CN114191556A

CN114191556A - 敲降rbms1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN114191556A
Application number: CN202210025680.7A
Authority: CN
Inventors: 汪洋; 张金瑞; 张鸽; 张文静; 祁旸凡; 赵瑾瑶; 白璐; 李田田; 王鹿宁
Original assignee: Dalian Medical University
Current assignee: Dalian Medical University
Priority date: 2022-01-11
Filing date: 2022-01-11
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2042-01-11
Also published as: CN114191556B

Abstract

本发明涉及敲降RBMS1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用，属于抗肿瘤药物技术领域。本发明提供了敲降RBMS1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。在三阴性乳腺癌中敲降RBMS1基因可以通过抑制B4GALT1基因转录进而下调PD‑L1表达从而影响肿瘤中浸润淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤能力，增强三阴性乳腺癌免疫治疗敏感性，为三阴性乳腺癌免疫分型及治疗提供新的潜在靶点。

Description

敲降RBMS1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，具体涉及敲降RBMS1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

背景技术

三阴性乳腺癌作为乳腺肿瘤分子分型一种，由于雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和表皮生长因子受体2(Her2)均呈阴性表达，所以一直没有很有效的靶标分子作为治疗策略，且大多数三阴性乳腺癌患者对免疫治疗表现出有限的反应，尤其是当肿瘤缺乏肿瘤浸润淋巴细胞而无法刺激抗癌免疫。因此，明确可以增强三阴性乳腺癌免疫原性的合适靶标，将为提高针对三阴性乳腺癌的免疫治疗提供一种新方法。程序性死亡配体-1(PD-L1；也称为B7-H1或CD274)是一种33kDa的I型跨膜蛋白，可与T细胞上的程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)结合，形成一种主要的免疫检查点，从而抑制肿瘤浸润淋巴细胞效应子功能的激活、扩展和获得，并使癌细胞能够逃避T细胞介导的免疫监视。PD-L1在肿瘤细胞中的过度表达也会介导嵌合抗原受体T(CAR-T：Chimeric antigen receptor T cell)细胞耗竭，这导致CAR-T细胞在实体瘤中的治疗效果不佳。因此，靶向PD-L1/PD1轴可以重振肿瘤微环境中耗尽的肿瘤浸润淋巴细胞和CAR-T细胞，为多种癌症提供有希望的治疗结果。然而，免疫检查点阻断单一疗法的反应率大多低于40％，并且大量患者对这种疗法反应不佳。因此，对新型免疫检查点调节剂的研究将能够为新的组合策略提供潜在的目标，以提高免疫检查点阻断疗法的疗效。但目前缺少针对三阴性乳腺癌的联合癌症免疫疗法的潜力靶标分子。

发明内容

本发明的目的在于提供敲降RBMS1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。在三阴性乳腺癌中敲降RBMS1基因能够增强肿瘤细胞杀伤能力，增强三阴性乳腺癌免疫治疗敏感性，实现三阴性乳腺癌免疫分型及治疗。

本发明提供了敲降RBMS1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

本发明还提供了敲降RBMS1的试剂在制备抑制三阴性乳腺癌肿瘤生长的药物中的应用。

本发明还提供了敲降RBMS1的试剂在制备促进T细胞分泌CD8+中干扰素γ和/或颗粒酶B的药物中的应用。

本发明还提供了敲降RBMS1的试剂在制备下调PD-L1表达的药物中的应用。

本发明还提供了敲降RBMS1的试剂在制备下调B4GALT1表达的药物中的应用。

本发明还提供了敲降RBMS1的试剂在制备增强三阴性乳腺癌免疫治疗敏感性的药物中的应用。

本发明还提供了检测RBMS1表达量的试剂在制备三阴性乳腺癌免疫分型试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种三阴性乳腺癌免疫治疗药物，所述药物包括敲降RBMS1的试剂和免疫治疗用药物。

优选的是，所述免疫治疗用药物包括免疫治疗用抗体。

优选的是，所述免疫治疗用抗体包括CTLA-4抗体。

本发明提供了敲降RBMS1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。在三阴性乳腺癌中敲降RBMS1基因可以通过抑制B4GALT1基因转录进而下调PD-L1表达从而影响肿瘤中浸润淋巴细胞对肿瘤细胞杀伤能力，增强三阴性乳腺癌免疫治疗敏感性，为三阴性乳腺癌免疫分型及治疗提供新的潜在靶点。本发明提供了RBMS1的新用途，可以用于判断三阴性乳腺癌患者是否适用免疫治疗，可作为免疫治疗方案中的联合抑制剂靶点、免疫抑制剂的潜在靶点，即提供了免疫疗法新靶点、还可用于制备抗肿瘤免疫药物检测试剂盒。

附图说明

图1为本发明提供的RBMS1和PD-L1在乳腺癌患者中表达情况图；其中，A为乳腺癌患者乳腺正常组织和癌症组织免疫组化染色结果图；B为对A图中免疫组化染色结果进行定量及统计图；

图2为本发明提供的敲降RBMS1下调PD-L1表达结果图；其中，A为调控PD-L1的RNA结合蛋白筛选的火山图；B为在三种三阴性乳腺癌细胞中采用免疫印迹方法检测干扰素γ处理和PBS处理后PD-L1蛋白水平表达；C为在三种三阴性乳腺癌细胞中采用流式细胞术检测干扰素γ处理和PBS处理后细胞表面PD-L1表达；

图3为本发明提供的RBMS1敲降可以促进增强肿瘤细胞抗免疫原性结果图；其中，A为敲降RBMS1细胞与未敲降细胞在Balb/c小鼠皮下成瘤瘤体图片；B为瘤体重量统计差异分析图；C为小鼠肿瘤生长曲线及差异分析图；D为小鼠瘤体内分离出的淋巴细胞分泌的干扰素γ分析流式图及统计图；E为小鼠瘤体内分离出的淋巴细胞分泌的颗粒酶B分析流式图及统计图；

图4为本发明提供的RBMS1下调B4GALT1基因表达结果图；其中，A为敲降RBMS1基因后采用实时荧光定量PCR检测B4GALT1基因mRNA水平定量图；B为敲降RBMS1基因后免疫印迹法检测B4GALT1蛋白水平图；C图为敲降RBMS1基因后检测B4GALT1基因RNA稳定性统计图；

图5为本发明提供的B4GALT1调控PD-L1表达结果图；其中，A为敲降B4GALT1后免疫印迹检测PD-L1蛋白水平；B为PD-L1与B4GLAT1相互作用检测图；

图6为本发明提供的在敲降RBMS1基因后回复B4GALT1后可促进肿瘤生长结果图；其中，A为在Balb/c小鼠皮下注射对照组、敲降RBMS1组及敲降RBMS1后回复B4GALT1组细胞成瘤实验瘤体照片；B为瘤体重量统计及差异分析图；C为瘤体生长曲线及差异分析图；

图7为本发明提供的抑制RBMS1表达可使免疫治疗发挥更好效果结果图；其中，A为小鼠成瘤后给予CTLA4抗体治疗后小鼠瘤体图片；B为瘤体重量及差异分析图；C为小鼠根据测量小鼠瘤体绘制的生长曲线及差异分析图；

图8为本发明提供的RBMS1敲降联合CTLA-4抗体治疗可以促进增强肿瘤细胞抗免疫原性结果图；其中，A为四组小鼠瘤体内分离出的淋巴细胞分泌的干扰素γ分析流式图及统计图；B为小鼠瘤体内分离出的淋巴细胞分泌的颗粒酶B分析流式图及统计图。

具体实施方式

本发明提供了敲降RBMS1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。本发明应用生物信息学分析RBMS1在三阴性乳腺癌及免疫浸润少的冷肿瘤中高表达。

本发明还提供了敲降RBMS1的试剂在制备抑制三阴性乳腺癌肿瘤生长的药物中的应用。本发明在免疫健全Balb/c小鼠皮下接种中4T1-RBMS1敲降及Control-sh细胞发现在免疫健全小鼠中RBMS1敲降成瘤生长明显小于Control-sh细胞，p<0.01，肿瘤大小有显著差异，且流式细胞术分析肿瘤中浸润CD8⁺T细胞分泌因子表达显示在RBMS1基因敲降组肿瘤内免疫微环境的改变明显更有利于的肿瘤杀伤，因此可以明显抑制肿瘤生长，差异分析具有显著差异。

本发明还提供了敲降RBMS1的试剂在制备促进T细胞分泌CD8+中干扰素γ和/或颗粒酶B的药物中的应用。本发明在小鼠瘤体中采用流式分析淋巴细胞分泌因子表达显示RBMS1敲降细胞瘤体中CD8⁺中干扰素γ(IFN-γ)和颗粒酶B(Granzyme B)表达均高于空载细胞瘤体。

本发明还提供了敲降RBMS1的试剂在制备下调PD-L1表达的药物中的应用。在不同类型乳腺癌中进行免疫组化染色分析，三阴性乳腺癌中RBMS1与PD-L1均高表达，二者具有相关性。本发明利用免疫印迹及流式细胞术及乳腺癌患者石蜡切片免疫组化染色结果检测发现RBMS1敲降以后PD-L1表达均显著下调。

本发明还提供了敲降RBMS1的试剂在制备下调B4GALT1表达的药物中的应用。在MDA-MB-231细胞敲降RBMS1细胞中检测B4GALT1蛋白水平及mRNA水平，显示二者均下降，且在敲降RBMS1基因后B4GALT1基因RNA稳定性明显下降，揭示RBMS1通过抑制B4GALT1基因转录进而下调PD-L1蛋白水平。为明确B4GALT1基因对PD-L1的调控，本发明对B4GALT1基因进行敲降，显示敲降B4GALT1基因后PD-L1蛋白水平明显下调；且进一步构建RBSM1敲降后进而回复B4GALT1细胞系进行小鼠荷瘤实验，结果进一步明确RBMS1-B4GALT1-PD-L1三者之间的调控作用，差异分析具有显著差异。

本发明还提供了敲降RBMS1的试剂在制备增强三阴性乳腺癌免疫治疗敏感性的药物中的应用。RBMS1基因敲降可以增强肿瘤细胞免疫原性，本发明在小鼠成瘤后联合CTLA-4抗体治疗，将Control sh和RBMS1 sh-4T1细胞分别注射小鼠腋下皮下，然后分别给予CTLA-4抗体和PBS以此检测RBMS1基因敲降以后对肿瘤细胞免疫治疗的反馈结果显示：在敲降RBMS1基因后给予CTLA-4治疗组小鼠瘤体生长最慢，瘤体积最小，差异分析具有显著差异。

本发明还提供了检测RBMS1表达量的试剂在制备三阴性乳腺癌免疫分型试剂盒中的应用。在本发明中，当RBMS1表达量高，说明三阴性乳腺癌免疫原性低，免疫治疗敏感性低，不适用免疫疗法进行治疗；当RBMS1表达量低时，说明三阴性乳腺癌免疫原性高，免疫治疗敏感性高，适合采用免疫疗法进行治疗。

本发明还提供了一种三阴性乳腺癌免疫治疗药物，所述药物包括敲降RBMS1的试剂和免疫治疗用药物。在本发明中，所述免疫治疗用药物优选包括免疫治疗用抗体。在本发明中，所述免疫治疗用抗体优选包括CTLA-4抗体。本发明通过RBMS1耗竭和CTLA-4免疫检查点阻断实现更好的免疫治疗。在使用CTLA-4抗体治疗后，给予抗体治疗组瘤体生长明显小于未给予抗体治疗组，同时RBMS1敲降且给予CTLA-4抗体治疗组瘤体最小，在瘤体中浸润淋巴细胞分析中显示RBMS1敲降且给予CTLA-4抗体治疗组中CD8+细胞分泌干扰素γ(IFN-γ)和颗粒酶B(Granzyme B)表达高于空载组、空载-CTLA-4治疗组及RBMS1敲降组。

下面结合具体实施例对本发明所述的敲降RBMS1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

后续实施例使用的材料和基础方法如下所示：

材料与方法

1.材料

1.1.细胞系

HEK293T和4T1细胞购于ATCC细胞库，培养条件：DMEM含10％FBS，培养于恒温37℃，5％CO₂的孵箱。MDA-MB-231细胞购于ATCC细胞库，培养条件：L-15含10％FBS，培养于恒温37℃，无CO₂的孵箱。HCC1937细胞购于ATCC细胞库，培养条件：RPMI-1640含10％FBS，BT-549细胞购于ATCC细胞库，培养条件：RPMI-1640含10％FBS并加入0.023IU/ml人胰岛素，培养于恒温37℃，5％CO₂的孵箱。

1.2试剂及耗材

1.2.1质粒构建相关试剂：

Max DNA Polymerase(Takara)、T4DNA ligase(Takara)、PCR引物、AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen)、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)、AxyPrep质粒中量制备试剂盒(Axygen)、Reverse-trans-scribed with SuperScript III Kit(Takara)、TRIzol(Invitrogen)、Agarose(Coolaber)、限制性内切酶(Takara)、DH5α感受态细胞(生工生物工程(上海)股份有限公司)、DNAmarker(Takara)、GelStain(上海翊圣生物科技有限公司)、200目尼龙网(索莱宝)，PMA，Ionomycin，Brefeldin A(Sigma)U型底96孔板(康宁)。

1.2.2细胞培养和病毒包装相关试剂：

DMEM培养基(ThermoFisher)、RPMI-1640培养基(ThermoFisher)、胎牛血清(BiochromAG)、细胞冻存液(新赛美生物科技有限公司)、0.25％胰蛋白酶(Gibco)、Puromycin(Invivogen)、Polybrene(sigma)、psPAX2、pMD2.G(Addgene,Plasmid#12260Plasmid#12259)、Lipo3000(ThermoFisher)、滤器(0.45μm Millipore)、各规格细胞培养皿和培养瓶、离心管、冻存管(Thermo)。

1.2.3 Western blot相关试剂：

RIPA细胞/组织裂解液(碧云天)、PMSF(Takara)、Na₃VO₄磷酸酶抑制剂(Sigma)、Cocktail蛋白酶体抑制剂(Sigma)、BCA法测蛋白浓度试剂盒(新赛美)、5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(新赛美)、30％Acr-Bis(29:1)(碧云天)、过硫酸铵(Amresco)、TEMED(碧云天)、10％SDS(碧云天)、1MTris-HCl，pH6.8(碧云天)、1.5M Tris-HCl，pH8.8(碧云天)、Triton-x100(Amresco)、Tween-20(Amresco)、预染蛋白marker(Thermo Fisher)、10×PBS(Takara)、脱脂牛奶(BD)、鼠/兔二抗(Thermo Fisher)各规格离心管(Eppendorf)、配胶玻璃板、配制SDS-PAGE胶所需梳子、转模所用滤纸(Bio-rad)、PVDF膜、化学发光底物(Millipore)、NaCl、KCl、Na₂HPO4·12H₂O、KH₂PO₄(国药)。

1.3仪器和设备

梯度PCR仪(AB Veriti 96well Thermal Cycler)、恒温细胞培养箱(ThermoFisher)、酶标仪(TECAN)、高速冷冻离心机(Eppendorf)、生物安全柜(ThermoFisher)、凝胶成像仪(Tanon)、垂直电泳槽(Bio-Rad)、转膜槽(Bio-rad)、化学发光成像系统(SAGECREATION)、Nanodrop 2000c(Thermo Scientific)、微量移液器(Eppendorf)、常温离心机(安徽中科中佳)、多功能酶标仪(Perkin Elmer)、流式细胞仪(BD)、-80℃超低温冰箱(Thermo Scientific)、微波炉(Midea)、脱色摇床(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、恒温金属浴(上海一恒)。

1.4常用溶液配制

1.4.1 10×SDS-PAGE电泳缓冲液(1L)：称取Tris-base：30.3g；Glycine 144g；SDS10g，

溶于ddH₂O，充分搅拌溶解，定容至1L。

1.4.2 10×转膜缓冲液：称取30.3g Tris-base、144g甘氨酸溶于800mL蒸馏水，磁力搅拌器上使其充分溶解，定容至1L，置于室温备用。使用期稀释为1×并补充20％甲醇，置于4℃保存备用。

1.4.3 LB液体培养基：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，溶于800mL蒸馏水中，充分溶解后，加入NaOH调节pH至7.0，定容至1L。高温高压蒸汽灭菌，置于4℃保存备用。

1.4.4 Amp固体培养板：称取10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，7.5gAgar溶于800mL蒸馏水中，充分溶解后，加入NaOH调节pH至7.0，定容至1L。高温高压蒸汽灭菌，待温度降至50℃加入1mLAmp，混匀后倒入适量。冷凝后置于4℃保存备用。

2.方法

2.1质粒构建

2.1.1引物设计与扩增

RBMS1基因(人源和鼠源，RBMS1-human：NM_016836GeneID：5937和RBMS1-mus:NM_001141932GeneID:56878)shRNA引物和B4GALT1(B4GALT1:NM_001497.4GeneID:2683)及PD-L1(PD-L1:NM_014143.4GeneID:29126)过表达质粒引物设计如下，空载质粒作为对照即Control。引物合成是由金唯智生物工程有限公司完成。

RBMS1sh1-F(鼠源，mus)

CCGGCCACAGAACCTTTATTGTGTACTCGAGTACACAATAAAGGTTCTGTGGTTTTTG(SEQ IDNO.1)

RBMS1sh1-R(mus)

AATTCAAAAACCACAGAACCTTTATTGTGTACTCGAGTACACAATAAAGGTTCTGTGG(SEQ IDNO.2)

RBMS1sh2-F(mus)

CCGGCCATATACCTTTCAACCTAATCTCGAGATTAGGTTGAAAGGTATATGGTTTTTG(SEQ IDNO.3)

RBMS1sh2-R(mus)

AATTCAAAAACCATATACCTTTCAACCTAATCTCGAGATTAGGTTGAAAGGTATATGG(SEQ IDNO.4)

RBMS1sh1-(人源，human)

CCGGCCACAGAACCTTTATTGTGTACTCGAGTACACAATAAAGGTTCTGTGGTTTTTG(SEQ IDNO.5)

RBMS1 sh1-R-(human)

AATTCAAAAACCACAGAACCTTTATTGTGTACTCGAGTACACAATAAAGGTTCTGTGG(SEQ IDNO.6)

RBMS1 sh2-F-(human)

CCGGCCATATACCTTTCAACCTAATCTCGAGATTAGGTTGAAAGGTATATGGTTTTTG(SEQ IDNO.7)

RBMS1 sh2-R-(human)

AATTCAAAAACCATATACCTTTCAACCTAATCTCGAGATTAGGTTGAAAGGTATATGG(SEQ IDNO.8)

pLKO.1-B4GALT1-sh-F

CCGGGCTGCTTTCACTATCCGCATACTCGAGTATGCGGATAGTGAAAGCAGCTTTTTG(SEQ IDNO.9)

pLKO.1-B4GALT1-sh-R

AATTCAAAAAGCTGCTTTCACTATCCGCATACTCGAGTATGCGGATAGTGAAAGCAGC(SEQ IDNO.10)

pCDH-Flag-PD-L1-Fwd

GAAGATTCTAGAGCTAGCATGAGGATATTTGCTGTCTTTA(SEQ ID NO.11)

pCDH-Flag-PD-L1-Rev

GTCTTTGTAGTCGGATCCCGTCTCCTCCAGATGTGTAT(SEQ ID NO.12)

2.1.2载体酶切及连接

1)pLKO.1-RBMS1-shRNA与pLKO.1-B4GALT1-shRNA载体构建：

a)寡核苷酸退火：加入去离子水溶解引物，使终浓度为10μM。于1.5mLEP管内按照下表所示反应体系配制反应体系。在烧杯内倒入800mL温度为95℃的水，将EP管用浮漂装载置放入烧杯中，烧杯中置入温度计显示水温，放于实验台上，缓慢降温至室温。反应体系如下：

b)酶切plKO.1载体：首先进行AgeI酶切，反应体系如下：

37℃，水浴孵育1.5小时

上述产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收，接着用EcoRI酶切，体系如下：

AgeI酶切产物30μL

10×NEB Buffer forEcoRI 5μL

EcoRI 2μL

去离子水 13μL

37℃，水浴孵育1.5小时

然后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收并纯化，得到最终连接用产物。

c)连接：

退火寡核苷酸产物 2μL

pLKO.1酶切载体 1μL

T4 ligase Buffer 1μL

T4 ligase 2μL

ddH₂O 4μL

16℃，水浴孵育3小时

得到pLKO.1-RBMS1-shRNA与pLKO.1-B4GALT1-shRNA质粒。

2)pCDH-Flag-B4GALT1载体构建

a)B4GALT1目的基因的获得：

cDNA 1μL

Max 25μL

Forward 1μL

Reverse 1μL

ddH₂O 补足至50μL

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并确定目的基因分子量大小，进行切胶回收。

b)酶切载体和基因片段

首先进行NheI酶切，反应体系如下：

pCDH载体/目的基因2μg/30μL

10×M 5μL

Nhe I 2μL

去离子水补足至50μL

37℃，水浴孵育2.5小时

上述产物进行PCR回收，后继续用NotI酶切，体系如下：

Nhe I酶切产物30μL

10×H 5μL

0.1％BSA5μL

0.1％Tritonx-1005μL

Not I 2μL

去离子水补足至50μL

37℃，水浴孵育2.5小时后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收并纯化，得到最终连接用产物。

c)连接：将酶切好的载体与片段进行连接，按照之前所述连接体系16℃连接3h。

得到PCDH-Flag-B4GALT1质粒。

3)pCDH-Flag-PD-L1载体构建

a)PD-L1目的基因的获得：

cDNA 1μL

Max 25μL

Forward 1μL

Reverse 1μL

ddH2O 补足至50μL

b)酶切载体和基因片段

首先进行NheI酶切，反应体系如下：

pCDH载体/目的基因2μg/30μL

10×M 5μL

Nhe I 2μL

去离子水补足至50μL

37℃，水浴孵育2.5小时

上述产物进行PCR回收，后继续用NotI酶切，体系如下：

Nhe I酶切产物30μL

10×H 5μL

0.1％BSA5μL

0.1％Tritonx-1005μL

Not I 2μL

去离子水补足至50μL

得到PCDH-Flag-PD-L1质粒。

2.1.3质粒转化与提取

1)混合孵育：50μLTrans 5a感受态中加入已连接好的产物(即上述载体构建中连接部分的终产物)5μL，吹打混匀，冰上放置30分钟。

2)热激：42℃水浴热激60秒后，冰浴5分钟。

3)培养：加入不含抗生素的500μl的LB液体培养基，37℃摇床，200rpm培养1h。

4)涂板：室温短暂离心，弃上清，用移液器吹打混匀沉淀加到含氨苄青霉素的LB固体琼脂板上，用灭菌涂布棒将菌液涂均匀，37℃培养箱倒置培养过夜。

5)挑单菌落：在8连排PCR管中放入适量液体LB培养基，另一8连排按下面的体系混成大样后加入其中，待12～14小时后，取出菌板，用无菌枪头挑取大小适当的单一菌落，分别在上述8连排中蘸取。

6)阳性克隆鉴定：

按照之前基因的扩增体系配制混合样品，反应循环数降到25个循环，待扩增完成后，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并依据目的基因分子量大小，挑选对应的阳性菌液进行摇菌提质粒，阳性的菌落即可放入15mL离心管中加入LB培养基及抗生素，放至37℃摇床扩增菌落，12～16小时进行质粒提取。酶切鉴定正确后送测序确认序列是否正确。

本发明通过分子克隆技术得到human-pLKO.1-RBMS1-sh1、human-pLKO.1-RBMS1-sh2、mus-pLKO.1-RBMS1-sh1、pLKO.1-B4GALT1、mus-pLKO.1-RBMS1-sh2、PCDH-Flag-B4GALT1、PCDH-Flag-PD-L1质粒，并且均测序正确。

2.2细胞培养

所有细胞均按照ATCC所需培养基进行传代培养，每2～3天换液并观察细胞状况，当细胞生长密度达到90％时弃去培养基，加入0.25％胰酶溶液，37℃放置1～2分钟，加入培养基终止消化，150g离心3分钟，用新的培养基重悬细胞并按约1：3进行传代培养。

2.3稳定细胞系构建

2.3.1慢病毒制备

1)准备细胞：转染前24h，将适量的HEK-293T细胞接种至10cm培养皿，保证第二天转染时细胞密度达到80～90％，用含10％FBS新鲜的DMEM完全培养基培养。

2)转染：将1.5mL Opti-MEM培养基于洁净无菌的15mL离心管中与7.5μg psPAX2质粒、2.5μg pMD2.G质粒和10μg目的质粒(即pLKO.1-RBMS1-sh1/sh2或pCDH-Flag-B4GALT1)混匀。同时取60μL转染试剂lipo3000和1.5mL Opti-MEM混合，室温静置5分钟后，加入15mL离心管，轻柔混匀，室温静置20分钟。将上述混合液加入培养皿中，轻轻混匀。

3)收集病毒：12～16h后，将转染后的HEK293T细胞传至15cm细胞培养皿中，用含10％FBS新鲜的DMEM完全培养基培养。培养48小时后，收集培养皿内培养基到15mL离心管中，1500rpm离心5分钟。用0.45μm滤膜过滤离心管内离心得到的上清液，即为含病毒颗粒的培养基，分装至无菌EP管，-80℃保存。

至此本发明得到pLKO.1-RBMS1-sh1/sh2(人源和鼠源)病毒液及PCDH-Flag-B4GALT1的病毒液，每种约10ml。

2.3.2慢病毒感染及筛选

1)准备细胞：人乳腺癌细胞使用MDA-MB-231细胞、HCC1937细胞、BT-549细胞以及鼠源乳腺癌细胞使用4T1细胞进行感染。感染前24小时，将试验细胞接种至6孔板，保证转染时细胞密度达到70～80％。

2)换液：转染时，弃尽原培养液，加入1mL RPMI 1640培养基/L-15培养基。

3)加病毒液：将1mL的病毒液(pLKO.1-RBMS1-sh1/sh2、sh-Control及pCDH-Flag-B4GALT1)加入六孔板内的培养基中，加入polybrene(提高病毒被细胞吸收效率)(终浓度8μg/mL)，混匀后放入孵箱培养。感染24小时后，将含有病毒的培养液倒入含有消毒液的废液桶中，并将细胞传代至10cm细胞培养皿中培养。

4)筛选：传代24小时左右，待细胞密度达到70～80％，用含浓度为5μg/mL嘌呤霉素的10％FBS RPMI 1640/L-15培养基培养。维持嘌呤霉素5μg/mL，连续培养5天。

5)验证、冻存：收集适量细胞提取蛋白，免疫印迹验证稳转细胞系目的基因的蛋白水平，最后得到三阴性乳腺癌中稳定敲降RBMS1基因和B4GALT1基因及稳定过表达B4GALT1基因的细胞系，即MDA-MB-231-Control、MDA-MB-231-RBMS1-sh1、MDA-MB-231-RBMS1-sh2、HCC1937-Control、HCC1937-RBMS1-sh1、HCC1937-RBMS1-sh2、BT-549-Control、BT-549-RBMS1-sh1、BT-549-RBMS1-sh2以及4T1-Control sh、4T1-RBMS1-sh1、4T1-RBMS1-sh2这些RBMS1敲降细胞以及MDA-MB-231-B4GALT1-sh和HCC1937-B4GALT1-sh敲降细胞和MDA-MB-231-PCDH-Flag-B4GALT1过表达细胞系，将细胞扩大培养以后进行冻存及开展后续试验。同样的实验方法，在4T1中敲降RBMS1细胞后获得的4T1-RBMS1 sh1/2细胞中加入PCDHL-B4GALT1病毒，获得4T1-sh-B4GALT1细胞。

2.4蛋白质免疫印迹(westernblot实验)

2.4.1提取细胞总蛋白及浓度定量

取对数生长期细胞置于冰上，用PBS清洗3遍，加入适量RIPA裂解液(提前加入磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂)，用细胞刮刀收集细胞转入1.5mL离心管中，冰上裂解30分钟，期间多次震荡，使其充分裂解。然后将样品吸至1.5mL离心管中于4℃，16000g条件下离心15分钟，取上清进行蛋白定量，蛋白定量采用BCA法，按照试剂盒说明书操作。

2.4.2聚丙烯酰胺凝胶电泳

制胶：配制10％的下层分离胶(30％聚丙烯酰胺、Tris-HCl pH8.8、10％APS、10％SDS、TEMED)和5％的上层浓缩胶(30％聚丙烯酰胺、pH6.8Tris-HCl、10％APS、10％SDS、TEMED)，凝固后拆下凝胶玻璃板，拔出梳子，蒸馏水冲洗胶孔去除残留胶粒。将玻板固定于电泳装置内，加入预冷的电泳缓冲液，并用移液枪再次吹打每个胶孔。取20-30μg细胞总蛋白，加入上样缓冲液，混合均匀，95℃金属浴煮5分钟，使样品充分变性。冷却并离心，缓慢加入上样孔。浓缩胶阶段80V电压电泳20分钟后，调节电压至120V至溴酚蓝移动到玻板最底部，电泳结束。

2.4.3蛋白质转移至NC膜

采用Bio-rad湿转装置，按照海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵的顺序将转模装置组装好放入转膜的槽子内上，使用电压800mA转膜90分钟。

2.4.4封闭、抗体孵育、显色

将转膜后的NC膜使用丽春红染色后，按照自己所需蛋白大小进行裁剪，然后对膜使用4％脱脂牛奶室温封闭1小时。封闭后，使用PBS清洗膜三次后孵育一抗，4℃过夜。用PBST(1×PBS中加入0.1％Tween-20)洗3次，每次8分钟。用4％牛奶溶液稀释相应二抗，室温孵育1h。使用PBST清洗膜3次，每次8分钟。使用ECL发光试剂盒中的A液和B液等量混合，并将混合液均匀滴加的NC膜上。室温孵育2分钟，用化学发光成像系统(SAGECREATION)检测蛋白表达。

2.5免疫共沉淀(Co-IP)

2.5.1转染

转染前将293T细胞接种至10cm皿中，培养过夜后待细胞密度达到70％进行转染(带有Flag标签的PD-L1和无标签的B4GALT1或者带有Flag标签的B4GALT1和无标签的PD-L1)，转染后12小时，对转染细胞进行换液，而后进行正常培养48小时。

2.5.2收集细胞裂解

将细胞取出放置于冰上，弃掉培养基后，用PBS进行清洗，然后加入RIPA裂解液，冰上裂解30分钟，将细胞裂解液收集进离心管后，离心弃掉细胞沉淀，吸取上清裂解液，并进行蛋白定量。

2.5.3抗体孵育及清洗

将定量的蛋白裂解液(500μg-1mg)与带有Flag抗体的琼脂糖珠(抗-

M2亲和琼脂糖凝胶，Merck，A2220)混合，四度旋转孵育4小时。然后使用PBST进行清洗，每次4℃，200g，5分钟，清洗三次后，使用Flag肽(Merck，F3290)温和的将FLAG融合蛋白从抗-

M2亲和树脂上洗脱，然后使用1X SDS loadingbuffer对洗脱下来的混合物进行加热溶解。

2.5.4免疫印迹验证

对于2.5.3步得到的产物进行免疫印迹(详细步骤见2.4)检测带有Flag标签的蛋白拉下来的蛋白中是否能检测到目的蛋白的表达。

2.6免疫组织化学染色

2.6.1脱蜡水化：浸入二甲苯I、II各5分钟。取出切片置于100％无水乙醇I、II→95％乙醇→70％乙醇→50％乙醇各2分钟。用PBS冲洗三次，每次3分钟。

2.6.2抗原修复：切片置于0.01M sodium citrate抗原修复液中高档微波5分钟，取出后密闭室温放置20分钟，再将修复液放置于中高档微波3分钟，室温敞口放置15分钟，PBS冲洗三次，每次3分钟。

2.6.3清除内源性过氧化氢酶：3％H₂O₂(PBS)室温30分钟，PBS冲洗三次，每次5分钟。

2.6.4湿盒封闭1小时：

2.6.5一抗孵育：封闭液稀释一抗，4℃湿盒中过夜(用封口膜盖上)，一抗在本实施例中指RBMS1及PD-L1，Blockingbuffer用PBS 1：10稀释后洗3次，每次10分钟。

2.6.6二抗孵育，滴加适量生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG聚合物到乳腺癌组织及正常组织切片上，室温孵育1小时，然后PBS洗三次，每次5分钟。

2.6.7滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液到组织上，室温孵育1小时，然后PBS洗三次，每次5分钟。

2.6.8DAB显色，滴加预备好的新鲜的显示剂DAB工作液，室温孵育，显示3～5分钟，光镜观察控制显色时间，显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显示。

2.6.9苏木精染核：苏木精染色3分钟，自来水冲洗，然后PBS冲洗，50％-100％各级酒精脱水，每级3分钟，最后置于二甲苯透明两次，每次3分钟。滴加中性树脂封片，通风橱中干燥。

2.7流式细胞术检测细胞膜表面PD-L1表达

首先将细胞种植于6孔板中，进行实验处理，待实验处理时间结束，弃掉就培养基，加入PBS进行清洗后加入5mM EDTA对细胞进行消化，约5～10分钟，消化结束后加入完全培养基，200g，5分钟离心弃掉上清，然后使用PBS清洗，清洗后使用PE-PD-L1抗体进行冰上避光染色20分钟，染色结束后使用PBS清洗两次后，最后加入200重悬细胞，并使用300目尼龙网进行过滤，过滤后使用流式检测荧光强度。

2.8小鼠皮下移植瘤实验

选取雌性4-6周龄Balb/c小鼠，进行随机分组，每组8只小鼠。

RBMS1敲降对小鼠肿瘤生长及免疫调控体内实验：2*10⁵/只的细胞量接种到裸鼠腋窝侧表皮下面，注射肿瘤细胞后，第六天可触肿瘤后开始测量，每天使用游标卡尺测量皮下肿瘤最长直径(L)和垂直方向最大横径(W)。在小鼠荷瘤最长不超过1.5cm前将小鼠进行CO₂处死，将小鼠瘤体取出后拍摄照片并称量重量，最后取出小鼠对应脾脏和淋巴结进行T细胞提取。

肿瘤中浸润T细胞提取及检测：将肿瘤取出后，剪成小块，使用美天旎小鼠肿瘤分离试剂盒，首先用酶混合物37℃消化45分钟，将未完全消化组织进行研磨，使用培养基进行冲洗，再使用尼龙网进行过滤，离心后获得肿瘤细胞和T细胞，使用40％和80％Percoll对细胞混合液进行离心梯度分离，中间层为淋巴细胞层，使用PBS进行清洗后获得肿瘤中淋巴细胞。淋巴结和小鼠脾脏进行研磨，使用200目尼龙网过滤后加入红细胞裂解液后，离心，使用PBS清洗，即可获得淋巴细胞，对肿瘤和淋巴结及脾脏中淋巴细胞进行细胞计数，然后加入RPMI-1640培养基含50ng/ml PMA，1μM ofIonomycin和1μg/ml BrefeldinA。在U型底96孔板中进行3-4小时培养。培养后将细胞吸至离心管中，使用PBS进行清洗，混合CD4和CD8抗体对细胞进行染色，避光，置于冰上染色15分钟，再次清洗后对IFN-γ和GzmB染色20分钟，再次离心清洗后，流式检测表达。

2.9统计学分析

用GraphPad Prism7.0软件对实验结果进行整理和统计分析。计量资料用平均数±标准差(Mean±SD)表示。用t检验对连续资料的两样本进行比较。利用Kaplan-Meier曲线分析影响因子与与总体生存的关系，用log-rank检验分析两组间差异。所有分析结果P<0.05时认为差异有统计学意义，P<0.01时认为差异有高度统计学意义。

实施例1

RBMS1在三阴性乳腺癌细胞中调控PD-L1表达

在乳腺癌患者组织中对癌组织和正常乳腺组织进行免疫组织化染色对比结果显示：在癌组织中三阴性乳腺癌组织中RBMS1和PD-L1表达均高于正常组织及Her2阳性乳腺癌组织(图1中的A)，对不同类型乳腺癌中二者表达强度分析，结果如图1中的B所示：在三阴性乳腺癌(TNBC)中PD-L1和RBMS1强阳性均最高，这也揭示了RBMS1和PD-L1在三阴性乳腺癌患者组织中呈现大部分组织高表达现象。

图1为RBMS1和PD-L1在乳腺癌患者中表达情况；其中，A：在乳腺癌患者和正常乳腺组织中用免疫组化染色技术检测RBMS1和PD-L1表达，B：对不同分子分型的乳腺癌中RBMS1和PD-L1表达进行表达强度分析。

采用对66个RNA结合蛋白进行敲降后免疫印迹检测PD-L1蛋白水平，绘制火山图分析发现RBMS1敲降后PD-L1显著下降结果见图2中的A(p<0.01)，同时在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、HCC1937以及BT-549细胞中加入及不加入干扰素(IFN-γ)处理分别采用免疫印迹(图2中的B)及流式细胞术(图2中的C)检测PD-L1水平及细胞膜表面PD-L1水平，结果显示RBMS1敲降可下调PD-L1水平(n＝3，p<0.05)。

图2为敲降RBMS1下调PD-L1表达；其中，A：免疫印迹方法检测66个RNA结合蛋白敲降以后PD-L1蛋白水平改变情况(n＝3，p<0.01)，根据PD-L1蛋白水平上升或下降倍数及三次重复的p值绘制火山图。B：在三种三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、HCC1937及BT-549细胞中构建RBMS1稳定敲降RBMS1细胞株，加入干扰素(IFN-γ)处理，采用免疫印迹方法检测PD-L1蛋白水平。C：在三种细胞系中加入干扰素(IFN-γ)处理，采用PE标记的PD-L1抗体，流式细胞术检测膜表面PD-L1水平。

实施例2

RBMS1调控肿瘤细胞抗免疫原性抑制肿瘤生长

在免疫健全Balb/c小鼠中皮下接种4T1细胞中已构建的control sh和RBMS1 sh稳转细胞系，观察小鼠荷瘤之后瘤体生长情况，RBMS1sh组小鼠瘤体明显小于control sh组，见图3中的(A-C)，对淋巴结和脾脏及肿瘤中T细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)和颗粒酶B(GzmB)水平进行分析，结果显示，RBMS1 sh组CD8⁺细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)和颗粒酶B(GzmB)显著高于control sh组，见图3中D和E。

图3为RBMS1敲降可以促进增强肿瘤细胞抗免疫原性；其中，A-C：在5周龄雌性Balb/c小鼠皮下接种20万细胞/只，第六天开始开始测量小鼠瘤体大小，截止第20天，采用CO₂方法处死小鼠，并取出瘤体称重和拍照，并绘制生长瘤体曲线(V＝L*W²*0.52)(n＝8，p<0.01)。D-E：取出腋下淋巴结和脾脏，将瘤体进行消化，淋巴结和脾脏进行研磨以获取淋巴细胞，对淋巴细胞进行激活并染色分析T细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)和颗粒酶B(GzmB)，水平进行分析(n＝5，p<0.01)。

实施例3

RBMS1通过结合糖基转移酶B4GALT1的3’-UTR调控其转录

为进一步探究RBMS1调控为了从机制上研究RBMS1如何下调PD-L1表达，本发明对MDA-MB-231中RBMS1敲降细胞细胞进行了RNA-seq测定。本发明发现糖基转移酶β-1,4-半乳糖基转移酶1(B4GALT1)是最重要的蛋白之一，进而本发明在细胞水平对其蛋白水平和mRNA水平进行验证，如图4中的A所示。在敲降RBMS1后B4GALT1 mRNA水平显著下降，图4中的B中也可见敲降RBMS1后B4GALT1蛋白水平显著下降。为进一步探究其调控B4GALT1表达机制，开展了检测其RNA稳定性实验，如图4中的C在细胞中加入放线菌素D分别处理0、4、8、12小时后发现B4GALT1mRNA降解速率Control sh明显快于RBMS1 sh，以上结果揭示RBMS1可能通过调控B4GALT1转录影响其RNA和蛋白质稳定性。

图4为RBMS1下调B4GALT1基因表达；其中，A：在MDA-MB-231敲降RBMS1细胞中提取RNA使用荧光定量PCR方法检测B4GALT1 mRNA水平。B：在MDA-MB-231敲降RBMS1细胞中使用免疫印迹方法检测B4GALT1蛋白表达。C：使用荧光定量PCR检测B4GALT1 mRNA降解速率。

B4GALT1作为糖基转移酶，而PD-L1作为一个高度糖基化蛋白，B4GALT1是否调控PD-L1表达呢？因此本发明在MDA-MB-231和HCC1937细胞中用shRNA对B4GALT1基因进行敲降，即在MDA-MB-231-B4GALT1-sh和HCC1937-B4GALT1-sh细胞中采用免疫印迹检测PD-L1表达，如图5中的A所示在使用和不使用IFNγ处理，在敲降B4GALT1后PD-L1均表达下降。开展免疫共沉淀实验，结果显示使用Flag标记的琼脂糖凝胶分别将B4GALT1和PD-L1富集下来后，进而分别使用PD-L1和B4GALT1内源性抗体检测在富集蛋白中能否检测到表达，结果见图5中的B：PD-L1和B4GALT1均在富集下来的裂解液中检测到，以上结果证明B4GALT1与PD-L1相互结合，结合敲降B4GALT1后PD-L1水平下降也表明B4GALT1与PD-L1存在蛋白质之间相互作用。

图5为B4GALT1调控PD-L1表达；其中，A:在MDA-MB-231和HCC1937细胞中加入和不加入IFNγ处理免疫印迹检测PD-L1表达；B：在293T细胞中转染pCDH-Flag-PD-L1然后采用B4GALT1抗体检测Flag标签富集的PD-L1中是否表达B4GALT1；同时转染pCDH-Flag-B4GALT1用PD-L1抗体检测Flag标签富集的B4GALT1中是否表达PD-L1蛋白。以此检测两个蛋白之间相互作用情况。

为了验证B4GALT1基因对PD-L1的调控在体内也发挥作用，本发明开展了在Balb/c小鼠中移植瘤实验，将4T1细胞中构建的Control-sh细胞、RBMS-sh敲降细胞，以及4T1中RBMS1敲降后回复B4GALT1基因细胞分别在小鼠皮下注射成瘤，结果如图6所示：小鼠瘤体(图6中的A)瘤重(图6中的B)及肿瘤生长曲线(图6中的C)，瘤体重量及肿瘤生长曲线显著差异分析显示RBMS1敲降组与Control组及RBMS1敲降后回复B4GALT1组相比均有显著差异，p<0.05，此实验结果进一步表明B4GALT1对PD-L1调控作用。

图6为在敲降RBMS1基因后回复B4GALT1后可促进肿瘤生长；其中，5周龄Balb/c小鼠随机分为三组，每组六只小鼠，每只小鼠皮下右侧腋下皮下注射20万细胞，注射6天后测量量瘤体最长和垂直宽度，在第三十天对小鼠进行CO₂处死后将瘤体取出并拍摄照片如A，同时对肿瘤进行称重如B，并根据记录长和宽计算瘤体积进行生长曲线绘制C。

实施例4

RBMS1可与免疫治疗检测点抗体联合应用发挥更好治疗效果

CTLA-4作为T细胞功能状况的重要影响因素，通过干预机体免疫环境可对疾病产生特异性治疗作用，可以增强肿瘤特异性T细胞激活作用，弥补传统用药和化疗的不足，为了明确RBMS1基因敲降可以增强肿瘤细胞免疫原性，因此本发明设计了小鼠成瘤后给予CTLA-4抗体治疗的实验。将Control sh和RBMS1 sh细胞分别注射小鼠腋下皮下，然后分别给予CTLA-4抗体和PBS以此检测RBMS1基因敲降以后对肿瘤细胞免疫治疗的反馈，结果如图7所示：在敲降RBMS1基因后给予CTLA-4治疗组小鼠瘤体生长最慢，瘤体积最小。

图7为抑制RBMS1表达可使免疫治疗发挥更好效果；其中，5周龄Balb/c小鼠随机分为三组，每组五只小鼠，每只小鼠皮下右侧腋下皮下注射20万细胞，注射6天后测量量瘤体最长和垂直宽度，同时在第6、9、12、15天给予治疗组每只小鼠100μg/只CTLA-4治疗，安慰剂组给予PBS注射，第16天对小鼠进行CO₂处死后将瘤体取出并拍摄照片如A，同时对肿瘤进行称重如B，并根据记录瘤体长和宽按照(体积＝长*宽²*0.52)计算瘤体积进行生长曲线绘制C。

为了揭示CTLA-4治疗后小鼠肿瘤组织中免疫环境改变，本发明采用流式细胞术对对荷瘤小鼠的淋巴结和脾脏及肿瘤中T细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)和颗粒酶B(GzmB)水平进行分析，结果如图8所示，RBMS1 sh组及RBMS1sh+anti-CTLA-4抗体治疗组CD8+细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)和颗粒酶B(GzmB)显著高于control sh和control sh+anti-CTLA-4抗体治疗组。以上结果表明，敲降RBMS1基因后可以增强免疫细胞对肿瘤的杀伤促进淋巴细胞分泌有助于肿瘤杀伤因子，而且在使用CTLA-4抗体治疗后可以显著抑制肿瘤生长，且在RBMS1基因敲降后使用CTLA-4抗体治疗后，能增强对肿瘤生长的抑制及淋巴细胞γ干扰素(IFN-γ)和颗粒酶B(GzmB)的分泌，进而增强免疫治疗功效。

图8为RBMS1敲降联合CTLA-4抗体治疗可以促进增强肿瘤细胞抗免疫原性；其中，A：在5周龄雌性Balb/c小鼠皮下接种20万细胞/只，第六天开始开始测量小鼠瘤体大小，并在第6、9、12、15天分别给予治疗组每只鼠100ug CTLA-4抗体治疗，截止第16天，采用CO₂方法处死小鼠，并取出瘤体称重和拍照，并绘制生长瘤体曲线(V＝L*W²*0.52)(n＝5，p<0.01)。B：取出腋下淋巴结和脾脏，将瘤体进行消化，淋巴结和脾脏进行研磨以获取淋巴细胞，对淋巴细胞进行激活并染色分析T细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)和颗粒酶B(GzmB)水平进行分析(n＝5，p<0.01)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 大连医科大学

<120> 敲降RBMS1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccggccacag aacctttatt gtgtactcga gtacacaata aaggttctgt ggtttttg 58

<210> 2

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aattcaaaaa ccacagaacc tttattgtgt actcgagtac acaataaagg ttctgtgg 58

<210> 3

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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<210> 6

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccggccatat acctttcaac ctaatctcga gattaggttg aaaggtatat ggtttttg 58

<210> 8

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

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<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

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<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaagattcta gagctagcat gaggatattt gctgtcttta 40

<210> 12

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtctttgtag tcggatcccg tctcctccag atgtgtat 38

Claims

1.敲降RBMS1的试剂在制备治疗三阴性乳腺癌的药物中的应用。

2.敲降RBMS1的试剂在制备抑制三阴性乳腺癌肿瘤生长的药物中的应用。

3.敲降RBMS1的试剂在制备促进T细胞分泌CD8+中干扰素γ和/或颗粒酶B的药物中的应用。

4.敲降RBMS1的试剂在制备下调PD-L1表达的药物中的应用。

5.敲降RBMS1的试剂在制备下调B4GALT1表达的药物中的应用。

6.敲降RBMS1的试剂在制备增强三阴性乳腺癌免疫治疗敏感性的药物中的应用。

7.检测RBMS1表达量的试剂在制备三阴性乳腺癌免疫分型试剂盒中的应用。

8.一种三阴性乳腺癌免疫治疗药物，其特征在于，所述药物包括敲降RBMS1的试剂和免疫治疗用药物。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述免疫治疗用药物包括免疫治疗用抗体。

10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于，所述免疫治疗用抗体包括CTLA-4抗体。