TWI777314B - 包含有專一性表現cd59標靶小髮夾rna的表現質體之類病毒顆粒及其用途 - Google Patents
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Abstract
一種人類JC病毒之類病毒顆粒,用於將異源核酸遞送至人體,包含:主要衣殼蛋白VP1,其胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示;以及CD59標靶小髮夾RNA表現質體,包含如SEQ ID NO:2所示之鹼基序列,該CD59標靶小髮夾RNA表現質體係由SEQ ID NO:2所示之鹼基序列中的肺部專一性啟動子所驅動,其中,該肺部專一性啟動子係驅動該CD59標靶小髮夾RNA表現質體於肺部表現CD59標靶小髮夾RNA。
Description
本發明相關於一種包含有專一性表現CD59標靶小髮夾RNA的表現質體之類病毒顆粒。
肺癌是全球最為常見的癌症。每年有將近180萬人被診斷出罹患肺癌,而每年因為肺癌而死亡的人數亦高達160萬人之多。據研究統計顯示,肺癌不論是在發生率或死亡率方面均位居第一,並且已成為目前全球最主要的健康問題之一。
除了根據傳統組織學將肺癌患者所罹患的肺癌分類為小細胞肺癌(small-cell lung carcinoma, SCLC)及非小細胞肺癌(non-SCLC, NSCLC)之外,近年由於次世代定序技術的蓬勃發展,患者所罹患的肺癌類型可以根據患者的腫瘤細胞是否表達特定的基因畸變生物標記而進行更進一步的分類。
表皮生長因子受體(EGFR)突變係在肺腺癌中常見的畸變。被設計用於標靶治療EGFR的單株抗體,例如cetuximab、panitumumab以及necitumumab已經由美國食品藥品監督管理局(FDA)批准用於病人的治療,從而增加了精確醫學於臨床上的應用。基於抗體的癌症治療(antibody-based cancer therapy)啟動了抗體依賴型之細胞介導的細胞毒殺作用(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC)及補體介導的細胞毒殺作用(complement-dependent cytotoxicity, CDC),以通過辨識並結合腫瘤細胞上的特定抗原的方式誘發腫瘤細胞生長停止或是細胞凋亡。然而,儘管上述的癌症治療方式具有臨床益處,但並非對所有患者都有效。在癌細胞所採用的諸多種防禦策略中,藉由過度表現膜補體調節蛋白(membrane complement regulatory protein, mCRP)以避免CDC的啟動,已成為現今許多研究的重點。
補體系統的啟動是人體免疫監視的一線防禦機制,其可識別非自身的微生物及腫瘤細胞。在三種補體活化路徑中的其中一種路徑係利用補體達到細胞裂解之目的。在C5轉化酶將C5切割成C5a及C5b之後,C5b、C6、C7及C8形成複合物,該複合物遂插入細胞膜中。緊接著,該複合物募集複數個C9加入,進而於細胞膜上形成膜攻擊複合物(membrane attack complex, MAC)並導致細胞裂解。
CD59是一種膜補體調節蛋白,可藉由補體在細胞膜表面聚集時,抑制C8募集C9,從而抑制MAC的組裝與形成,進而抑制CDC的啟動。許多不同類型的實質固態惡性腫瘤,包括肺癌細胞,經常是藉由過度表現CD59來避免上述形式的宿主免疫監視。這不僅代表補體在對抗癌症的宿主免疫監視中扮演極為重要的角色,癌細胞藉由過度表現CD59來避免啟動宿主免疫監視也成為目前癌症免疫療法的實際應用中所面臨的主要瓶頸。
因此,在過度表現CD59的癌細胞中有效抑制CD59的合成具有助於補體介導的腫瘤細胞清除的可能性。
因此,本發明的目的即在提供一種包含有專一性表現CD59標靶小髮夾RNA的表現質體之類病毒顆粒,可有效遞送該質體並表現CD59標靶小髮夾RNA以降低肺腺癌腫瘤細胞之CD59表現量。
本發明為解決習知技術之問題所採用之技術手段係提供一種人類JC病毒之類病毒顆粒,用於將異源核酸遞送至人體,包含:主要衣殼蛋白VP1,其胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示;以及CD59標靶小髮夾RNA表現質體,包含如SEQ ID NO:2所示之鹼基序列,該CD59標靶小髮夾RNA表現質體係由SEQ ID NO:2所示之鹼基序列中的肺部專一性啟動子所驅動,其中,該肺部專一性啟動子係驅動該CD59標靶小髮夾RNA表現質體於肺部表現CD59標靶小髮夾RNA。
在本發明的一實施例中係提供一種人類JC病毒之類病毒顆粒,該人類JC病毒之類病毒顆粒係以由該主要衣殼蛋白VP1自行組裝並包裝該CD59標靶小髮夾RNA表現質體的方式所形成。
在本發明的一實施例中係提供一種人類JC病毒之類病毒顆粒,該肺部專一性啟動子係為表面活性蛋白B啟動子(Surfactant protein-B promoter, SP-B promoter)。
在本發明的一實施例中係提供一種人類JC病毒之類病毒顆粒用於製備抑制人類肺腺癌(human lung adenocarcinoma)生長及轉移的醫藥組成物的用途。
經由本發明所採用之技術手段,本發明之該包含有專一性表現CD59標靶小髮夾RNA的表現質體之類病毒顆粒,可有效遞送該質體並表現CD59標靶小髮夾RNA以降低肺腺癌腫瘤細胞之CD59表現量,更可進一步作為肺腺癌的專一性基因治療載體。
以下根據第1圖至第6圖,而說明本發明的實施方式。該說明並非為限制本發明的實施方式,而為本發明之實施例的一種。
依據本發明的一實施例的一種人類JC病毒之類病毒顆粒,用於將異源核酸遞送至人體,包含:主要衣殼蛋白VP1,其胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示;以及CD59標靶小髮夾RNA表現質體,包含如SEQ ID NO:2所示之鹼基序列,該CD59標靶小髮夾RNA表現質體係由SEQ ID NO:2所示之鹼基序列中的肺部專一性啟動子所驅動,其中,該肺部專一性啟動子係驅動該CD59標靶小髮夾RNA表現質體於肺部表現CD59標靶小髮夾RNA。
詳細而言,本發明之人類JC病毒之類病毒顆粒係以由該主要衣殼蛋白VP1自行組裝並包裝該CD59標靶小髮夾RNA表現質體的方式所形成。
詳細而言,本發明之人類JC病毒之類病毒顆粒之該肺部專一性啟動子係為SP-B啟動子。
詳細而言,本發明之人類JC病毒之類病毒顆粒係用於製備抑制人類肺腺癌生長及轉移的醫藥組成物的用途。
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是一種對於有效抑制標靶基因的表現具有高度專一性的技術,而能夠參與並進行此種技術的RNA分別為小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)及小髮夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)。相較於在細胞中具有短期抑制效果的siRNA而言,shRNA具有更長的抑制效果(Brummelkamp, T.R., Bernards, R. and Agami, R. (2002) Science 296, 550–553)。因此,本案遂構築專一性表現CD59標靶小髮夾RNA表現質體pSPB-shCD59,以期利用該質體所表現出之CD59標靶小髮夾RNA抑制肺癌細胞之CD59的表現,從而在肺癌細胞誘發CDC的啟動。
概括而言,在本實施例中,係構築二質體,其中一質體為JCPyV主要病毒蛋白表現質體ΔpFlag-JCVP1,該質體係表現人類JC病毒之主要衣殼蛋白VP1(major capsid protein VP1),VP1可自行組裝成類病毒顆粒(virus-like particles, VLPs);另一質體為專一性表現CD59標靶小髮夾RNA表現質體pSPB-shCD59,該質體係包含肺部專一性啟動子及受該肺部專一性啟動子驅動之CD59標靶小髮夾RNA之鹼基序列。專一性表現CD59標靶小髮夾RNA表現質體pSPB-shCD59係被包裝入JCPyV主要病毒蛋白表現質體ΔpFlag-JCVP1所表現並自行組裝的類病毒顆粒中。而後係陸續利用包含有專一性表現CD59標靶小髮夾RNA表現質體之該類病毒顆粒(以下簡稱為pSPB-shCD59/VLP)進行CD59蛋白表現分析試驗、CCK-8活細胞測定試驗、乳酸脫氫酶釋放試驗、異種移植研究、抑制人類肺腺癌細胞轉移研究以及藉由免疫組織化學染色法檢測腫瘤中CD59的表現等。其中,上述之pSPB-shCD59/VLPs的相關製備材料及試驗方法係如下所示。
構築CD59標靶小髮夾RNA表現質體pSPB-shCD59:
使用Bgl II及EcoR I (NEB)處理表現質體主幹RNAi-Ready pSIREN-shuttle-shLT(Lin, M.C., Wang, M., Fang, C.Y., Chen, P.L., Shen, C.H. and Chang, D. (2014) Antiviral Res. 103, 25–31),並移除U6啟動子及shLT,進而得到長度為2882 bp的載體主幹。在本發明中,肺癌細胞為本發明之作用標的,因此原RNAi-Ready pSIREN-shuttle-shLT的啟動子係被取代為肺部專一性啟動子SP-B(Strayer, M., Savani, R.C., Gonzales, L.W., Zaman, A., Cui, Z., Veszelovszky, E. et al. (2002) Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 282, L394–L404; Kumar, A.S., Venkatesh, V.C., Planer, B.C., Feinstein, S.I. and Ballard, P.L. (1997) J. Biol. Chem. 272, 20764–20773),其模板為肺癌細胞株A549的基因體DNA,所使用的引子的鹼基序列如SEQ ID NO:4所示,為SPB-S-Bgl II (5’-gggcccagatctatagggctgtctg-3’),以及鹼基序列如SEQ ID NO:5所示之反向引子shCD59-AS (5’-tgaattcaaaaaa
tgagctaacgtactactgctctcttgaa
gcagtagtacgttagctcacgcatggccccttatag-3’)或是鹼基序列如SEQ ID NO:6所示之反向引子shCD59ctr-AS (5’-atgaattcaaaaaa
aagctgtcctcagttcagatctcttgaa
ttcgacaggagtcaagtctcgcatggccccttatag-3’) (Integrated DNA Technologies, Singapore),其中,反向引子中加底線的部分係為shCD59以及shCD59-ctr的DNA序列(Shi, X.X., Zhang, B., Zang, J.L., Wang, G.Y. and Gao, M.H. (2009) Cell. Mol. Immunol. 6, 61–66)。包括SP-B引子以及shCD59或shCD59-ctr的全長PCR片段長度為662 bp。PCR產物的長度係經由瓊脂糖凝膠電泳確認。PCR產物同樣係經由Bgl II及EcoR I (NEB)處理並與先前處理完成的該載體主幹連接,再轉形至勝任細胞(DH5α)中,最終的質體被命名為pSPB-shCD59以及pSPB-shCD59ctr,並經由定序確認。專一性表現CD59標靶小髮夾RNA表現質體pSPB-shCD59之鹼基序列如SEQ ID NO:2所示。pSPB-shCD59ctr係作為一控制組,其鹼基序列如SEQ ID NO:3所示,係為經由攪和shCD59之序列而設計出的與pSPB-shCD59相對應的攪和對應體,其對於抑制CD59之表現理應毫無效果。
製備包含有專一性表現CD59標靶小髮夾RNA的表現質體之類病毒顆粒pSPB-shCD59/VLP:
JCPyV主要病毒蛋白表現質體ΔpFlag-JCVP1可於大腸桿菌中表現主要衣殼蛋白VP1,其胺基酸序列為SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列,所表現之主要衣殼蛋白VP1能夠自行組裝成VLPs。經由主要衣殼蛋白VP1自行組裝而成的VLPs在本案中係用於包裝pSPB-shCD59而成為本案之pSPB-shCD59/VLP。
ΔpFlag-JCVP1帶有ampicillin抗藥性,而pSPB-shCD59及pSPB-shCD59ctr帶有kanamycin抗藥性。將ΔpFlag-JCVP1及pSPB-shCD59或是ΔpFlag-JCVP1及pSPB-shCD59ctr轉形至勝任細胞(JM109)中。值得注意的是,ΔpFlag-JCVP1所表現之主要衣殼蛋白VP1於自行組裝成VLPs的同時,會將同時存在於勝任細胞中的pSPB-shCD59或是pSPB-shCD59ctr包裝入VLPs當中。將ΔpFlag-JCVP1及pSPB-shCD59或是ΔpFlag-JCVP1及pSPB-shCD59ctr轉形至勝任細胞(JM109)後,係添加抗生素ampicillin及kanamycin以進行篩選。而後進行PCR以確認兩種質體同時存在於勝任細胞中,並將其命名為pSPB-shCD59/VLP以及pSPB-shCD59ctr/VLP。之後,VLP的純化以及表現係如參考文獻(Lin, M.C., Wang, M., Fang, C.Y., Chen, P.L., Shen, C.H. and Chang, D. (2014) Antiviral Res. 103, 25–31)所述。簡言之,細菌受IPTG誘導而裂解,並通過離心收集包含有可溶性蛋白的上清液,而後,將含有包裝質體DNA的JCPyV VLPs (即,pSPB-shCD59/VLPs或是pSPB-shCD59ctr/VLPs)通過10-30%蔗糖梯度進行純化,並藉由通過Centricon濃縮離心管(Millipore)中過濾進行濃縮。
細胞株:
人類肺癌細胞株A549係屬於肺腺癌細胞株,係購自台灣生物資源保存及研究中心。該人類肺癌細胞株A549係保存於補充有10%胎牛血清及抗生素的DMEM培養基中。
藉由西方墨點法分析CD59蛋白表現:
收集細胞並以PBS洗滌兩次。使用細胞裂解緩衝液(Cell Signaling Technology, Inc., MA, United States)進行細胞裂解。藉由15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)分離蛋白質並轉印至聚偏二氟乙烯(PVDF membrane)(Pall Corporation, Pensacola)。使用的一級抗體為anti-CD59 Ab(1:50, NBP1-89405, Novus)以及anti-actin Ab(1:5000, NB600-501, Novus)。使用的二級抗體為標記有HRP(actin)的山羊抗小鼠抗體或是標記有HRP(CD59)的山羊抗兔子抗體(Santa Cruz Biotechnology)。發光訊號係為使用Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus Kit(PerkinElmer Life Sciences)而產生。
細胞轉染pSPB-shCD59以及細胞感染pSPB-shCD59/VLP:
細胞轉染pSPB-shCD59:pSPB-shCD59以及pSPB-shCD59ctr係為按照Lipofectamine 2000試劑的產品製造商之說明,使用Lipofectamine 2000試劑將pSPB-shCD59以及pSPB-shCD59ctr遞送至細胞中。A549細胞係於35-mm培養皿中的完整的DMEM培養基中培養。將4 μg的質體DNA以及10 μl的Lipofectamine 2000試劑混合,並於室溫孵育20分鐘。隨後,將細胞加入前述之混合物以進行細胞轉染。
細胞感染pSPB-shCD59/VLP:細胞感染步驟如下,使用PBS將細胞洗滌兩次,而後加入10 μg的pSPB-shCD59/VLP或是pSPB-shCD59ctr/VLP,並在4°C下孵育1小時。隨後,使用冷的PBS洗滌細胞兩次,並除去游離的VLPs。加入完整的DMEM培養基,細胞係於37°C,5% CO
2下培養72小時。
參照第1圖,為了確認本案所構築的專一性表現CD59標靶小髮夾RNA表現質體pSPB-shCD59是否確實能夠降低肺癌細胞中CD59之表現,因此使用了具有內源性CD59過度表現的A549細胞進行西方墨點法分析,其中進行偵測與分析之標的分為未處理組(可視為對照組)、轉染組(sh代表受pSPB-shCD59轉染的A549細胞的CD59表現、ctr代表受pSPB-shCD59ctr轉染的A549細胞的CD59表現)以及感染組(sh代表受pSPB-shCD59/VLP感染的A549細胞的CD59表現、ctr代表受pSPB-shCD59ctr/VLP感染的A549細胞的CD59表現),而分析肌動蛋白之目的係為標準化。結果顯示,轉染組中受pSPB-shCD59轉染的A549細胞經過72小時後,與同組的受pSPB-shCD59ctr轉染的A549細胞相比,受pSPB-shCD59轉染的A549細胞的CD59表現量係下降了45%。由此結果可證實,本案所構築之專一性表現CD59標靶小髮夾RNA表現質體pSPB-shCD59確實能夠成功地降低CD59的表現。
參照第1圖,感染組中受pSPB-shCD59/VLP感染的A549細胞經過72小時後,與同組的受pSPB-shCD59ctr/VLP感染的A549細胞相比,受pSPB-shCD59/VLP感染的A549細胞的CD59表現量係下降了38%。由此結果可證實,包含有專一性表現CD59標靶小髮夾RNA的表現質體之類病毒顆粒pSPB-shCD59/VLP具有降低CD59的表現的能力。
乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放試驗:
細胞處理完成後,收集100 μl的上清液,並添加100 μl 新鮮製備的反應混合物(Clontech),並放置於室溫30分鐘。使用490 nm filter(Biotek Instruments, Winooski, VT, U.S.A.)測量吸光度。
藉由CCK-8活細胞測定試驗測定細胞存活度:
使用CCK-8活細胞測定試驗(Dojindo Molecular Technology, Inc.)測量細胞存活度。將細胞以1 x 104 cells/well 的密度接種到96孔平底微量滴定培養盤(BD Biosciences Clontech, San Diego, CA, U.S.A.)中,在溫度為37°C,5% CO
2的環境下培養。經過細胞轉染或是細胞感染3天後,將8%新鮮的正常人類血清(normal human serum, NHS)添加到含有失活補體的10% FBS的細胞培養基中,並將細胞於37°C孵育60分鐘。DMEM中的Triton X-100係作為細胞100%裂解之對照組,而DMEM係單獨作為細胞0%裂解之對照組。而後除去上清液後,加入10 μl的DMEM以及10 μl的CCK-8溶液,並將其放置在恆溫箱中1-4小時。使用490 nm filter(Biotek Instruments, Winooski, VT, U.S.A.)測量吸光度。
參照第2圖,為了確認降低肺癌細胞的CD59表現是否能夠使肺癌細胞回復對於CDC的敏感度,進而利用CDC抑制肺癌細胞之生長,或是造成肺癌細胞之死亡,因而進行了乳酸脫氫酶釋放試驗。在進行細胞處理(轉染或是感染細胞)的3天後,係對特定實驗組添加新鮮的正常人類血清(normal human serum, NHS),以期偵測到因CDC的啟動而受損或死亡的肺癌細胞所釋放出之乳酸脫氫酶。其中,pSIREN為構築CD59標靶小髮夾RNA表現質體pSPB-shCD59的過程中所使用的載體主幹;JCPyV VLP為空的類病毒顆粒(即,未包含有異源核酸或是原生病毒基因之類病毒顆粒)。依據該乳酸脫氫酶釋放測試之結果顯示,除了Triton X-100係作為細胞100%裂解之對照組外,只有添加NHS的轉染組的pSPB-shCD59以及添加NHS的感染組的pSPB-shCD59/VLP能夠偵測到明顯高於其餘實驗組及未處理組(可視為對照組)的吸光值。此結果表示本案之pSPB-shCD59/VLP確實能夠藉由降低肺癌細胞的CD59表現而使肺癌細胞回復對於CDC的敏感度,進而藉由CDC攻擊肺癌細胞。
參照第3圖,為了更進一步了解本案的pSPB-shCD59/VLP的應用範圍,因而進行了CCK-8活細胞測定試驗,用以測定受pSPB-shCD59轉染或是受pSPB-shCD59/VLP感染的A549細胞於經過3天後再添加NHS,而後所呈現的細胞存活度。結果顯示,添加NHS的轉染組的pSPB-shCD59以及添加NHS的感染組的pSPB-shCD59/VLP能夠偵測到明顯低於其餘實驗組及未處理組(可視為對照組)的吸光值。此結果表示利用本案之pSPB-shCD59/VLP感染肺癌細胞後,能夠藉由NHS啟動CDC,進而導致肺癌細胞的生長受到抑制。
異種移植研究:
自台灣的BioLASCO Taiwan Co., Ltd.購買四週大的雄性NU/NU小鼠,並在中山醫學大學將其飼養並保存在受控的無病原體專用氣流櫃中。給動物隨意加水和加標準飼料,並保持12小時的明/暗週期。所有動物程序均按照批准的步驟準則進行,並符合中山醫學大學的實驗動物照護及使用委員會關於適當照護和使用實驗動物的建議。A549細胞係以10
7個細胞/小鼠的劑量皮下注射。5天後,將小鼠隨機分為4組,每組4隻。第1組:對照組(未處理組);第2組:JCPyV VLP注射組;第3組:pSPB-shCD59ctr/VLP注射組;第4組:pSPB-shCD59/VLP注射組。每3天進行一次100 μg VLP 或 100 μl PBS的尾靜脈注射,總共12次注射。在最後一次注射完成的3天後,小鼠於腔室內以CO
2窒息的方式犧牲。CO
2係大約以每分鐘注入20%腔室體積的速度注入至腔室中。小鼠犧牲後,取出腫瘤以進行進一步的檢查。
參照第4a圖至第4c圖,依據文獻中指出,在皮下注射的異種移植小鼠模型中,JCPyV VLP能夠通過全身而將所攜帶的基因遞送至肺部腫瘤處並表現(Chao, C.N., Lin, M.C., Fang, C.Y., Chen, P.L., Chang, D., Shen, C.H. et al. (2016) PLoS ONE 11, e0157865)。因此,本案遂進行皮下注射異種移植小鼠之相關研究。A549細胞係皮下注射至小鼠體內,待實體的人類肺腺癌腫瘤結節形成後,JCPyV VLP、pSPB-shCD59ctr/VLP及pSPB-shCD59/VLP遂經尾靜脈注射至小鼠體內。整個處理流程完成後,遂將所取出之人類肺腺癌腫瘤結節進行秤重。第4a圖及第4b圖顯示,於第4組(pSPB-shCD59/VLP注射組)所取出之人類肺腺癌腫瘤結節,相較於其他組(包括對照組及其他不同條件之注射組)所取出之人類肺腺癌腫瘤結節而言,第4組的腫瘤結節的生長被顯著地抑制了87%,而這也表示本案的pSPB-shCD59/VLP能夠經由抑制腫瘤細胞過度表現CD59,使腫瘤細胞無法躲避宿主的免疫監視,從而抑制了腫瘤細胞的生長。第4c圖顯示,所有組別的小鼠於犧牲前的體重皆相似,而這代表所注射之物(JCPyV VLP、pSPB-shCD59ctr/VLP及pSPB-shCD59/VLP)對於實驗動物來說係為毒性低甚至是無毒性的。
肺癌細胞轉移的動物模型:
自台灣的BioLASCO Taiwan Co., Ltd.購買四週大的雄性NU/NU小鼠,並如上述之方式飼養及維持。將A549細胞係以10
7個細胞/小鼠的劑量注入小鼠的尾靜脈。1個月過後,將小鼠隨機分為4組,每組4隻。第1組:無治療組(對照組),係注射PBS;第2組:JCPyV VLP注射組;第3組:pSPB-shCD59ctr/VLP注射組;第4組:pSPB-shCD59/VLP注射組。每3天進行一次100 μg VLP 或 100 μl PBS的尾靜脈注射,總共12次注射。在最後一次注射完成的3天後,將小鼠秤重並於腔室內以CO
2窒息的方式犧牲,收取腫瘤並秤重以確定其大小。隨後進行H&E染色以確認小鼠肺部的變化。
參照第5a圖至第5c圖,由於本案的pSPB-shCD59/VLP於上述試驗中顯示了pSPB-shCD59/VLP可有效抑制肺腺癌腫瘤的生長,且pSPB-shCD59/VLP亦可通過循環系統到達腫瘤部位並發揮作用,這顯示了pSPB-shCD59/VLP可能對轉移性的腫瘤細胞來說係具有細胞毒性的。因此,本案建立了肺癌細胞轉移的動物模型,藉由尾靜脈注射A549細胞至小鼠體內,使A549細胞進入循環系統,從而模擬癌細胞向肺部的轉移。如第5a圖及第5b圖的結果,其中黑色箭頭所指之處係為位於肺部的腫瘤細胞,可觀察出於第4組(pSPB-shCD59/VLP注射組)所取出之肺部組織切片的H&E染色圖不僅顯示小鼠之肺部腫瘤的尺寸相較於其他組(包括對照組及其他不同條件之注射組)的肺部組織切片的H&E染色圖來的小很多,腫瘤數量亦明顯少於其他組,且當直接取出小鼠的肺部並秤重時,與無治療組的結果相比,第4組(pSPB-shCD59/VLP注射組)的肺部重量明顯降低了39%。如第5c圖的結果,在完成處理流程後,所有組別的小鼠於犧牲前的體重皆相似,而這代表所注射之物(JCPyV VLP、pSPB-shCD59ctr/VLP及pSPB-shCD59/VLP)對於實驗動物來說係為毒性低甚至是無毒性的。
詳細而言,通過上述的試驗結果可得知,接受本案之pSPB-shCD59/VLP注射的小鼠,其體內的癌細胞不能轉移至肺部生長,也代表著pSPB-shCD59/VLP於全身遞送時可以有效抑制癌細胞向肺部的轉移,從而證明了本案之pSPB-shCD59/VLP作為癌症轉移之病患的治療用途的可行性。
以免疫組織化學染色法檢測腫瘤中CD59的表現:
為了藉由免疫組織化學檢測CD59的表現,將取自肺癌細胞轉移小鼠的石蠟包埋的肺組織切片(厚度為5 μm)用二甲苯脫蠟,而後在序列稀釋的乙醇中脫水。將切片放置於水中10分鐘,隨後在121°C的0.01 M檸檬酸鹽緩衝液中加熱20分鐘以使抗原被揭露。內源性過氧化酶活性係使用3%的H
2O
2水溶液淬滅30分鐘。將切片用0.5%牛血清白蛋白阻絕1小時,然後在37°C與CD59抗體(1:50, NBP1-89405, Novus)一起孵育3小時。生物素化的山羊抗兔子二級抗體係用於進一步的孵育,而鏈黴親和素-生物素複合物系統(streptavidin-biotin complex system)係用於顯色。處理後之切片係於光學顯微鏡下檢測。
參照第6圖,本案係藉由免疫組織化學證實pSPB-shCD59/VLP注射組的小鼠肺部中的CD59表現受到了抑制,其中黑色箭頭所指之處係為CD59位在肺部組織表現的地方,其與第5a圖的黑色箭頭所指之處有高度的一致性。
本案之該包含有專一性表現CD59標靶小髮夾RNA的表現質體之類病毒顆粒pSPB-shCD59/VLP除了能夠有效地遞送該表現質體並專一性地表現CD59標靶小髮夾RNA以降低肺腺癌腫瘤細胞之CD59表現量,進而專一地於肺腺癌細胞啟動CDC外,亦可於皮下注射人類肺腺癌腫瘤的異種移植小鼠模型中抑制腫瘤的生長,且該pSPB-shCD59/VLP亦具有抑制於體內循環的腫瘤細胞向肺部轉移的能力。前述之所有試驗結果皆顯示了本案之pSPB-shCD59/VLP可為CD59過度表現的肺腺癌患者提供一更精確的人類腫瘤基因治療選擇。
以上之敘述以及說明僅為本發明之較佳實施例之說明,對於此項技術具有通常知識者當可依據以下所界定申請專利範圍以及上述之說明而作其他之修改,惟此些修改仍應是為本發明之發明精神而在本發明之權利範圍中。
第1圖為顯示根據本發明的實施例的包含有專一性表現CD59標靶小髮夾RNA的表現質體之類病毒顆粒(pSPB-shCD59/VLP)、對照組以及其他不同條件之實驗組對CD59之表現所造成的影響之西方墨點圖;
第2圖為顯示根據本發明的實施例的pSPB-shCD59/VLP、對照組以及其他不同條件之實驗組於乳酸脫氫酶釋放測試結果的長條圖;
第3圖為顯示根據本發明的實施例的pSPB-shCD59/VLP、對照組以及其他不同條件之實驗組於CCK-8活細胞測定試驗結果的長條圖;
第4a圖為顯示根據本發明的實施例的pSPB-shCD59/VLP、對照組以及其他不同條件之注射組對皮下異種移植小鼠模型中人類肺腺癌腫瘤結節的抑制生長情況之實體腫瘤結節對照圖;
第4b圖為顯示根據本發明的實施例的給予pSPB-shCD59/VLP、對照組以及其他不同條件之注射組的皮下異種移植小鼠模型的人類肺腺癌腫瘤結節重量量化長條圖;
第4c圖為顯示根據本發明的實施例的給予pSPB-shCD59/VLP、對照組以及其他不同條件之注射組的皮下異種移植小鼠模型在治療過程結束時的小鼠體重長條圖;
第5a圖為顯示根據本發明的實施例的靜脈注射pSPB-shCD59/VLP、無治療組(對照組)以及其他不同條件之實驗組後的人類肺腺癌轉移之小鼠模型的A549腫瘤細胞轉移抑制情況之肺部組織切片蘇木素-伊紅染色(H&E stain)圖;
第5b圖為顯示根據本發明的實施例的靜脈注射pSPB-shCD59/VLP、無治療組(對照組)以及其他不同條件之實驗組後的人類肺腺癌轉移之小鼠模型的平均肺部重量長條圖;
第5c圖為顯示根據本發明的實施例的靜脈注射pSPB-shCD59/VLP、無治療組(對照組)以及其他不同條件之實驗組後的人類肺腺癌轉移之小鼠模型在治療過程結束時的小鼠體重長條圖;以及
第6圖為顯示根據本發明的實施例的靜脈注射pSPB-shCD59/VLP、無治療組(對照組)以及其他不同條件之實驗組後的人類肺腺癌轉移之小鼠模型的CD59表現抑制情況之肺部組織切片免疫組織化學染色(immunohistochemistry stain, IHC stain)圖。
<110> 戴德森醫療財團法人嘉義基督教醫院國立中正大學中山醫學大學
<120> 包含有專一性表現CD59標靶小髮夾RNA的表現質體之類病毒顆粒及其用途
<160> 6
<210> 1
<211> 354
<212> PRT
<213> JC polyomavirus
<210> 2
<211> 3543
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pSPB-shCD59
<210> 3
<211> 3543
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 質體pSPB-shCD59ctr
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引子
<210> 5
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引子
<210> 6
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引子
Claims (4)
- 一種人類JC病毒之類病毒顆粒,用於將異源核酸遞送至人體,包含: 主要衣殼蛋白VP1,其胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示;以及 CD59標靶小髮夾RNA表現質體,包含如SEQ ID NO:2所示之鹼基序列,該CD59標靶小髮夾RNA表現質體係由SEQ ID NO:2所示之鹼基序列中的肺部專一性啟動子所驅動, 其中,該肺部專一性啟動子係驅動該CD59標靶小髮夾RNA表現質體於肺部表現CD59標靶小髮夾RNA。
- 如請求項1所述的人類JC病毒之類病毒顆粒,其中該人類JC病毒之類病毒顆粒係以由該主要衣殼蛋白VP1自行組裝並包裝該CD59標靶小髮夾RNA表現質體的方式所形成。
- 如請求項1所述的人類JC病毒之類病毒顆粒,其中該肺部專一性啟動子係為表面活性蛋白B啟動子(Surfactant protein-B promoter, SP-B promoter)。
- 一種如請求項1所述之人類JC病毒之類病毒顆粒用於製備抑制人類肺腺癌(human lung adenocarcinoma)生長及轉移的醫藥組成物的用途。
Priority Applications (1)
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TW109141691A TWI777314B (zh) | 2020-11-27 | 2020-11-27 | 包含有專一性表現cd59標靶小髮夾rna的表現質體之類病毒顆粒及其用途 |
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TW (1) | TWI777314B (zh) |
Families Citing this family (1)
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WO2024051765A1 (zh) * | 2022-09-08 | 2024-03-14 | 上海康景生物医药科技有限公司 | 一种cd59基因沉默的t细胞及其应用 |
-
2020
- 2020-11-27 TW TW109141691A patent/TWI777314B/zh active
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
期刊 Goldmann C., et al., "Molecular Cloning and Expression of Major Structural Protein VP1 of the Human Polyomavirus JC Virus: Formation of Virus-Like Particles Useful for Immunological and Therapeutic Studies", Journal of Virology, Vol. 73 , 1999, page 4465–4469.; * |
期刊 Hoffmann D.B., et al., "In Vivo siRNA Delivery Using JC Virus-like Particles Decreases the Expression of RANKL in Rats", Molecular Therapy–Nucleic Acids 5 , 2016, e298; doi:10.1038/mtna.2016.15 * |
Also Published As
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TW202221011A (zh) | 2022-06-01 |
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GD4A | Issue of patent certificate for granted invention patent |