WO2023033050A1 - ボルナウイルスベクターを利用した医薬組成物 - Google Patents

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bornavirus
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啓造 朝長
晶子 牧野
まどか 酒井
亮 小森園
真 漆谷
敏史 守村
素三雄 南山
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国立大学法人京都大学
国立大学法人滋賀医科大学
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a bornavirus vector, a recombinant virus containing RNA encoded by the bornavirus vector, a cell infected with the recombinant virus, and a pharmaceutical composition containing the cell.
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • SOD1 Cu/Zn superoxide dismutase I
  • SOD1 is an enzyme that removes superoxide, a reactive oxygen species, but neurotoxicity due to mutant SOD1 is unrelated to anti-reactive oxygen activity, and removal of mutant proteins has become a major strategy for drug development.
  • antisense oligonucleotide therapy against SOD1 has been put into practical use, and we are entering an era in which we can benefit from advanced medical treatment aimed at preventing the onset and progression of refractory ALS, and early diagnosis is becoming increasingly important.
  • Patent Documents 1-4 Various antibodies have been reported for use in diagnosing and treating such ALS (eg, Patent Documents 1-4 and Non-Patent Document 1).
  • BDV Borna disease virus
  • Mononegavirales which has a non-segmented, negative-strand, single-strand RNA genome, and is said to have an infection tropism to nerve cells. It has characteristics. Furthermore, BDV is a virus that replicates in the cell nucleus, but its infection is non-cytotoxic and persistently infected for a long period of time.
  • the purpose of the present invention is to provide a bornavirus vector that enables the treatment and prevention of ALS with mutations in the SOD1 gene.
  • a further object of the present invention is to provide a recombinant virus containing RNA encoded by the bornavirus vector, a cell infected with the recombinant virus, and a pharmaceutical composition containing the cell.
  • the present inventors have found that antibodies having binding properties to the mutant SOD1 protein obtained by the present inventors can be obtained in oligodendrocyte progenitor cells using a bornavirus vector.
  • OPC oligodendrocyte progenitor cells
  • scFv can be secreted into the culture supernatant by introducing the scFv gene into human mesenchymal stem cells using a bornavirus vector, and the integration of scFv DNA into the genome is extremely low. bottom.
  • Section 1 have binding properties to mutant SOD1 proteins, A heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of GFSLNTSGMG (SEQ ID NO: 1), a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of IWWDDDK (SEQ ID NO: 2), and the amino acids of ARLGYAMDY (SEQ ID NO: 3), which may have up to 3 amino acid substitutions A heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 consisting of a sequence, and/or a light chain consisting of a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of QNVGGTN (SEQ ID NO: 4), which may have 3 or less amino acid substitutions, and a light chain consisting of the SAS amino acid sequence.
  • a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of GFSLNTSGMG (SEQ ID NO: 1)
  • a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of IWWDDDK
  • ARLGYAMDY SEQ ID NO: 3
  • a heavy chain variable region comprising a
  • Section 2. Item 2. The bornavirus of Item 1, wherein the antibody fragment is Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv, scFab, scFv, dsFv, ds-scFv, diabodies, triabodies, tetrabodies, or minibodies. vector.
  • Item 3. Item 3. The bornavirus vector according to Item 1 or 2, wherein the antibody fragment is scFv. Section 4.
  • the Bornavirus vector according to any one of Items 1 to 3, wherein the antibody or antibody fragment is a humanized antibody or antibody fragment.
  • Item 5. (a) in an untranslated region having at least the N gene, the X gene, the P gene and the L gene in the Borna disease virus genome in the same order as in the Borna disease virus genome and linked downstream of the coding region of the P gene; cDNA of a recombinant viral RNA having a sequence in which said nucleic acid is inserted in, (b) a DNA encoding a ribozyme and (c) a promoter sequence, wherein (b) is arranged upstream and downstream of said (a), Item 5.
  • the bornavirus vector according to any one of Items 1 to 4, wherein (a) and (b) are arranged downstream of (c).
  • Item 6. (a) cDNA of recombinant viral RNA has a sequence in which the G gene is disrupted in the Borna disease virus genome, and a sequence in which the nucleic acid is inserted into an untranslated region linked downstream of the P gene translation region. Item 6.
  • the Bornavirus vector of Item 5 which is a recombinant viral RNA cDNA having Item 7.
  • the cDNA of the recombinant viral RNA has a sequence in which the G gene and M gene are disrupted in the Borna disease virus genome, and the nucleic acid is inserted into the untranslated region linked downstream of the P gene translation region.
  • the Bornavirus vector according to Item 5 which is a cDNA of recombinant viral RNA having the sequence defined in Item 5.
  • Item 8. The cDNA of the recombinant viral RNA is a cDNA of a recombinant virus in which the nucleic acid is inserted into the untranslated region between the translational region of the P gene and the translational region of the M gene of the cDNA encoding the Borna disease virus genome.
  • Item 10. (a) A cDNA sequence encoding a hammerhead ribozyme (b1) is arranged upstream of the cDNA of the recombinant viral RNA, and a cDNA sequence encoding a hepatitis delta virus ribozyme (b2) is arranged downstream of (a).
  • Item 11 A recombinant virus comprising RNA encoded by the bornavirus vector according to any one of Items 1 to 10.
  • Item 12. Item 12.
  • Item 13. Item 13.
  • Item 14. A pharmaceutical composition comprising the cells of Item 12 or 13.
  • Item 16. Item 14.
  • a method for treating diseases in which mutant SOD1 accumulates comprising the step of administering an effective amount of the cells of Item 12 or 13 to a mammal.
  • Item 17. 14 Use of the cells of Item 12 or 13 in the production of a pharmaceutical composition for treatment and/or prevention of diseases in which mutant SOD1 accumulates, such as amyotrophic lateral sclerosis.
  • a recombinant virus containing RNA encoded by the bornavirus vector is produced, and cells are infected with the recombinant virus to bind to the mutant SOD1 protein.
  • Cells can be generated that express the antibody or antibody fragment.
  • FIG. 3 shows the construction of the pCAG-Fct p/m ⁇ G LL GFP-scFv plasmid into which the anti-SOD1 antibody gene was inserted, prepared in Examples.
  • 1 is a photograph showing the results of observing OPCs inoculated with a scFv-encoding bornavirus vector under a fluorescence microscope.
  • Fig. 10 is a photograph showing the results of Western blotting of the culture supernatant of scFv-encoding bornavirus vector-introduced OPCs.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of relative quantification by Western blotting of the amount of SOD1 in the lumbar spinal cord collected from mutant SOD1 transgenic mice implanted with OPCs (soluble fraction).
  • FIG. 2 shows the results of relative quantification by Western blotting of the amount of SOD1 in the lumbar spinal cord collected from mutant SOD1 transgenic mice transplanted with OPCs (insoluble fraction).
  • FIG. 2 shows the results of relative quantification by Western blotting of the amount of SOD1 in the lumbar spinal cord collected from mutant SOD1 transgenic mice transplanted with OPCs (insoluble fraction).
  • Right Graph showing SOD1 levels in each OPC-administered group with SOD1/beta-actin in the NI group set to 1.0.
  • Fig. 3 is a photograph showing the results of Western blotting of the culture supernatant of scFv-encoding bornavirus vector-introduced mesenchymal stem cells.
  • 1 is a graph showing the relative amount of scFv mRNA to GAPDH expressed after introduction of a viral vector encoding scFv into mesenchymal stem cells.
  • nucleic acid means RNA or DNA.
  • gene includes double-stranded DNA, single-stranded DNA (sense strand or antisense strand), and fragments thereof, unless otherwise specified.
  • gene refers to regulatory regions, coding regions, exons, and introns without distinction, unless otherwise specified.
  • nucleic acid refers to DNA and RNA, and may be double-stranded or single-stranded.
  • SOD1 shall mean protein unless otherwise specified, but shall mean gene when it is appropriate to interpret it as a gene.
  • the RefSeq IDs shown below are those registered on the NCBI website.
  • the bornavirus vector of the present invention has a binding property to mutant SOD1 protein, A heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of GFSLNTSGMG (SEQ ID NO: 1), a heavy chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of IWWDDDK (SEQ ID NO: 2), and the amino acids of ARLGYAMDY (SEQ ID NO: 3), which may have up to 3 amino acid substitutions A heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR3 consisting of a sequence, and/or a light chain consisting of a light chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of QNVGGTN (SEQ ID NO: 4), which may have 3 or less amino acid substitutions, and a light chain consisting of the SAS amino acid sequence.
  • an antibody or antibody fragment (hereinafter also referred to as “the antibody or antibody fragment of the present invention”) comprising a light chain variable region comprising CDR2 and a light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 5) It is characterized by having a nucleic acid (hereinafter sometimes referred to as “the nucleic acid of the present invention”) that
  • SOD Superoxide dismutase
  • SOD1 is present in the cytoplasm and is usually a dimer.
  • SOD2 is present in mitochondria
  • SOD3 is present extracellularly, and they are usually tetramers.
  • SOD1 and SOD3 contain copper and zinc in the reaction center, and SOD2 contains manganese in the reaction center.
  • SOD1 in the present invention is usually animal-derived, preferably mammalian-derived, and particularly preferably human-derived.
  • the amino acid sequence of the human-derived SOD1 protein has been registered as RefSeq Accession No.NP_000445 and is shown in SEQ ID NO:6.
  • a gene encoding a human-derived SOD1 protein has been registered as RefSeq Accession No. NM_000454, and its nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO:7.
  • Mutant SOD1 in the present invention refers to SOD1 that is folded into a structure different from the natural structure due to mutations in the protein due to substitution, deletion, insertion or addition of amino acids, particularly ALS. SOD1 with related pathogenic structures. Mutant SOD1 may result from mutations in the protein sequence or may result from other modifications. Mutant SOD1 may have either sporadic mutation or familial mutation, particularly SOD1 having familial mutation.
  • the CDRs (complementarity determining regions) contained in the antibody or antibody fragment of the present invention are characterized by having binding properties to mutant SOD1.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention specifically binds to mutant SOD1 and does not bind to wild-type SOD1 having a normal structure.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention preferably has a heavy chain CDR1 consisting of the amino acid sequence of GFSLNTSGMG (SEQ ID NO: 1), which may have up to 3 amino acid substitutions, and a heavy chain consisting of the amino acid sequence of IWWDDDK (SEQ ID NO: 2).
  • a heavy chain variable region comprising chain CDR2 and a heavy chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of ARLGYAMDY (SEQ ID NO: 3), and a light chain consisting of the amino acid sequence of QNVGGTN (SEQ ID NO: 4), optionally with up to 3 amino acid substitutions It comprises a light chain variable region comprising CDR1, light chain CDR2 consisting of the amino acid sequence of SAS, and light chain CDR3 consisting of the amino acid sequence of QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 5).
  • Amino acid substitutions are made so that the binding of the antibody or antibody fragment to mutant SOD1 is maintained.
  • the above-mentioned "may have 3 or less amino acid substitutions" means that a total of 3 or less amino acids may be substituted in the heavy chain variable region or the light chain variable region, and the amino acid substitutions are in the CDR portion. preferably done.
  • the number of amino acid substitutions is preferably 2 or less, more preferably 1 or less, and still more preferably 0.
  • substitution with amino acids with similar properties is considered to facilitate maintenance of the activity of the original antibody fragment.
  • An antibody fragment refers to a portion of an antibody that retains all or part of the binding activity of the antibody from which the antibody fragment is derived.
  • Antibody fragments include, for example, Fab, Fab', F(ab') 2 , Fv, scFab, scFv, dsFv, ds-scFv, diabodies, triabodies, tetrabodies, minibodies and the like.
  • the diabodies, triabodies, tetrabodies, and minibodies may be of the same type or combinations of different types.
  • the antibody fragment of the present invention is preferably scFv.
  • scFv is an antibody fragment in which Fv consisting of a heavy chain variable region and a light chain variable region are linked by an appropriate peptide linker.
  • a scFv in which VH and VL are bound in any order can also be used.
  • the sequence of the framework region (FR region) in the variable region of the antibody or antibody fragment of the present invention is not particularly limited as long as the antibody fragment has binding properties to mutant SOD1, and any sequence can be used.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention is desirably a humanized antibody or antibody fragment whose framework region is of human origin. Such humanized antibodies or antibody fragments can be produced by known methods.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention may be derived from any animal such as mouse, rat, guinea pig, rabbit, cow, goat, and sheep, and is not particularly limited.
  • the isotype of the antibody or antibody fragment of the present invention is not particularly limited, and may be any of IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA, IgD, IgE and IgM.
  • any functional peptide domain eg, signal sequence, blood-brain barrier penetrating peptide
  • any functional peptide domain eg, signal sequence, blood-brain barrier penetrating peptide or the like may be added to the N-terminus and/or C-terminus of the antibody or antibody fragment of the present invention.
  • the antibody or antibody fragment of the present invention is capable of recognizing a wide variety of mutant SOD1 proteins regardless of the site of amino acid substitution, and is an antibody or antibody for the prevention or treatment of ALS having a mutation in the SOD1 gene. Widely used as an antibody fragment. For example, it is possible to recognize mutant SOD1 proteins such as A4V, C6G, H46R, G85R, G93A, C111Y, I112T and I113T. Antisense oligonucleotides require treatment specific to mutant genes, but the antibody or antibody fragment of the present invention can be used for prevention and treatment regardless of the type of mutation.
  • the nucleic acid of the present invention is characterized by encoding the antibody or antibody fragment described above. Sequences for improving translation and RNA stability may be added to the untranslated region of the transcribed mRNA to the nucleic acid.
  • the nucleic acid can be produced by conventional methods such as PCR, chemical synthesis, biochemical cleavage/recombination, and the like.
  • the bornavirus vector of the present invention is for producing the above antibody or antibody fragment, and is characterized by having the above nucleic acid.
  • the bornavirus vector of the present invention may contain genes other than the above nucleic acids.
  • the Bornavirus vector is not particularly limited, and widely known Bornavirus vectors can be used (for example, International Publication No. 2010/113647, Japanese Patent Application Publication No. 2018-148865, Microbiol Immunol 2017 Sep; 61(9):380-386, J Virol. 2011 Dec;85(23):12170-8, Sci Rep. 2016 May 18;6:26154, etc.).
  • the above nucleic acid can be inserted into a vector by a known method.
  • Bornavirus vectors exist as extrachromosomal RNA (episomal) in the cell nucleus, and localize to chromosomes even in dividing and proliferating cells, and can maintain infection semipermanently. Then, the N, P, X, and L proteins (derived from the virus) and the target gene (target RNA) are constantly expressed in the cell.
  • the BDV genome contains at least six proteins: nucleoprotein (N protein), X protein, phosphorylated protein (P protein), matrix protein (M protein), surface glycoprotein (G protein) and RNA-dependent RNA.
  • a polymerase (L protein) is encoded.
  • the BDV genome has the N, X, P, M, G and L genes in that order from the 3' end. Viral RNAs encoding G protein, M protein, N protein, P protein and L protein are referred to herein as G gene, M gene, N gene, P gene and L gene, respectively.
  • the Bornavirus vector of the present invention include (a) having at least the N gene, the X gene, the P gene and the L gene in the Borna disease virus genome in the same order as in the Borna disease virus genome; cDNA of a recombinant viral RNA having a sequence in which the nucleic acid of the present invention is inserted into an untranslated region linked downstream of the translational region of (b) a DNA encoding a ribozyme and (c) a promoter sequence, wherein the ( (b) is arranged upstream and downstream of a), and (a) and (b) are arranged downstream of (c).
  • cDNA of recombinant viral RNA in a BDV genome or a sequence in which either or both of the G gene and M gene are disrupted in the BDV genome, an untranslated region linked downstream of the translation region of the P gene Preferred is the cDNA of the recombinant viral RNA that encodes the sequence within which the nucleic acid of the invention has been inserted.
  • cDNA of recombinant viral RNA has a sequence in which either or both of the G gene and M gene are disrupted in the BDV genome, and in the untranslated region linked downstream of the translation region of the P gene More preferred is a recombinant viral RNA cDNA having a sequence into which the nucleic acid of the invention has been inserted. More preferably, a recombinant viral RNA having a sequence in which the G gene is disrupted in the BDV genome and a sequence in which the nucleic acid of the present invention is inserted into the untranslated region linked downstream of the P gene translation region. cDNA.
  • a recombinant virus obtained by inserting the nucleic acid of the present invention into the untranslated region between the P gene translation region and the M gene translation region of the cDNA encoding the BDV genome cDNA can also be used.
  • the BDV genome may be a gene of a virus belonging to Bornaviridae (family Bornaviridae) or a mutant strain thereof.
  • viruses belonging to the Bornaviridae family include He80, H1766, Strain V, huP2br and the like.
  • Mutant strains include, for example, No/98, Bo/04w, HOT6 and the like.
  • a recombinant BDV genome cDNA having a sequence in which the G gene in the BDV genome is disrupted and the G gene in the avian bornavirus genome gene is inserted may be used ( See Japanese Patent Application Laid-Open No. 2018-148865). As a result, the productivity and recovery rate of the resulting recombinant virus are higher, and the nucleic acid of the present invention can be efficiently introduced.
  • the ribozyme of the DNA encoding the ribozyme may have a sequence capable of cleaving the nucleic acid of the present invention transcribed from the cDNA of (a) the recombinant viral RNA.
  • hammerhead ribozyme HamRz
  • hepatitis delta virus ribozyme HDVRz
  • hairpin ribozyme DNA such as cDNA encoding ribozyme such as artificial ribozyme.
  • hammerhead ribozyme (HamRz) and hepatitis delta virus ribozyme (HDVRz) are preferred.
  • a DNA (preferably cDNA) encoding HamRz is arranged upstream of (a) the cDNA of the recombinant BDV genome, that is, on the 3' end side, and downstream of (a), that is, on the 5' end side It is particularly preferred that (b2) a DNA (preferably a cDNA) sequence encoding HDVRz is placed in (b2). This improves the efficiency of expression of the nucleic acid of the invention in cells.
  • Promoter sequences include RNA polymerase II-based promoter sequences, RNA polymerase I-based promoter sequences, and T7 polymerase-based promoter sequences, with RNA polymerase II-based promoter sequences being preferred. Promoters of RNA polymerase II system include CMV promoter and CAGGS promoter. Among them, the CAGGS promoter is particularly preferred.
  • Bornavirus vectors of the invention also include one or more nucleic acid sequences encoding part or all of the SV40 viral origin of replication/promoter region sequence, enhancers, activators (e.g., trans-acting factors), chaperones, processing proteases.
  • the viral vector of the present invention may be either linear DNA or circular DNA, and is preferably circular when introduced into cells.
  • the recombinant virus of the present invention is characterized by containing RNA encoded by the Bornavirus vector.
  • the recombinant virus of the present invention is preferably a recombinant virus comprising RNA encoded by the above-mentioned Bornavirus vector, and BDV N protein, BDV P protein and BDV L protein.
  • the recombinant virus of the present invention is a persistently infective recombinant virus that can persistently express the antibody or antibody fragment of the present invention after infection of cells by containing the above-described recombinant viral RNA.
  • the recombinant virus may optionally have the BDV G protein or other viral coat proteins, and may also have the BDV M protein.
  • the recombinant virus of the present invention can be produced by, for example, introducing a plasmid or a group of plasmids expressing the N gene, P gene and L gene of BDV as helper plasmids into cells in vitro, together with the above-mentioned Bornavirus vector. It can be produced by a method comprising the step of culturing cells into which a vector and a helper plasmid have been introduced to produce a recombinant virus.
  • a plasmid or a group of plasmids expressing the N gene, P gene and L gene of BDV as well as a plasmid expressing the viral coat gene and a plasmid that expresses the M gene of the BDV virus is preferably introduced into cells in vitro.
  • the cells of the present invention are those into which the nucleic acid of the present invention has been introduced by being infected with the above recombinant virus.
  • the nucleic acid of the present invention incorporated into the virus can be introduced into the cell.
  • the cells of the present invention are not particularly limited, and include, for example, oligodendrocyte progenitor cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells (e.g., bone marrow, dental pulp, and adipose-derived mesenchymal stem cells). It can be suitably used for the treatment and prevention of atrophic lateral sclerosis.
  • Cells to be infected with the recombinant virus include oligodendrocyte progenitor cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells, iPS cells (induced pluripotent stem cells), ES cells (embryonic stem cells), Muse cells, etc.
  • Pluripotent stem cells Pluripotent stem cells, glial neural progenitor cells, dopaminergic neural progenitor cells, microglia, neural progenitor cells can also be used. Since the bornavirus vector has a high transduction efficiency into stem cells and can induce differentiation while maintaining gene expression, pluripotent stem cells such as iPS cells, ES cells, and Muse cells were infected with the recombinant virus of the present invention. Cells obtained later by differentiation induction into oligodendrocyte progenitor cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells, etc. also maintain the expression of the above antibody or antibody fragment.
  • pluripotent stem cells such as iPS cells, ES cells, and Muse cells were infected with the recombinant virus of the present invention. Cells obtained later by differentiation induction into oligodendrocyte progenitor cells, neural stem cells, mesenchymal stem cells, etc. also maintain the expression of the above antibody or antibody fragment.
  • the cells of the present invention include cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells infected with the above recombinant virus (e.g., oligodendrocyte progenitor cells, neural stem cells, neural progenitor cells, mesenchymal stem cells). etc.) are also included.
  • Cells include cells of mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits, preferably human cells. Also, the cells may be either autologous cells or allogeneic cells.
  • a method for infecting cells with a recombinant virus in vitro it is desirable to serially dilute the recombinant virus with a culture medium such as Dulbecco's Modified Eagle or phosphate-buffered saline to prepare a diluted solution.
  • concentration of the recombinant virus in the diluent may be appropriately selected according to the type of virus-infected cells, etc., and the diluent is used to infect cells with the recombinant virus.
  • the pharmaceutical composition of the present invention which is administered to mammals including humans, is characterized by comprising the above cells, and is used for the treatment and treatment of diseases in which mutant SOD1 accumulates, particularly amyotrophic lateral sclerosis. / or have a prophylactic effect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can optionally contain biologically acceptable carriers, excipients, etc., depending on its usage form.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be manufactured according to conventional procedures. For example, it can be used nasally as a spray, or parenterally in the form of an injection such as a sterile solution or suspension containing water or other pharmaceutically acceptable liquid.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with other known low-molecular-weight drugs.
  • drugs for ALS include, for example, riluzole, edaravone, and the like.
  • the amount of cells which are the active ingredient in the pharmaceutical composition of the present invention, is appropriately selected according to the dosage form, administration route, etc., and is usually about 1.0 ⁇ 10 3 to 1.0 ⁇ 10 10 cells, preferably 1.0 cells in the total amount of the preparation. It is about ⁇ 10 4 to 1.0 ⁇ 10 9 cells.
  • the administration of the pharmaceutical composition of the present invention may be local or systemic.
  • the administration method is not particularly limited. Examples of administration routes include intrathecal, intracerebral parenchymal or intravenous injection or drip, intranasal administration and the like.
  • Oligodendrocyte progenitor cells and neural stem cells can be administered intrathecally or intraparenchymally, and mesenchymal stem cells can be administered intrathecally, intraparenchymally, intravenously or intranasally. be.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention can be finally determined as appropriate by the doctor's judgment, taking into account the type of dosage form, administration method, age and weight of the patient, symptoms of the patient, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used to treat diseases in which mutant SOD1 accumulates because the administered cells secrete antibodies or antibody fragments to decompose and remove misfolded SOD1.
  • Diseases in which mutant SOD1 accumulates are not particularly limited, and examples thereof include amyotrophic lateral sclerosis.
  • a recombinant virus containing RNA encoded by the bornavirus vector is produced, and cells are infected with the recombinant virus to bind to the mutant SOD1 protein. Cells can be generated that express the antibody or antibody fragment.
  • VH (amino acid sequence) QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFS GFSLNTSGMG VGWIRQPSGRVLEWLAH IWWDDDK RYNPALKSRLTISKDTSTNQVFLKIASVDTTDTATYYC ARLGYAMDY WGHGTSVTVS (SEQ ID NO: 8)
  • VL (amino acid sequence) DIVMTQSQKFMSTSLGDRVSVTCKAS QNVGTN VAWYQQKPGQSPKALIY SAS YRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFC QQYYIYPYT FGGGTKLEI (SEQ ID NO: 9)
  • VH (nucleotide sequence) (Test Examples 1-3) CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAACACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTC
  • PCR using the eGFP gene expression plasmid (pcDNA3-eGFP) as a template and PrimeSTARTM MAX DNA polymerase (Takara Bio Inc.) (98°C 10 seconds, 55°C 5 seconds, 72°C 5 seconds, 30 cycles) did The PCR product was recombined with pCAG-Fct p/m tandem GFP ⁇ G LL using AscI and AsiSI.
  • PCR (98°C 10 seconds, 55°C 5 seconds, 72°C 5 seconds, 30 cycles) was performed using primers and PrimeSTAR MAX DNA polymerase (Takara Bio Inc.) using the anti-SOD1 antibody scFv cDNA as a template.
  • PCR products were used with BstBI and PacI to obtain pCAG-Fct p/m tandem GFP ⁇ G LL and recombinant pCAG-Fct p/m ⁇ G LL GFP-scFv (Fig. 1). Myc is attached to the scFv here.
  • the amount of viral vector used for introduction was 1 to 4 ⁇ g of pCAG-Fct p/m ⁇ G LL GFP-scFv for 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 6 293T cells, and pcN (0.125 to 0.5 ⁇ g), pCXN2-P (0.125-0.05 ⁇ g), pcL (0.125-0.5 ⁇ g), and pcG (0.05-0.125 ⁇ g).
  • pcN and pCXN2-P a helper plasmid into which the gene sequence of not only borna disease virus 1 (BoDV-1) but also borna disease virus 2 (BoDV-2) is inserted may be used.
  • Vero-G cells After introducing the viral vector and helper plasmid into 293T cells, they were cultured at 37°C. Three days after the introduction, the cells were subcultured and co-cultured with Vero cells that constantly expressed the G gene (Vero-G cells). The Vero-G cells were harvested as recombinant virus-infected Vero cells.
  • ⁇ Collection of recombinant virus (bornavirus vector)
  • the recombinant virus-infected Vero-G cells prepared above were washed twice with PBS buffer and Nacalai Tesque Co., Ltd.) treatment, and then centrifuged at 3,500 rpm for 5 minutes to recover the infected cells. After centrifugation, the infected cells were suspended in 500 ⁇ L of Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) and sonicated using BIORUPTOR II (Sonic Bio Inc.). After sonication, the cell lysate was centrifuged at 1,200 xg for 25 minutes at 4°C, and the supernatant was collected as a viral vector solution and stored at -80°C.
  • oligodendrocyte progenitor cells from rats Newly born (0-2 days) wild-type SD rats were euthanized under isoflurane inhalation anesthesia, and a primary culture system was established.
  • Mixed glia astrocytes, microglia, and OPCs isolated from the cerebral cortex of 2 animals per 75 cm (Nunc) easy flask were cultured at 37°C for 2 weeks and shaken for 24 hours.
  • OPCs were isolated by The isolated OPCs were mixed with OPC proliferation medium (49 mL Neurobasal medium (Invitrogen), 1 mL Serum free-B27 supplement (Invitrogen), 5 ⁇ L Human PDGF-AA (Peprotech), 5 ⁇ L FGF-Basic (Peprotech). ) at a concentration of 200,000,000 per 1 ml, and cultured at 37°C.
  • OPC proliferation medium 49 mL Neurobasal medium (Invitrogen), 1 mL Serum free-B27 supplement (Invitrogen), 5 ⁇ L Human PDGF-AA (Peprotech), 5 ⁇ L FGF-Basic (Peprotech).
  • OPC proliferation medium 49 mL Neurobasal medium (Invitrogen), 1 mL Serum free-B27 supplement (Invitrogen), 5 ⁇ L Human PDGF-AA (Peprotech), 5 ⁇ L FGF- 2.5 mL of Basic (mixed with Peprotech) was added and cultured at 37°C.
  • Test example 1 The viral vector recovered by the above method was inoculated into OPCs.
  • FIG. 2 is an image of the OPC observed under a fluorescence microscope 3 days after inoculation. GFP inserted into the viral vector was expressed in OPCs, and GFP fluorescence was observed.
  • the OPC culture supernatant was collected and centrifuged at 3,500 rpm for 5 minutes at 4°C. Co., Ltd.), 4% SDS (FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.3 M sucrose (FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 125 mM Tris-HCl buffer containing 0.01% BPB (FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a liquid Tris, Nacalai Tesque Co., Ltd.
  • HCl Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • anti-Myc monoclonal antibody 9E10 Merck Millipore
  • CanGet Signal Immunoreaction Enhancer Solution 1 CanGet Signal Immunoreaction Enhancer Solution 1 (Toyobo Co., Ltd.) was allowed to react with the PVDF membrane after transfer and allowed to stand at room temperature for 1 hour. After standing, wash 3 times with TBS-T, react Peroxidase- conjugated anti mouse IgG antibody (Jackson ImmunoResearch) diluted with CanGet Signal Immunoreaction Enhancer Solution 2 (Toyobo Co., Ltd.) with the PVDF membrane and let it stand at room temperature for 1 hour. It was left still. After standing, it was washed with TBS-T, and scFv in the OPC supernatant was detected using Amersham ECL Prime (GE Healthcare) and ImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare).
  • OPC OPC transfected with GFP-loaded bornavirus vector
  • the number of administered OPC cells was 1.0 ⁇ 10 6 cells per individual, which was suspended in 10 ⁇ L of medium and administered. Survival rate test, body weight change, inclined plate test, grip strength test, and hind leg reflex test were performed on each group of transgenic mice. Survival rate test: The survival rate of each group was shown by a Kaplan-Meier curve.
  • Weight fluctuation The weight of each individual was measured on each measurement day, and the weight loss was plotted with the weight (g) on the first day of measurement set as 100%.
  • Inclined plate test Each individual was placed on a flat plate, and the maximum angle at which the individual could maintain a posture without falling over for 5 seconds or more was measured as an index of muscle strength.
  • Grip strength test Using a mouse/rat grip strength tester (Muromachi Kikai Co., Ltd.), hold the tail of each animal, hang the forepaws on the grip strength tester, pull the tail slowly, and repeat five times.
  • Hindfoot reflex test The progression of ALS symptoms was analyzed using the reflex reaction of lifting the tail and extending the limbs of each individual. As an index of paralysis, no paralysis was scored as 0, if one limb developed, 1 point, and all four limbs developed, 4 points, and measurements were made on each measurement day.
  • Test example 3 Eight weeks after OPC transplantation, tissues were collected from each individual and the amount of SOD1 in the lumbar spinal cord was determined by Western blotting. The collected tissue was dissolved in RIPA buffer (containing 50 mM Tris-HCL pH7.7, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40 substitute, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS), and the extracted fraction was called "soluble fraction: soluble”, and the fraction extracted with 2% SDS after dissolution with RIPA buffer was defined as “insoluble fraction: insoluble”, and Western blot was performed using anti-Myc monoclonal antibody 9E10 (Merck Millipore) in the same manner as above. rice field. Aggregated SOD1, which causes ALS, is extracted into the insoluble fraction. As an endogenous control in the same sample, beta-Actin was also detected simultaneously using an anti-beta-actin antibody (Sigma-Aldrich).
  • the results are shown in Figures 5 and 6.
  • the SOD1/beta-actin ratio was calculated based on the intensity of each detected band, and the relative SOD1 amount was shown in a graph. Assuming that SOD1/beta-actin in the NI group is 1.0, the amount of SOD1 in each OPC administration group is shown. As a result, SOD1 detected in the OPC scFv group was significantly decreased compared to the NI group and the OPC GFP group, suggesting that the scFv degrades SOD1 in vivo.
  • pCAG-FctHe80 p/l ⁇ MG scFv plasmid inserted with anti-SOD1 antibody gene Similar to Fujino K et al.
  • a pCAG-FctHe80 p/l ⁇ MG scFv plasmid was prepared by the procedure of .
  • the plasmid carries a cassette of BstBI and PacI sites between the P gene and the L gene as a foreign gene insertion cassette.
  • PCR was performed using primers and PrimeSTAR MAX DNA polymerase (Takara Bio Inc.) (98°C 10 seconds, 55°C 5 seconds, 72°C 5 seconds, 35 cycles).
  • the PCR product was used with BstBI and PacI to obtain pCAG-FctHe80 p/l ⁇ MG plasmid and recombinant pCAG-FctHe80 p/l ⁇ MG scFv plasmid (Fig. 7). Myc is attached to the scFv here.
  • the amount of viral vector used for introduction was 1 to 4 ⁇ g of pCAG-FctHe80 p/l ⁇ MG scFv for 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 6 293T cells, pcN (0.125 to 0.5 ⁇ g), pCXN2- Helper plasmids were added at the ratio of P (0.125-0.05 ⁇ g), pcL (0.125-0.5 ⁇ g), pcM (0.05-0.125 ⁇ g), pcG (0.05-0.125 ⁇ g).
  • helper plasmid into which the gene sequence of not only borna disease virus 1 (BoDV-1) but also borna disease virus 2 (BoDV-2) is inserted may be used.
  • the cells After introducing the viral vector and helper plasmid into 293T cells, the cells were cultured at 37°C. Three days after the introduction, the cells were subcultured and co-cultured with Vero cells (Vero-MG cells) that constitutively express the M and G genes. The Vero-MG cells were harvested as recombinant virus-infected Vero cells.
  • Test example 4 The culture medium was collected 3 days and 6 days after inoculation, and the supernatant obtained by centrifugation at 3,500 rpm for 5 minutes at 4° C. was concentrated 10-fold with Amicon Ultra 10K (Merck Millipore). Equal volume of 2 ⁇ SDS-Sample buffer (10% mercaptoethanol (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 4% SDS (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 0.3 M sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical Co., Ltd.), 125 mM Tris-HCl buffer (Tris, Nacalai Tesque Co., Ltd.) (HCl, Fuji Film Wako Pure Chemical Co., Ltd.) containing 0.01% BPB (Fuji Film Wako Pure Chemical Co., Ltd.) was added.
  • 2 ⁇ SDS-Sample buffer 10% mercaptoethanol (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 4% SDS (Fuji
  • CSII-CMV scFv and CSII-EF scFv plasmids were prepared according to the procedure.
  • PCR was performed using primers and PrimeSTAR MAX DNA polymerase (Takara Bio Inc.) (98°C 10 seconds, 55°C 5 seconds, 72°C 5 seconds, 35 cycles).
  • PCR products were used with XhoI and BamHI to obtain CSII-CMV MSC or CSII-EF MCS plasmids and recombinant CSII-CMV scFv and CSII-EF scFv plasmids.
  • the lentiviral vector CSII-CMV scFv or CSII-EF scFv plasmid, pCAG-HIVgp plasmid, pCMV-VSVG plasmid, and pRSV-rev plasmid were introduced into 293T cells using TransIT-293 Transfection Reagent (Mirus Bio).
  • the amounts of viral vectors used for introduction were 1-4 ⁇ g of lentiviral vector CSII-CMV scFv or CSII-EF scFv and 0.5-2 ⁇ g of pCAG-HIVgp for 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 7 293T cells.
  • pCMV-VSVG and 0.5-2 ⁇ g of pRSV-rev were introduced, respectively.
  • the cells were cultured at 37°C, and 3 days after the introduction, the culture supernatant was collected as a lentiviral vector solution.
  • 1/3 volume of Lenti-X Concentrator (Clontech) was added to the recovered lentiviral vector solution to suspend it, and the mixture was allowed to stand at 4°C for 16 hours. After standing, the mixture was centrifuged at 1,500 xg for 45 minutes, the supernatant was removed, and the pellet was resuspended in PBS to concentrate the lentiviral vector solution 10- to 100-fold. This concentrated lentiviral vector solution was stored at -80°C.
  • RT-qPCR was performed using scFv or GAPDH gene-specific primers and probes and Luna Universal qPCR Master mix (New England Biolabs). The method was performed on a CFX96 Touch real-time PCR analysis system (Bio-Rad Laboratories).
  • the amount of scFv mRNA in each sample was compared relative to the amount of scFv mRNA using GAPDH as an endogenous control two days after the introduction of the bornavirus vector.
  • the results are shown in FIG. As a result, 2 days after introduction, while the expression level of bornavirus vector was lower than that of lentivirus vector, 4 days after introduction, 1.5 times the amount of mRNA expression of lentivirus vector was confirmed.
  • each vector was introduced into human bone marrow-derived mesenchymal stem cells seeded in a 6-well plate at an MOI of 0.2, and 100 ⁇ L of the culture supernatant was collected every 2 days from day 0 to day 24 of introduction.
  • each viral vector was introduced into human bone marrow-derived mesenchymal stem cells at MOI 0.2, and DNA was recovered from the cells 2 days and 4 days later.
  • RNA was degraded by adding RNase A (QIAGEN) when extracting cell DNA using the Qiamp DNA mini kit. After DNA purification, DNA concentration was measured by Qubit dsDNA HS Assay (Thermo Fisher Scientific).
  • scFv DNA was quantified by qPCR using 200 ng of DNA and a primer pair and probe specific to the scFv gene. The results are shown in FIG.

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Abstract

開示されているのは、変異型SOD1タンパク質に結合性を有し、3以下のアミノ酸置換をしてもよい、GFSLNTSGMG (配列番号１)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、IWWDDDK (配列番号２)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及びARLGYAMDY (配列番号３)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は3以下のアミノ酸置換をしてもよい、QNVGGTN (配列番号４)のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、SASのアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及びQQYYIYPYT (配列番号５)のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む、抗体又は抗体断片をコードする核酸を有するボルナウイルスベクター、該ボルナウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルス、該組換えウイルスに感染した細胞、及び該細胞を含む医薬組成物である。

Description

ボルナウイルスベクターを利用した医薬組成物
　本発明は、ボルナウイルスベクター、該ボルナウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルス、該組換えウイルスに感染した細胞、及び該細胞を含む医薬組成物に関する。
　筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis: ALS)は、60～70歳で発症する全身の筋萎縮と筋力低下とを主症状とする神経変性疾患であり、発症後4年以内に致死性の嚥下障害と呼吸不全とを呈する。ALS患者の20%は家族性で、その30%はCu/Zn superoxide dismutase I (SOD1)遺伝子に突然変異を有し、その突然変異の数は200種類にも及ぶ。そして、ALSでは、変異型SOD1タンパク質が、異常蓄積することが知られている。
　SOD1はスーパーオキシドという活性酸素を除去する酵素であるが、変異SOD1による神経毒性は抗活性酸素活性とは無関係であり、変異タンパク質の除去が創薬開発の主要な戦略となっている。そして、近年SOD1に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド治療が実用化され、いよいよ難治性ALSも発症阻止、進行停止に向けた先進医療の恩恵に浴する時代を迎えており、早期診断がますます重要となっている。
　このようなALSの診断及び治療に使用するための抗体について、各種の抗体が報告されている(例えば、特許文献１－４及び非特許文献１)。
　ボルナ病ウイルス(Borna disease virus：以下、BDVともいう)は、非分節のマイナス鎖、１本鎖のRNAをゲノムとして持つモノネガウイルス目に属するウイルスであり、神経細胞に感染指向性があるという特徴を有する。さらに、BDVは細胞核で複製するウイルスであるが、その感染は非細胞障害性であり長期に持続感染するという特徴、及び感染可能な宿主域が極めて広いという特徴も有する。
国際公開第2011/142461号 国際公開第2012/058220号 国際公開第2014/191493号 国際公開第2007/025385号
PLoS ONE 8(4): e61210. Doi:10.1371/journal.pone.0061210
　本発明は、SOD1遺伝子に変異を有するALSの治療及び予防が可能となる、ボルナウイルスベクターを提供することを目的とする。
　さらに、本発明は、該ボルナウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルス、該組換えウイルスに感染した細胞、及び該細胞を含む医薬組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明者らが取得した変異型SOD1タンパク質に結合性を有する抗体について、ボルナウイルスベクターを利用してオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)へscFv遺伝子を導入し、当該細胞をモデルラットに細胞移植したところ、ALSの進行抑制と寿命延長効果が見られるという知見を得た。また、ヒト間葉系幹細胞にもボルナウイルスベクターを利用してscFv遺伝子を導入することで培養上清中にscFvを分泌させることができ、scFvのDNAのゲノムへのインテグレーションが極めて低いことも確認した。
　本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次のボルナウイルスベクター、該ボルナウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルス、該組換えウイルスに感染した細胞、及び該細胞を含む医薬組成物を提供するものである。
項１．変異型SOD1タンパク質に結合性を有し、
　3以下のアミノ酸置換をしてもよい、GFSLNTSGMG (配列番号１)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、IWWDDDK (配列番号２)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及びARLGYAMDY (配列番号３)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は
　3以下のアミノ酸置換をしてもよい、QNVGGTN (配列番号４)のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、SASのアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及びQQYYIYPYT (配列番号５)のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体又は抗体断片
をコードする核酸を有するボルナウイルスベクター。
項２．前記抗体断片がFab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFab、scFv、dsFv、ds-scFv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、又はミニボディである、項１に記載のボルナウイルスベクター。
項３．前記抗体断片がscFvである、項１又は２に記載のボルナウイルスベクター。
項４．前記抗体又は抗体断片がヒト化抗体又は抗体断片である、項１～３のいずれか一項に記載のボルナウイルスベクター。
項５．（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に前記核酸が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、（ｂ）リボザイムをコードするDNA及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、且つ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されている、項１～４のいずれか一項に記載のボルナウイルスベクター。
項６．（ａ）組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてG遺伝子が破壊された配列を有し、且つP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に前記核酸が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである、項５に記載のボルナウイルスベクター。
項７．（ａ）組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてG遺伝子及びM遺伝子が破壊された配列を有し、且つP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に前記核酸が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである、項５に記載のボルナウイルスベクター。
項８．（ａ）組換えウイルスRNAのcDNAが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に前記核酸を挿入した組換えウイルスのcDNAである、項５に記載のボルナウイルスベクター
項９．（ｃ）プロモーター配列が、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列である、項５～８のいずれか一項に記載のボルナウイルスベクター。
項１０．（ａ）組換えウイルスRNAのcDNAの上流に（ｂ１）ハンマーヘッドリボザイムをコードするcDNAが配置され、且つ該（ａ）の下流に（ｂ２）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするcDNA配列が配置されている、項５～９のいずれか一項に記載のボルナウイルスベクター。
項１１．項１～１０のいずれか一項に記載のボルナウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルス。
項１２．項１１に記載の組換えウイルスに感染することにより前記核酸が導入された細胞。
項１３．前記細胞が、オリゴデンドロサイト前駆細胞、グリア系神経前駆細胞、ドパミン神経前駆細胞、ミクログリア、神経前駆細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、Muse細胞、iPS細胞又はES細胞である、項１２に記載の細胞。
項１４．項１２又は１３に記載の細胞を含む医薬組成物。
項１５．筋萎縮性側索硬化症の治療及び／又は予防用である、項１４に記載の医薬組成物。
項１６．項１２又は１３に記載の細胞の有効量を哺乳動物に投与する工程を含む、筋萎縮性側索硬化症等の変異型SOD1が蓄積する疾患の治療方法。
項１７．筋萎縮性側索硬化症等の変異型SOD1が蓄積する疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物の製造における、項１２又は１３に記載の細胞の使用。
　本発明のボルナウイルスベクターを用いて、当該ボルナウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルスを作製し、更に当該組換えウイルスを細胞に感染させることで、変異型SOD1タンパク質に結合性を有する抗体又は抗体断片を発現する細胞を生成することができる。そして、当該細胞を移植することで、SOD1遺伝子に変異を有するALSの治療及び予防が可能となる。
実施例で作製した抗SOD1抗体遺伝子を挿入したpCAG-Fct p/mΔG LL GFP-scFvプラスミドの構成を示す図である。 scFvをコードするボルナウイルスベクターを接種したOPCを蛍光顕微鏡で観察した結果を示す写真である。 scFvをコードするボルナウイルスベクター導入OPCの培養上清のウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。 ボルナウイルスベクターを導入したOPCを投与した変異型SOD1トランスジェニックマウスについて(A)生存率試験、(B)体重変動、(C)傾斜プレート試験、(D)握力試験、(E)後足反射試験を行った結果を示すグラフである。データは平均±SD、* P<0.01, ** P<0.001, *** P<0.0001、Two-way ANOVA OPCを移植した変異型SOD1トランスジェニックマウスより採取した腰髄内SOD1量をウェスタンブロット法により相対定量した結果を示す図である(可溶性画分)。左：ウェスタンブロッティング、右：NI群のSOD1/beta-actinを1.0とし、各OPC投与群のSOD1量を示すグラフ、データは平均±SD、n=3 OPCを移植した変異型SOD1トランスジェニックマウスより採取した腰髄内SOD1量をウェスタンブロット法により相対定量した結果を示す図である(不溶性画分)。左：ウェスタンブロッティング、右：NI群のSOD1/beta-actinを1.0とし、各OPC投与群のSOD1量を示すグラフ、データは平均±SD、n=3 実施例で作製した抗SOD1抗体遺伝子を挿入したpCAG-FctHe80 p/lΔMG scFvプラスミドの構成を示す図である。 scFvをコードするボルナウイルスベクター導入間葉系幹細胞の培養上清のウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。 scFvをコードするウイルスベクターを間葉系幹細胞に導入後に発現するscFv mRNAのGAPDHに対する相対量を示すグラフである。使用したウイルスベクターは、LeV-CMV: CSII-CMV scFv、LeV-EF1a: CSII-EF scFv、ボルナウイルスベクター: pCAG-FctHe80 p/lΔMG scFvである。データは平均±SD、n=3 scFvをコードするウイルスベクターを間葉系幹細胞に導入後に分泌するscFvの相対発光量を示すグラフである。使用したウイルスベクターは、LeV-CMV: CSII-CMV scFv、LeV-EF1a: CSII-EF scFv、ボルナウイルスベクター: pCAG-FctHe80 p/lΔMG scFvである。データは平均±SD、n=3 scFvをコードするウイルスベクターを間葉系幹細胞に導入後に検出されるscFvのDNAの相対量を示すグラフである。使用したウイルスベクターは、LeV-CMV: CSII-CMV scFv、LeV-EF1a: CSII-EF scFv、ボルナウイルスベクター: pCAG-FctHe80 p/lΔMG scFvである。データは平均、n=3
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　なお、本明細書において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。
　また、本発明において「核酸」とはRNA又はDNAを意味する。本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、2本鎖DNA、1本鎖DNA(センス鎖又はアンチセンス鎖)、及びそれらの断片が含まれる。また、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
　本発明において、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は同義であって、これらはDNA及びRNAの両方を含み、2本鎖であっても1本鎖であってもよい。
　本明細書において、「SOD1」は特に明示が無い限りタンパク質を意味するものとするが、遺伝子として解釈することが適切な場合は遺伝子を意味するものとする。
　なお、以下に示すRefSeq IDはNCBIのweb siteに登録されているものである。
　本発明のボルナウイルスベクターは、変異型SOD1タンパク質に結合性を有し、
　3以下のアミノ酸置換をしてもよい、GFSLNTSGMG (配列番号１)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、IWWDDDK (配列番号２)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及びARLGYAMDY (配列番号３)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は
　3以下のアミノ酸置換をしてもよい、QNVGGTN (配列番号４)のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、SASのアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及びQQYYIYPYT (配列番号５)のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体又は抗体断片(以下、「本発明の抗体又は抗体断片」と称することもある)をコードする核酸(以下、「本発明の核酸」と称することもある)を有することを特徴とする。
　スーパーオキシドディスムターゼ(SOD)は、スーパオキシドアニオンを酸素と過酸化水素に不均化する反応を触媒する酵素である(EC 1.15.1.1)。ヒトでは、SODは3種の形態が存在し、SOD1は細胞質に存在し通常2量体である。SOD2はミトコンドリアに存在し、SOD3は細胞外に存在し、これらは通常4量体である。SOD1とSOD3は反応中心に銅と亜鉛とを含み、SOD2は反応中心にマンガンを含む。
　本発明におけるSOD1は、通常、動物由来であり、好ましくは哺乳動物由来、特に好ましくはヒト由来である。
　ヒト由来のSOD1タンパク質のアミノ酸配列は、RefSeq Accession No.NP_000445として登録され、配列番号６に示されている。また、ヒト由来のSOD1タンパク質をコードする遺伝子は、RefSeq Accession No.NM_000454として登録され、その塩基配列は配列番号７に示されている。
　本発明における変異型SOD1とは、アミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されることなどによりタンパク質に変異が生じることで、天然構造とは異なる構造にフォールディングしたSOD1のことであり、特にALSと関連する病原構造を有するSOD1のことである。変異型SOD1はタンパク質配列の変異によるものであってもよいし、又は他の修飾によるものであってもよい。また、変異型SOD1とは、孤発性変異又は家族性変異のいずれの変異を有するものであってもよく、特に家族性変異を有するSOD1である。
　本発明の抗体又は抗体断片に含まれる上記CDR (相補性決定領域)は、変異型SOD1に結合性を有することを特徴とする。本発明の抗体又は抗体断片は、変異型SOD1に特異的に結合し、正常構造を有する野生型SOD1には結合しないことが望ましい。
　本発明の抗体又は抗体断片は、好ましくは、3以下のアミノ酸置換をしてもよい、GFSLNTSGMG (配列番号１)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、IWWDDDK (配列番号２)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及びARLGYAMDY (配列番号３)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに3以下のアミノ酸置換をしてもよい、QNVGGTN (配列番号４)のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、SASのアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及びQQYYIYPYT (配列番号５)のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む。
　アミノ酸置換は、抗体又は抗体断片の変異型SOD1に対する結合性が維持されるように行われる。上記「3以下のアミノ酸置換をしてもよい」とは、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域において合計3個以下のアミノ酸を置換してもよいことを意味し、アミノ酸置換はCDRの部分で行われるのが望ましい。
　アミノ酸置換の数は、好ましくは2以下、より好ましくは1以下であり、更に好ましくは0である。アミノ酸を置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、元の抗体断片の活性が維持されやすいと考えられる。特定のアミノ酸配列において、アミノ酸を置換させる技術は公知である。
　抗体断片とは、その抗体断片が由来する抗体の結合活性の一部又は全部を保持する抗体の一部を示すものとする。抗体断片としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFab、scFv、dsFv、ds-scFv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディなどが挙げられる。なお、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディは、同種又は異なる種類の組合せのいずれであってもよい。
　本発明の抗体断片としては、scFvであることが望ましい。scFvとは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とからなるFvを、適当なペプチドリンカーで連絡した抗体断片のことである。scFvとしては、VHとVLとがいずれの順序で結合しているものも使用することができる。
　本発明の抗体又は抗体断片の可変領域におけるフレームワーク領域(FR領域)の配列は、抗体断片が変異型SOD1に結合性を有する限り特に制限されず、いずれの配列も使用することができる。本発明の抗体又は抗体断片は、フレームワーク領域がヒト由来であるヒト化抗体又は抗体断片であることが望ましい。このようなヒト化抗体又は抗体断片は公知の方法により作製することができる。
　本発明の抗体又は抗体断片としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどいずれの動物由来のものであってもよく、特に限定されない。また、本発明の抗体又は抗体断片のアイソタイプも特に限定されず、IgG (IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA、IgD、IgE及びIgMのいずれであってもよい。また、本発明の抗体又は抗体断片のN末端及び／又はC末端には、任意の機能性ペプチドドメイン(例えば、シグナル配列、血液脳関門透過性ペプチド)などが付加されていてもよい。
　本発明の抗体又は抗体断片は、アミノ酸置換の部位を問わず、幅広い種類の変異型SOD1タンパク質を認識することが可能であり、SOD1遺伝子に突然変異を有するALSの予防、治療のための抗体又は抗体断片として用途が広い。例えば、A4V、C6G、H46R、G85R、G93A、C111Y、I112T、I113Tなどの変異型SOD1タンパク質を認識することが可能である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは変異遺伝子特異的な治療が必要となるが、本発明の抗体又は抗体断片は変異の種類を問わず予防及び治療に利用可能である。
　本発明の核酸は、上記抗体又は抗体断片をコードすることを特徴とする。当該核酸には、転写されるmRNAの非翻訳領域に翻訳向上及びRNA安定性を向上させるための配列などが付加されていてもよい。当該核酸は、PCR法、化学合成、生化学的切断／再結合などの常法で作製することができる。
　本発明のボルナウイルスベクターは、上記抗体又は抗体断片を産生させるためのものであって、上記核酸を有することを特徴とする。また、本発明のボルナウイルスベクターは、上記核酸以外の遺伝子を含んでいてもよい。当該ボルナウイルスベクターとしては、特に制限されず、公知のボルナウイルスベクターを広く使用することができる(例えば、国際公開第2010/113647号、日本国特開2018-148865号公報、Microbiol Immunol 2017 Sep;61(9):380-386、J Virol. 2011 Dec;85(23):12170-8、Sci Rep. 2016 May 18;6:26154等参照)。また、上記核酸は、公知の方法によりベクターに挿入することができる。ボルナウイルスベクターは、ウイルスが細胞核で染色体外RNA (エピソーマル)として存在し、分裂及び増殖細胞でも染色体に局在することで半永続的に感染を維持することができる。そして、細胞内で、N、P、X、Lタンパク質(ウイルス由来)と目的遺伝子(目的RNA)とを常時発現させる。
　なお、BDVゲノムには、少なくとも６つのタンパク質、すなわち核タンパク質(Nタンパク質)、Xタンパク質、リン酸化タンパク質(Pタンパク質)、マトリックスタンパク質(Mタンパク質)、表面糖タンパク質(Gタンパク質)及びRNA依存性RNAポリメラーゼ(Lタンパク質)がコードされている。BDVゲノムは、N、X、P、M、G及びLの各遺伝子を、3’末端からこの順に有する。本明細書中、Gタンパク質、Mタンパク質、Nタンパク質、Pタンパク質及びLタンパク質をコードするウイルスRNAを、それぞれG遺伝子、M遺伝子、N遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子という。
　ボルナウイルスベクター及びその調製方法、ボルナウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルス及びその調製方法、当該ウイルスに細胞を感染させる方法などは周知であり、例えば、国際公開第2010/113647号、日本国特開2018-148865号公報、Microbiol Immunol 2017 Sep;61(9):380-386、J Virol. 2011 Dec;85(23):12170-8、Sci Rep. 2016 May 18;6:26154等の記載を参考にして実施することができる。
　本発明のボルナウイルスベクターの具体例としては、（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に本発明の核酸が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、（ｂ）リボザイムをコードするDNA及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、且つ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されている、ものを挙げることができる。
　このような（ａ）組換えウイルスRNAのcDNAとして、BDVゲノム又はBDVゲノムにおいてG遺伝子及びM遺伝子のいずれか又は両方が破壊された配列において、P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に本発明の核酸が挿入された配列をコードする組換えウイルスRNAのcDNAが好ましい。
　中でも、（ａ）組換えウイルスRNAのcDNAとして、BDVゲノムにおいてG遺伝子及びM遺伝子のいずれか又は両方が破壊された配列を有し、P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に本発明の核酸が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAがより好ましい。更に好ましくは、BDVゲノムにおいてG遺伝子が破壊された配列を有し、且つP遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に本発明の核酸が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNAである。G遺伝子が破壊されることにより、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、導入された細胞以外の細胞に伝播しないため、病原性が低減されて安全性が高いものとなる。
　また、（ａ）組換えウイルスRNAのcDNAとしては、BDVゲノムをコードするcDNAのP遺伝子の翻訳領域とM遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に本発明の核酸を挿入した組換えウイルスのcDNAを用いることもできる。
　BDVゲノムは、Bornaviridae (ボルナウイルス科)に属するウイルス又はその変異株の遺伝子であればよい。ボルナウイルス科に属するウイルスとしては、例えば、He80、H1766、Strain V、huP2br等が挙げられる。変異株としては、例えば、No/98、Bo/04w、HOT6等が挙げられる。
　（ａ）組換えウイルスRNAのcDNAとしては、BDVゲノムにおけるG遺伝子が破壊され、且つ鳥ボルナウイルスゲノム遺伝子におけるG遺伝子が挿入された配列を有する組換えBDVゲノムのcDNAを使用してもよい(日本国特開2018-148865号公報参照)。これにより、得られる組換えウイルスの産生能及び回収率がより高く、本発明の核酸を効率よく導入することができる。
　（ｂ）リボザイムをコードするDNAのリボザイムとしては、（ａ）組換えウイルスRNAのcDNAから転写された本発明の核酸を切断することができる配列のものであればよく、例えば、ハンマーヘッドリボザイム(HamRz)、δ型肝炎ウイルスリボザイム(HDVRz)、ヘアピンリボザイム、人工リボザイム等のリボザイムをコードするcDNA等のDNAが挙げられる。中でも、ハンマーヘッドリボザイム(HamRz)、δ型肝炎ウイルスリボザイム(HDVRz)が好ましい。また、（ａ）組換えBDVゲノムのcDNAの上流、すなわち3’末端側に（ｂ１）HamRzをコードするDNA (好ましくはcDNA)が配置され、且つ該（ａ）の下流、すなわち5’末端側に（ｂ２）HDVRzをコードするDNA (好ましくはcDNA)配列が配置されていることが特に好ましい。これにより、細胞における本発明の核酸の発現効率が向上する。
　（ｃ）プロモーター配列としては、RNAポリメラーゼII系のプロモーター配列、RNAポリメラーゼI系プロモーター配列、T7ポリメラーゼ系プロモーター配列が挙げられ、中でもRNAポリメラーゼII系のプロモーター配列が好ましい。RNAポリメラーゼII系のプロモーターとしては、CMVプロモーター、CAGGSプロモーターが挙げられる。中でも、CAGGSプロモーターが特に好ましい。
　本発明のボルナウイルスベクターは、SV40ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列の１部又は全部の配列、エンハンサー、アクティベーター(例えば、トランス作用因子)、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列も更に含み得る。本発明のウイルスベクターは、線状DNA又は環状DNAのいずれであってもよく、細胞に導入する際には環状であることが好ましい。
　本発明の組換えウイルスは、上記ボルナウイルスベクターにコードされるRNAを含むことを特徴とする。本発明の組換えウイルスは、好ましくは、上記ボルナウイルスベクターにコードされるRNA、並びにBDVのNタンパク質、BDVのPタンパク質及びBDVのLタンパク質を含む組換えウイルスである。本発明の組換えウイルスは、上記組換えウイルスRNAを含むことにより、細胞に感染後、持続的に本発明の抗体又は抗体断片を発現することができる持続感染型の組換えウイルスである。組換えウイルスは、所望によりBDVのGタンパク質又は他のウイルスの外殻タンパク質を有していてもよく、さらに、BDVのMタンパク質を有していてもよい。
　本発明の組換えウイルスは、例えば、上記ボルナウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてBDVのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、及び該ボルナウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含む方法により作製することができる。この際に、G遺伝子及びM遺伝子欠損型のボルナウイルスベクターを用いる場合には、上記BDVのN遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と共に、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミド及びBDVウイルスのM遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入することが好ましい。
　本発明の細胞は、上記組換えウイルスに感染することにより本発明の核酸が導入されたものである。本発明の組換えウイルスを細胞に感染させることにより、該ウイルスに組み込まれた本発明の核酸を細胞に導入することができる。
　本発明の細胞としては、特に限定されず、例えば、オリゴデンドロサイト前駆細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞(例えば、骨髄、歯髄、脂肪由来の間葉系幹細胞)等が挙げられ、これらは筋萎縮性側索硬化症の治療及び予防に好適に使用することができる。上記組換えウイルスに感染させる細胞としては、オリゴデンドロサイト前駆細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞以外にも、iPS細胞(人工多能性幹細胞)、ES細胞(胚性幹細胞)、Muse細胞などの多能性幹細胞、グリア系神経前駆細胞、ドパミン神経前駆細胞、ミクログリア、神経前駆細胞も使用可能である。ボルナウイルスベクターは幹細胞への導入効率が高く、遺伝子発現を維持したまま分化誘導が可能なため、iPS細胞、ES細胞、Muse細胞などの多能性幹細胞を本発明の組換えウイルスに感染させた後に、オリゴデンドロサイト前駆細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞等に分化誘導させて得られた細胞も、上記抗体又は抗体断片の発現を維持している。そのため、本発明の細胞としては、上記組換えウイルスに感染させた多能性幹細胞から分化誘導して得られた細胞(例えば、オリゴデンドロサイト前駆細胞、神経幹細胞、神経前駆細胞、間葉系幹細胞等)も含まれる。また、細胞としては、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの哺乳動物の細胞が挙げられ、好ましくはヒトの細胞である。また、細胞は自家細胞及び他家細胞のいずれであってもよい。
　組換えウイルスをin vitroで細胞に感染させる方法としては、組換えウイルスをダルベッコ変法イーグル等の培養培地又はリン酸緩衝生理食塩水等により段階希釈して希釈液を作製することが望ましい。希釈液中の組換えウイルスの濃度としては、ウイルスを感染させる細胞の種類等により適宜選択すればよく、この希釈液を用いて組換えウイルスを細胞に感染させる。
　本発明の医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物に投与されるものであって、上記細胞を含むことを特徴とし、変異型SOD1が蓄積する疾患、特に筋萎縮性側索硬化症の治療及び／又は予防の効果を有する。
　本発明の医薬組成物は、その使用形態に応じて、生物学的に許容される担体、賦形剤等を任意に含有できる。本発明の医薬組成物は、常套手段に従って製造することができる。例えば、噴霧剤等として経鼻的に、水又はそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、懸濁液剤等の注射剤の形で非経口的に使用できる。また、本発明の医薬組成物は、他の公知の低分子医薬と併用して使用することも可能である。そのようなALSの医薬としては、例えば、リルゾール(riluzole)、エダラボン(edaravone)などが挙げられる。
　本発明の医薬組成物における有効成分である細胞の配合量は、剤型、投与経路等に応じて適宜選択され、通常、製剤全量中1.0×103～1.0×1010 cells程度、好ましくは1.0×104～1.0×109 cells程度である。
　本発明の医薬組成物の投与は、局所的であってもよく、全身的であってもよい。投与方法には特に制限はない。投与経路としては、例えば、髄腔内、脳実質内又は静脈内への注射又は点滴、鼻腔内投与等が挙げられる。オリゴデンドロサイト前駆細胞、神経幹細胞は、髄腔内又は脳実質内への投与が可能であり、間葉系幹細胞は髄腔内投与、脳実質内投与、静脈内投与又は鼻腔内投与が可能である。本発明の医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢及び体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定できる。
　本発明の医薬組成物は、投与した細胞が抗体又は抗体断片を分泌させることで、ミスフォールドしたSOD1を分解除去できるため、変異型SOD1が蓄積する疾患の治療に使用することができる。変異型SOD1が蓄積する疾患としては、特に限定されず、例えば、筋萎縮性側索硬化症等が挙げられる。
　本発明のボルナウイルスベクターを用いて、当該ボルナウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルスを作製し、更に当該組換えウイルスを細胞に感染させることで、変異型SOD1タンパク質に結合性を有する抗体又は抗体断片を発現する細胞を生成することができる。そして、本発明の医薬組成物を投与することにより、当該細胞を移植することで、SOD1遺伝子に変異を有するALSの治療及び予防が可能となる。
　以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。
　＜実験方法＞
　・抗SOD1抗体
　以下の実験で使用した変異型SOD1タンパク質に結合性を有する抗SOD1抗体(scFv)のVH及びVLのアミノ酸配列及び塩基配列を以下に示す。下線部分は、順にCDR1、CDR2、CDR3である。
VH (アミノ酸配列)
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGMGVGWIRQPSGRVLEWLAHIWWDDDKRYNPALKSRLTISKDTSTNQVFLKIASVDTTDTATYYCARLGYAMDYWGHGTSVTVS (配列番号８)
VL (アミノ酸配列)
DIVMTQSQKFMSTSLGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYYIYPYTFGGGTKLEI (配列番号９)
VH (塩基配列)(試験例１～３)
CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAACACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAGGGTTCTGGAGTGGCTGGCACACATTTGGTGGGATGATGACAAGCGCTATAACCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACAATCTCCAAGGATACCTCCACCAACCAGGTATTCCTCAAGATCGCCAGTGTGGACACTACAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGACTTGGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCACGGAACCTCAGTCACCGTCTCC (配列番号１０)
VL (塩基配列)(試験例１～３)
GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCACTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGGCAATCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATTACATCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATA (配列番号１１)
VH (塩基配列)(試験例４～６)
CAGGTTACTCTGAAGGAGTCTGGCCCTGGGATACTGCAGCCCTCACAGACCCTGAGTCTGACTTGTTCCTTCTCTGGATTTTCACTGAACACCTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCTTCCGGGAGGGTTCTGGAGTGGCTGGCTCACATCTGGTGGGATGATGATAAGCGCTATAACCCTGCCCTGAAGAGCCGACTGACCATCTCTAAGGATACCTCCACCAACCAGGTATTCCTCAAGATCGCCAGTGTGGACACCACCGATACTGCTACATACTACTGTGCTCGTCTTGGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCACGGAACCTCAGTCACCGTCTCC (配列番号１２)
VL (塩基配列)(試験例４～６)
GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACCTCACTTGGAGACCGAGTCTCAGTCACCTGCAAGGCTTCCCAGAATGTGGGTACAAATGTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGACAGTCTCCTAAGGCACTGATTTACTCGGCTTCCTACCGTTACTCCGGAGTCCCTGATCGTTTCACAGGTAGTGGATCTGGAACAGATTTCACCCTGACCATCAGCAATGTTCAGTCTGAAGATTTGGCAGAGTATTTCTGCCAGCAATATTACATCTATCCGTACACGTTCGGAGGAGGAACCAAGCTGGAAATT (配列番号１３)
　・抗SOD1抗体遺伝子を挿入したpCAG-Fct p/mΔG LL GFP-scFvプラスミドの作製
　日本国特開2018-148865号公報と同様の手順でpCAG-Fct p/m tandem GFP ΔG LLプラスミドを作製した。該プラスミドは外来遺伝子挿入カセットとして、P遺伝子M遺伝子間にAscI、AsiSIサイト及びBstBI、PacIサイトの2カセットを搭載している。eGFP遺伝子発現プラスミド(pcDNA3-eGFP)を鋳型にプライマー及びPrimeSTAR(商標) MAX DNA polymerase (タカラバイオ株式会社)を用いてPCR (98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 5秒、30サイクル)を行った。PCR産物をAscI及びAsiSIを用いてpCAG-Fct p/m tandem GFP ΔG LLと組換えた。次に、抗SOD1抗体scFv cDNAを鋳型にプライマー及びPrimeSTAR MAX DNA polymerase (タカラバイオ株式会社)を用いてPCR (98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 5秒、30サイクル)を行った。PCR産物をBstBI及びPacIを用いてpCAG-Fct p/m tandem GFP ΔG LLと組換えpCAG-Fct p/mΔG LL GFP-scFvを得た(図１)。ここでのscFvにはMycが結合されている。
　・組換えウイルスの作製
　pCAG-Fct p/mΔG LL GFP-scFv及びヘルパープラスミド(N遺伝子発現プラスミド、P遺伝子発現プラスミド、L遺伝子発現プラスミド及びG遺伝子発現プラスミド：それぞれpcN, pCXN2-P、pcL、pcG)をTransIT-293 Transfection Reagent (Mirus Bio社)、Lipofectamine(商標) 2000 (Invitrogen社)、FuGENE(商標) 6 Transfection Reagent (プロメガ株式会社)を用いて293T細胞に導入した。導入に使用したウイルスベクター等の量としては、1×104～1×106の293T細胞に対して、pCAG-Fct p/mΔG LL GFP-scFvを1～4μg使用し、pcN (0.125～0.5μg)、pCXN2-P (0.125～0.05μg)、pcL (0.125～0.5μg)、pcG (0.05～0.125μg)の割合でヘルパープラスミドを加えた。この際、pcN及びpCXN2-Pに関してはborna disease virus 1 (BoDV-1)のみならずborna disease virus 2 (BoDV-2)の遺伝子配列を挿入したヘルパープラスミドを用いてもよい。
　ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを293T細胞に導入後、37℃で培養し、導入3日後に細胞を継代し、さらにG遺伝子恒常発現Vero細胞(Vero-G細胞)と共培養した。該Vero-G細胞を組換えウイルス感染Vero細胞として回収した。
　・組換えウイルス（ボルナウイルスベクター）の回収
　上記にて調製した組換えウイルス感染Vero-G細胞をPBS緩衝液にて2回洗浄し、2.5 mg/l-トリプシン/1 mmol/l-EDTA溶液(ナカライテスク株式会社)処理にて細胞懸濁後、3,500 rpm, 5分間遠心分離し感染細胞を回収した。遠心分離後、感染細胞をOpti-MEM (Thermo Fisher Scientific社) 500μLに懸濁しBIORUPTOR II (ソニック・バイオ株式会社)を用いて同細胞を超音波破砕した。超音波破砕後、細胞破砕液を1,200 xgで25分間4℃にて遠心し上清をウイルスベクター溶液として回収、-80℃に保存した。
　・ラットからのオリゴデンドロサイト前駆細胞(OPC)の採取と培養
　新生(0－2日目)野生型SDラットに対して、イソフルラン吸入麻酔下に安楽死を施行し、初代培養系を作製した。イージーフラスコ75 cm (Nunc)に1フラスコ当たり2匹分の大脳皮質より単離したMixed glia (アストロサイトとミクログリアとOPCとが混在した状態)を37℃で2週間培養し、24時間震盪することによりOPCを単離した。単離したOPCはOPC proliferation培地(49 mL Neurobasal medium (Invitrogen社), 1 mL Serum free-B27 supplement (Invitrogen社), 5μL Human PDGF-AA (Peprotech社), 5μL FGF-Basic (Peprotech社)を混合)に1 mlあたり200000万個の濃度で撒き、37℃にて培養した。
　・OPCへのベクター導入
　10 cmディッシュに播種し培養したOPCの培養上清を除去後、上記にて調製したウイルスベクター溶液をOPCに加え1時間37℃にて静置した。静置後、十分量のOpti-MEMにて洗浄しOPC proliferation培地(49 mL Neurobasal medium (Invitrogen), 1 mL Serum free-B27 supplement (Invitrogen), 5μL Human PDGF-AA (Peprotech社), 5μL FGF-Basic (Peprotech社)を混合)を2.5 mL加え37℃にて培養した。
　・ボルナウイルスベクター導入OPCの移植
　10 cmディッシュで培養後の感染OPCをaccumax (ナカライテスク株式会社)で剥がしたのち500Gで10分間遠心分離後、10μlのOPC proliferation培地に溶解した1.0×106個のOPCが入るように調整する。生後19週目のSOD1H46Rラットにイソフルラン吸入麻酔下に後頭部を切開し、後頭骨と第一頸椎の間より上記のOPC溶解培地10μlを投与した。
　試験例１
　上記の方法にて回収したウイルスベクターをOPCへ接種した。接種し3日後、該OPCを蛍光顕微鏡で観察した像が図２である。ウイルスベクターに挿入したGFPがOPC内で発現し、GFP蛍光が観察された。
　また、該OPCの培養上清を回収し、3,500 rpm, 5分間 4℃にて遠心分離後、培養上清に等量の2×SDS-Sample 緩衝液(10%メルカプトエタノール(富士フイルム和光純薬株式会社)、4% SDS (富士フイルム和光純薬株式会社)、0.3 M スクロース(富士フイルム和光純薬株式会社)、0.01% BPB (富士フイルム和光純薬株式会社)を含む125 mM Tris-HCl 緩衝液(Tris、ナカライテスク株式会社)(HCl、富士フイルム和光純薬株式会社))を添加し、95℃で5分間加熱した。加熱後、調製したサンプルとAny kDミニプロティアンTGXプレキャストゲル(Bio-Rad Laboratories社)とを用いてSDS-PAGEを行い、泳動後、Trans-Blot Turbo PVDF Transfer Pack (Bio-Rad Laboratories社)にてPVDF膜へとセミドライ式ブロッティング法により転写した。膜へのタンパク質転写後、Blocking One (ナカライテスク株式会社)を用いてブロッキングをおこない、0.1% Tween(商標)-20 (富士フイルム和光純薬株式会社)を含むTBS-T緩衝液で洗浄した。
　scFvを検出するため、CanGet Signal Immunoreaction Enhancer Solution 1 (東洋紡株式会社)で希釈した抗Mycモノクローナル抗体9E10 (Merck Millipore)と転写後のPVDF膜とを反応させ1時間室温にて静置した。静置後TBS-Tで3回洗浄し、CanGet Signal Immunoreaction Enhancer Solution 2 (東洋紡株式会社)で希釈したPeroxidase- conjugated anti mouse IgG antibody (Jackson ImmunoResearch社)とPVDF膜とを反応させ同様に1時間室温にて静置した。静置後、TBS-Tにて洗浄しAmersham ECL Prime (GE Healthcare社)及びImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare社)を用いてOPC上清中のscFvを検出した。
　結果を図３に示す。その結果、scFvをコードするベクター導入OPCの培養上清でバンド(scFv)が検出され(3レーン目)、また細胞外分泌阻害剤であるBrefeldin Aを添加し培養した場合(4レーン目)は検出されるバンド強度は非添加と比較し弱くなった。以上のことから、ボルナウイルスベクターに由来するscFvは細胞内輸送機構を介してOPCの培養上清中に分泌されることが示唆された。
　試験例２
　H46R変異型SOD1トランスジェニックラットの髄腔内に培養液(NI : n=10), GFP搭載ボルナウイルスベクターを導入したOPC (OPC BoDV GFP : n=10)、GFP及びscFvを搭載したボルナウイルスベクターを導入したOPC (OPC BoDV scFv : n=10)を投与した。投与したOPCの細胞数は1個体あたり1.0×106細胞であり10μLの培地に懸濁し投与した。各群のトランスジェニックマウスについて生存率試験、体重変動、傾斜プレート試験、握力試験、後足反射試験を行った。
生存率試験：各群の生存率をKaplan-Meier曲線にて示した。
体重変動：測定日ごとに各個体の体重を測定し、測定初日の体重(g)を100%とした体重減少をプロットした。
傾斜プレート試験：各個体を平面板の上に載せ、5秒間以上個体が倒れることなく姿勢を維持できる最大角度を測定することで筋力の指標とした。
握力試験：マウス・ラット握力測定器(室町機械株式会社)を用いて各個体のしっぽを持ち前足を握力測定器にかけ尾をゆっくり引っ張り5回繰り返し、最大値をその日の測定値とした。
後足反射試験：各個体の尾を持ち上げ四肢が進展する反射反応を利用しALSの症状進行を解析した。麻痺の指標として麻痺なしが0点、四肢のうち1本が進展すれば1点、4本すべて進展すれば4点とスコア化し各測定日にて測定した。
　上記の結果を図４に示す。その結果、NI群及びOPC GFPと比較し、OPC scFv群において生存率が向上し(図４Ａ)、また体重変動が改善された(図４Ｂ)。またALS症状の指標として傾斜プレート試験(図４Ｃ)、握力試験(図４Ｄ)、後足反射試験(図４Ｅ)を行った結果、すべての試験においてOPC scFv群はALS症状の緩和が示唆された。
　試験例３
　OPCを移植し8週間後、各個体より組織を採取し腰髄内SOD1量をウェスタンブロット法により相対定量した。採取した組織をRIPAバッファー(50 mM Tris-HCL pH7.7, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40 substitute, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS含有)にて溶解し抽出した画分を「可溶性画分：soluble」、RIPAバッファーで溶解後の残渣を2% SDSにて抽出した画分を「不溶性画分：insoluble」とし、上記と同様に抗Mycモノクローナル抗体9E10 (Merck Millipore)を用いてウェスタンブロットを行った。ALSの原因となる凝集性SOD1は不溶性画分に抽出される。同サンプルの内在性コントロールとしてbeta-Actinも同時に抗beta-actin抗体(Sigma-Aldrich社)を用いて検出した。
　結果を図５及び６に示す。検出された各バンドの強度をもとにSOD1/beta-actin比を算出し、相対的SOD1量をグラフに表した。NI群のSOD1/beta-actinを1.0とし、各OPC投与群のSOD1量を示す。その結果、OPC scFv群はNI群、OPC GFP群と比較し顕著に検出されるSOD1は減少しており、scFvにより生体内においてSOD1が分解されることが示唆された。
　・抗SOD1抗体遺伝子を挿入したpCAG-FctHe80 p/lΔMG scFvプラスミドの作製
　Fujino K et al. (Microbiol Immunol. 2017 Sep;61(9):380-386.doi: 10.1111/1348-0421.12505.)と同様の手順でpCAG-FctHe80 p/lΔMG scFvプラスミドを作製した。該プラスミドは外来遺伝子挿入カセットとして、P遺伝子L遺伝子間にBstBI、PacIサイトのカセットを搭載している。抗SOD1抗体scFv cDNAを鋳型にプライマー及びPrimeSTAR MAX DNA polymerase (タカラバイオ株式会社)を用いてPCR (98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 5秒、35サイクル)を行った。PCR産物をBstBI及びPacIを用いpCAG-FctHe80 p/lΔMGプラスミドと組換えpCAG-FctHe80 p/lΔMG scFvプラスミドとを得た(図７)。ここでのscFvにはMycが結合されている。
　・M及びG遺伝子欠損組換えウイルスの作製
　pCAG-FctHe80 p/lΔMG scFv及びヘルパープラスミド(N遺伝子発現プラスミド、P遺伝子発現プラスミド、L遺伝子発現プラスミド、M遺伝子発現プラスミド及びG遺伝子発現プラスミド：それぞれpcN, pCXN2-P、pcL、pcM、pcG)をTransIT-293 Transfection Reagent (Mirus Bio社)を用いて293T細胞に導入した。導入に使用したウイルスベクター等の量としては、1×104～1×106の293T細胞に対しpCAG-FctHe80 p/lΔMG scFvを1～4μg使用し、pcN (0.125～0.5μg)、pCXN2-P (0.125～0.05μg)、pcL (0.125～0.5μg)、pcM (0.05～0.125μg)、pcG (0.05～0.125μg)の割合でヘルパープラスミドを加えた。この際、pcN及びpCXN2-Pに関してはborna disease virus 1(BoDV-1)のみならずborna disease virus 2 (BoDV-2)の遺伝子配列を挿入したヘルパープラスミドを用いてもよい。
　ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを293T細胞に導入後、37℃で培養し、導入3日後に細胞を継代し、さらにM及びG遺伝子恒常発現Vero細胞(Vero-MG細胞)と共培養した。該Vero-MG細胞を組換えウイルス感染Vero細胞として回収した。
　・M及びG遺伝子欠損組換えウイルスの回収
　上記にて調製した組換えウイルス感染Vero-MG細胞を20 mM HEPES緩衝液(Thermo Fisher Scientific社、pH7.5)にて2回洗浄後、20 mM HEPES (pH7.5)/250 mM MgCl2/1% FCS緩衝液を添加し37℃にて90分静置した。静置後添加した緩衝液を回収し、3,500 rpmで5分間4℃にて遠心分離により得た上清をウイルスベクター溶液とし-80℃に保存した。
　・間葉系幹細胞へのボルナウイルスベクターの導入
　RetroNectin(商標) (タカラバイオ社)をコーティングした6ウェルプレートにヒト骨髄由来間葉系幹細胞(MSC)(PromoCell社 #C-12974)を播種し、Mesenchymal Stem Cell Growth Medium XF (PromoCell社)にて培養した間葉系幹細胞の培養上清を除去後、上記にて調製したウイルスベクター溶液をMOI0.25もしくはMOI0.5で間葉系幹細胞に添加し90分間37℃にて静置した。静置後、十分量のMesenchymal Stem Cell Growth Medium XFで2回洗浄し、再び37℃にて培養を続けた。
　試験例４
　接種3日及び6日後の培養液を回収し、3,500 rpmで5分間4℃にて遠心分離により得た上清をAmicon Ultra 10K (Merck Millipore)にて10倍濃縮した。濃縮した培養上清に等量の2×SDS-Sample 緩衝液(10%メルカプトエタノール(富士フイルム和光純薬株式会社)、4% SDS (富士フイルム和光純薬株式会社)、0.3 M スクロース(富士フイルム和光純薬株式会社)、0.01% BPB (富士フイルム和光純薬株式会社)を含む125 mM Tris-HCl 緩衝液(Tris、ナカライテスク株式会社)(HCl、富士フイルム和光純薬株式会社))を添加し、95℃で5分間加熱した。加熱後、調製したサンプルとAny kDミニプロティアンTGXプレキャストゲル(Bio-Rad Laboratories社)とを用いてSDS-PAGEを行い、泳動後、Trans-Blot Turbo PVDF Transfer Pack (Bio-Rad Laboratories社)にてPVDF膜へとセミドライ式ブロッティング法により転写した。膜へのタンパク質転写後、Blocking One (ナカライテスク株式会社)を用いてブロッキングをおこない、0.1% Tween-20 (富士フイルム和光純薬株式会社)を含むTBS-T緩衝液で洗浄した。
　scFvを検出するため、CanGet Signal Immunoreaction Enhancer Solution 1 (東洋紡株式会社)で希釈した抗Mycモノクローナル抗体9E10 (Merck Millipore)もしくは抗α-チューブリン抗体(Sigma-Aldrich社)と転写後のPVDF膜とを反応させ1時間室温にて静置した。静置後TBS-Tで3回洗浄し、CanGet Signal Immunoreaction Enhancer Solution 2 (東洋紡株式会社)で希釈したPeroxidase- conjugated anti mouse IgG antibody (Jackson ImmunoResearch社)とPVDF膜とを反応させ同様に1時間室温にて静置した。静置後、TBS-Tにて洗浄しAmersham ECL Prime (GE Healthcare社)及びImageQuant LAS 4000mini (GE Healthcare社)を用いて間葉系幹細胞上清中に分泌されたscFvを検出した。
　結果を図８に示す。その結果、scFvをコードするベクター導入間葉系幹細胞の培養上清でバンド(scFv)が検出され(3～6レーン目)、また導入したベクター量依存的に、検出されるバンド強度MOI0.25と比較しMOI0.5のバンドは強くなった。1レーン目の非導入MSCはボルナウイルスベクターを導入していないMSC、2レーン目に導入MSC(Ctrl)はscFvをコードするベクターの代わりにGFPをコードしたボルナウイルスベクターを導入したMSCを示す。以上のことから、ボルナウイルスベクターに由来するscFvは間葉系幹細胞の培養上清中に分泌されることが示唆された。
　・抗SOD1抗体遺伝子を挿入したレンチウイルスベクターの作製
　Miyoshi, H et al. (Gene delivery to hematopoietic stem cells using lentiviral vectors. Methods Mol. Biol. 246:429-38, 2004. PMID: 14970608)と同様の手順によりCSII-CMV scFv、CSII-EF scFvプラスミドを作製した。抗SOD1抗体scFv cDNAを鋳型にプライマー及びPrimeSTAR MAX DNA polymerase (タカラバイオ株式会社)を用いてPCR (98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 5秒、35サイクル)を行った。PCR産物をXhoI及びBamHIを用いCSII-CMV MSCもしくはCSII-EF MCSプラスミドと組換えCSII-CMV scFv、CSII-EF scFvプラスミドとを得た。
　レンチウイルスベクターCSII-CMV scFv又はCSII-EF scFvプラスミド、pCAG-HIVgpプラスミド、pCMV-VSVGプラスミド、pRSV-revプラスミドをTransIT-293 Transfection Reagent (Mirus Bio社)を用いて293T細胞に導入した。導入に使用したウイルスベクター等の量としては、1×105～1×107の293T細胞に対しレンチウイルスベクターCSII-CMV scFv又はCSII-EF scFvを1～4μg、pCAG-HIVgpを0.5～2μg、pCMV-VSVGを0.5～2μg、pRSV-revを0.5～2μgの割合でそれぞれ導入した。プラスミドを293T細胞に導入後、37℃で培養し、導入3日後に培養上清をレンチウイルスベクター溶液として回収した。回収したレンチウイルスベクター溶液にLenti-X Concentrator (クロンテック)を1/3量加え懸濁したのち、4℃にて16時間静置した。静置後、混合液を1,500 xgにて45分間遠心し上清を除去したのちのペレットをPBSにて再懸濁することでレンチウイルスベクター溶液を10～100倍濃縮にした。この濃縮したレンチウイルスベクター溶液は-80℃に保存した。
　・試験例５
　pCAG-FctHe80 p/lΔMG scFv、CSII-CMV scFv、及びCSII-EF scFvレンチウイルスベクターをMesenchymal Stem Cell Growth Medium XFで培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞にMOI 0.2で導入した。導入2日後及び4日後にRNeasy mini kit (QIAGEN社)を用いて細胞からRNAを抽出した。抽出したRNAとVerso cDNA Synthesis kit (Thermo Fisher Scientific社)を用いてcDNAを合成後、scFv又はGAPDH遺伝子特異的プライマー及びプローブとLuna Universal qPCR Master mix (New England Biolabs社)とを用いてRT-qPCR法をCFX96 TouchリアルタイムPCR解析システム(Bio-Rad Laboratories社)にて実施した。
　ボルナウイルスベクター導入2日後のGAPDHを内在性コントロールとしたscFv mRNA量を基準とし、各サンプルのscFv mRNA量を相対比較した。結果を図９に示す。その結果、導入2日後時点において、ボルナウイルスベクターはレンチウイルスベクターと比較し発現量は低い一方で、導入4日後においてはレンチウイルスベクターの1.5倍量のmRNA発現が確認された。
　上記と同様の手順により、scFvのC末端にHiBitタグを付加した遺伝子をコードしたpCAG-FctHe80 p/lΔMG scFv-HiBit、及びCSII-CMV scFv-HiBit、CSII-EF scFv-HiBitレンチウイルスベクターを作製した。同様に6ウェルプレートに播種したヒト骨髄由来間葉系幹細胞にMOI 0.2で各ベクター導入し、導入0日目から24日目まで2日ごとに培養上清を100μLずつ回収した。回収した培養上清とNanoGlo HiBit Extracellular Detection System (Promega社)とを用いた化学発光によって、分泌タンパク質をGloMAX Discover Microplate Reader (Promega社)により経時的に定量した。結果を図１０に示す。その結果、導入4日後の時点でレンチウイルスベクター導入細胞とほぼ同等の化学発光が検出され、分泌されたscFv量は同程度であることが示唆された。また導入24日後までに発光量に顕著な減少は認められず、持続的に間葉系幹細胞からscFvが分泌されることが示唆された。
　・試験例６
　上記と同様の手順により、各ウイルスベクターをヒト骨髄由来間葉系幹細胞にMOI 0.2で導入し2日及び4日後に細胞からDNAを回収した。Qiamp DNA mini kitを用いて細胞DNAを抽出する際にRNase A (QIAGEN社)を添加することでRNAを分解した。DNA精製後に、Qubit dsDNA HS Assay (Thermo Fisher Scientific社)によりDNA濃度を測定した。DNA 200 ngとscFv遺伝子に特異的なプライマーペア及びプローブとを用いたqPCR法にてscFv DNAを定量した。結果を図１１に示す。その結果、レンチウイルスベクター導入細胞からはscFv DNAが検出される一方で、同様に精製したボルナウイルスベクター導入細胞のDNAからはscFv DNAが検出限界以下であった。以上のことから、ボルナウイルスベクター導入間葉系幹細胞において、導入後に生成されるベクター由来外来遺伝子のDNAはレンチウイルスベクターと比較し有意に少なく、宿主ゲノムへのインテグレーションの確率も極めて低いことが示唆された。

Claims (10)

  1. 　変異型SOD1タンパク質に結合性を有し、
    　3以下のアミノ酸置換をしてもよい、GFSLNTSGMG (配列番号１)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR1、IWWDDDK (配列番号２)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR2、及びARLGYAMDY (配列番号３)のアミノ酸配列からなる重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、並びに／又は
    　3以下のアミノ酸置換をしてもよい、QNVGGTN (配列番号４)のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR1、SASのアミノ酸配列からなる軽鎖CDR2、及びQQYYIYPYT (配列番号５)のアミノ酸配列からなる軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域
    を含む、抗体又は抗体断片
    をコードする核酸を有するボルナウイルスベクター。
  2. 　前記抗体断片がFab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、scFab、dsFv、ds-scFv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、又はミニボディである、請求項１に記載のボルナウイルスベクター。
  3. 　前記抗体断片がscFvである、請求項１又は２に記載のボルナウイルスベクター。
  4. 　前記抗体又は抗体断片がヒト化抗体又は抗体断片である、請求項１又は２に記載のボルナウイルスベクター。
  5. 　（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともN遺伝子、X遺伝子、P遺伝子及びL遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記P遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に前記核酸が挿入された配列を有する組換えウイルスRNAのcDNA、（ｂ）リボザイムをコードするDNA及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、且つ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されている、請求項１又は２に記載のボルナウイルスベクター。
  6. 　請求項１又は２に記載のボルナウイルスベクターにコードされるRNAを含む組換えウイルス。
  7. 　請求項６に記載の組換えウイルスに感染することにより前記核酸が導入された細胞。
  8. 　前記細胞が、オリゴデンドロサイト前駆細胞、グリア系神経前駆細胞、ドパミン神経前駆細胞、ミクログリア、神経前駆細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、Muse細胞、iPS細胞又はES細胞である、請求項７に記載の細胞。
  9. 　請求項７に記載の細胞を含む医薬組成物。
  10. 　筋萎縮性側索硬化症の治療及び／又は予防用である、請求項９に記載の医薬組成物。
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