（pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not)）。さらに、pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not) のSeV: 5335以降にSeV: 5336-6299がCl.151株由来、SeV: 6300-10484が名古屋株由来の配列を挿入することによって、pBSK/Na151F(E-E; ΔM+Bsr;Mp+Not)を得た。
（１）外来遺伝子挿入部位の組み込み
pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr)のSeV: 3655に挿入したNhe I認識配列の直前に、5’-AGGGTGAAAGAAATGCGGCCGCTTGCTAGCAGAATATA-3’（同配列番号５３（センス鎖））
5’-TATATTCTGCTAGCAAGCGGCCGCATTTCTTTCACCCT-3’（同配列番号５４（アンチセンス鎖））を用いてNot I 認識配列を挿入した（pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not)）。さらに、pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not) のSeV: 5335以降にSeV: 5336-6299がCl.151株由来、SeV: 6300-10484が名古屋株由来の配列を挿入することによって、pBSK/Na151F(E-E; ΔM+Bsr;Mp+Not)を得た。
（２）EGFP遺伝子の挿入
pBSK/Na(3’+X+3G)のSeV: 1-2871（Xho I 〜 EcoR I）とpBSK-N/151(E-C+NN)のSeV: 2871-3655（EcoR I 〜 Not I）をつなぎ合わせてpBSK/Na(3’-Mp+NN)を得た。
EGFP遺伝子挿入用プライマーとして、
5’-ACTAGCTAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG-3’（同配列番号５５（N末端側））5’-ACTTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTAGACGGCCGCTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’（同配列番号１４（C末端側））の２本のプライマーを用いてpEGFP-C1上からEGFP遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Not Iで切断し、pBSK/Na(3’-Mp+NN)のNhe I-Not I間に挿入することによって、pBSK/Na(3’-Mp+GFP)を得た。
pBSK/Na(3’+X+3G)のSeV: 1-2871（Xho I 〜 EcoR I）とpBSK-N/151(E-C+NN)のSeV: 2871-3655（EcoR I 〜 Not I）をつなぎ合わせてpBSK/Na(3’-Mp+NN)を得た。
EGFP遺伝子挿入用プライマーとして、
5’-ACTAGCTAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG-3’（同配列番号５５（N末端側））5’-ACTTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTAGACGGCCGCTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’（同配列番号１４（C末端側））の２本のプライマーを用いてpEGFP-C1上からEGFP遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Not Iで切断し、pBSK/Na(3’-Mp+NN)のNhe I-Not I間に挿入することによって、pBSK/Na(3’-Mp+GFP)を得た。
（３）組換えセンダイウイルス作成用ベクターの構築
以上によって得られた各プラスミドのうち、pBSK/Na(3’-Mp+GFP)からT7プロモーター配列〜SeV: 1- 3655+GFP（Xho I 〜 Not I）を、pBSK/Na151F(E-E;DM+Bsr;Mp+Not)からSeV: 3655-10484（Not I - EcoRI）を、pBSK/151(V-5’)’からSeV: 10480-15384〜T7 RNA polymerase終止配列を切り出して、λDASHII にこの順番でクローニングし、λ/Na151FL(ΔM+Bsr;Mp+GFP)を得た。（図２１）。
以上によって得られた各プラスミドのうち、pBSK/Na(3’-Mp+GFP)からT7プロモーター配列〜SeV: 1- 3655+GFP（Xho I 〜 Not I）を、pBSK/Na151F(E-E;DM+Bsr;Mp+Not)からSeV: 3655-10484（Not I - EcoRI）を、pBSK/151(V-5’)’からSeV: 10480-15384〜T7 RNA polymerase終止配列を切り出して、λDASHII にこの順番でクローニングし、λ/Na151FL(ΔM+Bsr;Mp+GFP)を得た。（図２１）。
（４）組換えセンダイウイルス作成用ベクターからのウイルスベクター再構成
〔実施例１５〕と同様な方法でλ/Na151FL(ΔM+Bsr;Mp+GFP)から欠損型組換えセンダイウイルス（rNa151FL(ΔM+Bsr;Mp+GFP)）を作製し、さらに得られたベクター産生細胞から〔実施例１６〕と同様な方法で、ベクターの回収、感染を行った。
図１９に示すように、M遺伝子欠損、EGFP発現非伝播型センダイウイルスベクターは作製可能であり、他細胞に感染させてもEGFP遺伝子を持続的に発現し続けるということを明らかにした。
〔実施例１５〕と同様な方法でλ/Na151FL(ΔM+Bsr;Mp+GFP)から欠損型組換えセンダイウイルス（rNa151FL(ΔM+Bsr;Mp+GFP)）を作製し、さらに得られたベクター産生細胞から〔実施例１６〕と同様な方法で、ベクターの回収、感染を行った。
図１９に示すように、M遺伝子欠損、EGFP発現非伝播型センダイウイルスベクターは作製可能であり、他細胞に感染させてもEGFP遺伝子を持続的に発現し続けるということを明らかにした。
〔実施例１８〕複数遺伝子欠損組換えセンダイウイルスの作製（１）M、F遺伝子欠損cDNAの作製
5’-ACGAAGATCTCCGGTCGCCACCATGGTGAG-3’（同配列番号５６（N末端側））5’-ACGAAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’（同配列番号５７（C末端側））の２本のプライマーを用いてpEGFP-C1上から増幅し、Bgl IIで切断したEGFP遺伝子をpBSK/151(E-E;ΔF+Bsr)のブラストサイジン耐性遺伝子の代わりに挿入した（pBSK/151(E-E;ΔF+GFP)）。
pBSK/151(E-E;ΔF+GFP)に対して、Mlu I認識配列導入用プライマーセット5’-CTGTAAATGTGCACGCGTCAGAGACCTGCA-3’（同配列番号３３（センス鎖））
5’-TGCAGGTCTCTGACGCGTGCACATTTACAG-3’（同配列番号３４（アンチセンス鎖））を用いてMlu I 認識配列をSeV: 4722の後ろに挿入した（pBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+Mlu)）。そして、pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr)のSeV: 2871-4722（EcoR I 〜 Mlu I）とpBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+Mlu) のSeV: 4722-10480（Mlu I 〜 EcoR I）をつなぎ合わせて、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr; ΔF+GFP)を得た。
5’-ACGAAGATCTCCGGTCGCCACCATGGTGAG-3’（同配列番号５６（N末端側））5’-ACGAAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’（同配列番号５７（C末端側））の２本のプライマーを用いてpEGFP-C1上から増幅し、Bgl IIで切断したEGFP遺伝子をpBSK/151(E-E;ΔF+Bsr)のブラストサイジン耐性遺伝子の代わりに挿入した（pBSK/151(E-E;ΔF+GFP)）。
pBSK/151(E-E;ΔF+GFP)に対して、Mlu I認識配列導入用プライマーセット5’-CTGTAAATGTGCACGCGTCAGAGACCTGCA-3’（同配列番号３３（センス鎖））
5’-TGCAGGTCTCTGACGCGTGCACATTTACAG-3’（同配列番号３４（アンチセンス鎖））を用いてMlu I 認識配列をSeV: 4722の後ろに挿入した（pBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+Mlu)）。そして、pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr)のSeV: 2871-4722（EcoR I 〜 Mlu I）とpBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+Mlu) のSeV: 4722-10480（Mlu I 〜 EcoR I）をつなぎ合わせて、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr; ΔF+GFP)を得た。
（２）F、HN遺伝子欠損cDNAの作製
pBSK/151(E-E; ΔF+GFP)に対して、Nhe I認識配列導入用プライマーセット5’-GCGGTATTTTAGCTAGCATCTCAAACAAGC-3’（同配列番号３６（センス鎖））5’-GCTTGTTTGAGATGCTAGCTAAAATACCGC-3’（同配列番号３７（アンチセンス鎖））を用いてNhe I 認識配列をSeV: 6667の後ろに挿入した（pBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+Nhe)）。そして、pBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+Nhe)のSeV: 2871-6667（EcoR I 〜 Nhe I）とpBSK/151(E-E;ΔHN+Bsr) のSeV: 6667-10480（Nhe I 〜 EcoR I）をつなぎ合わせて、pBSK/151(E-E;ΔF+GFP;ΔHN+Bsr)を得た。
pBSK/151(E-E; ΔF+GFP)に対して、Nhe I認識配列導入用プライマーセット5’-GCGGTATTTTAGCTAGCATCTCAAACAAGC-3’（同配列番号３６（センス鎖））5’-GCTTGTTTGAGATGCTAGCTAAAATACCGC-3’（同配列番号３７（アンチセンス鎖））を用いてNhe I 認識配列をSeV: 6667の後ろに挿入した（pBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+Nhe)）。そして、pBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+Nhe)のSeV: 2871-6667（EcoR I 〜 Nhe I）とpBSK/151(E-E;ΔHN+Bsr) のSeV: 6667-10480（Nhe I 〜 EcoR I）をつなぎ合わせて、pBSK/151(E-E;ΔF+GFP;ΔHN+Bsr)を得た。
（３）M、HN遺伝子欠損cDNAの作製
5’-ACTAGCTAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG-3’（同配列番号５５（N末端側））5’-GGTCCACGCGTTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’（同配列番号５８（C末端側））の２本のプライマーを用いてpEGFP-C1上からEGFP遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Mlu Iで切断し、pBSK/151(E-E;ΔHN+Bsr)のNhe I-Mlu I間に挿入することによって、pBSK/151(E-E;ΔHN+GFP)を得た。そして、pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not)のSeV: 2871-5335（EcoR I 〜 Cla I）とpBSK/151(E-E;ΔHN+GFP)のSeV: 5335-10480（Cla I 〜 EcoR I）をつなぎ合わせて、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔHN+GFP)を得た。
5’-ACTAGCTAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCG-3’（同配列番号５５（N末端側））5’-GGTCCACGCGTTTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’（同配列番号５８（C末端側））の２本のプライマーを用いてpEGFP-C1上からEGFP遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Mlu Iで切断し、pBSK/151(E-E;ΔHN+Bsr)のNhe I-Mlu I間に挿入することによって、pBSK/151(E-E;ΔHN+GFP)を得た。そして、pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not)のSeV: 2871-5335（EcoR I 〜 Cla I）とpBSK/151(E-E;ΔHN+GFP)のSeV: 5335-10480（Cla I 〜 EcoR I）をつなぎ合わせて、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔHN+GFP)を得た。
（４）M、F、HN遺伝子欠損cDNAの作製
pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not)に対し、
5’-AAATGCGGCCGCTTGGCGCCAGAATATATGAAAA-3’（同配列番号５９（センス鎖））5’-TTTTCATATATTCTGGCGCCAAGCGGCCGCATTT-3’（同配列番号６０（アンチセンス鎖））を用いてNhe I 認識配列をKas I認識配列に変換した（pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not;N-K)）。
pBSK/151(E-E;ΔHN+Bsr)に対し、5’-TACCCGAAATTAAAGCATGCGTCGGCTTTGCTGA-3’（同配列番号６１（センス鎖））
5’-TCAGCAAAGCCGACGCATGCTTTAATTTCGGGTA-3’（同配列番号６２（アンチセンス鎖））を用いてMlu I 認識配列をSph I認識配列に変換した（pBSK/151(E-E; ΔHN+Bsr;M-S)）。
pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not)に対し、
5’-AAATGCGGCCGCTTGGCGCCAGAATATATGAAAA-3’（同配列番号５９（センス鎖））5’-TTTTCATATATTCTGGCGCCAAGCGGCCGCATTT-3’（同配列番号６０（アンチセンス鎖））を用いてNhe I 認識配列をKas I認識配列に変換した（pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not;N-K)）。
pBSK/151(E-E;ΔHN+Bsr)に対し、5’-TACCCGAAATTAAAGCATGCGTCGGCTTTGCTGA-3’（同配列番号６１（センス鎖））
5’-TCAGCAAAGCCGACGCATGCTTTAATTTCGGGTA-3’（同配列番号６２（アンチセンス鎖））を用いてMlu I 認識配列をSph I認識配列に変換した（pBSK/151(E-E; ΔHN+Bsr;M-S)）。
5’-ACTAGCTAGCCCTTATGAAGACCTTAATTCTTGC-3’（同配列番号６３（N末端側））5’-GGTCCGCATGCTCTATTTGCATTCATCTGGTACT-3’（同配列番号６４（C末端側））の２本のプライマーを用いてpCLm（ATTO）上から分泌ルシフェラーゼ遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Sph Iで切断し、pBSK/151(E-E;ΔHN+Bsr;M-S)のNhe I-Sph I間に挿入することによって、pBSK/151(E-E;ΔHN+Cluc)を得た。
pBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+Nhe)に対し、
5’-CTGTAAATGTGCACGCGTCAGAGACCTGCA-3’（同配列番号３３（センス鎖））5’-TGCAGGTCTCTGACGCGTGCACATTTACAG-3’（同配列番号３４（アンチセンス鎖））を用いてMlu I 認識配列をSeV: 4722の後ろに挿入した（pBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+MN)）。
pBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+Nhe)に対し、
5’-CTGTAAATGTGCACGCGTCAGAGACCTGCA-3’（同配列番号３３（センス鎖））5’-TGCAGGTCTCTGACGCGTGCACATTTACAG-3’（同配列番号３４（アンチセンス鎖））を用いてMlu I 認識配列をSeV: 4722の後ろに挿入した（pBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+MN)）。
上記のプラスミドから、pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not;N-K)のSeV: 2871-4722（EcoR I 〜 Mlu I）とpBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+MN)のSeV: 4722-6667（Mlu I 〜 Nhe I）、pBSK/151(E-E;ΔHN+Cluc)のSeV: 6667-10484（Nhe I 〜 EcoR I）をつなぎ合わせて、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+Cluc)を得た。
（５）組換えセンダイウイルス作成用ベクターの構築
上記の各遺伝子欠損型cDNAを用いて、〔実施例１〕と同様の方法でセンダイウイルス全長cDNA（λ/Na151(ΔM+Bsr;ΔF+GFP)、λ/Na151(ΔF+GFP;ΔHN+Bsr)、λ/Na151(ΔM+Bsr;ΔHN+GFP)、λ/Na151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+Cluc)）をクローニングした（図２０）。
（６）組換えセンダイウイルス作成用ベクターからの組換えセンダイウイルス再構成
上記の各遺伝子欠損型cDNAを用いて、〔実施例１〕と同様の方法でセンダイウイルス全長cDNA（λ/Na151(ΔM+Bsr;ΔF+GFP)、λ/Na151(ΔF+GFP;ΔHN+Bsr)、λ/Na151(ΔM+Bsr;ΔHN+GFP)、λ/Na151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+Cluc)）をクローニングした（図２０）。
（６）組換えセンダイウイルス作成用ベクターからの組換えセンダイウイルス再構成
〔実施例１５〕と同様な方法で上記の組換えセンダイウイルス作成用ベクターから欠損型組換えセンダイウイルス（rNa151(ΔM+Bsr;ΔF+GFP)、rNa151(ΔF+GFP;ΔHN+Bsr)、rNa151(ΔM+Bsr;ΔHN+GFP) 、rNa151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+Cluc)）を作製し、さらに得られたベクター産生細胞から〔実施例１６〕と同様な方法で、ベクターの回収、感染を行った。
図２２に示すように、いずれの複数遺伝子欠損型組換えセンダイウイルスも作製可能であり、欠損遺伝子をウイルス産生細胞に補うことにより、他細胞への感染も可能であるということが明らかになった。
〔実施例１９〕複数遺伝子欠損組換えセンダイウイルスの感染持続性の確認
〔実施例１８〕で得られた複数遺伝子欠損組換えセンダイウイルスをLLCMK2細胞、CV-1細胞、HL60細胞に感染させ、ブラストサイジン添加条件下で約２週間培養した後、ブラストサイジン耐性複数遺伝子欠損組換えセンダイウイルス導入細胞を、ブラストサイジン添加、非添加の両条件下で培養した。ブラストサイジン非添加培養開始から、図２３に示す日に細胞を分離し、センダイウイルスに対する抗体を用いて、蛍光抗体法でセンダイウイルスの感染を確認し、顕微鏡観察視野中の全細胞に対する組換えセンダイウイルス感染細胞数の割合を算出した。
〔実施例１８〕で得られた複数遺伝子欠損組換えセンダイウイルスをLLCMK2細胞、CV-1細胞、HL60細胞に感染させ、ブラストサイジン添加条件下で約２週間培養した後、ブラストサイジン耐性複数遺伝子欠損組換えセンダイウイルス導入細胞を、ブラストサイジン添加、非添加の両条件下で培養した。ブラストサイジン非添加培養開始から、図２３に示す日に細胞を分離し、センダイウイルスに対する抗体を用いて、蛍光抗体法でセンダイウイルスの感染を確認し、顕微鏡観察視野中の全細胞に対する組換えセンダイウイルス感染細胞数の割合を算出した。
その結果図２３に示すように、ブラストサイジン非添加の条件下でも、大部分の遺伝子欠損組換えセンダイウイルスは非欠損型と比較して持続感染性に大きな変化はなかった。ただ、HN遺伝子にブラストサイジン耐性遺伝子を挿入した組換えセンダイウイルス（rNa151(ΔHN+Bsr)、rNa151(ΔF+GFP;ΔHN+Bsr)）は持続感染性が低下する傾向が見られた。
この結果から、基本的に遺伝子を欠損させても持続感染能は維持されているということが明らかになり、逆に、ゲノムが脱落しやすい構造を元にベクター設計をすることにより、ある程度の期間持続発現させた後にゲノムが脱落して外来遺伝子発現が消失するという、発現持続性を調節した持続感染型センダイウイルスベクターの作製も可能であることが予想された。
また、ブラストサイジン添加の条件下では、いずれの遺伝子欠損組換えセンダイウイルスもすべての細胞に持続感染していた。
また、ブラストサイジン添加の条件下では、いずれの遺伝子欠損組換えセンダイウイルスもすべての細胞に持続感染していた。
〔実施例２０〕複数遺伝子欠損組換えセンダイウイルス感染細胞からのウイルス様粒子放出量の定量
〔実施例１５〕、〔実施例１８〕で得られた欠損型組換えセンダイウイルス産生細胞を３２℃で ３日間培養し、その培養上清を回収した。回収した上清を0.1% Triton X-100で処理した後に5% skim milk/PBSで希釈し、ウサギ抗センダイウイルス抗体でコーティングした96-well plateに加えた。室温で１時間放置した後にPBSで４回洗浄し、HRP結合マウス抗センダイウイルスNPタンパク質抗体を加えた。さらに室温で１時間放置した後に、PBSで４回洗浄し、TMBによって発色させた。既知の量のセンダイウイルス粒子を用いて検量線を作製し、それを元に培養上清中のウイルス粒子数を算出した。
その結果、図２４に示すように、M、F、HN遺伝子を単独で欠損させた組換えセンダイウイルスからはウイルス粒子が放出されていることが明らかとなった。なお、〔実施例１６〕で示したようにこれらの粒子は感染性が無いことから、ウイルス様粒子（VLP）であると考えられた。また、複数遺伝子を欠損させることによって、VLP放出は抑制され、３遺伝子欠損にすることによって、ほぼ完全に粒子は産生されないことを明らかにした。
〔実施例１５〕、〔実施例１８〕で得られた欠損型組換えセンダイウイルス産生細胞を３２℃で ３日間培養し、その培養上清を回収した。回収した上清を0.1% Triton X-100で処理した後に5% skim milk/PBSで希釈し、ウサギ抗センダイウイルス抗体でコーティングした96-well plateに加えた。室温で１時間放置した後にPBSで４回洗浄し、HRP結合マウス抗センダイウイルスNPタンパク質抗体を加えた。さらに室温で１時間放置した後に、PBSで４回洗浄し、TMBによって発色させた。既知の量のセンダイウイルス粒子を用いて検量線を作製し、それを元に培養上清中のウイルス粒子数を算出した。
その結果、図２４に示すように、M、F、HN遺伝子を単独で欠損させた組換えセンダイウイルスからはウイルス粒子が放出されていることが明らかとなった。なお、〔実施例１６〕で示したようにこれらの粒子は感染性が無いことから、ウイルス様粒子（VLP）であると考えられた。また、複数遺伝子を欠損させることによって、VLP放出は抑制され、３遺伝子欠損にすることによって、ほぼ完全に粒子は産生されないことを明らかにした。
〔実施例２１〕非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターを用いたタンパク質産生
（１）外来遺伝子挿入用M、F遺伝子欠損ベクターの構築
Nhe I、EcoR I、Not I認識配列とセンダイウイルの転写終結シグナルおよび転写開始シグナルを挿入するため、オリゴDNA
5'-CTAGCGAATTCGCGGCCGCCGTACGGTAAAGATTTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCAT(同配列番号７１)、
5'-GGCCATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTAAATCTTTACCGTACGGCGGCCGCGAATTCG(同配列番号７２)をアニーリングさせてpBSK/151(Nhe-Not)のNhe I-Not Iサイトに挿入し、pBSK/151(Nhe I - EcoR I - Not I)を得た。pBSK/151(Nhe I - EcoR I - Not I)を制限酵素Xho IおよびKas Iで切断してT7プロモーター配列からSeV; 1〜1899 (Xho I 〜 Kas I) までを分離し、同酵素で切断したpBSK-N/151(E-C+NN)に組み込んだ（pBSK/151(Nhe I - EcoR I - Not I) Le-M）。pBSK/151(Nhe-Eco-Not) Le-MをXho IおよびXma Iで切断して生じるT7プロモーター配列からSeV; 1〜3558断片(Xho I 〜 Xma I)と、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr; ΔF+GFP)からSeV; 3559〜10484断片(Xma I-EcoR I)、pBSK/151(V-5’)’からSeV: 10479-15384〜T7 RNA polymerase終止配列を切り出して、λDASHII (STRATAGENE)にこの順番でクローニングし直し、外来遺伝子挿入用MF欠損ベクターλ/151(NPp+Nhe I-EcoR I-Not I;ΔM+Bsr;ΔFp+GFP)を得た。
（１）外来遺伝子挿入用M、F遺伝子欠損ベクターの構築
Nhe I、EcoR I、Not I認識配列とセンダイウイルの転写終結シグナルおよび転写開始シグナルを挿入するため、オリゴDNA
5'-CTAGCGAATTCGCGGCCGCCGTACGGTAAAGATTTAAGAAAAACTTAGGGTGAAAGTTCAT(同配列番号７１)、
5'-GGCCATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTAAATCTTTACCGTACGGCGGCCGCGAATTCG(同配列番号７２)をアニーリングさせてpBSK/151(Nhe-Not)のNhe I-Not Iサイトに挿入し、pBSK/151(Nhe I - EcoR I - Not I)を得た。pBSK/151(Nhe I - EcoR I - Not I)を制限酵素Xho IおよびKas Iで切断してT7プロモーター配列からSeV; 1〜1899 (Xho I 〜 Kas I) までを分離し、同酵素で切断したpBSK-N/151(E-C+NN)に組み込んだ（pBSK/151(Nhe I - EcoR I - Not I) Le-M）。pBSK/151(Nhe-Eco-Not) Le-MをXho IおよびXma Iで切断して生じるT7プロモーター配列からSeV; 1〜3558断片(Xho I 〜 Xma I)と、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr; ΔF+GFP)からSeV; 3559〜10484断片(Xma I-EcoR I)、pBSK/151(V-5’)’からSeV: 10479-15384〜T7 RNA polymerase終止配列を切り出して、λDASHII (STRATAGENE)にこの順番でクローニングし直し、外来遺伝子挿入用MF欠損ベクターλ/151(NPp+Nhe I-EcoR I-Not I;ΔM+Bsr;ΔFp+GFP)を得た。
（２）α-galactosidase A遺伝子発現組換えセンダイウイルス作成用ベクターの構築
5'-CGGAATTCGTGACAATGCAGCTGAGGAACCCAG（同配列番号７３（N末端側））5'-GTGCGGCCGCTTAAAGTAAGTCTTTTAATGACATCTGC-3’（同配列番号７４（C末端側））の２本のプライマーを用いてHeLa cDNAライブラリー（Stratagene）よりα-galactosidase A遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をEcoR I、Not Iで切断し、pBluescript IIの EcoR I-Not I間に挿入して、pBSK-α-galAを得た。λ/151(NPp+Nhe I-EcoR I-Not I;ΔM+Bsr;ΔFp+GFP)のEcoR I - Not I間に、pBSK-α-galAよりEcoR IおよびNot Iで切り出したα-galactosidase A遺伝子を挿入し、λ/151(NPp+α-gal;ΔM+Bsr;ΔFp+GFP)を得た。
5'-CGGAATTCGTGACAATGCAGCTGAGGAACCCAG（同配列番号７３（N末端側））5'-GTGCGGCCGCTTAAAGTAAGTCTTTTAATGACATCTGC-3’（同配列番号７４（C末端側））の２本のプライマーを用いてHeLa cDNAライブラリー（Stratagene）よりα-galactosidase A遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をEcoR I、Not Iで切断し、pBluescript IIの EcoR I-Not I間に挿入して、pBSK-α-galAを得た。λ/151(NPp+Nhe I-EcoR I-Not I;ΔM+Bsr;ΔFp+GFP)のEcoR I - Not I間に、pBSK-α-galAよりEcoR IおよびNot Iで切り出したα-galactosidase A遺伝子を挿入し、λ/151(NPp+α-gal;ΔM+Bsr;ΔFp+GFP)を得た。
（３）組換えセンダイウイルス作成用ベクターからのウイルスベクター再構成
〔実施例１４〕と同様な方法でl/151(NPp+α-gal;ΔM+Bsr;ΔFp+GFP)から欠損型組換えセンダイウイルス（r151(NPp+α-gal;ΔM+Bsr;ΔFp+GFP)）を作製した。
〔実施例１４〕と同様な方法でl/151(NPp+α-gal;ΔM+Bsr;ΔFp+GFP)から欠損型組換えセンダイウイルス（r151(NPp+α-gal;ΔM+Bsr;ΔFp+GFP)）を作製した。
（４）α-galactosidase A産生量の定量
図２６に示すように、α-galactosidase A遺伝子発現組換えセンダイウイルスベクター産生細胞の培養液中から得られるα-galactosidase A 活性は、M、F遺伝子欠損型ベクターで約1,500 units/cell/day、遺伝子を欠損させていないCl.151全長cDNA由来のベクターからは約1,100 units/cell/dayであった。この発現量を、DHFR遺伝子を用いてCHO細胞内で遺伝子コピー数を増幅させて得られるタンパク質産生量約1,300 units/106 cells/day(7.5 pg/cell/day) (Ioannou et.al. (1992) J. Cell Biol. 119, 1137-1150)より換算すると約9.1 pg/cell/dayであった。非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターは、一度感染させるのみでこのような高発現を実現できることから、簡便に高発現が得られ、培養細胞を用いたタンパク質産生に有用であることを明らかにした。
図２６に示すように、α-galactosidase A遺伝子発現組換えセンダイウイルスベクター産生細胞の培養液中から得られるα-galactosidase A 活性は、M、F遺伝子欠損型ベクターで約1,500 units/cell/day、遺伝子を欠損させていないCl.151全長cDNA由来のベクターからは約1,100 units/cell/dayであった。この発現量を、DHFR遺伝子を用いてCHO細胞内で遺伝子コピー数を増幅させて得られるタンパク質産生量約1,300 units/106 cells/day(7.5 pg/cell/day) (Ioannou et.al. (1992) J. Cell Biol. 119, 1137-1150)より換算すると約9.1 pg/cell/dayであった。非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターは、一度感染させるのみでこのような高発現を実現できることから、簡便に高発現が得られ、培養細胞を用いたタンパク質産生に有用であることを明らかにした。
〔実施例２２〕gp91 phox発現非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターの作製
（１）gp91 phox遺伝子の挿入gp91 phox遺伝子挿入用プライマーとして、5’-ACTAGCTAGCTGCCACCATGGGGAACTGGGCTGTGAATGA-3’（同配列番号６５（N末端側））5’-ACTTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTAAAGAGACAAGTTAGAAGTTT-3’（同配列番号６６（C末端側））の２本のプライマーを用いてgp91 phox-pCI-neoからgp91 phox遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Not Iで切断し、pBSK/Na(3’-Mp+NN)のNhe I-Not I間に挿入することによって、pBSK/Na(3’-Mp+gp91)を得た。
（１）gp91 phox遺伝子の挿入gp91 phox遺伝子挿入用プライマーとして、5’-ACTAGCTAGCTGCCACCATGGGGAACTGGGCTGTGAATGA-3’（同配列番号６５（N末端側））5’-ACTTGCGGCCGCGATGAACTTTCACCCTAAGTTTTTCTTAAAGAGACAAGTTAGAAGTTT-3’（同配列番号６６（C末端側））の２本のプライマーを用いてgp91 phox-pCI-neoからgp91 phox遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Not Iで切断し、pBSK/Na(3’-Mp+NN)のNhe I-Not I間に挿入することによって、pBSK/Na(3’-Mp+gp91)を得た。
（２）組換えセンダイウイルス作成用ベクターの構築
pBSK/Na(3’-Mp+gp91)からT7プロモーター配列〜SeV: 1- 3655+GFP（Xho I 〜 Not I）を、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔHN+GFP)からSeV: 3655-10484（Not I - EcoRI）を、pBSK/151(V-5’)’からSeV: 10480-15384〜T7 RNA polymerase終止配列（EcoR I 〜 Sal I）を切り出して、λDASHIIにこの順番でクローニングし、λ/Na151FL(ΔM+Bsr; ΔHN +GFP;Mp+gp91)を得た（図２１）。
pBSK/Na(3’-Mp+gp91)からT7プロモーター配列〜SeV: 1- 3655+GFP（Xho I 〜 Not I）を、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔHN+GFP)からSeV: 3655-10484（Not I - EcoRI）を、pBSK/151(V-5’)’からSeV: 10480-15384〜T7 RNA polymerase終止配列（EcoR I 〜 Sal I）を切り出して、λDASHIIにこの順番でクローニングし、λ/Na151FL(ΔM+Bsr; ΔHN +GFP;Mp+gp91)を得た（図２１）。
（３）組換えセンダイウイルス作成用ベクターからのウイルスベクター再構成
〔実施例１５〕と同様な方法でλ/Na151FL(ΔM+Bsr; ΔHN+GFP;Mp+gp91)から欠損型組換えセンダイウイルス（rNa151FL(ΔM+Bsr; ΔHN+GFP;Mp+gp91)）を作製し、さらに得られたベクター産生細胞から〔実施例１６〕と同様な方法で、ベクターの回収、感染を行った。
図２７に示すように、gp91 phox発現非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターは作製可能であり、他細胞に感染させてもEGFP遺伝子と共にgp91 phox遺伝子を持続的に発現し続けるということを明らかにした。
〔実施例１５〕と同様な方法でλ/Na151FL(ΔM+Bsr; ΔHN+GFP;Mp+gp91)から欠損型組換えセンダイウイルス（rNa151FL(ΔM+Bsr; ΔHN+GFP;Mp+gp91)）を作製し、さらに得られたベクター産生細胞から〔実施例１６〕と同様な方法で、ベクターの回収、感染を行った。
図２７に示すように、gp91 phox発現非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターは作製可能であり、他細胞に感染させてもEGFP遺伝子と共にgp91 phox遺伝子を持続的に発現し続けるということを明らかにした。
〔実施例２３〕非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターを用いた造血幹細胞への持続的遺伝子導入
（１）造血幹細胞の分離 １０〜１４週齢のマウスから大腿骨と頸骨を分離し、骨中から骨髄細胞を分離する。分離した骨髄細胞をLymphoprepを用いて精製し、さらに抗B-220、CD4、CD8a、Gr1、CD11b、TER119、CD2抗体を用いてnegative selectionした後に、抗c-kit抗体でpositive selectionを行い、c-kit(+), linage(-)細胞（KL細胞）を分離する。ヒト造血幹細胞についても、臍帯血から同様の方法でAC133(+), linage(-)細胞を分離した。
（１）造血幹細胞の分離 １０〜１４週齢のマウスから大腿骨と頸骨を分離し、骨中から骨髄細胞を分離する。分離した骨髄細胞をLymphoprepを用いて精製し、さらに抗B-220、CD4、CD8a、Gr1、CD11b、TER119、CD2抗体を用いてnegative selectionした後に、抗c-kit抗体でpositive selectionを行い、c-kit(+), linage(-)細胞（KL細胞）を分離する。ヒト造血幹細胞についても、臍帯血から同様の方法でAC133(+), linage(-)細胞を分離した。
（２）造血幹細胞への遺伝子導入 遺伝子導入に用いる非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターをStemPro-34 SFM培地（GIBCO）に懸濁させてマウスKL細胞に加えた。３７℃で４時間放置した後に、MethoCult培地に１プレートあたり5 x 102細胞を播いた。約２週間３７℃で培養した後に、形成しているコロニーを観察して、ベクターによって導入された遺伝子の発現の有無や、分化傾向等を調べた。
また、ヒト造血幹細胞の場合、同様な方法でAC133(+), linage(-)細胞に非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターを感染させた後、放射線照射したOP9細胞をfeeder細胞として約５週間培養した後にMethoCult培地に移してコロニーを形成させ、そのコロニーを観察することによって約７週間後の発現持続性を調べた。
その結果、図２８に示すようにマウス、ヒトともに、造血幹細胞由来と思われるコロニーにおいて、ベクター由来の外来遺伝子の持続的発現が確認された。このことから、非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターは造血幹細胞へ持続的遺伝子導入が可能であるということを明らかにした。
また、ヒト造血幹細胞の場合、同様な方法でAC133(+), linage(-)細胞に非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターを感染させた後、放射線照射したOP9細胞をfeeder細胞として約５週間培養した後にMethoCult培地に移してコロニーを形成させ、そのコロニーを観察することによって約７週間後の発現持続性を調べた。
その結果、図２８に示すようにマウス、ヒトともに、造血幹細胞由来と思われるコロニーにおいて、ベクター由来の外来遺伝子の持続的発現が確認された。このことから、非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターは造血幹細胞へ持続的遺伝子導入が可能であるということを明らかにした。
〔実施例２４〕非伝播性持続感染型センダイウイルスベクターの多重感染
（１）外来遺伝子挿入３遺伝子欠損cDNAの作製
pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+Cluc)に対し、5’-TGAATGCAAATAGAACCGGTGTCGGCTTTGCTGA-3’（同配列番号７５ （センス鎖））
5’-TCAGCAAAGCCGACACCGGTTCTATTTGCATTCA-3’（同配列番号７６ （アンチセンス鎖））を用いてSph I 認識配列をAge I認識配列に変換した（pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+ClucAge)）。
5’-ACTAGCTAGCTGCCACCATGGGGAACTGGGCTGTGAATGA-3’（同配列番号６５（N末端側））5’-GGTCCACCGGTGTTAGAAGTTTTCCTTGTTGA-3’（同配列番号７７（C末端側））の２本のプライマーを用いてgp91 phox-pCI-neoからgp91 phox遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Age Iで切断し、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+ClucAge)のNhe I-Age I間に挿入することによって、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+gp91)を得た。
5’-AATTGGCGCCAGCCACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGT-3’（同配列番号７８（N末端側））5’-GGTCCACGCGTTTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTG-3’（同配列番号 ７９ （C末端側））の２本のプライマーを用いてpUT58上からゼオシン耐性遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をKas I、Mlu Iで切断し、pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not;N-K)のBsr遺伝子のかわりに挿入することによって、pBSK/151(E-C;ΔM+Zeo)を得た。
5’-ACGAAGATCTAGCCTAGGGGGACCATGGTGAGCGTGATCA -3’（同配列番号８０（N末端側））
5’-ACGAAGATCTGACGTCTTCAGCAGTGGGCCACGGCGT -3’（同配列番号８１（C末端側））の２本のプライマーを用いてphKO1-MN1（MBL）上から増幅し、Bgl IIで切断したhKO遺伝子をpBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+MN)）のGFP遺伝子のかわりに挿入した（pBSK/151(E-E;ΔF+hKO;+MN)）。
pBSK/151(E-C;ΔM+Zeo)のSeV: 2871-4722（EcoR I 〜 Mlu I）とpBSK/151(E-E;ΔF+hKO;+MN)のSeV: 4722-6667（Mlu I 〜 Nhe I）、pBSK/151(E-E;DHN+Cluc)のSeV: 6667-10484（Nhe I 〜 EcoR I）をつなぎ合わせて、pBSK/151(E-E;ΔM+Zeo;ΔF+hKO;ΔHN+Cluc)を得た。
（１）外来遺伝子挿入３遺伝子欠損cDNAの作製
pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+Cluc)に対し、5’-TGAATGCAAATAGAACCGGTGTCGGCTTTGCTGA-3’（同配列番号７５ （センス鎖））
5’-TCAGCAAAGCCGACACCGGTTCTATTTGCATTCA-3’（同配列番号７６ （アンチセンス鎖））を用いてSph I 認識配列をAge I認識配列に変換した（pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+ClucAge)）。
5’-ACTAGCTAGCTGCCACCATGGGGAACTGGGCTGTGAATGA-3’（同配列番号６５（N末端側））5’-GGTCCACCGGTGTTAGAAGTTTTCCTTGTTGA-3’（同配列番号７７（C末端側））の２本のプライマーを用いてgp91 phox-pCI-neoからgp91 phox遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をNhe I、Age Iで切断し、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+ClucAge)のNhe I-Age I間に挿入することによって、pBSK/151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+gp91)を得た。
5’-AATTGGCGCCAGCCACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGT-3’（同配列番号７８（N末端側））5’-GGTCCACGCGTTTCAGTCCTGCTCCTCGGCCACGAAGTG-3’（同配列番号 ７９ （C末端側））の２本のプライマーを用いてpUT58上からゼオシン耐性遺伝子を増幅し、得られた二本鎖DNAの末端をKas I、Mlu Iで切断し、pBSK/151(E-C;ΔM+Bsr;Mp+Not;N-K)のBsr遺伝子のかわりに挿入することによって、pBSK/151(E-C;ΔM+Zeo)を得た。
5’-ACGAAGATCTAGCCTAGGGGGACCATGGTGAGCGTGATCA -3’（同配列番号８０（N末端側））
5’-ACGAAGATCTGACGTCTTCAGCAGTGGGCCACGGCGT -3’（同配列番号８１（C末端側））の２本のプライマーを用いてphKO1-MN1（MBL）上から増幅し、Bgl IIで切断したhKO遺伝子をpBSK/151(E-E;ΔF+GFP;+MN)）のGFP遺伝子のかわりに挿入した（pBSK/151(E-E;ΔF+hKO;+MN)）。
pBSK/151(E-C;ΔM+Zeo)のSeV: 2871-4722（EcoR I 〜 Mlu I）とpBSK/151(E-E;ΔF+hKO;+MN)のSeV: 4722-6667（Mlu I 〜 Nhe I）、pBSK/151(E-E;DHN+Cluc)のSeV: 6667-10484（Nhe I 〜 EcoR I）をつなぎ合わせて、pBSK/151(E-E;ΔM+Zeo;ΔF+hKO;ΔHN+Cluc)を得た。
（２）組換えセンダイウイルス作成用ベクターの構築
上記の各遺伝子欠損型cDNAを用いて、〔実施例１〕と同様の方法でセンダイウイルス全長cDNA（λ/Na151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+gp91)、λ/Na151(E-E;ΔM+Zeo;ΔF+hKO;ΔHN+Cluc)）をクローニングした（図２５）。
上記の各遺伝子欠損型cDNAを用いて、〔実施例１〕と同様の方法でセンダイウイルス全長cDNA（λ/Na151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+gp91)、λ/Na151(E-E;ΔM+Zeo;ΔF+hKO;ΔHN+Cluc)）をクローニングした（図２５）。
（３）組換えセンダイウイルス作成用ベクターからの組換えセンダイウイルス再構成
〔実施例１５〕と同様な方法で上記の組換えセンダイウイルス作成用ベクターから欠損型組換えセンダイウイルス（rNa151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+gp91)、rNa151(E-E;ΔM+Zeo;ΔF+hKO;ΔHN+Cluc)）を作製し、さらに得られたベクター産生細胞から〔実施例１６〕と同様な方法で、ベクターを回収した。
〔実施例１５〕と同様な方法で上記の組換えセンダイウイルス作成用ベクターから欠損型組換えセンダイウイルス（rNa151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+gp91)、rNa151(E-E;ΔM+Zeo;ΔF+hKO;ΔHN+Cluc)）を作製し、さらに得られたベクター産生細胞から〔実施例１６〕と同様な方法で、ベクターを回収した。
（４）ベクターの二重感染
rNa151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+gp91)が感染しているLLCMK2細胞に対してrNa151(E-E;ΔM+Zeo;ΔF+hKO;ΔHN+Cluc)）を〔実施例１６〕と同様な方法で感染させ、ブラストサイジンとゼオシンの両薬剤を用いて選択を行った。その結果、両薬剤に対して耐性の細胞中に、EGFP, gp91, hKO, Clucの発現が確認された（図２９）。
このことから、ベクターを多重感染させることが可能であるということが明らかになり、これを応用することによって、複数の遺伝子を同時に一つの細胞内に導入することが可能であるということが明らかになった。
rNa151(E-E;ΔM+Bsr;ΔF+GFP;ΔHN+gp91)が感染しているLLCMK2細胞に対してrNa151(E-E;ΔM+Zeo;ΔF+hKO;ΔHN+Cluc)）を〔実施例１６〕と同様な方法で感染させ、ブラストサイジンとゼオシンの両薬剤を用いて選択を行った。その結果、両薬剤に対して耐性の細胞中に、EGFP, gp91, hKO, Clucの発現が確認された（図２９）。
このことから、ベクターを多重感染させることが可能であるということが明らかになり、これを応用することによって、複数の遺伝子を同時に一つの細胞内に導入することが可能であるということが明らかになった。
〔実施例２５〕開裂型Fタンパク質を用いた欠損型組換えセンダイウイルスの回収、感染
〔実施例１８〕で得られたM、F遺伝子欠損型もしくはM、F、HN遺伝子欠損型組換えセンダイウイルス産生細胞に、〔実施例１４〕で作製した欠損遺伝子発現プラスミドをLipofectamine 2000を用いてトランスフェクションし、24時間後に細胞を洗浄した後、10%血清を含んだDMEM培地を加えてさらに32℃で３日間培養した。その後、培養上清を回収し、0.45μmのフィルターで濾過後、7.5μg/mlのトリプシンで処理をした上清と処理をしていない上清に分けて新たな標的細胞の培地に加え、32℃で２日間培養した。その後、センダイウイルスに対する抗体を用いて、蛍光抗体法で組換えセンダイウイルスの感染を確認し、顕微鏡観察視野中の全細胞に対する組換えセンダイウイルス感染細胞数の割合を算出した。
〔実施例１８〕で得られたM、F遺伝子欠損型もしくはM、F、HN遺伝子欠損型組換えセンダイウイルス産生細胞に、〔実施例１４〕で作製した欠損遺伝子発現プラスミドをLipofectamine 2000を用いてトランスフェクションし、24時間後に細胞を洗浄した後、10%血清を含んだDMEM培地を加えてさらに32℃で３日間培養した。その後、培養上清を回収し、0.45μmのフィルターで濾過後、7.5μg/mlのトリプシンで処理をした上清と処理をしていない上清に分けて新たな標的細胞の培地に加え、32℃で２日間培養した。その後、センダイウイルスに対する抗体を用いて、蛍光抗体法で組換えセンダイウイルスの感染を確認し、顕微鏡観察視野中の全細胞に対する組換えセンダイウイルス感染細胞数の割合を算出した。
図３０に示すように、いずれの欠損型組換えセンダイウイルスにおいても、開裂型Fタンパク質発現ベクターを用いた場合の方が、高効率で標的細胞に組換えセンダイウイルスが感染し、トリプシン処理を必要としないことを明らかにした。
Claims (42)
- センダイウイルスのＬタンパク質の少なくとも一部をコードし、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスの細胞障害性を減弱させるために用いる遺伝子材料であって、少なくとも、該Ｌタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることを特徴とする、上記遺伝子材料。
- 細胞障害性の減弱が、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスによるインターフェロンの発現誘導の抑制に基づくものである請求項１に記載の遺伝子材料。
- 細胞障害性の減弱が、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのゲノムＲＮＡの３’末端から転写されるＲＮＡのコピー数の減少に基づくものである請求項１に記載の遺伝子材料。
- センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されていることを特徴とする、インターフェロンの発現誘導を抑制するために用いられる遺伝子材料。
- 請求項１に記載の遺伝子材料と、少なくとも以下１）〜６）のアミノ酸変異を有するタンパク質をコードする遺伝子とからなることを特徴とする、非持続感染型センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスに、持続感染性を付与するために用いる遺伝子材料。
１）６９Ｅ、２）１１６Ａ、３）１８３Ｓ、４）６Ｒ、５）１１５Ｌ、６）１３７Ｔ
（但し、上記１）〜３）中の数字は、センダイウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列における位置番号を、４）〜６）中の数字は、同Ｆタンパク質のアミノ酸配列における位置番号をそれぞれ表し、１）〜６）中、アルファベットは該位置における変異したアミノ酸残基を表す。） - センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されている遺伝子材料を含むことを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子材料。
- プラス鎖ｃＤＮＡからなることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子材料。
- 非持続感染型センダイウイルスの遺伝子が、Ｌタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンに置換されたタンパク質をコードするように変換されていることを特徴とする、センダイウイルス遺伝子。
- さらに、非持続感染型センダイウイルス遺伝子が、少なくとも以下のアミノ酸変異を有するタンパク質をコードするように変換されていることを特徴とする、請求項８に記載のセンダイウイルス遺伝子。１）６９Ｅ、２）１１６Ａ、３）１８３Ｓ、４）６Ｒ、５）１１５Ｌ、６）１３７Ｔ
（但し、上記１）〜３）中の数字は、センダイウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列における位置番号を、４）〜６）中の数字は、同Ｆタンパク質のアミノ酸配列における位置番号をそれぞれ表し、１）〜６）中、アルファベットは該位置における変異したアミノ酸残基を表す。） - さらに、センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されていることを、特徴とする、請求項８又は９に記載のセンダイウイルス遺伝子。
- Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上を欠損させたことを特徴とする上記請求項８または９に記載のセンダイウイルス遺伝子。
- Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上の欠損が、これら各遺伝子に対するマーカー遺伝子の挿入によるものである、請求項１１に記載のセンダイウイルス遺伝子。
- 非持続感染性センダイウイルスのＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基がバリンに置換されたタンパク質をコードするように変換された変異Ｌ遺伝子と、ＮＰ及びＰ遺伝子とからなることを特徴とする、センダイウイルス遺伝子。
- さらに、センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されていることを、特徴とする、請求項１１〜１３に記載のセンダイウイルス遺伝子。
- プラス鎖ｃＤＮＡからなることを特徴とする、請求項８〜１４のいずれかに記載のセンダイウイルス遺伝子。
- 請求項８〜１０のいずれかに記載のセンダイウイルス遺伝子ｃＤＮＡからなることを特徴とする、持続感染型組換えウイルス作成用遺伝子材料。
- 請求項１１〜１４のいずれかに記載のセンダイウイルス遺伝子ｃＤＮＡからなることを特徴とする、非伝播性持続感染型ウイルス作成用遺伝子材料。
- ベクターに、請求項１７に記載の組換えウイルス作成用遺伝子材料が導入されていることを特徴とする、持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
- ベクターに、請求項１８に記載の組換えウイルス作成用遺伝子材料が導入されていることを特徴とする、非伝播性持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
- 外来遺伝子ＤＮＡが導入されていることを特徴とする、請求項１８に記載の持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
- 外来遺伝子が、生理活性ペプチドあるいはタンパク質をコードするものである、請求項２０に記載の組換えウイルス作成用ベクター。
- 外来遺伝子ＤＮＡが導入されていることを特徴とする、請求項１９に記載の非伝播性持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
- Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上が欠損している請求項２２に記載の非伝播性持続感染型ウイルスベクターであって、外来遺伝子がＭ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上に挿入されていることを特徴とする、請求項２２に記載の非伝播性持続感染型組換えウイルス作成用ベクター。
- 外来遺伝子が、生理活性ペプチドあるいはタンパク質をコードするものである、請求項２２または２３に記載の組換えウイルス作成用ベクター.
- 請求項２０または２１のいずれかに記載の組換えウイルス作成用ベクターが導入されていることを特徴とする細胞 。
- 請求項２２〜２４のいずれかに記載の組換えウイルス作成用ベクターが導入されていることを特徴とする細胞 。
- 請求項２０〜２４のいずれかに記載の組換えウイルス作成用ベクターを複数導入した細胞であって、該ベクターはそれぞれ異なる外来遺伝子を担持し、複数の外来遺伝子が同時に発現していることを特徴とする細胞 。
- 請求項２０〜２４のいずれかに記載の組換えウイルス作成用ベクターと、ウイルス粒子形成のために不足する遺伝子を有する他の組換えベクターとが導入されていることを特徴とする細胞。
- ウイルス粒子形成のために不足する遺伝子がＦ遺伝子であって、該Ｆ遺伝子が、Ｆタンパク質の１１２〜１１６番目のアミノ酸配列において、アルギニン-アルギニン-Ｘ-リジン又はアルギニン-アルギニンで表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列に変換されていることを特徴とする、請求項２８に記載の細胞（但し上記アミノ酸配列中Ｘは、任意のアミノ酸残基を表す）。
- ヒト型コドンに変換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項２５〜２９のいずれかに記載の細胞
- 請求項２６に記載の細胞内で再構成されたセンダイウイルスＲＮＰ複合体 。
- 請求項２５〜２９のいずれかに記載の細胞を培地に培養することを特徴とする、外来遺伝子産物の製造方法。
- 請求項２５〜２９のいずれかに記載の細胞を培地に培養することを特徴とする、外来遺伝子を保持したセンダイウイルスの粒子の製造方法。
- 請求項２５〜２９のいずれかに記載の細胞を培地に培養することにより得られた、外来遺伝子を保持したセンダイウイルス粒子。
- 非持続感染型センダイウイルスの全長遺伝子のうち、Ｌ遺伝子がＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンになるように置換したタンパク質をコードするように変換されていることを特徴とする、ウイルス粒子。
- 非持続感染型センダイウイルスの全長遺伝子のうち、Ｌ遺伝子がＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンに置換したタンパク質をコードするように変換され、かつＭおよびＦ遺伝子が、以下１）〜６）の変異を含むアミノ酸配列をコードするように変換されていることを特徴とする、ウイルス粒子。
１）６９Ｅ、２）１１６Ａ、３）１８３Ｓ、４）６Ｒ、５）１１５Ｌ、６）１３７Ｔ
（但し、上記１）〜３）中の数字は、センダイウイルスＭタンパク質のアミノ酸配列における位置番号を、４）〜６）中の数字は、同Ｆタンパク質のアミノ酸配列における位置番号をそれぞれ表し、１）〜６）中、アルファベットは該位置における変異したアミノ酸残基を表す。） - 非持続感染型センダイウイルスの全長遺伝子のうち、Ｌ遺伝子が、Ｌタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンに置換したタンパク質をコードするように変換されているとともに、Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のいずれか１種以上が欠損している遺伝子をゲノムとして有するウイルス粒子であって、該ウイルス粒子形成において不足するＭ、Ｆ及びＨＮタンパク質のいずれか１種以上が、上記ゲノム以外の遺伝子発現系により補われていることを特徴とする、ウイルス粒子。
- 非持続感染型センダイウイルスのＬタンパク質の１６１８番目のアミノ酸残基をバリンに置換したタンパク質をコードするように変換された変異Ｌ遺伝子、並びにＮＰ遺伝子及びＰ遺伝子をゲノムとして少なくとも有するとともに、Ｍ、Ｆ及びＨＮ遺伝子のうちいずれか１種以上をゲノムとして有しないウイルス粒子であって、ウイルス粒子形成において不足する上記Ｍ、Ｆ、ＨＮタンパク質のいずれか１種以上が、上記ゲノム以外の遺伝子発現系により補われていることを特徴とする、ウイルス粒子。
- ウイルス粒子形成において不足するタンパク質が少なくともＦタンパク質であって、該Ｆタンパク質の１１２〜１１６番目のアミノ酸配列がアルギニン-アルギニン-Ｘ-リジンまたはアルギニン-アルギニンで表される配列に変換されていることを特徴とする、請求項３７または３８に記載のウイルス粒子（但し上記アミノ酸配列中Ｘは、任意のアミノ酸残基を表す）。
- さらに、センダイウイルスあるいはその類縁ウイルスのリーダーRNA配列の３’末端に転写終結配列が付加されていることを、特徴とする、請求項３４〜３９に記載のウイルス粒子。
- 請求項３４〜４０に記載のウイルス粒子に外来遺伝子が導入されていることを特徴とする、組換えウイルス。
- 請求項４１に記載の組換えウイルスを有効成分として含有することを特徴とする、遺伝子治療用薬剤。
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