JPWO2010113647A1 - ボルナ病ウイルスを利用するベクター及びその利用 - Google Patents

Abstract

（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されていることを特徴とするウイルスベクター。

Description

本発明は、外来性遺伝子を細胞に導入するためのウイルスベクター、組換えウイルス及びその利用に関する。

外来性遺伝子を生体又は細胞に運搬する手段として、ウイルスベクターを利用する方法が知られている。これまでに、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、センダイウイルスを利用するベクターが開発されている。

しかしながら、これらの既存のウイルスベクターでは、例えばＤＮＡウイルスの場合には宿主染色体にウイルス遺伝子が組み込まれることにより宿主（例えば、ヒト）への病原性が発現するという問題点があった。また、ウイルスによっては感染可能な宿主域が狭く、特定の生物にしか適用できないという問題点や、外来性遺伝子のウイルスゲノムへの組込み部位により遺伝子導入効率に差があり、遺伝子導入効率が悪いという問題点があった。また、生体内での免疫応答によりウイルスが排除されたり、ウイルス遺伝子の変異やプロモーター効率の変化が生じたりすることから、安定性及び持続性が悪いという問題点もあった。

さらに、遺伝子治療等においては、目的とする細胞のみに遺伝子を導入することができる遺伝子導入技術が期待されている。特に、神経系疾患の治療には遺伝子治療が有効であると考えられるため、神経細胞に選択的に遺伝子を導入でき、しかも安全性、安定性、持続性及び遺伝子導入効率が高いウイルスベクターの開発が望まれている。

ボルナ病ウイルス（Borna disease virus：以下、ＢＤＶともいう）は、非分節のマイナス鎖、１本鎖のＲＮＡをゲノムとして持つモノネガウイルス目に属するウイルスであり、神経細胞に感染指向性があるという特徴を有する。さらに、ＢＤＶは細胞核で複製するウイルスであるが、その感染は非細胞障害性であり長期に持続感染するという特徴や、感染可能な宿主域が極めて広いという特徴も有する（非特許文献１及び２等）。

ＢＤＶを利用する外来性遺伝子の細胞への導入技術として、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の発現カセットをＢＤＶゲノムの５’末端側の非翻訳領域に挿入し、この組換えウイルスを高活性のポリメラーゼと共にラットに感染させると、ラットの神経細胞においてＧＦＰ遺伝子が発現したことが報告されている（非特許文献３）。

特許文献１には、（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＧ遺伝子の翻訳領域に任意の外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするｃＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されているウイルスベクターが開示されている。

ＢＤＶを利用する上記技術によれば、中枢神経系の細胞に選択的に外来性遺伝子を挿入することができると考えられる。しかしながら、上記ＢＤＶを用いる技術においては、遺伝子の導入効率が十分高くないため、遺伝子の導入効率をより高くするための改良の余地があった。従って、組換えウイルスの複製効率が高く、感染可能な宿主域が広く、安全性及び外来性遺伝子の導入効率が高く、安定性及び持続性が良好であり、しかも中枢神経系に選択的に外来性遺伝子を導入することができるウイルスベクターは、未だ開発されていなかった。

特開２０１０−２２３３８号公報

蛋白質 核酸 酵素、Ｖｏｌ．５２、Ｎｏ．１０、ｐ．１１６８−１１７４（２００７） 朝長啓造、「ボルナ病ウイルス感染と中枢神経系疾患」、最新医学・第６０巻・第２号（2005年２月号別刷）、７９−８５頁 U. Schneider et al., Journal of Virology (2007) p.7293-7296

本発明は、感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも目的細胞（例えば、脳神経系等の中枢神経系の細胞等）に選択的に外来性遺伝子を導入することができ、かつ目的細胞以外の細胞に伝播しないため病原性が低い（安全性が高い）組換えウイルスを効率よく産生できるウイルスベクター、組換えウイルス及び該組換えウイルスを利用する外来性遺伝子の導入方法、外来性遺伝子導入剤等を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため、本発明者らはＢＤＶゲノム（ＲＮＡウイルスゲノム）における外来性遺伝子の挿入部位について鋭意研究を行った。その結果、ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡ（ＢＤＶゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ）の種々の部位に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスゲノムのｃＤＮＡを含むウイルスベクターを作製し、これらを後述するヘルパープラスミド（ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド（群））と共に細胞に導入して組換えウイルスを産生させ、得られた組換えウイルスを細胞に感染させたところ、ＢＤＶゲノムにおいてＰ遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域（Ｐ遺伝子のＯＲＦの下流に結合する非翻訳領域）に外来性遺伝子を挿入した場合に、該ベクターの組換えウイルスの産生能が高い（該ベクターから産生される組換えウイルスの複製効率が高い）ことを見出し、さらに、該ベクターから産生される組換えウイルスにより細胞において外来性遺伝子が効率よく発現されること、すなわち細胞に外来性遺伝子を非常に効率よく導入することができることを見出した。

これまで、このようなＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えＢＤＶベクターの作製は不可能であると考えられていたが、本発明者らは、このような組換えＢＤＶベクターの作製に初めて成功した。既存の組換えＢＤＶベクターにおいては、外来性遺伝子をＧ遺伝子領域（特許文献１）又はゲノムの５’末端領域（非特許文献３）に挿入して該遺伝子を発現させていた。しかしながら、外来性遺伝子をＧ遺伝子領域に挿入したベクターは、組換えウイルス産生能が低く、また、該ベクターから産生される組換えウイルスの細胞への感染は一過性であり、持続的に外来性遺伝子を発現できなかった。また、ゲノムの５’末端領域に外来性遺伝子を挿入した組換えＢＤＶベクターは、遺伝子の導入効率が低かった。本発明者らは、Ｐ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えＢＤＶベクターは、既存の組換えＢＤＶベクターよりウイルス産生能が高いものであること、該ベクターから産生される組換えウイルスは、脳神経系細胞においても高効率に、長期間目的遺伝子を発現することができるものであることを見出し、これらを用いると様々な外来性遺伝子を目的細胞に効率よく導入することができることに想到した。

本発明者らはまた、上記ＢＤＶゲノムのＰ遺伝子のＯＲＦとＭ遺伝子のＯＲＦとの間の非翻訳領域（Ｐ遺伝子のＯＲＦの下流に結合する非翻訳領域）内に外来性遺伝子を挿入した組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡを使用するウイルスベクターにおいて、Ｇ遺伝子をコードする配列を破壊(削除)すると、該ベクターから産生される組換えウイルスの病原性を低減できることを見出した。このようなＧ遺伝子欠損型のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、細胞内における複製能は維持されているため導入された細胞には持続感染するが、Ｇ蛋白質を合成できないため他の細胞に伝播しない。本発明者らは、このようなウイルスベクターにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子を破壊させると、組換えウイルスの細胞内における複製能は維持したまま、その伝播能力をより低減することができることを見出した。さらに、ウイルスベクターにおいて、Ｌ遺伝子のイントロン（Ｇ遺伝子の一部）を削除することにより、ＢＤＶゲノムではＧ遺伝子により分断されているＬ遺伝子のＯＲＦを結合させると、産生される組換えウイルスの複製能力を向上させることができる、すなわち細胞内における外来性遺伝子の複製速度を速くすることができることを見出した。

本発明者らは更に、上記のＧ遺伝子を破壊したウイルスベクターと共に、他のウイルスの外殻蛋白質をコードする遺伝子を用いて組換えウイルスを製造すると、組換えウイルスの細胞指向性を変化させることができるため、種々の細胞に目的遺伝子を効率よく導入できることを見出した。

なお、ＢＤＶゲノムには、少なくとも６つの蛋白質、すなわち核蛋白質（Ｎ蛋白質）、Ｘ蛋白質、リン酸化蛋白質（Ｐ蛋白質）、マトリックス蛋白質（Ｍ蛋白質）、表面糖蛋白質（Ｇ蛋白質）及びＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ蛋白質）がコードされている。図１は、ＢＤＶゲノムの構造を模式的に示す図である。図１において、Ｎ、Ｘ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬは、それぞれの遺伝子のＯＲＦを模式的に示している。ＢＤＶゲノムは、図１に示すように、Ｎ、Ｘ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬの各遺伝子を、３’末端からこの順に有する。本明細書中、Ｇ蛋白質、Ｍ蛋白質、Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質をコードするウイルスＲＮＡを、それぞれＧ遺伝子、Ｍ遺伝子、Ｎ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子という。また、例えば、「Ｇ遺伝子のｃＤＮＡ」とは、Ｇ遺伝子をコードするｃＤＮＡを意味する。

すなわち、本発明は、以下の項１〜項１４に関する。
項１． （ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されていることを特徴とするウイルスベクター。
項２． （ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである項１に記載のウイルスベクター。
項３． （ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子が破壊された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである項１又は２に記載のウイルスベクター。
項４． （ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡである項１に記載のウイルスベクター
項５． （ｃ）プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列であることを特徴とする項１〜４のいずれかに記載のウイルスベクター。
項６． （ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡの上流に（ｂ１）ハンマーヘッドリボザイムをコードするｃＤＮＡが配置され、かつ、該（ａ）の下流に（ｂ２）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするｃＤＮＡ配列が配置されていることを特徴とする項１〜５のいずれかに記載のウイルスベクター。

項７． 項１〜６のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるＲＮＡを含むことを特徴とする組換えウイルス。
項８． 項１〜６のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、及び該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
項９． ヘルパープラスミドとして、さらに、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する項８に記載の組換えウイルスの作製方法。
項１０． ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスのＭ遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する項８又は９に記載の組換えウイルスの作製方法。

項１１． 項７に記載の組換えウイルス、又は項８〜１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを細胞又は動物に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
項１２． 項７に記載の組換えウイルス、又は項８〜１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
項１３． 項７に記載の組換えウイルス、又は項８〜１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
項１４． 項１〜６のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。

本発明はまた、以下の方法、使用等も包含する。
項７に記載の組換えウイルス、又は項８〜１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを動物に投与する脳神経系細胞への外来性遺伝子の導入方法、
項７に記載の組換えウイルス、又は項８〜１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
項７に記載の組換えウイルス、又は項８〜１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスの、脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤製造のための使用。
in vitroの細胞又は動物に外来性遺伝子を導入するための、項７に記載の組換えウイルス、又は項８〜１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。
脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するための、項７に記載の組換えウイルス、又は項８〜１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルス。

本発明によれば、感染可能な宿主域が広く、外来性遺伝子導入効率が高く、ウイルスゲノムが宿主染色体に挿入されないため安全であり、細胞核で非細胞障害的に外来性遺伝子を発現することができるため宿主細胞内での安定性及び持続性が良好であり、しかも脳神経系の細胞等の目的細胞に選択的に外来性遺伝子を導入することができ、かつ目的細胞以外の細胞には伝播しないため病原性が低い（安全性が高い）組換えウイルスを高い生産性で産生できるウイルスベクター及び組換えウイルスを作製することができる。また、本発明によれば、外来性遺伝子を脳神経系の細胞等の目的細胞に選択的にかつ効率よく導入することができ、該細胞において外来性遺伝子を持続的に発現させることができる。さらに、本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、脳神経系細胞等の細胞の核内で持続感染を起こすため、宿主免疫の攻撃を受け難く、排除が起こりにくい。また、本発明の組換えウイルスが持つＰ蛋白質には、宿主免疫の応答経路を阻害するという働きがあり、ウイルス感染細胞では自然免疫の活性化も起こらない。

図１は、ボルナ病ウイルスのゲノム（野生型）の構造を模式的に示す図である。 図２（ａ）は、野生型のＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおけるＰ遺伝子のＯＲＦとＭ遺伝子のＯＲＦとの間の非翻訳領域（ＢＤＶゲノムの塩基の番号で１８７５〜１８９５）を模式的に示した図であり、（ｂ）は、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子挿入部位の一例を模式的に示した図である。 図３は、本発明のウイルスベクターの構造の一例を模式的に示す図である。 図４は、ＢＤＶゲノムの５’末端側の非翻訳領域にＧＦＰ遺伝子を挿入した組換えウイルスベクター（ｒＢＤＶ−５’ＧＦＰ）の構造を模式的に示す図である。 図５は、野生型又は組換え型ＢＤＶに感染したＶｅｒｏ細胞の経時変化（感染後０日から１９日の感染率変化）を示す図である。 図６（ａ）及び（ｂ）は、野生型ＢＤＶ、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び組換えウイルス５’ＧＦＰそれぞれを感染させた細胞における遺伝子の発現をノーザンブロット法により調べた結果（ａ）、及び蛋白質の発現をウェスタンブロット法により調べた結果を示す図（ｂ）である。 図７ａ〜ｆはそれぞれ、野生型ＢＤＶ、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び組換えウイルス５’ＧＦＰそれぞれを感染させた細胞における蛋白質の発現を調べた結果を示す顕微鏡写真である。 図８ａ〜ｆはそれぞれ、野生型ＢＤＶ、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び組換えウイルス５’ＧＦＰそれぞれを感染させた細胞における蛋白質の発現を調べた結果を示す顕微鏡写真である。 図９は、ラット脳へのウイルスの感染を調べる実験方法を説明するための図である。 図１０は、ラット脳へのウイルスの接種部位を示す図である。 図１１は、ラット脳において発現したＢＤＶゲノムのＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す図である。 図１２ａ〜ｄはそれぞれ、組換えウイルス接種後１４日後のラット脳を切開して裏返したマクロ写真（ａ及びｂ）、及び該脳のマクロ蛍光写真（ｃ及びｄ）である。 図１３上図及びａ〜ｄはそれぞれ、ウイルスを感染させたラット脳の大脳皮質のマクロ写真（上図）及び該大脳皮質の切片の顕微鏡写真（ａ〜ｄ）である。 図１４（ａ）及び（ｂ）は、ｒＢＤＶ−ｐ／ｍＤｓＲｅｄベクターから得られた組換えウイルスを感染させた細胞における蛋白質の発現を調べた結果を示す顕微鏡写真である。 図１５（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ、ｒＢＤＶ−ｐ／ｍＬｕｃｉベクターから得られた組換えウイルスを感染させた細胞における蛋白質の発現を調べた結果を示す顕微鏡写真（ａ）及びルシフェラーゼの活性（ｂ）を示す図である。 図１６は、本発明のウイルスベクターの構造の一例を模式的に示す図である。 図１７は、本発明のウイルスベクターの構造の一例を模式的に示す図である。 図１８は、組換えウイルス接種８カ月後のマウスの脳切断面の蛍光顕微鏡写真（図１８ａ：マクロ写真、図１８ｂ：図１８ａの４００倍拡大写真）である。 図１９は、プラスミドp/mGFP ΔGの作製手順の概略を示す図である。 図２０は、プラスミドp/mGFP ΔG LLの作製手順の概略を示す図である。 図２１は、BDVのG遺伝子発現プラスミドの作製手順の概略を示す図である。 図２２は、プラスミドp/mGFPΔG及びp/mGFP ΔG LLそれぞれによる組換えBDV産生能力を比較した図である。 図２３は、G遺伝子安定発現Vero細胞及びVero細胞へのp/mGFP ΔG-LLウイルスの感染率の推移を示す図である。 図２４ａは、野生型ＢＤＶ及びG欠損型組換えウイルスそれぞれを感染させた細胞における蛋白質の発現をウェスタンブロット法により調べた結果を示す図であり、図２４ｂは、G欠損型組換えウイルスの感染によりGFPを発現したVero細胞の蛍光顕微鏡写真である。 図２５は、BDV G遺伝子細胞内領域と水疱性口内炎ウイルス(VSV)のG遺伝子細胞外及び膜貫通領域とを有するキメラ蛋白質発現プラスミドの作製手順の概略を示す図である。 図２６は、ヘルパープラスミドとしてBDVのG遺伝子、又はVSV及び狂犬病ウイルス(Rab)のいずれかの外殻遺伝子を用いた場合のG欠損型組換えウイルスの回収効率を示す図である。 図２７は、M遺伝子を欠損させたプラスミドp/mGFP ΔM-G LLの作製手順の概略を示す図である。 図２８は、p/mGFP ΔM-G LL P-M tandem vectorの作製手順の概略を示す図である。 図２９は、組換えウイルスp/mNEP感染細胞のWestern Blottingの結果を示す図である。 図３０は、組換えウイルスを感染させた細胞におけるNEPの酵素活性を示す図である。 図３１は、p/m miR155導入用ベクター(pSIRIUS-B)の作製手順の概略を示す図である。 図３２は、プラスミドｐ/ｍ miR155の作製手順の概略を示す図である。 図３３は、組換えウイルスを感染させた細胞における標的遺伝子の転写阻害効率を示す図である。 図３４は、プラスミドp/m miRx2の作製手順の概略を示す図である。 図３５は、miRNA×1（p/m miR155）、miRNA×2及びmiRNA×4を挿入したp/mベクターの模式図である。 図３６は、GAPDHに対するmiRNAを挿入した組換えウイルスRNAを有する組換えウイルスp/m-miR-GAPDHを感染させた効果を示す図である。 図３７は、APP(アミロイド前駆蛋白質)に対するmiRNAを挿入した組換えウイルスRNAを有する組換えウイルスp/m-miR-APPを感染させた効果を示す図である。

以下に、本発明を説明する。
１．ウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、（ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されているものである。
以下、上記（ａ）の組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを、単に「（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ」ともいう。本発明のウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）以外の配列を含んでもよい。

（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ
本発明における（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有する組換えＢＤＶ ＲＮＡのｃＤＮＡであり、該組換えＢＤＶ ＲＮＡは、前記Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する。
このような（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡとして、ＢＤＶゲノム又はＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子のいずれか又は両方が破壊された配列において、Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列をコードするｃＤＮＡ等が好適に用いられる。
中でも、本発明における（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡとして、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子のいずれか又は両方が破壊された配列を有し、Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有するＲＮＡのｃＤＮＡが好適である。

本発明における（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、より好ましくは、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである。（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡとして、このようなＧ遺伝子が破壊された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを含むウイルスベクターを、以下、「Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクター」ともいう。Ｇ遺伝子が破壊されていることにより、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、導入された細胞以外の細胞に伝播しないため、病原性が低減されて安全性が高いものとなる。さらに好ましくは、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子が破壊された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである。このような組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡを含むウイルスベクターを、以下、「Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクター」ともいう。Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子が破壊されていることにより、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスの病原性がより低減され、安全性がより高くなる。
遺伝子を破壊するとは、通常、該遺伝子が蛋白質（例えばＧ遺伝子であればＧ蛋白質）をコードすることができる形態で存在しないことを意味する。遺伝子の破壊は、その遺伝子全体を削除することの他、該遺伝子の一部の削除、該遺伝子に他の配列を挿入する、該遺伝子中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する等により行うことができる。

Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクター、及びＧ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターにおいては、ＢＤＶゲノムにおけるＬ遺伝子のイントロンが削除されていることが好ましい。Ｌ遺伝子のイントロンを削除することにより、天然型ＢＤＶゲノムでは分断されているＬ遺伝子のＯＲＦが図１６に示すように連結されるため、組換えウイルスの複製能力、すなわち細胞内での外来性遺伝子の発現効率がより向上する。また、Ｌ遺伝子のイントロンを削除すると、より大きな外来性遺伝子を挿入することが可能となる。Ｌ遺伝子のイントロンの除去は、公知の方法により行うことができる。

本発明における（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡとして、ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡを用いることもできる。このような組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノム（ＲＮＡウイルスゲノム）をコードするｃＤＮＡにおいて、ＢＤＶのＰ遺伝子の翻訳領域（ＯＲＦ）とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に任意の外来性遺伝子が挿入されたものである。

本発明のウイルスベクターにおける（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの構造の一例を、図３に模式的に示す。図３は、ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡである。

本発明のウイルスベクターにおける（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの好ましい構造の一例を、図１６に模式的に示す。図１６に示される組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊（削除）された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである。

本発明のウイルスベクターにおける（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの別の好ましい構造の一例を、図１７に模式的に示す。図１７に示される組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子が破壊（削除）された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである。図１７中の点線で囲まれたＭは、削除されたＭ遺伝子を示す。なお、図３においては、Ｌ遺伝子はＧ遺伝子により分断されているが、図１６及び図１７に示される組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおいては、Ｇ遺伝子の一部の削除によりＢＤＶゲノムにおけるＬ遺伝子のイントロンが削除されているため、Ｌ遺伝子のＯＲＦが図中に矢印で示す部分において結合されている。

本発明におけるＢＤＶゲノムは、Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ（ボルナウイルス科）に属するウイルス又はその変異株の遺伝子であればよい。ボルナウイルス科に属するウイルスとしては、例えば、Ｈｅ８０、Ｈ１７６６、Ｓｔｒａｉｎ Ｖ、ｈｕＰ２ｂｒ等の菌株が挙げられる。変異株としては、例えば、Ｎｏ／９８、Ｂｏ／０４ｗ、ＨＯＴ６等が挙げられる。これらのゲノム配列は、例えば、以下から入手可能である。
Ｈｅ８０；GenBank Accession# L27077, Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C. Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994).
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Ｓｔｒａｉｎ Ｖ；GenBank Accession# U04608, Briese,T., Schneemann,A., Lewis,A.J.,
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ｈｕＰ２ｂｒ；GenBank Accession# AB258389, Nakamura, Y., Takahashi, H., Shoya, Y., Nakaya, T., Watanabe, M., Tomonaga, K., Iwahashi, K., Ameno, K., Momiyama, N., Taniyama, H., Sata, T., Kurata, T., de la Torre, J. C., Ikuta, K. Isolation of Borna disease virus from human brain tissue, J. Virol 74 (2000) 4601-4611.
Ｎｏ／９８；GenBank Accession# AJ311524, Nowotny,N. and Kolodziejek,J. Isolation and characterization of a new subtype of Borna disease virus. J. Gen. Virol. 74, 5655-5658 (2000).
Ｂｏ／０４ｗ；GenBank Accession# AB246670, Watanabe,Y., Ibrahim,M.S., Hagiwara,K., Okamoto,M., Kamitani,W., Yanai,H., Ohtaki,N., Hayashi,Y., Taniyama,H., Ikuta,K. and Tomonaga,K. Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility. Microbes and Infection 9 (2007) 417-427.

また、ＢＤＶゲノムは、ＢＤＶとしての機能が保持されている限り、これらのゲノム配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、１乃至数個（通常１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）であってよい。

ＢＤＶゲノム、及びＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子等が破壊された配列を有するＲＮＡのｃＤＮＡ、すなわちこのような配列のＲＮＡをコードするｃＤＮＡは、当該ウイルスゲノム情報に基づいて調製することができる。例えば、ＲＮＡゲノムから、配列逆転酵素を使用してｃＤＮＡを調製することができる。また、ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊された配列を有するＲＮＡのｃＤＮＡは、例えば、ＢＤＶゲノムのｃＤＮＡを鋳型に、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより容易に作製することができる。ＢＤＶゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子が破壊された配列を有するＲＮＡのｃＤＮＡは、例えば、ＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ又は該ゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊された配列を有するＲＮＡのｃＤＮＡを鋳型に、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行なうことにより容易に作製することができる。また、ＲＮＡゲノムの配列、又は該ＲＮＡゲノムからＧ遺伝子等を欠損させた配列に基づき、ＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。あるいは、本発明における（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡを取得する方法として、公知のＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。ＰＣＲ、プライマーの調製等の操作は、公知の遺伝子工学的手法（遺伝子操作技術）により、行うことができる。

（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、ＢＤＶゲノムにおけるＰ遺伝子のＯＲＦの下流に連結する非翻訳領域内に任意の外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである。Ｐ遺伝子のＯＲＦの下流に連結する非翻訳領域は、例えば、ＢＤＶゲノムにおいては、Ｐ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域（以下、単に「Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域」ともいう）である。外来性遺伝子がこのような箇所に挿入されていることにより、ウイルスベクターの組換えウイルス生産性、すなわち該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスの複製効率を高くすることができるため、効率よく組換えウイルスを産生することができる。また、該ウイルスベクターから産生（複製）される組換えウイルスは、細胞に導入した場合に外来性遺伝子を効率よく発現できるものとなる。従って、本発明のウイルスベクターを細胞に導入した際、又は該ウイルスベクターから産生される組換えＢＤＶを細胞に感染させた際に、任意の外来性遺伝子が効率よく細胞に導入される。すなわち、外来性遺伝子が細胞内において効率よく発現されることになる。図２（ａ）に示すように、野生型のＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおいて、Ｐ遺伝子のＯＲＦの下流に連結する非翻訳領域（すなわちＢＤＶゲノムにおけるＰ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域）（例えば、配列番号１にそのｃＤＮＡ配列が示されるＢＤＶゲノムの塩基の番号で１８７５〜１８９５（すなわち配列番号１の１８７５〜１８９５番の塩基））には、Ｐ遺伝子の停止シグナル配列（配列番号１の塩基の番号で１８７５〜１８８２）及びＭ遺伝子の開始シグナル配列（配列番号１の塩基の番号で１８７５〜１８９０）が存在する。Ｐ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域（例えば、配列番号１の塩基の番号で１８７８〜１８９２の間）における外来性遺伝子の挿入部位としては、Ｐ遺伝子の停止シグナル配列及び／又はＭ遺伝子の開始シグナル配列を含まない領域が好ましく、Ｐ遺伝子の停止シグナル配列及びＭ遺伝子の開始シグナル配列を含まない領域がより好ましく、例えば、配列番号１にそのｃＤＮＡ配列が示されるＢＤＶゲノムであれば、配列番号１の塩基の番号で１８９０と１８９１の間等が特に好ましい。

本発明における組換えＢＤＶゲノムは、外来性遺伝子の両側又は片側（好ましくは、両側）に制限酵素サイトを含むことができる。制限酵素サイトを有すると、外来性遺伝子をＢＤＶゲノムの配列中に容易に組み込みやすくなると共に、外来性遺伝子の蛋白質への翻訳効率が上昇するため好ましい。本発明において、外来性遺伝子の両側又は片側に配置することができる制限酵素サイトとしては、例えば、外来性遺伝子の３’末端側については、Ｂｓｔ ＢＩサイト、Ｐａｃ Ｉサイト、Ｓｓｅ８３８７ Iサイト、Ｓｗａ Ｉサイト、Ｋｐｎ Ｉサイト等が挙げられ、Ｂｓｔ ＢＩサイトが好ましい。外来性遺伝子の５’末端側については、Ｐａｃ Ｉサイト、Ｂｓｔ ＢＩサイト、Ｓｓｅ８３８７ Iサイト、Ｓｗａ Ｉサイト、Ｋｐｎ Ｉサイト等が挙げられ、Ｐａｃ Ｉサイトが好ましい。

また、本発明における組換えＢＤＶゲノムがＭ遺伝子を含む場合には、該組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡは、外来性遺伝子（及び必要に応じてその両側又は片側に配置される制限酵素サイト）とＰ遺伝子のＯＲＦとの間、及び外来性遺伝子（及び必要に応じてその両側又は片側に配置される制限酵素サイト）とＭ遺伝子のＯＲＦとの間にそれぞれ、Ｐ遺伝子の停止シグナル配列及びＭ遺伝子の開始シグナル配列（taaaaaaatcgaatca（配列番号１１））を含む配列が存在することが好ましい。本発明における組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡにおいては、例えば、図２（ｂ）にあるような配列で任意の外来性遺伝子が挿入されていることがより好ましい。図２（ｂ）には、一例としてＭ遺伝子を含む組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡが示されている。Ｍ遺伝子欠損型のウイルスベクターの場合にも、図２（ｂ）に示されるように、外来性遺伝子の下流にＰ遺伝子の停止シグナル配列及びＭ遺伝子の開始シグナル配列（配列番号１１）を含む配列を有することが好ましい。Ｍ遺伝子欠損型のウイルスベクターの場合、図２（ｂ）に示される外来性遺伝子の下流のＰ遺伝子の停止シグナル配列及びＭ遺伝子の開始シグナル配列は、外来性遺伝子の停止シグナル及びＬ遺伝子の開始シグナルとして機能する。なお、図２（ｂ）では、一例として外来性遺伝子の３’末端側にＢｓｔ ＢＩサイト、外来性遺伝子の５’末端側にＰａｃ Ｉサイトをそれぞれ挿入した場合を示しているが、外来性遺伝子の両側に配置する制限酵素サイトは、これらに限定されるものではない。

本発明における外来性遺伝子の種類や長さは特に限定されず、目的に応じて所望の遺伝子を用いることができる。例えば、蛋白質又はペプチドをコードする遺伝子のｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、short hairpin RNA (shRNA)、microRNA (miRNA)をコードするｃＤＮＡ、ＲＮＡアプタマーをコードするｃＤＮＡ等を用いることができる。本発明のウイルスベクターにおいては、１又は２以上の外来性遺伝子を使用することができる。

（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ
リボザイムとしては、（ａ）組換えウイルスのｃＤＮＡから転写された任意の外来性遺伝子を切断することができる配列のものであればよい。（ｂ）としては、例えば、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｍＲｚ）、δ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶＲｚ）、ヘアピンリボザイム、人工リボザイム等のリボザイムをコードするｃＤＮＡ等のＤＮＡが挙げられる。また、リボザイム活性を有する限り、上記リボザイムの改変型リボザイムをコードするｃＤＮＡ等のＤＮＡも使用することができる。改変型リボザイムとしては、共通配列を有し、１〜数個（数個とは、例えば、１０個、好ましくは５個、より好ましくは３個、さらに好ましくは２個である）の塩基が置換、欠損又は付加された塩基配列からなり、かつリボザイムとして機能するポリヌクレオチド等が挙げられる。中でも、本発明におけるリボザイムとしては、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｍＲｚ）、δ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶＲｚ）が好ましい。また、（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡの上流、すなわち３’末端側に（ｂ１）ＨａｍＲｚをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）が配置され、かつ、該（ａ）の下流、すなわち５’末端側に（ｂ２）ＨＤＶＲｚをコードするＤＮＡ（好ましくはｃＤＮＡ）配列が配置されていることが特に好ましい。これにより、細胞における外来性遺伝子の発現効率が向上する。

ＨａｍＲｚの塩基配列は、Yanai et al., Microbes and Infections 8 (2006) 1522-1529、Mercier et al., J. Virol. 76 (2002) 2024-2027及びInoue et al., J. Virol. Methods 107 (2003) 229-236等に記載されている。
ＨＤＶＲｚの塩基配列は、Ferre-D'Amare,A.R., Zhou,K. and Doudna,J.A. Crystal structure of a hepatitis delta virus ribozyme. Nature 395 (6702), 567-574 (1998)
等に記載されている。本発明においては、これらの文献に記載されているＨａｍＲｚの塩基配列をコードするｃＤＮＡを用いることができる。本発明における特に好ましいＨａｍＲｚ及びＨＤＶＲｚの塩基配列を、以下に示す。
ＨａｍＲｚ：
5’-UUGUAGCCGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACUAUAGGAAAGGAAUUCCUAUAGUCAGCGCUACAACAAA-3’（配列番号２）
ＨＤＶＲｚ：
5’-GGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACACCAUUGCACUCCGGUGGCGAAUGGGAC-3’
（配列番号３）

（ｃ）プロモーター配列
本発明における（ｃ）プロモーター配列としては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列、ＲＮＡポリメラーゼＩ系プロモーター配列、Ｔ７ポリメラーゼ系プロモーター配列が挙げられるが、中でもＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列が好ましい。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＣＡＧＧＳプロモーターが挙げられる。中でも、ＣＡＧＧＳプロモーターが特に好ましい。このようなプロモーター配列は、例えば、J.A. Sawicki, R.J. Morris, B. Monks, K. Sakai, J. Miyazaki, A composite CMV-IE enhancer/b-actin promoter is ubiquitously expressed in mouse cutaneous epithelium, Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。

本発明の好ましい態様においては、（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ（組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ）の上流に（ｂ１）ハンマーヘッドリボザイムをコードするｃＤＮＡが配置され、かつ、該（ａ）の下流に（ｂ２）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするｃＤＮＡ配列が配置されている。また、（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターの下流に配置されている。

（ｄ）その他の塩基配列
本発明のウイルスベクターは、ＳＶ４０ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列の１部又は全部の配列を含むことができる。また、ウイルスベクターがＳＶ４０ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列の１部又は全部の配列を含む場合には、該配列は（ａ）及び（ｂ）の下流に配置されていることが好ましい。ＳＶ４０ウイルスＤＮＡの複製開始点／プロモーター領域配列の一部としては、ＳＶ４０複製開始点／プロモーター領域内の５’側の１１３塩基からなる断片が好適である。
ＳＶ４０ウイルス複製開始点／プロモーター領域配列（配列番号４）は、例えば、D.A. Dean, B.S. Dean, S. Muller, L.C. Smith, Sequence requirements for plasmid nuclear import, Exp. Cell. Res. 253 (1999) 713-722等に記載されている。

本発明のウイルスベクターは、本発明の効果を奏する限り、さらに、蛋白質の発現に有利である１又は複数の因子、例えば、エンハンサー、アクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列も含み得る。また、本発明のウイルスベクターは、選択された細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。

本発明のウイルスベクターは、線状ＤＮＡであっても環状ＤＮＡであってもよいが、細胞に導入する際には環状であることが好ましい。環状のウイルスベクターとしては、例えば、本発明のウイルスベクターの必須の配列である上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のＤＮＡ、並びに必要に応じて含まれる上記（ｄ）のＤＮＡが、上述した所定の順番で、市販のプラスミドベクター中に配置されているもの等が挙げられる。市販のプラスミドベクターとしては、ウイルスベクターを導入する細胞内で自己複製可能なものであればよく、例えば、pBluescript SKII(-)、pCAGGS、pCXN2、pCDNA3.1等が挙げられる。

２．ウイルスベクターの作製方法
本発明のウイルスベクターの作製方法としては特に限定されず、自体公知の遺伝子工学的手法を用いればよい。例えば、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法において、ＣＡＴ遺伝子をＢＤＶのゲノム配列に置き換え、さらにＰ遺伝子の下流に連結する非翻訳領域（Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域）内に目的とする外来性遺伝子を挿入することによって、本発明の自己複製型（持続感染型）のウイルスベクターを作製することができる。上記方法により作製されるウイルスベクターは、（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡとして、ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡ（例えば、図３に模式的に示される構造を有する組換えウイルスのｃＤＮＡ）を有するものである。

Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクター、並びにＧ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターは、自体公知の遺伝子工学的手法を用いて、例えば、（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡとして、ＢＤＶゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡ（例えば図３に模式的に示される構造を有する（ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ）を有する自己複製型ウイルスベクターを鋳型として、ＰＣＲ等によりＧ遺伝子に欠損変異等を挿入することにより本発明におけるＧ遺伝子欠損型ウイルスベクターを作製することができる。Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクターの作製において、好ましくは、Ｌ遺伝子のイントロン部分も同様にＰＣＲにより削りとり、本発明におけるより好ましいＧ遺伝子欠損型ウイルスベクターを作製することができる。Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターも同様に、Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクターを鋳型にＰＣＲ等によりＭ遺伝子を欠損させることにより作製できる。

ウイルスベクターが線状の場合には、上記環状のウイルスベクターを、（ａ）組換えＢＤＶゲノムのｃＤＮＡ領域、（ｃ）プロモーター配列の領域、及びその他蛋白質発現に必要なシグナル配列領域以外の領域で１箇所切断する制限酵素を該ベクターの種類にあわせて適宜選択し、該制限酵素により環状のウイルスベクターを切断することにより線状のウイルスベクターを作製することができる。

本発明のウイルスベクターに含まれる外来性遺伝子を目的細胞に導入する方法としては、該ウイルスベクターを後述するヘルパープラスミドと共に目的細胞に導入する方法、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを目的細胞に感染させる方法があるが、ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを用いる方法が好ましい。本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、野生型ＢＤＶゲノムの代わりに上記ウイルスベクターにコードされるＲＮＡを有する組換え型ＢＤＶである。

３．組換えウイルス
上記ウイルスベクターにコードされるＲＮＡを含む組換えウイルスも、本発明の１つである。好ましくは、ウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶのＮ蛋白質、ＢＤＶのＰ蛋白質及びＢＤＶのＬ蛋白質を含む組換えウイルスである。本発明の組換えウイルスは、上記組換えＢＤＶゲノムを含むことにより、細胞に感染後、持続的に外来性遺伝子を発現することができる持続感染型の組換えウイルスである。組換えウイルスは、所望によりＢＤＶのＧ蛋白質又は他のウイルスの外殻蛋白質を有していてもよく、さらに、ＢＤＶのＭ蛋白質を有していてもよい。本発明における外殻遺伝子は、ウイルスの外殻蛋白質をコードする遺伝子である。ＢＤＶでは、外殻蛋白質をコードする遺伝子は、Ｇ遺伝子である。

本発明の組換えウイルスは、例えば、上記ウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、及び該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含む方法により作製することができる。このような組換えウイルスの作製方法も、本発明の１つである。このような方法により、in vitroで組換えウイルスを産生することができる。ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入するin vitroの細胞は、通常、培養細胞である。

本発明の方法において、Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、ヘルパープラスミドとして、さらに、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入することが好ましい。ウイルスの外殻遺伝子は、外来性遺伝子を導入する目的細胞に応じて適宜選択すればよく、ＢＤＶのＧ遺伝子、ＢＤＶ以外のウイルスの外殻遺伝子を用いることができる。Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、ヘルパープラスミドとして、さらに、ＢＤＶウイルスのＭ遺伝子を発現するプラスミドを細胞に導入することが好ましい。すなわちＧ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、上記ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群と共に、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶウイルスのＭ遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入することが好ましい。

ヘルパープラスミドは、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＭ遺伝子、並びにウイルスの外殻遺伝子それぞれを発現することができるものであればよく、これらの遺伝子の２つ以上が１つのプラスミドに含まれていてもよく、これらの遺伝子がそれぞれ別のプラスミドに含まれていてもよい。例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミドとして、下記（１）〜（４）のいずれかのプラスミド又はプラスミド群等が好適に用いられる。
（１）ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミド、ＢＤＶのＰ遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（２）ＢＤＶのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド、並びにＢＤＶのＬ遺伝子を発現するプラスミド
（３）ＢＤＶのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド、並びにＢＤＶのＰ遺伝子を発現するプラスミド
（４）ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミド

ヘルパープラスミドは、ＢＤＶゲノム複製に必要なウイルス蛋白質を提供するものであり、ウイルスベクターと共にヘルパープラスミドを細胞に導入することにより、感染性のある組換えウイルスを産生することができる。ヘルパープラスミドにおけるＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現する上記（１）〜（４）のいずれかのプラスミド（群）としては、（１）〜（３）のいずれかのプラスミド群が好ましい。また、本発明の組換えウイルスの作製方法に用いられるウイルスベクター及びその好ましい態様としては、上述したのと同様である。

本発明におけるヘルパープラスミドは、上記ウイルスベクターと共に細胞に導入された際に、該細胞内でＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現することができるものであればよい。例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶのＰ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＰ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶのＬ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＬ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドを用いることが好ましい。

ＢＤＶのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡ及びＰ遺伝子のｃＤＮＡがこの順番で配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡ及びＰ遺伝子のｃＤＮＡがこの順番で配置されたプラスミドが好ましい。ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡ、Ｌ遺伝子のｃＤＮＡ及びＰ遺伝子のｃＤＮＡがこの順番で配置されたプラスミドが好ましい。

ウイルスベクターがＧ遺伝子欠損型ウイルスベクターの場合には、ヘルパープラスミドは、該Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクターと共に細胞に導入された際に、該細胞内でＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子並びにウイルスの外殻遺伝子を発現することができるものであればよい。ウイルスベクターがＧ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターの場合には、ヘルパープラスミドは、細胞内でさらに、ＢＤＶのＭ遺伝子を発現することができるものであればよい。

ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、上記（１）〜（４）のいずれかのプラスミド（群）と共に用いることができる。さらに、外殻遺伝子を発現するプラスミドとして、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子及びＰ遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子、並びにウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いることもできる。外殻遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流に外殻遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドが好ましい。

ＢＤＶのＧ遺伝子等の外殻遺伝子にコードされる外殻蛋白質は、通常膜貫通型蛋白質であり、そのアミノ酸配列中に、細胞外に位置する領域（細胞外配列）、細胞膜貫通領域（細胞膜貫通配列）、及び細胞内に位置する領域（細胞内配列）を含む。ヘルパープラスミドにおける外殻遺伝子は、ＢＤＶのＧ遺伝子でもよく、例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス等の宿主細胞膜を外殻として利用する全てのエンベロープウイルスの外殻遺伝子を使用できるが、細胞内配列として、ＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードしていることが好ましい。すなわち本発明における外殻遺伝子は、細胞内配列としてＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列を有し、任意のウイルス（ＢＤＶ又はＢＤＶ以外のウイルス）の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列を有する蛋白質をコードする遺伝子であることが好ましい。細胞内配列としてＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列を有することにより、組換えウイルス産生効率が向上する。例えば、ヘルパープラスミドにおいてＢＤＶ以外のウイルスの外殻遺伝子を用いる場合には、該外殻遺伝子において、細胞内配列をコードする遺伝子配列を、公知の遺伝子工学的手法によりＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする配列に置換して用いることが好ましい。
ＢＤＶ以外のウイルスの細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする外殻遺伝子をヘルパープラスミドに用いると、遺伝子が由来するウイルスの種類により、産生されるウイルスの細胞指向性を変化させることができる。例えば、上皮系、呼吸器系細胞等に組換えウイルスを感染させる場合には、上皮系、呼吸器系細胞等への指向性が高いウイルス（例えば麻疹ウイルス、センダイウイルス、水疱性口内炎ウイルス等）の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いることが好ましい。

Ｍ遺伝子を発現するプラスミドとして、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子、Ｐ遺伝子及びウイルスの外殻遺伝子からなる群より選択される１種以上の遺伝子、並びにＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドを用いることもできる。Ｍ遺伝子を発現するプラスミドとしては、プロモーター配列の下流にＢＤＶのＭ遺伝子のｃＤＮＡが配置されたプラスミドが好ましい。

ＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡ、Ｐ遺伝子のｃＤＮＡ及びＬ遺伝子のｃＤＮＡは、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、及びＬ遺伝子それぞれの配列情報に基づいて調製することができる。ＢＤＶのＭ遺伝子のｃＤＮＡ及びＧ遺伝子のｃＤＮＡは、ＢＤＶのＭ遺伝子及びＧ遺伝子それぞれの配列情報に基づいて調製することができる。例えば、ＲＮＡから、配列逆転酵素を使用してｃＤＮＡを調製することができる。また、ＲＮＡの配列に基づき、ＤＮＡ合成機を用いて化学合成することができる。

ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子、並びにＭ遺伝子及びＧ遺伝子としては、例えば、上述したCubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C. Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994)に記載されている配列の遺伝子を用いることができる。また、これらの遺伝子として、上記の配列に従って合成したＲＮＡを使用することもできる。さらに、ＢＤＶのＮ、Ｐ、Ｌ、Ｍ及びＧ蛋白質間それぞれで保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。さらに他の既知のＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子、Ｌ遺伝子、Ｍ遺伝子及びＧ遺伝子それぞれの配列を基に設計したミックスプライマーを用い、ディジェネレートＲＴ−ＰＣＲによって断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法により塩基配列を決定することができる。さらに、本発明におけるＢＤＶのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子、並びにＭ遺伝子及びＧ遺伝子は、該遺伝子にコードされる蛋白質がそれぞれＢＤＶのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質、並びにＭ遺伝子及びＧ蛋白質の機能を保持している限り、塩基配列の一部が他の塩基と置換、削除又は新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されていてもよい。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、１乃至数個（１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）であってよい。

このようなＮ遺伝子として、例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＮ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＮ遺伝子として使用できる。また、ＢＤＶのＰ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＰ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＰ遺伝子として使用できる。ＢＤＶのＬ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＬ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＬ遺伝子として使用できる。ＢＤＶのＧ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＧ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＧ遺伝子として使用できる。ＢＤＶのＭ遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつＭ蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるＢＤＶのＭ遺伝子として使用できる。配列同一性は、CLUSTAL W ，GCG program, GENETYX，BLAST searchにより決定される。

水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、レトロウイルス等のＢＤＶ以外のウイルスの外殻遺伝子として、例えば、水疱性口内炎ウイルスはＧｅｎｅＢａｎｋ,Ｎｏ：Ｊ０２４２８．１、狂犬病ウイルスはＧｅｎｅＢａｎｋ，Ｎｏ：ＡＢ０４４８２４．１に記載されている配列の遺伝子等を用いることができる。好ましくは、これらの外殻遺伝子中の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする配列を用いる。外殻遺伝子中の外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードする配列は、Garry RF. Proteomics computational analyses suggest that the bornavirus glycoprotein is a class III viral fusion protein (γ penetrene). Virol J. 145(6),Sep-18(2009)等に記載されている。また、これらの遺伝子として、上記の配列に従って合成したＲＮＡを使用することもできる。さらに、このような外殻遺伝子と少なくとも約９０％、好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上の配列同一性を有し、かつ外殻蛋白質の機能を有するポリペプチドをコードするＲＮＡも、本発明におけるウイルスの外殻遺伝子として使用できる。

ヘルパープラスミドは、細胞に導入する際には線状であっても問題はないが、環状であることが好ましい。環状のヘルパープラスミドは、例えば、本発明におけるヘルパープラスミドの必須の配列であるプロモーター配列及び蛋白質のｃＤＮＡが配置された形態で、蛋白質の発現に有利である１又は複数の因子、例えば、エンハンサー、アクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロン、プロセッシングプロテアーゼをコードする１又は複数の核酸配列も含み得る。また、選択された細胞内で機能的であるいずれかの因子を有していてもよい。ヘルパープラスミドは、該ヘルパープラスミドを導入する細胞内で自己複製可能な市販のプラスミドベクターを使用して構築するのが好ましく、市販のプラスミドベクターとしては、例えば、pCAGGS、pCXN2、pCDNA3.1等が挙げられる。ヘルパープラスミドにおけるプロモーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーターが好ましい。

これらのヘルパープラスミドは、自体公知の遺伝子工学的手法により作製することができる。例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミド、ＢＤＶのＰ遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＬ遺伝子を発現するプラスミドは、Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529の“Materials and methods”の2.2 Plasmid constructionに記載されている方法により作製することができる。

ＢＤＶのＮ遺伝子及びＰ遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミドのＮ遺伝子のｃＤＮＡの下流のユニークな制限酵素配列領域から、Ｎ遺伝子のｃＤＮＡやプロモーターなどのシグナル配列を切断しない制限酵素を適宜選択し、その制限酵素サイトにＢＤＶのＰ遺伝子のｃＤＮＡを挿入することで作製することができる。ＢＤＶのＮ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、ＢＤＶのＮ遺伝子を発現するプラスミドのＮ遺伝子のｃＤＮＡの下流のユニークな制限酵素配列領域から、Ｎ遺伝子のｃＤＮＡやプロモーターなどのシグナル配列を切断しない制限酵素を適宜選択し、その制限酵素サイトにＢＤＶのＬ遺伝子のｃＤＮＡを挿入することで作製することができる。ただし、Ｎ遺伝子のｃＤＮＡ領域とＬ遺伝子又はＰ遺伝子のｃＤＮＡが挿入された領域との間の領域にＬ遺伝子又はＰ遺伝子の発現を促進するようなプロモーター配列や配列内部リボソーム進入部位などの配列を挿入することも可能である。

ＢＤＶのＧ遺伝子を発現するプラスミドは、ＢＤＶのＮ遺伝子、Ｌ遺伝子又はＰ遺伝子を発現するヘルパープラスミドの作製において、ＢＤＶのＮ遺伝子のｃＤＮＡの代わりにＢＤＶのＧ遺伝子のｃＤＮＡを用いることによって作製することができる。例えば、一例として、実施例７及び図２１に示される方法に従っても作製することができる。ＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドは、例えば、ｐＥＦ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ａ、Ｂ，and C(Invitrogen)に添付の説明書に記載されている方法に従って作製することができる。

ＢＤＶ以外のウイルスの外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドは、例えば、ＢＤＶ以外のウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを鋳型に、適当なプライマーを用いてＰＣＲを行なって、任意のウイルス外殻遺伝子の細胞内配列をコードする配列をＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする配列で置換することにより作製することができる。このようなヘルパープラスミドは、例えば、一例として実施例８及び図２５に記載されている方法に従っても調製することができる。ＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする遺伝子配列は、例えば配列番号１にそのｃＤＮＡ配列が示されるＢＤＶゲノムでは３７１２〜３７４７番目の配列（配列番号１の３７１２〜３７４７番目の塩基）である。

上記のウイルスベクターを細胞に導入する際は、例えば、該ウイルスベクターを含むベクター組成物を用いることができる。ベクター組成物は、ウイルスベクター以外にヘルパープラスミドを含んでいてもよい。ベクター組成物は、ウイルスベクター及びヘルパープラスミド以外にも、導入方法及び導入対象等に応じて、その他の成分、例えば、適当な緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、細胞培養標準液等を含んでいてもよい。

ベクター組成物中の上記ウイルスベクターの含有量としては、感染方法及び感染対象等に応じて適宜選択すればよいが、例えば、ＤＮＡ濃度として約０．２５〜２．０μｇ／μＬのウイルスベクターを含むことが好ましい。

ベクター組成物中の例えば、各ヘルパープラスミドの含有量としては、上記ウイルスベクター１μｇに対して約０．０１２５〜０．１２５μｇとすることが好ましい。

上記ウイルスベクター及びヘルパープラスミドをin vitroで細胞に導入する方法としては特に限定されず、例えば、市販のトランスフェクション試薬を用いる自体公知の方法を採用することができる。市販のトランスフェクション試薬としては、例えば、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics（登録商標）、Pleasanton、CA)等が挙げられるが特に限定されない。具体的には、例えば、上記量のウイルスベクター及びヘルパープラスミド、並びに緩衝液等を含むベクター組成物に、市販のトランスフェクション試薬を適量加え、これをウイルスベクター１μｇに対して通常約１０^３〜１０^７個、好ましくは約１０^４〜１０^７個の細胞に加えることによりウイルスベクター及びヘルパープラスミドを該細胞に導入することができる。なお、ウイルスベクター及びヘルパープラスミドは、同時に細胞に導入してもよく、別々に導入してもよい。別々に導入する際の導入順序は、特に限定されない。

ウイルスベクターを導入する細胞としては、ウイルスベクターの導入により本発明における組換えウイルスを産生することができる哺乳類の培養細胞等であればよいが、例えば、ヒト腎臓由来の２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞が挙げられる。

Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドに用いた外殻遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞等の細胞に、外殻遺伝子を発現する各種プラスミドを用いて、該外殻遺伝子を導入することにより作製することができる。外殻遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に記載された方法に従って、該プラスミド内に該外殻遺伝子を導入することにより製造される。このような外殻遺伝子を発現するプラスミドとして、上述した外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドも好適に用いることができる。Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いる場合には、ＢＤＶのＭ遺伝子及び外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドに用いた外殻遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、２９３Ｔ細胞、ＢＨＫ細胞等の細胞に同様の方法でＢＤＶのＭ遺伝子及び該外殻遺伝子を導入することにより製造される。外殻遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に従って、該プラスミド内に外殻遺伝子及びＢＤＶのＭ遺伝子をそれぞれ導入することにより容易に製造される。このような外殻遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドとして、上述した外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミド、ＢＤＶのＭ遺伝子を発現するヘルパープラスミド等も好適に用いることができる。

次いで、ウイルスベクターを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる。組換えウイルスを産生させるための培地、培養温度及び培養時間等の培養条件は、細胞の種類により適宜設定すればよい。培養温度は、２９３Ｔ細胞又はＢＨＫ細胞を用いる場合は、通常約３６〜３７℃とする。培地は、ダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地を用いることが好ましい。培養時間は、通常約２４〜９６時間、好ましくは約３６〜４８時間とする。

上記培養により、ウイルスベクターを導入した細胞においてウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。ウイルスベクターの導入において、さらにウイルスの外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いた場合には、ウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質に加えて、該外殻遺伝子にコードされる外殻蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。ウイルスベクターの導入において、さらにウイルスの外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミド及びＢＤＶのＭ遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いた場合には、ウイルスベクターにコードされるＲＮＡ、並びにＢＤＶのＮ蛋白質、Ｐ蛋白質及びＬ蛋白質に加えて、該外殻遺伝子にコードされる外殻蛋白質及びＢＤＶのＭ蛋白質を含む組換えウイルスが産生される。

ウイルスベクターを導入した細胞において組換えウイルスが産生されたことは、例えば、細胞を培養した培地の上澄みを遠心分離などにより回収し、該上澄みを用いてＢＤＶが感染性を有する細胞、例えば、サル腎由来Ｖｅｒｏ細胞、ラットグリア由来Ｃ６細胞、ヒトグリア由来ＯＬ細胞などに感染をさせることで確認される。組換えウイルスが産生されたことの確認は、後述する組換えウイルスを産生した細胞を増殖速度が速い細胞と混合培養する工程を行なった後行ってもよい。
例えば、組換えウイルスであることは、感染した細胞内での外来性遺伝子（例えばＧＦＰなど）の発現を定量解析することで確認できる。産生されたウイルスが持続性感染型であることは、感染した細胞内での外来性遺伝子（例えばＧＦＰなど）の発現を定量解析すると共に、その培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることを調べることにより確認される。培養上清中に次の世代の組換えウイルスの粒子が産生されることは、例えば、その上清を遠心分離などにより回収し、これをさらに他の細胞へ感染させ、該細胞において組換えウイルスに由来する外来性遺伝子が発現することを調べることで確認できる。

本発明の作製方法においては、上記のように細胞にウイルスベクター等を導入して組換えウイルスを産生させた後、効率よく組換えウイルスを増殖させるために、該組換えウイルスを産生した細胞（例えば、２９３T細胞、ＢＨＫ細胞）を増殖速度が速い細胞と混合培養する工程を行なうことが好ましい。組換えウイルスを産生した細胞を増殖速度が速い細胞と混合培養することにより、感染性を持つ組換えウイルスは増殖速度が速い細胞に感染する。該増殖速度が速い細胞を培養すると、細胞の増殖と共に感染したウイルスも増殖するため、組換えウイルスを効率よく増殖させることができる。増殖速度が速い細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞等が好適である。組換えウイルスを産生した細胞と、増殖速度の速い細胞との混合比率としては、例えば、組換えウイルスを産生した細胞１個に対して増殖速度の速い細胞を通常０．１〜１０個程度、好ましくは０．２〜２個程度とする。混合培養後、増殖速度が速い細胞を培養させる条件としては特に限定されず、例えば、Ｖｅｒｏ細胞を用いる場合には、培養温度を通常約３６〜３７℃とし、ダルベッコ変法イーグルMEM培地で通常３日〜５週間程度、好ましくは３日〜３週間程度培養を行なう。

Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いた場合には、増殖速度が速い細胞として、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドに用いた外殻遺伝子を、恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞等の細胞に、外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いて、該遺伝子を導入することにより作製することができる。さらに、Ｇ遺伝子及びＭ遺伝子欠損型ウイルスベクターを用いた場合には、増殖速度が速い細胞として、外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミドを用いた外殻遺伝子及びＢＤＶのＭ遺伝子を恒常的に発現する細胞を使用することが好ましい。このような細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞等に、外殻遺伝子を発現するプラスミドおよびＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドを用いて、該遺伝子を導入することにより作製することができる。外殻遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドは、通常、各種発現プラスミドに添付の説明書に従って、該プラスミド内に外殻遺伝子及びＢＤＶのＭ遺伝子をそれぞれ導入することにより容易に製造される。このような外殻遺伝子を発現するプラスミド及びＢＤＶのＭ遺伝子を発現するプラスミドとして、上述した外殻遺伝子を発現するヘルパープラスミド、ＢＤＶのＭ遺伝子を発現するヘルパープラスミド等も好適に用いることができる。

本発明の作製方法においては、細胞に組換えウイルスを産生（及び増殖）させた後、該組換えウイルスを精製する工程を行うことが好ましい。精製方法としては特に限定されず、自体公知の方法によって行うことができ、組換えウイルスの感染対象に応じて精製方法を適宜選択すればよい。

例えば、組換えウイルスを培養細胞に感染させる場合には、上記のように組換えウイルスを産生（及び増殖）させた後、該組換えウイルスを産生させた培養細胞上清を回収し、細胞を破砕する。細胞の破砕は、例えば、凍結及び融解、又は超音波破砕機を用いて行うことができる。次いで、細胞破砕液から細胞の破砕成分を取り除く。細胞破砕液から細胞の破砕成分を取り除く方法としては、遠心分離（例えば、４℃、８００ｇで１０分間程度）等が挙げられる。細胞の破砕成分を取り除いた後に、０．２２又は０．４５μｍのポアサイズを有する濾過膜を通すことにより組換えウイルスを含む上澄みを得ることができる。培養細胞に組換えウイルスを感染させる際は、この上澄みを用いることができる。また、この組換えウイルスを含む上澄みを公知の手法により濃縮して用いることもできる。
生体細胞（動物個体中の細胞）に組換えウイルスを感染させる場合には、この組換えウイルスを含む上清を、超遠心機を用いて濃度勾配による超遠心を行なうことによりウイルス粒子へと高度の精製を行うことが好ましい。精製を行ったウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、希釈を行った後に適量を動物へ感染させる。

４．外来性遺伝子の導入方法
上記組換えウイルスを細胞に感染させることにより、該ウイルスに組み込まれた外来性遺伝子を細胞や生体に導入することができる。このような、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスをin vitroの細胞又は動物に感染させる工程を含む外来性遺伝子の導入方法も本発明の１つである。

組換えウイルスを感染させる動物としては特に限定されず、例えば、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類等が挙げられる。中でも、ヒト、サル、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラット、ネズミ、ウサギ、ウシ等の哺乳類が好ましく、ラット、マウス又はヒトがより好ましく、マウス又はヒトがさらに好ましい。組換えウイルスを感染させる細胞としては、このような動物の細胞が好ましい。また、ＢＤＶは神経系細胞に感染指向性があることから、哺乳類の神経系細胞がさらに好ましく、中でも、脳神経系細胞が特に好ましい。中でも、ラット、マウス又はヒトの神経系細胞が好ましい。細胞は、培養細胞であってもよく、生体細胞であってもよい。哺乳類の脳神経系細胞としては、グリア細胞、大脳皮質の神経細胞、海馬神経細胞、小脳神経細胞、中脳神経細胞胞等が挙げられる。哺乳類の脳神経細胞の培養細胞としては、ＯＬ、Ｃ６、Ｕ３７３、Ｎ２a、Ｎ１８、ＰＣ１２、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞等が好適である。

Ｇ遺伝子欠損型ウイルスベクター及びヘルパープラスミドとしてウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドを用いて産生された組換えウイルスは、外殻遺伝子が由来するウイルスの種類に応じた感染指向性を示す。例えば、ヘルパープラスミドにおいてＢＤＶのＧ遺伝子を使用した場合、得られる組換えウイルスは、脳神経系細胞に感染指向性を示すため、脳神経細胞への外来性遺伝子導入に好適に使用される。ヘルパープラスミドにおいてＢＤＶ以外のウイルスの外殻遺伝子（好ましくは、ＢＤＶ以外のウイルスの外殻蛋白質の細胞外配列及び細胞膜貫通配列をコードし、かつＢＤＶのＧ蛋白質の細胞内配列をコードする外殻遺伝子）を使用した場合、得られる組換えウイルスは、該ウイルスが感染指向性を示す細胞に好適に感染させることができるものである。

組換えウイルスをin vitroで細胞に感染させる方法としては、例えば、培養細胞に感染させる場合には、上記精製方法により得られた組換えウイルスを含む上清をダルベッコ変法イーグル等の培養培地又はリン酸緩衝生理食塩水等により段階希釈して希釈液を作製することが好ましい。希釈液中の組換えウイルスの濃度としては、ウイルスを感染させる細胞の種類等により適宜選択すればよいが、例えば、哺乳類の神経細胞等であれば、通常ＭＯＩ(multiplicity of infection、感染価)約０．０１〜１０(細胞１個に対してウイルス粒子０．０１から１０個が感染する量)、好ましくはＭＯＩ約１〜１０となるようにする。この希釈液を用いて、組換えウイルスを細胞に感染させる。

組換えウイルスを生体細胞（動物）に感染させる際には、上記のように高度に精製されたウイルス粒子を、例えばリン酸緩衝生理食塩水に浮遊させ、該リン酸緩衝生理食塩水により希釈を行った後に適量を動物へ感染させることが好ましい。希釈液中の組換えウイルスの濃度は、感染対象により適宜選択すればよい。例えば、感染対象が哺乳類の神経細胞であれば、組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価（focus-forming unit (FFU)）を約１０^-１〜１０^９ＦＦＵとして個体に接種することが好ましい。また、組換えウイルスを含む希釈液は、マウス又はラットに接種する際には、ウイルス力価を通常約１０^-１〜１０^７ＦＦＵとすることが好ましい。イヌ又はネコ、ヒトに接種する際には、ウイルス力価を通常約１０〜１０^８ＦＦＵとすることが好ましく、ウシ又はウマに接種する際には、ウイルス力価を通常１０^５〜１０^１２ＦＦＵとすることが好ましい。ヒトに接種する際には、ウイルス力価を通常約１０^５〜１０^９ＦＦＵとすることが好ましい。また、組換えウイルスを生体細胞に感染させる際には、後述する外来性遺伝子導入剤も好適に用いることができる。

例えば、哺乳類の脳神経系細胞に組換えウイルスを感染させる場合には、上記組換えウイルスを含む希釈液を哺乳類の鼻腔に接種する方法が好適である。また、マウスやラット等に動物実験において脳神経系細胞に感染させる場合には、動物の脳内に組換えウイルスを含む希釈液を直接接種することもできる。
組換えウイルスの接種量としては、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液を、鼻腔内接種では１回につき通常約５μＬ〜１ｍＬ、脳内接種では１回につき通常約１〜５０μＬ接種する。組換えウイルスの動物への接種量は、動物の体重等に応じて適宜選択すればよく、例えば、上記濃度の組換えウイルスを含む希釈液をマウス又はラットに鼻腔内接種する場合には、１回につき通常約５〜２００μＬ、好ましくは約１０〜１００μＬ接種する。

脳神経細胞以外の生体細胞に組換えウイルスを感染させる場合には、上記組換えウイルスを含む希釈液を非経口投与することが好ましい。例えば、哺乳類の腹腔内、血管内、筋肉内等に接種する方法等が好適である。
組換えウイルスの接種量としては、接種部位等により適宜選択すればよく、特に限定されない。例えば、通常、組換えウイルスを含む希釈液のウイルス力価を約１０^-１〜１０^９ＦＦＵとして、この組換えウイルスを含む希釈液を、マウスであれば１回につき通常約５〜５００μＬ、好ましくは約２０〜２００μＬ接種する。

５．外来性遺伝子導入剤
（１）上記ウイルスベクター、又は、（２）上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤も、本発明の１つである。好ましい態様としては、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する外来性遺伝子導入剤である。このような外来性遺伝子導入剤は、上述した外来性遺伝子の導入方法において、組換えウイルスをin vitroの細胞又は生体細胞（動物）に感染させる際に好適に用いることができるものである。本発明は、動物の神経系細胞等に外来性遺伝子を導入するのに好適に用いることができる。中でも、脳神経系細胞に外来性遺伝子を導入するのにより好適に用いられる。

本発明の外来性遺伝子導入剤の好ましい態様の１つは、上記組換えウイルス、又は上記方法により作製された組換えウイルスを含有する脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤である。脳神経系細胞としては、哺乳類の脳神経系細胞が好ましく、例えば、グリア細胞、大脳皮質の神経細胞、海馬神経細胞、小脳神経細胞、中脳神経細胞等が挙げられる。本発明の外来性遺伝子導入剤は、さらに、神経疾患治療剤等の他の薬剤等を含んでいてもよく、剤型に応じて医薬上許容される成分を含んでいてもよい。本発明の外来性遺伝子導入剤の剤型としては、非経口投与のための剤型が好ましく、例えば、注射剤、点滴剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、貼付剤、噴霧剤、スプレー剤等が挙げられるが、注射剤が好ましい。

非経口投与のための注射剤としては、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とする場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒（注射用水、精製水等）に、医薬上許容される添加剤を適宜添加した溶液に、組換えウイルスを混合した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。医薬上許容される添加剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等の等張化剤；リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸緩衝液、イプシロンアミノカプロン酸緩衝液等の緩衝剤；パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等の保存剤；ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール等の増粘剤；亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等の安定化剤；塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等のｐＨ調整剤等が挙げられる。また注射剤には、適当な溶解補助剤、例えば、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０、リソレシチン、プルロニックポリオール等の非イオン界面活性剤等をさらに配合してもよい。また、例えば、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の蛋白質；アミノデキストラン等のポリサッカリド等を含有してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はベンジルアルコール等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等に充填される。注射剤等の液状製剤は、凍結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存することもできる。凍結乾燥製剤は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。

本発明の外来性遺伝子導入剤に含まれる組換えウイルスの量は、外来性遺伝子導入剤の製剤形態又は投与経路によって異なるが、通常、最終製剤中に約０．０００１〜１００％の範囲から適宜選択して決定することができる。外来性遺伝子導入剤の投与方法及び投与量は、上述した外来性遺伝子の導入方法における方法及び組換えウイルスの投与量と同様である。本発明の外来性遺伝子導入剤は、例えば、動物の脳神経系疾患治療、Ｃ型肝炎等の慢性肝疾患、抗腫瘍薬及びワクチン等のための遺伝子デリバリー用組成物として有用である。本発明の外来性遺伝子導入剤の投与対象は、上述した哺乳動物が好適である。

６．ウイルスベクターの利用
本発明のウイルスベクター、組換えウイルス及び外来性遺伝子の導入方法、並びに外来性遺伝子導入剤は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野に応用することができるものである。
例えば、本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、ヒトを含む動物の脳神経系疾患治療のための遺伝子デリバリーベクターとして使用することができる。また、慢性肝疾患、腫瘍、感染症等に対するワクチン等にも好適に使用することができる。
脳神経系疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、統合失調症、自閉症、その他の機能性精神疾患等が挙げられる。本発明の組換えウイルスは、このような疾患の治療又は予防に有用である。例えば、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子として、脳神経系疾患の原因となる蛋白質を分解する酵素の遺伝子、該蛋白質の発現を抑制する機能を有する核酸配列等を使用すると、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該原因蛋白質を分解又は該原因蛋白質の発現を抑制して該疾患を予防又は治療することができる。また、脳内物質（例えば、セロトニン、ドーパミン、ソマトスタチン、ネプリライシン等）の分泌低下により発症する疾患においては、該脳内物質をコードする遺伝子をウイルスベクターに挿入し、該ウイルスベクターから産生される組換えウイルスを脳神経細胞に感染させることにより、該脳内物質が産生されるため、該疾患を予防又は治療することができる。
なお、「治療」とは、病態を完全に治癒させることの他、完全に治癒しなくても症状の進展及び／又は悪化を抑制し、病態の進行をとどめること、又は病態の一部若しくは全部を改善して治癒の方向へ導くことを、「予防」とは病態の発症を防ぐこと、抑制すること又は遅延させることを、それぞれ意味するものとする。

本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、日本脳炎等のウイルス性脳炎の治療又は予防にも使用できる。また、実験動物、伴侶動物又は生産動物の脳神経系疾患、例えば、ＢＳＥ（牛海綿状脳症）、狂犬病等にも好適に使用できる。実験動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ等が挙げられる。伴侶動物としては、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ等が挙げられる。生産動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等が挙げられる。

本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスは、脳神経科学領域における神経系細胞の可視化技術に使用することができる。さらに、本発明のウイルスベクターは、機能性ＲＮＡ分子を発現できるＲＮＡウイルスベクターとしても有用であり、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー等の機能性ＲＮＡの安定発現ベクター技術に応用することもできる。例えば、本発明のウイルスベクターにおける外来性遺伝子としてｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー等の機能性ＲＮＡをコードする配列を用いると、所望の細胞においてこれらの機能性ＲＮＡ分子を発現させることができる。本発明のウイルスベクター及び組換えウイルスを用いると、脳内において一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を発現させることもできる。

また外殻蛋白質を他のウイルス由来のものにすることで、腫瘍細胞に特異的に感染するウイルスベクター又は組換えウイルスに改良し、腫瘍細胞に薬剤遺伝子や過剰に発現した遺伝子を抑えるｓｉＲＮＡを導入すること等で、抗腫瘍ウイルスベクターとしても利用可能である。さらに、外来性遺伝子としてＨＩＶ、インフルエンザウイルス等に対する中和活性をもつ遺伝子(例えば、HIVのenv、gag等；インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ遺伝子等)等を導入することで、本発明のウイルスベクター又は組換えウイルスを組換えワクチンに利用することも可能である。そして、HCV等の慢性経過をたどる感染症に対しては、標的となるウイルスのゲノムに対するsiRNAを導入することで、機能性ＲＮＡを利用した感染症に対する新たな治療法の開発にも有効である。

上記ウイルスベクターを含有する外来性遺伝子導入用キットも、本発明の１つである。
本発明のキットは、ウイルスベクター以外に、ヘルパープラスミド、外来性遺伝子を導入する細胞、緩衝液、培地等を適宜含んでもよい。ウイルスベクターの好ましい態様は、上述した通りである。外来性遺伝子を導入する細胞は、脳神経系細胞等の神経系細胞等が好ましい。本発明のキットは、これまで技術的に困難であった脳神経系細胞等への外来性遺伝子の導入に好適に用いることができるものである。

以下、実施例によって本発明を詳述するが、これらの実施例は本発明の一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。

＜実施例１＞
１．プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｃｔの作製
Yanai et al., Microbes and Infection 8 (2006), 1522-1529に記載されているプラスミドｐＣＡＧ−ＨＲ−ＳＶ３を基に、その中に挿入されているクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子の領域をボルナ病ウイルスのＨｅ／８０株のゲノムの配列（配列番号１）に置き換えたプラスミドを以下のようにして作製した。

サイトメガウイルス（ＣＭＶ）由来のＢＤＶミニゲノムベクター（ｐＣＭＶ−ＨＲ）を得るために、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｍＲｚ）をコードする化学合成オリゴヌクレオチド（Briese et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (1992) 11486-11489、及びLe Mercier et al., J. Virol., 76 (2002) 2024-2027）及びＢＤＶの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）配列をコードする化学合成オリゴヌクレオチド（Cubitt,B., Oldstone,C. and de la Torre,J.C., Sequence and genome organization of Borna disease virus. J. Virol. 68 (3), 1382-1396 (1994)）をアニールし、ベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社、San Diego， CA）のKpnI及びXhoIサイトに連結した。得られたプラスミドをEco47III及びXbaIサイトで切断した。このプラスミドに、δ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨｄＲｚ）と融合させたＢＤＶの３’ＵＴＲと、ＢＤＶ Ｈｅ／８０株のゲノムをコードするｃＤＮＡクローンを挿入してプラスミドｐｃ−ＨＲを得た。なお、ＨｄＲｚと融合させたＢＤＶの３’ＵＴＲは、プラスミドｐｈｕＰｏｌ Ｉ−ＭＧ（Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104）から増幅した。最後に、ｐｃ−ＨＲのBglII及びXbaI断片をpBluescript SKII(-)（Stratagene, La Jolla, CA）のBamHI及びXbaIサイトに挿入することによって、ｐＣＭＶ−ＨＲを作製した。

ＣＡＧ（Chicken β-actin promoterとCMV enhancerとの複合体）由来のＢＤＶミニゲノムベクターｐＣＡＧ−ＨＲは、ＣＡＧプロモーターをpBluescript SKII(-)（Stratagene, La Jolla, CA）にサブクローニングすることによって得た（ｐＢＳ−ＣＡＧ）。ＣＡＧプロモーターは、サイトメガロウイルスＩＥエンハンサーにニワトリβ−アクチンプロモーターが融合してなるハイブリッドプロモーターであり、Sawichi et al., Exp. Cell Res. 244 (1998) 367-369に記載されている。ｐＣＭＶ−ＨＲのＨａｍＲｚとＨｄＲｚの配列にまたがる領域をＰＣＲによって増幅し、ｐＢＳ−ＣＡＧのSalI及びEcoRIサイトの平滑末端に挿入した。

次に、ＳＶ４０開始点／プロモーター内の５’側の１１３塩基からなる断片（ＳＶ３領域）を、ＰＣＲ（Clontech Laboratory, Inc., Palo Alto, CA）によってｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clontech社製）から増幅し、ｐＣＡＧ−ＨＲのＮｏｔＩサイトに挿入した。これにより、プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｃｔを得た。

２．Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域にＧＦＰを挿入したＢＤＶゲノムプラスミド（ｐＣＡＧ−Ｆｃt−Ｐ／ＭＧＦＰ）の作製
Ｐ遺伝子とＭ遺伝子の間の非翻訳領域に外来遺伝子挿入カセットを挿入し、プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−Ｐ／Ｍを作製した。
Ａ）実施例１で作製したｐＣＡＧ−Ｆｃｔ（ボルナウイルスのＨｅ８０株のｃＤＮＡ（配列番号１）がクローニングされているプラスミド）を鋳型に、ＥｃｏＴ２２ＩからＢｓｔ１１０７Ｉサイトまでの領域をプライマー１及び４、並びにプライマー２及び３を用いてそれぞれＰＣＲで増幅した。その後、両方のＰＣＲ産物を０．５μＬずつ混合し、プライマー１及び２にて再度増幅し、Ｐ−Ｍ遺伝子間にＢｓｔＢＩサイト及びＰａｃＩサイトを有する外来遺伝子挿入カセットを作製した。
Ｂ）Ａ）のＰＣＲ産物をＥｃｏＴ２２Ｉ及びＢｓｔ１１０７Ｉを用いてｐＣＡＧ−Ｆｃｔへと組込み、ｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−Ｐ／Ｍを完成させた。
Ｃ）ＢｓｔＢＩとＰａｃＩを用いてＧＦＰを挿入し、プラスミドｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−Ｐ／Ｍ−ＧＦＰを完成させた。
（プライマー）
プライマー１：5-GGAATGCATTGACCCAACCGGTAGACCAGC-3（配列番号５）
プライマー２：5-AACATGTATTTCCTAATCGGGTCCTTGTATACGG-3（配列番号６）
プライマー３：5-ttcgaaGGTTGGttaattaaccataaaaaaatcgaatcacc-3（配列番号７）
プライマー４：5-ttaattaaCCAACCttcgaaGGTGATTCGATTTTTTTATGG-3（配列番号８）

３．ヘルパープラスミドの作製
ヘルパープラスミド、すなわちＢＤＶのＮ遺伝子発現プラスミド（ｐｃＮ）、ＢＤＶのＰ遺伝子発現プラスミド（ｐＣＸＮ２−Ｐ）及びＢＤＶのＬ遺伝子発現プラスミド（ｐｃＬ）を以下の手順で作製した。
ｐｃＮは、ｐＨＡ−ｐ４０Ｎプラスミド（Kobayashi T, Watanabe M, Kamitani W, Zhang G, Tomonaga K and Ikuta K. Borna disease virus nucleoprotein requires both nuclear localization and export activities for viral nucleocytoplasmic shuttling. J. Virol. 75:3404-3412. (2001)からＮ遺伝子領域をＰＣＲで増幅し、ｐＢＳ−ＣＡＧ（上述）へと挿入することで作製した。
プラスミドｐＣＸＮ２−Ｐは、ｐｃＤ−Ｐ（Zhang G, Kobayashi T, Kamitani W, Komoto S, Yamashita M, Baba S, Yanai H, Ikuta K and Tomonaga K. Borna disease virus phosphoprotein represses p53-mediated transcriptional activity by interference with HMGB1. J. Virol. 77:12243-12251. (2003)）からゲル抽出した断片をｐＣＸＮ２（Niwa H, Yamamura K, Miyazaki J 1991 Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene 108:193-199）のEcoRI及びXhoIサイトに挿入することによって作製した。
ｐｃＬについては、Perez et al., J. Gen. Virol. 84 (2003) 3099-3104に記載されている方法で作製した。組換えプラスミドのヌクレオチド配列は、ＤＮＡシークエンスによって確認した。

＜参考例１＞
U. Schneider et al., Journal of Virology (2007) p.7293-7296に記載の方法に従って、ＢＤＶゲノムの５’末端側の非翻訳領域にＧＦＰ遺伝子を挿入した組換えウイルスベクターを作製した。この組換えウイルスベクター（ｒＢＤＶ−５’ＧＦＰ）の構造を、図４に模式的に示す。

＜実施例２＞
Ｐ−Ｍ遺伝子間プラスミドを用いたBDVベクターの作製と性状比較
ｐＣＡＧ−Ｆｃｔ−Ｐ／Ｍ−ＧＦＰ及びヘルパープラスミド（Ｎ遺伝子発現プラスミド、Ｐ遺伝子発現プラスミド及びＬ遺伝子発現プラスミド；それぞれｐｃＮ、ｐＣＸＮ２−Ｐ及びｐｃＬ）を、FuGENE 6 transfection reagent (Roche Molecular Diagnostics（登録商標）、Pleasanton、CA)又Lipofectamine（登録商標）2000、Invitrogen）を用いて２９３Ｔ細胞に導入した。導入に使用したウイルスベクター等の量としては、１０^４〜１０^６の細胞（２９３Ｔ細胞）に対して、ｐＣＡＧ−Ｆｃｔ-P/M-ＧＦＰを１〜４μｇ使用し、ｐｃＮ（０．１２５〜０．５μｇ）、ｐＣＸＮ２−Ｐ（０．０１２５〜０．０５μｇ）、ｐｃＬ（０．１２５〜０．５μｇ）の割合でヘルパープラスミドを加えた。

ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入後、２９３Ｔ細胞を３７℃で４８時間ダルベッコ変法イーグル培地で培養後に上清を回収して、８００ｇで１０分遠心後、０．２２から０．４５μｍのフィルタで濾過してＧＦＰを発現する組換えウイルス（以下、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰともいう）を精製した。

比較として、参考例１で作製したベクターｒＢＤＶ−５’ＧＦＰについても、上記と同様にして該ベクターを２９３Ｔ細胞に導入して組換えウイルス（以下、組換えウイルス５’ＧＦＰともいう）を作製し、次いで組換えウイルスを精製した。コントロールとして、野生型のＢＤＶ（以下、ｗｔともいう）を２９３Ｔ細胞に導入した。

培養細胞への感染後、４８時間以降における細胞間での感染の広がり、並びに感染細胞上清中へのウイルスベクターの放出を、間接免疫蛍光抗体法又はウェスタンブロット法により調べたところ、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び５’ＧＦＰ、並びにｗｔのいずれについても、感染後２４時間後よりウイルスの産生が観察され始めることが確認された。

また、野生型のＢＤＶ（ｗｔ）、精製した組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び５’ＧＦＰをそれぞれ、Ｍ．Ｏ．Ｉ＝０．０１でＶｅｒｏ細胞に感染させて、感染後０日から１９日における細胞間での感染の広がりを、ノーザンブロット法、ウェスタンブロット法又は間接免疫蛍光抗体法により調べた。結果を図５〜８に示す。

間接免疫蛍光抗体法は、以下の方法により行った。
抗ＢＤＶ Ｎ抗体及び抗ＢＤＶ Ｍ抗体を、Watanabe M, Zhong Q, Kobayashi T, Kamitani W, Tomonaga K, Ikuta K. Molecular ratio between Borna disease viral-p40 and -p24 proteins in infected cells determined by quantitative antigen capture ELISA. Microbiol Immunol. 2000. 44:765-72、Chase G, Mayer D, Hildebrand A, Frank R, Hayashi Y, Tomonaga K, Schwemmle M. Borna disease virus matrix protein is an integral component of the viral ribonucleoprotein complex that does not interfere with polymerase activity. J Virol. 2007. 81:743-749に記載の方法に従って作製した。
野生型ＢＤＶ並びに各組換えウイルスをそれぞれ感染させたＶｅｒｏ細胞を、感染後の一定の日数培養した後回収し、ガラスプレートに固定した後、これと、抗ＢＤＶ Ｎ抗体（リン酸緩衝液で、抗ＢＤＶ Ｎ抗体濃度０．２〜５μｇ／ｍＬに希釈したもの）又は抗ＢＤＶ Ｍ抗体（リン酸緩衝液で、抗ＢＤＶ Ｍ抗体濃度０．２〜５μｇ／ｍＬに希釈したもの）を３７℃で１時間程度反応させた。洗浄後、２次抗体として蛍光標識された抗ＩｇＧ抗体（モリキュラープローブ社製、リン酸緩衝液で、抗体濃度０．０１〜０．１μｇ／ｍＬに希釈したもの）と同様に反応させた後に、細胞の蛍光（抗Ｎ抗体又はＭ抗体：赤、ＧＦＰ：緑）を蛍光顕微鏡で観察した。
ノーザンブロット法及びウェスタンブロット法は、Watanabe Y, Ibrahim MS, Hagiwara K, Okamoto M, Kamitani W, Yanai H, Ohtaki N, Hayashi Y, Taniyama H, Ikuta K, Tomonaga K. Characterization of a Borna disease virus field isolate which shows efficient viral propagation and transmissibility. Microbes Infect. 2007. 9:417-427.に記載の方法に従って行った。

図５は、感染後０日〜１９日の間の、野生型又は組換えＢＤＶを感染させたＶｅｒｏ細胞の、感染率の経時変化を調べた結果を示す図である。図５に示す感染率は、野生型ＢＤＶについては、抗ＢＤＶ Ｎ抗体に対する蛍光標識抗体の蛍光を指標とする間接免疫蛍光抗体法により、組換えＢＤＶについては、ＧＦＰの蛍光及び抗ＢＤＶ Ｎ抗体に対する蛍光標識抗体の蛍光を指標とする間接免疫蛍光抗体法により、それぞれ求めた。図５において、ｗｔ（ひし形：◆）は野生型ＢＤＶを、ｐ／ｍＧＦＰ（四角：■）は組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを、５’ＧＦＰ（三角：▲）は、参考例１で作製した組換えウイルス５’ＧＦＰを、それぞれ示す。図５より、感染から約１５日後には、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び５’ＧＦＰのいずれも、野生型ＢＤＶと同様に、Ｖｅｒｏ細胞にほぼ１００％感染した。このことから、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び５’ＧＦＰのいずれも、野生型ＢＤＶと同様のウイルス産生能を有することが分かった。

図６は、ノーザンブロットの結果である。図６中、ｗｔは野生型ＢＤＶを、ｐ／ｍは、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを、５’は、組換えウイルス５’ＧＦＰを、それぞれ示す。ｕ．ｉ．は、非感染細胞を示す。
図６（ａ）は、感染後１９日後のＶｅｒo細胞におけるＢＤＶのＮ遺伝子（上の図）及びＧＦＰ遺伝子（中の図）の発現量をノーザンブロットによって調べた結果を示す図である。図６（ａ）より、ウイルス蛋白質（Ｎ蛋白質）の遺伝子は、いずれのＢＤＶを感染させた細胞においても同程度に発現していることが分かる。一方、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた細胞における、感染したウイルスに対する外来性遺伝子（ＧＦＰ遺伝子）の発現率は、ＧＦＰ遺伝子／Ｎ遺伝子＝０．７８であり、組換えウイルス５’ＧＦＰを感染させた細胞においては、ＧＦＰ遺伝子／Ｎ遺伝子＝０．４５であった。感染したウイルスに対するＧＦＰ遺伝子の発現率は、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰにおいて組換えウイルス５’ＧＦＰと比較して約２倍も多いことが分かる。図６（ａ）の下図は、解析に使用したＲＮＡ量を定量するために、サンプル中に含まれるリボゾームＲＮＡを電気泳動後、可視化したものである。

図６（ｂ）は、感染後１９日後のＶｅｒo細胞におけるＢＤＶのＮ蛋白質（最上段）、Ｐ蛋白質（上から２段目）、Ｍ蛋白質（上から３段目）及びＧＦＰ（最下段）の発現量をウェスタンブロットによって調べた結果を示す図である。図６（ｂ）より、ウイルス蛋白質（Ｎ蛋白質、Ｐ蛋白質、及びＭ蛋白質）は、いずれのＢＤＶを感染させた細胞おいても同程度に発現していることが分かる。一方、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた細胞における、感染したウイルスに対する外来性遺伝子（ＧＦＰ遺伝子）の発現率は、ＧＦＰ／Ｎ蛋白質＝０．８５であり、組換えウイルス５’ＧＦＰを感染させた細胞においては、ＧＦＰ／Ｎ蛋白質＝０．５８であった。感染したウイルスに対するＧＦＰ遺伝子の発現率は、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰにおいて組換えウイルス５’ＧＦＰと比較して多いことが分かる。

図７ａ〜ｆは、野生型ＢＤＶ、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び組換えウイルス５’ＧＦＰそれぞれを感染させた細胞の、顕微鏡写真である。図７ａ及びｂは、野生型ＢＤＶを感染させた細胞、ｃ及びｄは、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた細胞、ｅ及びｆは、組換えウイルス５’ＧＦＰを感染させた細胞である。図７ａ、ｃ及びｅは、細胞へのウイルスの感染を、Ｎ蛋白質抗体（抗ＢＤＶ Ｎ抗体）及び蛍光標識抗体（モリキュラープローブ社製）を使用する間接免疫蛍光抗体法により調べた結果である。図７ａ、ｃ及びｅにおいて、発光部分（赤色）がＮ蛋白質である。図７ｂ、ｄ及びｆは、該ウイルスによる外来性遺伝子（ＧＦＰ）の発現を、該蛋白質の蛍光（緑色の蛍光）によって調べた結果である。図７ｂ、ｄ及びｆでは、ＧＦＰは緑色の蛍光によって検出される。
図７ａ〜ｆより、いずれのＢＤＶウイルスを感染させた細胞でもＮ蛋白質は同程度発現していることから、ウイルスの複製能力は同程度であることがわかる。しかし、ＧＦＰの蛍光強度は、組換えウイルス５’ＧＦＰよりも組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた細胞で顕著に大きいことから、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰは、外来性遺伝子（ＧＦＰ）の発現効率が組換えウイルス５’ＧＦＰより顕著に高いことが分かる。

図８ａ〜ｆは、野生型ＢＤＶ、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び組換えウイルス５’ＧＦＰそれぞれを感染させた細胞の、顕微鏡写真である。図８ａ及びｂは、野生型ＢＤＶを感染させた細胞、ｃ及びｄは、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた細胞、ｅ及びｆは、組換えウイルス５’ＧＦＰを感染させた細胞である。図８ａ、ｃ及びｅは、細胞へのウイルスの感染を、Ｍ蛋白質抗体（抗ＢＤＶ Ｍ抗体）及び蛍光標識抗体（モリキュラープローブ社製）を使用する間接免疫蛍光抗体法により調べた結果である。図８ｂ、ｄ及びｆは、該ウイルスによる外来性遺伝子（ＧＦＰ）の発現を、該蛋白質の蛍光（緑色の蛍光）によって調べた結果である。図８ａ、ｃ及びｅにおいて、発光部分（赤色）がＭ蛋白質である。図８ｂ、ｄ及びｆでは、ＧＦＰは緑色の蛍光によって検出される。
図８ａ〜ｆより、いずれのＢＤＶウイルスを感染させた細胞でもＭ蛋白質は同程度発現していることから、ウイルスの複製能力は同程度であることがわかる。しかし、ＧＦＰの蛍光強度は、組換えウイルス５’ＧＦＰよりも組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた細胞で顕著に大きいことから、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰは、外来性遺伝子の発現効率が組換えウイルス５’ＧＦＰより顕著に高いことが分かる。

＜実施例３＞
実施例２で作製した組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び参考例１で作製した組換えウイルス５’ＧＦＰをそれぞれ、ラットの脳へ感染させた。
精製された各組換えウイルスを、ＰＢＳ又は培養メディウムで１０^３ＦＦＵに希釈後、生後２４時間以内の新生仔ラットの頭蓋内に、左側頭部より１０〜２０μＬ接種した（図９）。接種後、７、１４及び２１日後に採材を行って、図１０に示すように脳を各領域に分割し、各領域についてＤＮＡを抽出し（キアゲン社のＤＮＡ抽出キットを用いた）、個別に組換えウイルスの感染をＰＣＲとＧＦＰの発現によりチェックした。ＰＣＲは、ＢＤＶに特異的なプライマーを用いた。これらのプライマーの配列を以下に示す。
ＢＤＶ特異的なＦｏｗａｒｄプライマーの配列；
5- GGAATGCATTGACCCAACCGGTAGACCAGC -3 （配列番号９）
ＢＤＶ特異的なＲｅｖｅｒｓｅプライマー配列；
5- AACATGTATTTCCTAATCGGGTCCTTGTATACGG -3 （配列番号１０）

ＰＣＲ産物を１％のアガロース電気泳動法で確認した。この結果、左脳中部にウイルスを接種後７日後のラットにおいて、接種部位に加えて、大脳皮質（図１０の右脳の前部）及び小脳部位（図１０の右脳の後部）でも組換えウイルスが検出された。図１１に、ＰＣＲ産物を電気泳動した結果を示す。ｐ／ｍＧＦＰで示されるレーンは、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させたラットの脳のＰＣＲ産物である。５’ＧＦＰで示されるレーンは、組換えウイルス５’ＧＦＰを感染させたラットの脳のＰＣＲ産物である。ｐ／ｍＧＦＰ及び５’ＧＦＰの各レーンにおいて、ａは、大脳皮質、ｂは、小脳部位のＤＮＡのＰＣＲ産物である。なお、図１１において検出されるバンドは、いずれも上記ＰＣＲで増幅されたＢＤＶゲノム断片のバンドであるが、上記ＰＣＲを行なうと、ＢＤＶのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間の領域が増幅される。組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰにおいては、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間にＧＦＰ遺伝子を含むため、組換えウイルス５’ＧＦＰのＰＣＲ産物よりも高分子量側にバンドが検出される。なお、図１１中のＩとは、野生型ＢＤＶ感染Ｖｅｒｏ細胞であり、Ｕは、非感染細胞である。この結果より、接種した組換えウイルスが脳の他の箇所に感染伝播したことが示された。

図１２に、接種後１４日後のラット脳を切開して裏返したマクロ写真（ａ及びｂ）、及び該脳のマクロ蛍光写真（ｃ及びｄ）をそれぞれ示す。図１２ｃ及びｄにおいて、蛍光部分が発現したＧＦＰである。図１２ｃ及びｄより、ＧＦＰの蛍光強度は、組換えウイルス５’ＧＦＰよりも組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた脳の大脳皮質で顕著に大きいことから、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを用いると、外来性遺伝子の発現効率が組換えウイルス５’ＧＦＰより顕著に高いことが分かる。

図１３ａ〜ｄは、大脳皮質の切片（図１３ａ〜ｄの上部に示す、写真中の四角で示す部分）の顕微鏡写真である。図１３ａ及びｃに、接種後７日目のラットの大脳皮質におけるＮ遺伝子の発現を、実施例２と同様のＮ蛋白質に対する抗体（抗ＢＤＶ Ｎ抗体）及び蛍光標識抗体（モリキュラープローブ社製）を使用する間接免疫蛍光抗体法により調べた結果を示す。Ｎ蛋白質は、赤色の蛍光によって検出され、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰ及び組換えウイルス５’ＧＦＰのいずれを感染させた場合も、同程度のＮ蛋白質が発現している（ウイルス感染量は同程度である）ことが分かった。図１３ｂ及びｄに、図１３ａ及びｃとそれぞれ同様の切片について、ＧＦＰの発現を蛍光により検出した結果を示す。ＧＦＰの蛍光強度は、組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを感染させた脳の大脳皮質（図１３ｂ）において、組換えウイルス５’ＧＦＰを感染させた脳の大脳皮質（図１３ｄ）と比較して顕著に大きかった。

＜実施例４＞
実施例１において、ＧＦＰ遺伝子の代わりにＤｓＲｅｄ遺伝子（クローンテック社製）を用いて、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域にＤｓＲｅｄ遺伝子を挿入した組換えベクター（ｒＢＤＶ−ｐ／ｍＤｓＲｅｄベクター）を作製し、実施例２と同様にして組換えウイルスを作製した。比較として、参考例１においてＧＦＰ遺伝子の代わりにＤｓＲｅｄ遺伝子を用いて、ＢＤＶゲノムの５’末端にＤｓＲｅｄ遺伝子を挿入した組換えベクター（ｒＢＤＶ−５’ＤｓＲｅｄベクター）を作製し、実施例２と同様にして組換えウイルスを作製した。培養細胞に各組換えウイルスをそれぞれ感染させた後、１０日目における細胞への組換えウイルスの感染及びＤｓＲｅｄ遺伝子の発現を、実施例２と同様のＮ蛋白質に対する抗体（抗ＢＤＶ Ｎ抗体）及び蛍光標識抗体（モリキュラープローブ社製）を使用する間接免疫蛍光抗体法により調べたところ、ｒＢＤＶ−ｐ／ｍＤｓＲｅｄベクターから産生された組換えウイルスを感染させた細胞においては、図１４に示すようにＮ蛋白質の発現（図１４（ａ））及びＤｓＲｅｄの発現（図１４（ｂ））が観察された（Ｎ蛋白質は二次抗体によって緑色の蛍光及びＤｓＲｅｄは赤色の蛍光によって検出された）。一方、ｒＢＤＶ−５’ＤｓＲｅｄベクターは、感染細胞において組換えウイルスを産生することができなかった。

＜実施例５＞
実施例１において、ＧＦＰ遺伝子の代わりにホタル由来のルシフェラーゼ遺伝子（１．６ｋｂ）（クローンテック社製）を用いて、Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間の非翻訳領域にルシフェラーゼ遺伝子を挿入した組換えベクター（ｒＢＤＶ−ｐ／ｍＬｕｃｉベクター）を作製し、実施例２と同様にして組換えウイルスを作製した。比較として、参考例１においてＧＦＰ遺伝子の代わりにルシフェラーゼ遺伝子を用いて、ＢＤＶゲノムの５’末端にルシフェラーゼ遺伝子を挿入した組換えベクター（ｒＢＤＶ−５’Ｌｕｃｉベクター）を作製した。培養細胞に各組換えウイルスをそれぞれ感染させた後、１０日目における細胞への組換えウイルスの感染及びルシフェラーゼ遺伝子の発現を、実施例２と同様のＮ蛋白質に対する抗体（抗ＢＤＶ Ｎ抗体）を用いる間接免疫蛍光抗体法により調べたところ、ｒＢＤＶ−ｐ／ｍＬｕｃｉベクターから産生された組換えウイルスを感染させた細胞においては、図１５aに示すようにＮ蛋白質が観察されたが、ｒＢＤＶ−５’Ｌｕｃｉベクターは、感染細胞において組換えウイルスを産生することができなかった。また、組換えウイルスｒＢＤＶ−ｐ／ｍＬｕｃｉ感染Vero細胞（図１５ｂ中、ｒＢＤＶ・ｐ/ｍＬｕｃｉ）におけるルシフェラーゼの活性をルシフェラーゼアッセイキット(Promega社)を用いて、添付の説明書に従って測定したところ、非感染細胞に比べ有為に高いルシフェラーゼ活性を示した(図１５ｂ)。このことから、組換えウイルスｒＢＤＶ−ｐ／ｍＬｕｃｉから産生されるルシフェラーゼが機能していることが確認された。

＜実施例６＞
実施例３と同様にして、実施例１で作製したＰ−Ｍ遺伝子間にＧＦＰが挿入されたプラスミド（プラスミドpCAG-Fct-P/M-GFP、以下、「p/mGFP」という）から産生された組換えウイルスｐ／ｍＧＦＰを新生仔マウスの頭蓋内に接種した。組換えウイルス接種２ヶ月後及び８ヶ月後に、マウスの大脳皮質及び小脳から採材を行ない（それぞれｎ＝２）、実施例３と同様にして細胞へのウイルスの感染を、（１）Ｎ蛋白質抗体（抗ＢＤＶ Ｎ抗体）及び蛍光標識抗体（モリキュラープローブ社製）を使用する間接免疫蛍光抗体法、並びに（２）ＧＦＰの蛍光により調べた。その結果、ＢＤＶウイルスは、接種から２ヶ月〜８カ月間、感染細胞（マウスの大脳皮質及び小脳）で持続発現することが分かった。

図１８ａ及びｂは、組換えウイルス接種８カ月後のマウスの脳切断面の蛍光顕微鏡写真である。図１８ａは、マクロ写真であり、図１８ｂは、図１８ａの四角で囲った部分を顕微鏡で拡大した写真である。図１８ａ及びｂにおいて、ＧＦＰは緑色の蛍光によって検出された。図１８ａ及びｂ中では、灰色に見える部分がＧＦＰにより緑色に蛍光を発する部分である。

＜実施例７＞
Ｇ欠損ウイルスの回収
（１）プラスミドの構築
A) p/mGFP deltaG L linear (p/mGFP ΔG LL)の作製
実施例１で作製したp/mGFPを元に、ウイルス膜糖蛋白質であるＧ遺伝子をＰＣＲを用いた点変異導入により欠損させた。具体的な方法として、Ｇ遺伝子に存在する２つのメチオニンをコードする配列(ゲノム番号（すなわち配列番号１の塩基）2236-2238、及び2248-2250)をスレオニン(ATG→ACG)へと置換した。図１９に、Ｇ遺伝子欠損型ウイルスをコードするプラスミドであるp/mGFP ΔGの作製手順の概略を示す。先ずp/mGFPを鋳型に表１に示す配列のプライマーA1及びB1、並びにプライマーC1及びD1を用いてＰＣＲ（98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5又は1分を25サイクル）を行った（図１９（ａ））。

次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型に、上記のプライマーA1及びD1を用いて再びＰＣＲ（98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 1.5分を25サイクル）を行った（図１９（ｂ））。増幅産物（2ndPCR産物）はＧ遺伝子のメチオニンがスレオニンへと変異しており、これを制限酵素Bst1107I及びNheIを用いて、ベクターであるp/mGFPと組換えて（図１９（ｃ））、p/mGFP ΔGを得た。

さらに、不要になったＬ遺伝子イントロン領域（本来この部分はＧ遺伝子の領域）を削りＬ遺伝子を直結した(L linearize)。具体的な方法として、制限酵素サイトBst1107I（配列番号１の2166〜2171番目の塩基配列）からＬ遺伝子のエクソン前半部までとＬ遺伝子のエクソン後半部(NheIサイト（配列番号１の6158〜6163番目の塩基配列）まで)をそれぞれ増幅し両者を結合させてp/mGFP ΔGに組込んだ。この手順の概略を、図２０に示す。先ず、表１に示すプライマーA1及びE1、並びに及びプライマーF1及びD1を用いてp/mGFP ΔGを鋳型にPCR（98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5分を25サイクル）を行った（図２０（ａ））。次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型にプライマーA1及びD1を用いてPCR（98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 1を25サイクル）を行った（図２０（ｂ））。増幅産物（2ndPCR産物）は、Ｌ遺伝子のイントロン部分が削除されており、これを制限酵素Bst1107I及びNheIを用いて、ベクターであるp/mGFP ΔGと組換えて、p/mGFP ΔG LLを得た（図２０（ｃ））。

B)BDV G遺伝子発現プラスミド
G欠損ウイルスを回収するために、ヘルパープラスミドとしてBDVのG蛋白質を哺乳類細胞で発現させるプラスミドを作製した。この手順の概略を、図２１に示す。具体的な方法として、p/mGFPを鋳型にPCRでG遺伝子領域を増幅し、ニワトリベータアクチンプロモーターの下流に挿入した(上述した他のN、P及びL遺伝子のヘルパープラスミドと同様の方法)。先ず、表１に示すプライマーG1及びH1、並びにプライマーI1及びJ1を用いてp/mGFPを鋳型にPCR（98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5又は1.0分を25サイクル）を行った（図２１（ａ））。次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型にプライマーG1及びJ1を用いてPCR（98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 1.5分を25サイクル）を行った（図２１（ｂ））。増幅産物（2ndPCR産物）はG遺伝子をコードしているが、BDVが本来有するスプライシングサイト(SD = 2409-2415、SA = 2437-2442)に、PCRの際に変異を導入し、機能しないようにしている(アミノ酸変異は無い)。具体的には、野生型BDV（WT）のゲノムの2409-2415番目のGGTTATGを、agtctccとし（ΔSA）、さらに野生型BDV（WT）のゲノムの2437-2442番目のGGTTATGを、agtctccとした（ΔSD）。この2ndPCR産物（ΔSDSA G遺伝子）を、制限酵素KpnI及びSmaIを用いて発現プラスミド（実施例１のヘルパープラスミドの作製で使用したｐＣＸＮ２）に挿入し（図２１（ｃ））、BDV G遺伝子発現プラスミドを作製した。組換えプラスミドのヌクレオチド配列は、ＤＮＡシークエンスによって確認した。なお、本実験ではG遺伝子発現プラスミドの作製にｐＣＸＮ２を使用したが、哺乳類細胞で遺伝子を発現できる他のプラスミドも使用可能である。
上記で使用したプライマーの配列を、表１に示す。

（２）BDV G遺伝子発現細胞の作製
上記（１）A)で作製したG蛋白質発現プラスミドを用いてBDVのG遺伝子安定発現細胞を作製した。具体的な方法として、回収に用いる哺乳類培養細胞株、すなわち293T細胞及びVero細胞それぞれ1〜5×10⁵個を9.4 cm²の培養シャーレに撒き、翌日市販の遺伝子導入試薬(Fugen6、Lipofectamine2000)を用いて、上記（１）で作製したプラスミドDNAを2〜5μg導入した。細胞の培養は、３７℃でダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地を用いて行った。プラスミド添加から３日後細胞を継代し、新しい培養プレートに1/3量撒いた。その際、選択薬剤としてジェネティシン(G418)（Invitrogen:GIBCO）を1μg/mlの濃度でダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地に加えた。薬剤選択によって目的遺伝子が安定的に導入された細胞のみ生存するため、この方法によりG遺伝子安定発現細胞株（G遺伝子安定発現293T細胞及びG遺伝子安定発現Vero細胞）を単離した。

（３）G遺伝子欠損ウイルスの回収
A) G遺伝子欠損ウイルス感染Vero細胞の回収
293T細胞にヘルパープラスミドとしてN、P、L及びG遺伝子を導入した。さらに上記で作製したp/mGFP ΔG又はp/mGFP ΔG LLを導入した(遺伝子導入方法は上記（２）と同じ)。各プラスミドを、N遺伝子=0.25μg、P遺伝子=0.025μg、L遺伝子=0.25μg、G遺伝子=0.01μg、p/mGFP ΔG又はp/mGFP ΔG LL＝2.0μgという量比で細胞に導入した。遺伝子導入後、３７℃で293T細胞を培養した。遺伝子導入３日後に細胞を継代し、その際上記で作製したG遺伝子安定発現Vero細胞と共培養を行った後、該Vero細胞を、G遺伝子欠損ウイルス感染Vero細胞として回収した。

B)粒子状のG遺伝子欠損ウイルスの回収
上記（３）A)で作製した感染Vero細胞をトリプシン溶液(トリプシン0.03% w/v、EDTA/2Na 0.02% w/v in PBS-)を用いて培養プレートから回収し、室温にて100〜150g、5分間遠心分離し細胞沈殿物を回収した。回収した細胞沈殿物をもう一度イーグルMEM培養液を用いて懸濁した。作製した懸濁液を、超音波細胞破砕機を用いて処理した。破砕処理後の懸濁液は4℃にて1000〜1200g、25分間遠心分離し上清をウイルス液として回収した。p/mGFP ΔG及びp/mGFP ΔG LLのいずれを導入した細胞からも、組換えBDVが回収された。

C)ウイルスの濃縮
ウイルス液は、必要に応じ超遠心機を用いて濃縮した。具体的な方法として、超遠心用のチューブに20%ショ糖液を加え、その上に上記（３）B)で回収したウイルス液を加えた。4℃にて50000〜100000g、2時間遠心分離し、沈殿物をPBS-で再懸濁して濃縮液として回収した。

＜実施例８＞
p/mGFP ΔG LL感染細胞の作製とシュードタイプウイルスの作製
（１）p/mGFP ΔG LL感染細胞の作製と持続感染性の確認
A)p/mGFP ΔG LL感染細胞の作製
実施例７の（３）B)又はC)で回収したウイルスをVero細胞に接種し、p/mGFP ΔG LL感染細胞を作製した。ウイルス液の希釈にはOpti-MEM(Invitrogen:GIBCO)を用い、24wellプレートに撒いた単層のVero細胞にウイルス希釈Opti-MEMを100μl接種し（Vero細胞１個につき、ウイルスを約0.1〜0.01粒子）、37℃で1時間感作させた。その後PBS-を用いて細胞を洗浄しダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地にて37℃で培養を続けた。接種した感染細胞はウイルスが伝播しない為、細胞のクローニング法(限界希釈法)により100%感染細胞を分離した。感染細胞かどうかの判断は蛍光顕微鏡によりＧＦＰの発現を観察し判断した。ここで分離した感染細胞は、後述するシュードタイプウイルスの作製にも用いた。

実施例７で作製したp/mGFP ΔG及びG遺伝子欠損ウイルス感染Vero細胞、並びにp/mGFP ΔG LL及び上記A)で作製したp/mGFP ΔG LL感染細胞をそれぞれ用いて、プラスミドp/mGFPΔG及びp/mGFP ΔG LLそれぞれによる組換えBDV産生能力を比較した。p/mGFP ΔG及びp/mGFP ΔG LLの各細胞への感染は、実施例７と同様の方法により行った。
図２２は、G遺伝子安定発現細胞への共培養後１２日目の各細胞のウイルス陽性率をGFPを指標に測定したものである。図２２から、細胞１０万個当たりのGFP陽性細胞の数は、p/mGFP ΔGを用いた場合を１としたとき、p/mGFP ΔG LLはその約８倍の陽性率を示した。
このことから、p/mGFP ΔG LLは、p/mGFPΔGと比較して、組換えBDV産生能力が高いことが分かった。

B)p/mGFP ΔG-LLウイルスの持続感染性と伝播能
実施例７の（３）B)又はC)で回収したウイルス（G欠損型組換えウイルス）をVero細胞又はG遺伝子安定発現Vero細胞にウイルス：細胞＝1:100で接種し、増殖性及び持続性を観察した。感染率は、24wellプレートに撒いた細胞１０万個あたりの感染細胞数をカウントすることにより測定した。その結果、図２３に示すように、Vero細胞に接種した場合、感染率は約1％程度で推移したが、G遺伝子安定発現Vero細胞に接種した場合、経過とともに感染率は上昇した。このことから、BDVはG遺伝子なしでも持続感染するが(少なくても100日以上は観察)、感染を拡大するのにG遺伝子が必要であることが確認された。図２３中、◆は、BDVのG遺伝子安定発現Vero細胞であり、■は、Vero細胞（G遺伝子を発現しない細胞）である。
図２４ａは、野生型ＢＤＶ及びG欠損型組換えウイルスそれぞれを感染させた細胞における蛋白質の発現をウェスタンブロット法により調べた結果を示す。図２４ａ中、G、N及びGFPは、それぞれG蛋白質、N蛋白質及びGFPである。図２４ｂは、G欠損型組換えウイルスを感染させたVero細胞の蛍光顕微鏡写真である。図２４ｂの写真で灰色見える部分はGFPによる緑色蛍光部分である。図２４ａ及びｂより、G遺伝子欠損ウイルスを感染させた細胞において、該ウイルスにより導入されたGFPが発現していることが確認された。

（２）p/mGFP ΔG LL感染細胞を用いたシュードタイプウイルスの作製
A)BDVG遺伝子細胞内領域と水疱性口内炎ウイルス(VSV)又は狂犬病ウイルス(RabV)のG遺伝子細胞外及び膜貫通領域を有するキメラ蛋白質発現プラスミドの作製
シュードタイプウイルスを作製するために、他のウイルスの膜蛋白質遺伝子を発現するプラスミドを作製した。図２５に、手順の概略を示す。具体的な方法として、VSV(Indiana株)のG遺伝子発現プラスミド（GeneBank ID:J02428.1）を鋳型に、表２に示すプライマーA2及びB2を用いてPCR（98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 1.5分を25サイクル）を行った（図２５（ａ））。増幅産物（PCR産物）は細胞内領域はBDV由来、細胞外及び膜貫通領域はVSV由来のキメラ膜蛋白（以下、キメラVSV-G蛋白質ともいう）をコードするDNA配列となっている。このPCR産物を制限酵素EcoRI及びEcoRVを用いて哺乳類細胞発現プラスミドであるｐＣＸＮ２(実施例７の（１）B)参照)に組込み（図２５（ｂ））、VSV−G発現プラスミドを得た。

BDVとRabVとのキメラ膜蛋白質を発現するプラスミド（キメラRab−G発現プラスミド）の作製は、鋳型としてRabV：Nishigahara株のG遺伝子発現プラスミド（GeneBank ID:AB044824.1）を用い、プライマーとして、プライマーA2及びB2の代わりに表２に示すプライマーC2及びD2を用い、制限酵素としてKpnI及びEcoRVを用いた以外は、上記と同様の方法で行った。Rab−G発現プラスミドは、細胞内領域はBDV由来、細胞外及び膜貫通領域はRabV由来のキメラ膜蛋白（以下、キメラRab−G蛋白質ともいう）を発現する。

B)キメラ膜蛋白質安定発現細胞の作製
VSV及びRabVのG遺伝子の安定発現細胞株（VSV-G蛋白質安定発現株及びRab−G蛋白質安定発現株）を作製した。上記（２）A)で作製したプラスミド又は同様の方法で作製したTetシステム発現プラスミドに導入したプラスミドを用いてキメラ膜蛋白質安定発現細胞を作製した。具体的には実施例７の（２）に記載されている方法において、G蛋白質発現プラスミドの代わりに上記（２）A)で作製したキメラG蛋白質を発現するプラスミド又は同様の方法で作製したTetシステム発現プラスミドに導入したプラスミドを使用し、293T細胞及びVero細胞、並びに上記（１）で作製したp/mGFP ΔG LL感染細胞に導入した。Tetシステムの薬剤耐性濃度等は添付の説明書に記載の通りに行った。なお、今回用いたのはInvitrogen社のT-RExシステムである。

C)シュードタイプウイルスの回収
上記（１）A）で作製したp/mGFP ΔG LL感染細胞クローンを用いて、シュードタイプウイルスの回収を行った。具体的な方法として、p/mGFP ΔG LL感染細胞にキメラ膜蛋白質発現プラスミドを遺伝子導入し、ダルベッコ変法イーグルＭＥＭ培地またはNutrient Mixture F-12 HAM培地(SIGMA)中で37℃で培養後48-96時間後に上清をシュードタイプウイルス含有液として回収した。p/mGFP ΔG LLにコードされる組換えBDVゲノムを有し、VSV又はRabのウイルス膜蛋白質を被ったシュードウイルスが回収された。G遺伝子としてBDVのG遺伝子、並びにVSV及びRabの外殻遺伝子を用いた場合の、三者の間におけるウイルスの回収効率（粒子形成効率）の違いを、図２６に示した。図２６では、ウイルスの回収効率は、BDV のG遺伝子を使用したときを１とする相対値で表わされている。
さらに、実施例７（３）B)及びC)で示した方法と同様にして、キメラ蛋白質発現細胞を用いてVSV又はRabの膜蛋白質を被ったシュードタイプウイルスを回収した。これらのシュードタイプウイルスは、VSV又はRab由来の外殻を有し、かつp/mGFP ΔG LLにコードされる組換えBDVゲノムを発現できるシュードタイプウイルスである。

＜実施例９＞
M及びG遺伝子欠損ウイルス
（１）p/mGFP ΔG LLをもとにM遺伝子を欠損させたプラスミドp/mGFP ΔM-G LLを作製した。
A)p/mGFP ΔM-G LLプラスミドの構築
さらなる安全性の向上と外来遺伝子挿入箇所の拡大を目的にBDVの膜裏打ち蛋白質をコードするM遺伝子を欠損させた。図２７に、M遺伝子を欠損させたp/mGFP ΔM-G LLプラスミドの作製手順の概略を示す。具体的な方法として、p/mGFP ΔG LLを鋳型に、表３に示すプライマーA3及びプライマーB3を用いてPCR（98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 1.5分を25サイクル）を行った（図２７(a)）。得られたPCR産物(1stPCR産物)をPacIとNheIを用いてp/mGFP ΔG LLに挿入し、p/mGFP ΔM-G LLを作製した（図２７(ｂ)）。

B)p/mGFP ΔM-G LLウイルスの回収
実施例７においてp/mGFP ΔG‐LLウイルスを回収したときと同様に、M蛋白質及びG蛋白質を両方共安定的に発現する培養細胞株を作製し(M遺伝子の選択薬剤にはゼオシンを使用した)、p/mGFP ΔM-G LLウイルスの回収を行った。

C)p/mGFP ΔM-G LLウイルスの性状解析
得られたp/mGFP ΔM-G LLウイルスをVero培養細胞に感染させたところ、野生株と同様に感染性を有することが確認された。

（２）p/mGFP ΔM-G LL P-M tandem vectorの作製
p/mGFP ΔM-G LL のp/m遺伝子間にもう一つ外来遺伝子挿入したカセットを作製した。
さらなる外来遺伝子を挿入する目的で、新たな外来遺伝子挿入カセットをp/m遺伝子間に挿入した。図２８に、p/mGFP ΔM-G LL P-M tandem vectorの作製手順の概略を示す。具体的な方法として、p/mGFP ΔM-G LLを鋳型に表３に示すプライマーC３及びD３を用いてPCR（98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5分を25サイクル）を行った（図２８(a)）。さらに、得られたPCR産物（1stPCR産物）を鋳型にプライマーC3及びE3（表３）を用いてPCR（98℃ 10秒、98℃ 5秒、72℃ 0.5分を25サイクル）を行った（図２８(ｂ)）。得られたPCR産物（2ndPCR産物）を、EcoT22IとBstBIを用いてp/mGFP ΔM-G LLに挿入した。これにより新たな外来遺伝子挿入カセットSse8381I−SwaIをp/mGFP ΔM-G LLに挿入でき、p/mGFP ΔM-G LL P-M tandem vectorが得られた。
このカセットは、P遺伝子のORFとM遺伝子のORFの間にBstBI-PacIサイトを有する他のp/mベクターにEcoT22IとBstBIを用いて組込みことが可能である。

＜実施例１０＞
p/mベクターの利用
（１）アルツハイマー病の治療を目的としたp/mNEPベクターの作製
A)p/mNEPベクターの作製
アルツハイマー病の遺伝子治療法開発を目的にp/m遺伝子間にアミロイドベータ蛋白質(Aβ)分解酵素であるNeprilysin(NEP : Gene ID = 4311)を挿入したp/mNEPベクターを作製した。具体的な方法として、ヒト由来培養細胞からRNAを抽出し、oligodTをプライマーに逆転写酵素(Invitrogen、Super script III)によりmRNAの逆転写反応を行った。得られたcDNAを鋳型に、表６に示すプライマーA4及びB4を用いてNEPをPCR（98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 2.5分を25サイクル）により増幅した。得られたPCR産物をBstBI-PacIを用いてp/mGFPベクターと組換え、p/mNEPベクターを作製した。p/mNEPベクターは、実施例１で作製したBDVのＰ−Ｍ遺伝子間にＧＦＰが挿入されたプラスミド（p/mGFP）において、GFPのｃDNAがNEPのｃDNAで置換されている。さらに、比較のため、NEP酵素活性部位に変異を加えたものをp/mベクターに挿入した組換えベクター（以下、比較ベクター１という）を作製した。方法としては、表６に示すプライマーA4及びC4、並びにB4及びD4を用いてp/mNEPを鋳型にPCR(98℃10秒、55℃5秒、72℃2分又は0.5分を25サイクル)を行った。次に双方の増幅産物(1stPCR産物)を鋳型にプライマーA4及びB4を用いてPCR(98℃10秒、55℃5秒、72℃2.5分を25サイクル)を行った。増幅産物(2ndPCR産物)はNEPのアミノ酸配列585番目がグルタミン酸(ＧＡＡ)からバリン(ＧｔＡ)に置換されており、これをBstBI-PacIを用いてp/mNEPベクターと組換え、比較ベクター１を作製した。

作製したp/mNEPベクター及び比較ベクター１それぞれから、組換えウイルスを、実施例２と同様の方法にて回収し、性状の解析を行った。また、回収したウイルスはアルツハイマー病モデルマウスに投与した。
B)Vero細胞におけるp/mNEPの発現及び活性測定
上記で作製したp/mNEPベクターを用いて、実施例２と同様の方法により、p/mNEP感染Vero細胞を得た。
得られたp/mNEP感染Vero細胞が実際にNEPを発現しているかをWestern Blotting及び間接蛍光抗体法にて確認した。今回用いた一次抗体は抗CD10[56C6]マウスモノクローナル抗体(abcam社:ab951)である。図２９に、p/mNEP感染細胞のWestern Blottingの結果を示す。図２９中、NEPは、p/mNEPベクターから産生された組換えウイルスp/mNEP感染細胞であり、d.nは、比較ベクター１から産生されたウイルスが感染した比較細胞であり、n.cは、非感染細胞である。α-Nは、BDVのN蛋白質である。図２９から、p/mNEPベクター及び比較ベクター１から産生された組換えウイルスが感染した細胞（比較細胞１）では、NEPが発現したことが確認された。

NEPの活性測定には反応領域を疑似的に合成したものであるDAGNPG(Sigma社)を用いた。先ずp/mNEPが感染した細胞をトリプシンで培養シャーレから剥がし、遠心分離にて回収した。回収した細胞は、DAGNPG入りの溶液(50mM Tris-HCl、1μM カプトプリル、50μM DAGNPG)で再懸濁し、37℃で2時間反応させた。反応後100℃で5分間熱して酵素を失活させた。その後4℃にて15000g程度で5分間遠心分離し、上清を回収した。回収した液を96wellプレートに１well あたり200μl注入し、マイクロプレートリーダーにて波長342 nmの励起光で励起し、波長580nmの発光を測定した。NEP活性が強いほど、検出される発光量が多くなる。図３０に、切断酵素活性を測定した結果を示す。p/mNEP感染細胞では、非感染細胞及び比較細胞１と比較してNEP活性が顕著に高かった。

C)p/mNEPをアルツハイマー病モデルマウスへ接種
治療法開発に向け、先ずアルツハイマー病モデルマウスにp/mNEPを接種した。数多く存在するアルツハイマー病のモデルマウスの中で、今回はB6SJL-Tg(APPSwFlLon,PSEN1*M146L*L286V)6799Vas/J(Jackson研究所No6554)とB6.Cg-Tg(APPSwe,PSEN1dE9)85Dbo/J(Jackson研究所No5864)を使用した。これらのモデルマウスはいずれも、ヒトのAβ前駆蛋白質とその分解酵素プレセニリンの変異体を神経細胞に発現させたもので、出生後早期にアルツハイマー病様の症状を示すことが報告されている。

上記モデルマウスの新生仔の脳内に、p/mNEPベクターから産生された組換えウイルスを接種する。

D) p/mGFPベクターから産生された組換えウイルスの脳内での持続性
現時点で、p/mGFPベクターから産生された組換えウイルスを接種したマウスでは脳内に少なくとも8カ月間は導入したGFPの発現が確認された（実施例６及び図１８）。このことからp/mベクターはアルツハイマー病のような長期経過を辿る神経疾患に適用できると考えられる。

＜実施例１１＞
（１）miRNA導入ベクターの開発
医療及び研究への応用に役立てるため、機能性RNAであるmiRNAを導入可能なp/mベクターを作製した。
A)p/m miR155導入用ベクター(pSIRIUS-B)の作製
pSIRIUS-Bの作製手順の概略を、図３１に示す。まず、様々なmiRNA配列を導入するために必要となる導入用ベクターを作製した。初めにpBluescript SK-のマルチクローニングサイトにBstBIとPacIの制限酵素サイトを導入し（図３１（b））、p/m miR155導入用ベクターpSIRIUS-Bを完成させた。次にその間にmiR 155をもとに設計したmiRNA発現に必要な制御配列を導入した。さらに、その中心にはBbsIによる制限酵素カセットを挿入し、様々なmiRNA配列を導入できるようにした(図３１(a))。
図３１(a)の模式図において、白い部分がmiRNA発現制御部位であり、黒い部分がオリゴ導入カセットである。図３１(a)に模式的に示されるDNA断片の配列及び該配列内の制限酵素サイトを、下記表４に示す。

B)p/m miR155を用いた活性測定用ベクターの作製
A)で作製したベクターを利用して様々なmiRNA配列をBstBI、PacIを用いてp/mベクターに挿入することが可能である。今回は一例としてmiR155を用いた。miR155標的配列を合成し、これをpSIRIUS-BにBbsIを用いて導入し、pSirius-B miR-155を得た（図３２(a)）。表５に、今回合成したmiR155標的配列の配列を示す。上段が、miRNA155の配列（配列番号３２）である。表５の下段の配列を配列番号３３に示す。miR155標的配列（オリゴ）を、pSirius-B miR-155から、BstBI-PacIを用いてp/mベクターに導入し、p/m miR155を作製した（図３２(ｂ)）。

さらに導入したmiR155が機能しているかを調べる目的で、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼの下流にmiR155のターゲット配列を導入したプラスミドを作製しmiR155の効果を判定できるようにした。

C)p/m miR155の回収と活性測定
実施例２に示した方法と同様の方法によりp/m miR155のプラスミドから組換えウイルスを回収し、B)で作製したプラスミドを用いてその活性を測定した。方法として、p/m miR155感染細胞及びBDV野生株感染細胞（いずれもVero細胞にウイルスを感染させた）に遺伝子導入試薬(Lipofectamine2000など)を用いてレポータープラスミドを導入し、2〜3日後Luciferase Assay System(Promega社)に添付のプロトコール通りに実験を行い、p/m miR155感染細胞とBDV野生株感染細胞とを比較した。図３３に、組換えウイルスを感染させた細胞における標的遺伝子の転写阻害効率を示す（図３３のwt: BDV野生株感染細胞、x1：p/m miR155感染細胞）。

D)p/m miRx2、p/m miRx4の作製
さらに、a)を改良しmiRNAの配列をx2（2回繰り返した配列）、x4（4回繰り返した配列）で挿入することができるように新たなプラスミドを作製した。作製手順の概略を、図３４に示す。まずpcDNA3のマルチクローニングサイトにBstBIとPacIを挿入した(pSIRIUS-D)。次にA)で作製したプラスミド(目的のmiRNA挿入済み)を鋳型に表６に示すプライマーＥ４及びＦ４を用いてPCRを行った（98℃ 10秒、55℃ 5秒、72℃ 0.5分を25サイクル）。得られたPCR産物をpSIRIUS-DにSalIとXhoIを用いて挿入した（図３４(a)）(このとき挿入される向きに注意した)。さらに、作製したプラスミドからSalIとXbaIでインサートを切り出し（図３４（ｂ））、得られた断片をもう一度同一のプラスミドに今度はXhoIとXbaIを使って挿入した(SalIとXbaIは同一の切断配列を有した)（図３４（ｃ））。これによりmiRNAx2のプラスミドが得られた。得られた、miRNAx2のプラスミドをBstBIとPacIで切り出してp/mベクターに挿入することにより、p/m miRNAx2が得られた。miRNA x4は上記工程を繰り返すことによって作製した。miRNA×2及びmiRNA×4のp/mベクターの模式図を、図３５に示す。得られたmiRNA×2及びmiRNA×4のp/mベクターを、実施例２に示した方法と同様の方法により回収し、その効果を確認した。結果を、図３３に示す。図３３中、×１、×２、及び×４はそれぞれ、プラスミド中に挿入したmiR155の数である。図３３から分かるように、miR155が導入された数が多いほど、標的遺伝子の発現が効率よく阻害された。また、細胞に導入されたmiR155は、細胞で持続的に発現することが確認され、本発明のベクターは、機能性RNAを発現できるRNAベクターとして有用であることが示された。

（２）miRNA導入ベクターの応用
A)p/m miRNA GAPDHを用いたマウス海馬初代培養細胞におけるmiRNAの効果
p/m miRNA155において、miRNA155の代わりに細胞内で恒常的に発現しているＧＡＰＤＨに対するmiRNA（miR-GAPDH）を挿入したプラスミド(p/m miRNA-GAPDH)を作製し、その効果をより生体に近いマウス海馬初代培養細胞で確認した。p/m miRNA-GAPDHの作製方法は(１)で示したp/m miR155の作製方法とほぼ同様である(合成したmiR-GAPDHの配列を、配列番号４０及び４１に示した)。配列番号４０のDNA及び配列番号４１のDNAは、プラスミド内では二重鎖を形成している。実施例２に示した方法と同様の方法によりp/m miRNA-GAPDHから産生された組換えウイルスp/m miRNA-GAPDHを回収した。回収した組換えウイルスp/m miRNA-GAPDHを新生仔マウスの海馬から採取した初代培養細胞にMOI＝0.01で接種した。７日後に固定後、抗ＢＤＶ-N抗体、及び抗GAPDH抗体で染色し、蛍光顕微鏡にて観察した。その結果、組換えウイルスp/m miR-GAPDHを感染させた細胞では野生型ＢＤＶを感染させた細胞に比べ有為にＧＡＰＤＨの発現が抑制されていた(図３６)。図３６ａ及びｂは、野生型ＢＤＶを感染させた細胞であり、図３６ｃ及びｄは、組換えウイルスp/m miR-GAPDHを感染させた細胞である。図３６ａ及びｃは、抗ＢＤＶ-N抗体で染色した細胞の蛍光顕微鏡写真であり、図３６ｂ及びｄは、抗GAPDH抗体で染色した細胞の蛍光顕微鏡写真である。図３６ｂ及びｄの四角内は、拡大写真であり、＊＊を付した矢印は、非感染細胞を示す。＊＊が付されていない矢印は、感染細胞(図３６ｂでは野生型、図３６dではp/m miR-GAPDH)を示す。図３６ｂでは非感染細胞、感染細胞共にＧＡＰＤＨの発現レベルは高い(ＧＡＰＤＨは抑制されていない)が、図３６ｄでは感染細胞は非感染細胞に比べＧＡＰDHの発現レベルが抑制されていることが観察された。

B)p/m miRNA APPを用いた感染Ｖｅｒo細胞におけるmiRNA-APPの効果
p/m miRNA155において、miRNA155の代わりにアルツハイマー病の原因蛋白質であるＡＰＰに対するmiRNA（miRNA-APP）を挿入したプラスミド(p/m miRNA-APP) を作製し、その効果をp/m miRNA-APP感染Ｖｅｒｏ細胞を用いて確認した。p/m miRNA-APPの作製方法は(１)で示したp/m miR155の作製方法とほぼ同様である(合成したmiRNA-APPを、配列番号４２及び４３に示した)。配列番号４２のDNA及び配列番号４３のDNAは、プラスミド内では二重鎖を形成している。実施例２に示した方法と同様の方法によりp/m miRNA-GAPDHから産生された組換えウイルスp/m miRNA-APPを回収した。回収した組換えウイルスp/m miRNA-APPを感染させた細胞にLipofectamine2000を用いてAPP発現プラスミド（pcDNA3に添付の説明書に従って作製。APPのcDNA(Accession No＝NM_000484）はヒト由来培養細胞からＲＮＡを抽出し、oligo dTプライマー及び逆転写酵素を用いて調製した。）を添付の説明書に従って導入した。４８時間後にRNAを回収し、上記表６に示すＡＰＰに特異的なプライマーG4及びH4を用いた定量的ＲＴ−ＰＣＲ(９５℃１０秒、６０℃３０秒、４０サイクル)によりＡＰＰのmRNAのレベルを確認した。コントロールとして、p/mGFPから産生された組換えウイルスを感染させた細胞を用いて同様の実験を行なった。その結果、組換えウイルスp/m miRNA-APPが感染したＶｅｒｏ細胞ではp/mGFPが感染したＶｅｒo細胞に比べ有為にAPPのmRNAの量が低下していた(図３７)。

本発明のウイルスベクターから産生される組換えウイルスは、細胞核で非細胞障害的にかつ効率的に外来性遺伝子を発現できるものであり、また、ウイルスゲノムがＲＮＡであることから宿主染色体に挿入されることがなく安全なベクターである。さらに、本発明のウイルスベクターはボルナ病ウイルスを利用するものであるが、ボルナ病ウイルスは神経細胞に感染指向性があることから外来性遺伝子を脳神経系に選択的に導入することができる特異性に優れたベクターである。このため、本発明は、宿主染色体に影響を及ぼさない遺伝子導入技術として種々の分野、例えば、脳神経系疾患治療及び予防、脳神経化学領域における神経系細胞の可視化技術等に使用することができるため有用である。さらに、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー等の機能性ＲＮＡの安定発現ベクター技術に応用することもできる。従って、本発明は、医療、動物医療、治験、研究等の分野において有用である。

Claims (14)

1. （ａ）ボルナ病ウイルスゲノムにおける少なくともＮ遺伝子、Ｘ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を、ボルナ病ウイルスゲノムにおける順序と同じ順序で有し、前記Ｐ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡ、（ｂ）リボザイムをコードするＤＮＡ及び（ｃ）プロモーター配列を含み、該（ａ）の上流及び下流に（ｂ）が配置され、かつ（ａ）及び（ｂ）が（ｃ）の下流に配置されていることを特徴とするウイルスベクター。
2. （ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてＧ遺伝子が破壊された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである請求項１に記載のウイルスベクター。
3. （ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムにおいてＧ遺伝子及びＭ遺伝子が破壊された配列を有し、かつＰ遺伝子の翻訳領域の下流に連結する非翻訳領域内に外来性遺伝子が挿入された配列を有する組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡである請求項１又は２に記載のウイルスベクター。
4. （ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡが、ボルナ病ウイルスゲノムをコードするｃＤＮＡのＰ遺伝子の翻訳領域とＭ遺伝子の翻訳領域との間の非翻訳領域に外来性遺伝子を挿入した組換えウイルスのｃＤＮＡである請求項１に記載のウイルスベクター
5. （ｃ）プロモーター配列が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ系のプロモーター配列であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のウイルスベクター。
6. （ａ）組換えウイルスＲＮＡのｃＤＮＡの上流に（ｂ１）ハンマーヘッドリボザイムをコードするｃＤＮＡが配置され、かつ、該（ａ）の下流に（ｂ２）δ型肝炎ウイルスリボザイムをコードするｃＤＮＡ配列が配置されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のウイルスベクター。
7. 請求項１〜６のいずれかに記載のウイルスベクターにコードされるＲＮＡを含むことを特徴とする組換えウイルス。
8. 請求項１〜６のいずれかに記載のウイルスベクターと共に、ヘルパープラスミドとしてボルナ病ウイルスのＮ遺伝子、Ｐ遺伝子及びＬ遺伝子を発現するプラスミド又はプラスミド群をin vitroの細胞に導入する工程、及び該ウイルスベクター及びヘルパープラスミドを導入した細胞を培養して組換えウイルスを産生させる工程を含むことを特徴とする組換えウイルスの作製方法。
9. ヘルパープラスミドとして、さらに、ウイルスの外殻遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する請求項８に記載の組換えウイルスの作製方法。
10. ヘルパープラスミドとして、さらに、ボルナ病ウイルスのＭ遺伝子を発現するプラスミドをin vitroの細胞に導入する請求項８又は９に記載の組換えウイルスの作製方法。
11. 請求項７に記載の組換えウイルス、又は請求項８〜１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスをin vitroの細胞又は動物に感染させる工程を含むことを特徴とする外来性遺伝子の導入方法。
12. 請求項７に記載の組換えウイルス、又は請求項８〜１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入剤。
13. 請求項７に記載の組換えウイルス、又は請求項８〜１０のいずれかに記載の方法により作製された組換えウイルスを含有することを特徴とする脳神経系細胞への外来性遺伝子導入剤。
14. 請求項１〜６のいずれかに記載のウイルスベクターを含有することを特徴とする外来性遺伝子導入用キット。