CN106148337B - 长非编码rna ay927503及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因技术领域，涉及长非编码RNA AY927503及其用途，本发明通过实验证实，长非编码RNA‑AY927503能调节人肝癌细胞的迁移；脑硫脂能通过其调节人肝癌细胞的迁移；能调节整合素αV的表达；长非编码RNA‑AY927503通过整合素αV调节细胞的迁移；经实验证实，长非编码RNA‑AY927503主要位于细胞质中，也存在于细胞核中；长非编码RNA‑AY927503能调节整合素αV的启动子的活性，其不与整合素αV的启动子上的转录因子结合，而是与整合素αV的启动子直接结合。本发明提供了长非编码RNA AY927503及其在基因调控中的用途，其能直接结合整合素αV的启动子，调节整合素αV转录活性，进而影响细胞的行为；所述的长非编码RNA AY927503可用于制备人肝癌细胞的靶标分子。

Description

长非编码RNA AY927503及其用途

技术领域

本发明属于基因技术领域，具体涉及长非编码RNA AY927503及其在基因调控中的用途，该长非编码RNA-AY927503能直接结合整合素αV的启动子，调节整合素αV转录活性，进而影响细胞的行为；尤其是所述的长非编码RNA AY927503在用于人肝癌细胞的靶标分子中的用途。

背景技术

现有技术报道了原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最为常见的一种肝癌类型。肝癌是世界上排名第五的最为常见的癌症之一，已成为世界排名第三的癌症死亡原因，严重威胁人类的健康。已有报道称，原发性肝细胞癌的手术切除后的复发和转移是肝癌治疗中最主要的障碍，而在分子水平上研究原发性肝细胞癌的侵袭，则成为攻克这一难题的最为重要的手段。简单来说，肿瘤细胞的转移主要经历渗出并侵袭、运输并被捕获、生存并继续生长等阶段，但是由于缺乏更为全面而深入的分子机制的研究，极大的限制了现有治疗方式的进步与发展，

据研究报道，脑硫脂是细胞膜上的一种重要的糖脂分子，在肝癌组织中表达升高，对细胞功能有重要影响，研究显示，脑硫脂能够通过调节整合素αV促进人肝癌细胞的迁移，然而，脑硫脂是如何影响整合素αV的表达进而参与到人肝癌细胞迁移的机制并不十分清楚。已经有越来越多的证据表明，尽管绝大部分的长非编码RNA是没有功能的转录本，但是不可否认，仍有相当一部分长非编码RNA在基因调控以及其他许多生物学过程中在扮演着非常重要的角色。

传统观点认为，哺乳动物的基因组中存在着很大一部分重复的、非转录的序列，基因调控以编码蛋白的基因为中心、遵从中心法则进行。然而，在过去的十多年来，高通量基因组平台的结果却使人们逐渐认识到，有大量的基因组区域都能转录出转录本，即使这些转录本无法编码蛋白质，这一令人惊讶的发现屡屡挑战着上述观点。这些长度大于200bp、不能编码蛋白质的转录本被称为长非编码RAN(long non-coding RNA，lncRNA)。目前，根据相邻的编码蛋白的基因，大致可将长非编码RNA分为五种类型：(1)基因间的，(2)基因内的，(3)双向的，(4)反义的，(5)正义的。尽管，仍有绝大多数的长非编码RNA 尚未被研究证实其功能，但是人们已不再将其看成是转录“噪声”，他们在多种生物进程中至关重要的作用越来越不容忽视，并且影响人类疾病的发生与发展。有报道称，长非编码RNA参与细胞的侵袭转移，如H19、HOTAIR、LET、MALAT-1、Dreh等；参与细胞的增殖，如HULC、LALR1、HOTTIP、HEIH等；参与细胞的凋亡，如MEG3、uc002mbe.2等[；参与血管生成，如MVIH等。其中涉及到的分子机制包括：(1)长非编码RNA与miRNA相互作用，调节miRNA的目标mRNAs的表达；(2)长非编码RNA与蛋白质结合，作为结构分子，调节蛋白的活性或定位等；(3)长非编码RNA参与选择性剪接；(4)长非编码RNA参与表观遗传沉默；(5)长非编码RNA的基因突变。

已知神经酰胺(ceramide)又称神经鞘脂类，是鞘脂类的中间代谢产物，在维持细胞结构、参与细胞免疫、细胞识别、细胞生长分化以及诱导细胞凋亡中发挥重要作用。乳糖基或半乳糖基可修饰神经酰胺形成乳糖基神经酰胺或半乳糖基神经酰胺，属于脑苷脂。脑苷脂(cerebroside)也称为酰基鞘氨醇己糖苷，是酰基鞘氨醇上以糖苷键结合一分子己糖而成的化合物，为神经鞘糖脂的一种。脑苷脂磺酰基转移酶(cerebrosidesulfotransferase，CST)能催化活性硫酸分子3’磷酸腺苷5’磷酸硫酸(3′-phospho-adenosine-5′-phosphosullfate，PAPS)上的磺酰基基团转移到乳糖基或半乳糖基3’位羟基上，使得乳糖基神经酰胺被磺酰化修饰形成磺酰化的乳糖基脑苷脂(sulfatedlactosylceramide，SM3)，使得半乳糖基神经酰胺被磺酰化修饰形成磺酰化的半乳糖基脑苷脂(sulfated galactosylcera-mide，sulfatide，SM4)。有研究表明，脑硫脂(sulfatide)作为一种多功能的重要的糖脂分子，参与到在众多的生物学过程中，例如神经系统、免疫系统、细菌感染、病毒感染、止血/血栓形成以及胰岛素的分泌等。有报道称，脑苷脂磺酰基转移酶(CST)在原发性肝细胞癌病人血清中的活性要高于健康的正常人，脑硫脂在肝癌组织中的表达要高于癌旁的正常组织，脑硫脂可以影响整合素αVβ3与玻连蛋白的相互作用，改变细胞的粘附，通过刺激整合素αV的表达，促进肝癌细胞的迁移。然而，脑硫脂如何改变整合素αV的表达，迄今，未见报道。

整合素(integrin)是细胞粘附分子家族的重要成员之一，主要介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(ECM)之间的粘附，有报道称，在恶性肿瘤的转移过程中，肿瘤细胞与细胞外基质(ECM)的粘附是至关重要的步骤。整合素是由α(120～185KD)和β(90～110KD)两个亚单位共价结合形成的异二聚体，属于跨膜糖蛋白家族，是细胞表面受体的主要家族成员，介导细胞与细胞外基质(ECM)之间的双向信号转导，包括由内向外(inside-out)的信号通路，即细胞的状态传达给外界，以及由外向内(out-inside)的信号通路，即外 界的信号传递给细胞，使得细胞基本行为的调控更加迅速灵活。此外，整合素还能与血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)结合，在肿瘤转移过程中的血管形成中，参与介导白细胞与血管内皮细胞的粘附。迄今为止已发现18种α亚单位和8种β亚单位，按不同的组成构成24种整合素，例如整合素αV亚单位，可与整合素β亚单位家族成员分别组成αVβ1、αVβ3、αVβ5、αVβ6和αVβ8，它们可结合不同的配体，但同时又都与玻连蛋白结合。其中整合素αVβ3被认为与肿瘤细胞的迁移、侵袭以及血管生成等尤为相关。

本申请的发明人在现有技术研究的基础上，拟进通过进一步探讨脑硫脂调节整合素αV的分子机制，提供长非编码RNA AY927503及其在基因调控中的用途，尤其是所述的长非编码RNA AY927503在用于人肝癌细胞的靶标分子中的用途。

与本发明相关的现有技术有：

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发明内容

本发明的目的在于提供长非编码RNA AY927503及其在基因调控中的用途，具体涉及该长非编码RNA-AY927503能直接结合整合素αV的启动子，调节整合素αV转录活性，进而影响细胞的行为；尤其是所述的长非编码RNA AY927503在用于人肝癌细胞的靶标分子中的用途。

具体而言，在第一方面，本发明在之前的研究基础上，进一步探讨脑硫脂调节整合素αV的分子机制。首先采用基因芯片的方法，筛查出在脑硫脂的作用下表达升高的长非编码RNA，从中挑选出升高最为明显的长非编码RNA-AY927503，并且通过RT-PCR的方法，进一步验证了在多种人肝癌细胞中，无论外源还是内源的脑硫脂，都能明显升高长非编码RNA-AY927503的表达。

本发明提供了本发明第一方面的长非编码RNA-AY927503。

在第二方面，本发明提供了长非编码RNA-AY927503对肝癌细胞迁移的影响的试验方法，以及长非编码RNA-AY927503在用于制备直接结合整合素αV的启动子，调节整合素αV转录活性，进而影响细胞的行为的药物组合物中的应用方法以及在用于人肝癌细胞的靶标分子中的用途。

本发明中，进行了长非编码RNA-AY927503对肝癌细胞迁移的影响实验，其中包括：

构建了长非编码RNA-AY927503的过表达质粒以及siRNA干扰质粒，通过伤口愈合实验(wound healing)、转移培养皿实验(transwell assay)和琼脂滴实验(the agarosedrop explants assay)，结果显示，长非编码RNA-AY927503表达升高促进人肝癌细胞的迁移，长非编码RNA-AY927503表达降低抑制人肝癌细胞的迁移；

进一步，采用实时荧光定量PCR(qPCR)的方法，检测了53例肝癌病人的癌组织与癌旁肝组织中长非编码RNA-AY927503的表达量，结果显示，肝癌组织中长非编码RNA-AY927503 的表达显著高于癌旁肝组织，并且通过Pearson χ²统计学检验表明，长非编码RNA-AY927503的表达与整合素αV的表达具有相关性；

进一步，本发明中检测了在长非编码RNA-AY927503表达异常的情况下，整合素αV在RNA水平上和蛋白水平上的表达变化，qPCR、蛋白免疫印记(western blot)、免疫荧光(immunofluorescence)以及流式细胞术(flow cytometey analysis)的结果均显示，无论是在RNA水平上还是在蛋白水平上，整合素αV的表达随着长非编码RNA-AY927503的表达升高而升高，随着其表达降低而降低。

本发明中，还用原位杂交(in situ hybridization，ISH)的方法检测了长非编码RNA-AY927503的亚细胞定位，结果显示，尽管长非编码RNA-AY927503主要存在于细胞质中，但是在细胞核中也有其存在，并且，通过荧光素酶(luciferase report assay)实验显示，长非编码RNA-AY927503能够调节整合素αV的转录活性；RNA pull-down实验结果显示，长非编码RNA-AY927503不能与HBO1、HDAC8和STAT3结合，同时RNA沉淀实验(RNAimmunoprecipitation，RIP)的结果也显示，BRD1、SP1、MOZ和HDAC1抗体不能富集长非编码RNA-AY927503。然而有趣的是，整合素αV启动子-937～-923区域的15bp的碱基与长非编码RNA-AY927503的600～614区域的15bp的碱基完全互补，实验结果显示了两者之间有结合，说明长非编码RNA-AY927503能直接结合整合素αV的启动子，调节整合素αV转录活性，进而影响细胞的行为。

本发明通过实验证实了，长非编码RNA-AY927503能调节人肝癌细胞的迁移；脑硫脂能通过长非编码RNA-AY927503调节人肝癌细胞的迁移；长非编码RNA-AY 927503能调节整合素αV的表达；脑硫脂能通过长非编码RNA-AY927503调节整合素αV的表达；长非编码RNA-AY927503通过整合素αV来调节细胞的迁移；本发明通过进一步研究证实，长非编码RNA-AY927503主要位于细胞质中，但也存在于细胞核中；长非编码RNA-AY927503能调节整合素αV的启动子的活性；长非编码RNA-AY927503不与整合素αV的启动子上的转录因子结合，而是与整合素αV的启动子直接结合。

本发明提供了长非编码RNA AY927503及其在基因调控中的用途，具体涉及该长非编码RNA-AY927503能直接结合整合素αV的启动子，调节整合素αV转录活性，进而影响细胞的行为；尤其是本发明提供了所述的长非编码RNA AY927503在用于人肝癌细胞的靶标分子中的用途。

附图说明

图1显示了长非编码RNA分为五种类型。

图2.显示了长非编码RNA作用机制。

图3.显示了伤口愈合实验(wound healing)检测细胞的迁移能力，其中，Control组为二甲亚枫(DMSO)处理，Gal-Cer组为半乳糖基神经酰胺处理，Sulfatide组为脑硫脂处理，药物浓度均为2μM，0h，24h，36h，48h和72h观察拍照，放大10倍。

图4显示了转移培养皿实验(Transwell assay)检测细胞的迁移能力，其中，Control组为二甲亚枫(DMSO)处理，Gal-Cer组为半乳糖基神经酰胺处理，Sulfatide组为脑硫脂处理，药物浓度均为2μM，处理48h后接种于上室，迁移12h，结晶紫染色，放大20倍。

图5显示了伤口愈合实验(wound healing)和转移培养皿实验(Transwell assay)检测内源性脑硫脂对细胞迁移的影响，其中，CST8：脑苷脂磺酰基转移酶(cerebrosidesulfotransferase，CST)过表达稳定转染的SMMC-7721细胞株；Chp：CST被干扰的稳定转染的SMMC-7721细胞株；Mock和Scramble：各自的对照细胞株。

图6.显示了RT-PCR检测在外源性脑硫脂的作用下，人肝癌细胞中长非编码RNA-AY927503的表达情况，其中Control组为二甲亚枫(DMSO)处理，Gal-Cer组为半乳糖基神经酰胺处理，Sulfatide组为脑硫脂处理，药物作用24h后，收取细胞RNA，做逆转录，以GAPDH为内参。

图7显示了RT-PCR检测在内源性脑硫脂的作用下，人肝癌细胞中长非编码RNA-AY927503的表达情况，其中，CST8：脑苷脂磺酰基转移酶(cerebroside sulfotransferase，CST)过表达稳定转染的SMMC-7721细胞株；siCST：CST被干扰的稳定转染的SMMC-7721细胞株；Mock和Scramble：各自的对照细胞株，以GAPDH为内参。

图8为检测不同人肝癌细胞系中长非编码RNA-AY927503的表达结果。

图9为RT-PCR检测长非编码RNA-AY927503全长的过表达质粒的表达效率，其中，AY：转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY；Mock：转染空载体pcDNA3.1-basic，GAPDH作为内参。

图10.伤口愈合实验(wound healing)检测长非编码RNA-AY927503表达升高促进人肝癌细胞的迁移，其中，AY：转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY；Mock：转染空载体pcDNA3.1-basic。

图11.转移培养皿实验(Transwell assay)检测长非编码RNA-AY927503表达升高促进人肝癌细胞的迁移。AY：转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY；Mock：转染空载体pcDNA3.1-basic。

图12.琼脂滴实验(the agarose drop explants assay)检测长非编码RNA-AY927503表达升高促进人肝癌细胞的迁移，其中，AY：转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY；Mock：转染空载体pcDNA3.1-basic。

图13.长非编码RNA-AY927503对Chp细胞株迁移的影响，其中，上：伤口愈合实验(wound healing)；中：转移培养皿实验(Transwell assay)；下：琼脂滴实验(the agarosedrop explants assay)。Mock：转染空载质粒pcDNA3.1-basic；AY：转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY；Chp：CST被干扰的稳定转染的SMMC-7721细胞株；Scramble：空载质粒稳定转染的SMMC-7721细胞株。

图14.RT-PCR检测长非编码RNA-AY927503干扰质粒的干扰效率，其中，Scramble：瞬时转染空载体质粒pSilencer 4.1；siAY：瞬时转染长非编码RNA-AY927503干扰质粒——pSilencer 4.1-siAY，GAPDH为内参。

图15.显示其中，左：伤口愈合实验(wound healing)；中：转移培养皿实验(Transwell assay)；右：琼脂滴实验(the agarose drop explants assay)。Scramble：转染空载质粒pSilencer4.1；siAY：转染重组质粒pSilencer 4.1-siAY。

图16，显示了在脑硫脂(Sulfatide)处理的SMMC-7721细胞中，干扰长非编码RNA-AY927503的表达，检测细胞的迁移能力，其中，上：伤口愈合实验(wound healing)；中：转移培养皿实验(Transwell assay)；下：琼脂滴实验(the agarose drop explants assay)。Gal-Cer：半乳糖基神经酰胺处理；Sulfatide：脑硫脂处理；Scramble：转染空载质粒pSilencer4.1；siAY：转染重组质粒pSilencer 4.1-siAY。

图17，长非编码RNA-AY927503表达降低对CST8细胞株迁移的影响，其中，上：伤口愈合实验(wound healing)；中：转移培养皿实验(Transwell assay)；下：琼脂滴实验(theagarose drop explants assay)；Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染重组质粒pSilencer 4.1-siAY；CST8：CST过表达稳定转染的SMMC-7721细胞株；Mock：空载质粒稳定转染的SMMC-7721细胞株。

图18，real time-PCR检测53例肝癌病人样本中长非编码RNA-AY927503的表达情况。

图19.长非编码RNA-AY927503在MHCC97H和MHCC97L两种细胞株中的表达。

图20.分析长非编码RNA-AY927503与整合素αV表达的相关性，其中，-：与癌旁组织相比，在癌组织中的表达下降；+：与癌旁组织相比，在癌组织中的表达升高。

图21.Real time-PCR检测长非编码RNA-AY927503以及整合素αV的mRNA表达，其中，AY：瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY；Mock：瞬时转染空载质粒pcDNA3.1-basic。

图22.western blot检测长非编码RNA-AY927503对整合素αV蛋白表达的影响，其中，AY：瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY；Mock：瞬时转染空载质粒pcDNA3.1-basic。GAPDH为内参。

图23.免疫荧光(immunofluorescence)检测长非编码RNA-AY927503对整合素αV蛋白表达的影响，其中，AY：瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY；Mock：瞬时转染空载质粒pcDNA3.1-basic，绿色荧光为整合素αV染色；蓝色荧光为细胞核染色。

图24.流式细胞术(flow cytometey analysis)检测长非编码RNA-AY927503对整合素αV蛋白表达的影响，其中，AY：瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY；Mock：瞬时转染空载质粒pcDNA3.1-basic。

图25.检测在siCST细胞株中，长非编码RNA-AY927503对整合素αV表达的影响，其中，上：western blot；下：免疫荧光(immunofluorescence)；siCST：CST被干扰的稳定转染的SMMC-7721细胞株；Scramble：相应的对照细胞株；AY：瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY；Mock：瞬时转染空载质粒pcDNA3.1-basic。western blot结果以GAPDH为内参；免疫荧光结果蓝色荧光代表细胞核，绿色荧光代表整合素αV。

图26.Real time-PCR检测长非编码RNA-AY927503以及整合素αV的mRNA表达。，其中，siAY：瞬时转染重组质粒pSilencer 4.1-siAY；Sramble：瞬时转染空载质粒pSilencer4.1。

图27.western blot检测长非编码RNA-AY927503表达下降对整合素αV蛋白表达的影响，其中，Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染干扰质粒pSilencer 4.1-siAY，GAPDH为内参。

图28.免疫荧光(immunofluorescence)检测长非编码RNA-AY927503表达下降对整合素αV蛋白表达的影响，其中，Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染干扰质粒pSilencer 4.1-siAY，免疫荧光结果蓝色荧光代表细胞核，绿色荧光代表整合素αV。

图29.流式细胞术(flow cytometey analysis)检测长非编码RNA-AY927503表达下降对整合素αV蛋白表达的影响，其中，Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染干扰质粒pSilencer 4.1-siAY。

图30.real time-PCR检测在脑硫脂处理的细胞中长非编码RNA-AY927503的表达下降对整合素αV的表达的影响，其中，Gal-Cer：半乳糖基神经酰胺；Sulfatide：脑硫脂；Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染重组质粒pSilencer 4.1-siAY。

图31.western blot检测在脑硫脂处理的细胞中干扰长非编码RNA-AY927503的表达， 对整合素αV表达的影响，其中，Gal-Cer：半乳糖基神经酰胺；Sulfatide：脑硫脂；Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染重组质粒pSilencer 4.1-siAY。

图32.免疫荧光(immunofluorescence)检测在脑硫脂处理的细胞中干扰长非编码RNA-AY927503的表达，对整合素αV表达的影响，其中，Gal-Cer：半乳糖基神经酰胺；Sulfatide：脑硫脂；Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染重组质粒pSilencer4.1-siAY，免疫荧光结果蓝色荧光代表细胞核，绿色荧光代表整合素αV。

图33.流式细胞术(flow cytometey analysis)检测在脑硫脂处理的细胞中干扰长非编码RNA-AY927503的表达，对整合素αV表达的影响，其中，Gal-Cer：半乳糖基神经酰胺；Sulfatide：脑硫脂；Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染重组质粒pSilencer4.1-siAY。

图34.CST8细胞株中长非编码RNA-AY927503表达下降对整合素αV表达的影响，其中，上：real time-PCR；中：western blot；下：免疫荧光(immunofluorescence)。CST8：CST过表达稳定转染的SMMC-7721细胞株；Mock：相应的对照细胞株，Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染重组质粒pSilencer 4.1-siAY，GAPDH为western blot的内参，免疫荧光结果蓝色荧光代表细胞核，绿色荧光代表整合素αV。

图35.长非编码RNA-AY927503通过整合素αV调节人肝癌细胞迁移，其中，上：伤口愈合实验(wound healing)；下：转移培养皿实验(transwell assay)；Mock：转染空载质粒pcDNA3.1-basic；AY：转染长非编码RNA-AY927503的过表达质粒pcDNA3.1-basic-AY；siIntegrin αV：转染整合素αV的干扰质粒si Integrin αV。

图36.长非编码RNA-AY927503通过整合素αV调节人肝癌细胞迁移，其中，上：伤口愈合实验(wound healing)；下：转移培养皿实验(transwell assay)；Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染长非编码RNA-AY927503的干扰质粒pSilencer 4.1-siAY；Integrin αV：转染整合素αV的过表达质粒Integrin αV。

图37.原位杂交检测长非编码RNA-AY927503的亚细胞定位，其中，采用碱性磷酸酶检测系统和免疫荧光检测系统；sulfatide：脑硫脂处理SMMC-7721细胞；Gal-Cer：半乳糖基神经酰胺处理SMMC-7721细胞。

图38.荧光素酶报告基因检测不同长度的整合素αV启动子片段的活性，其中，pGL3-Basic-αV promoter(-1295/+207)：包含整合素αV启动子-1295～+207区域的重组质粒；pGL3-Basic-αV promoter(-795/+207)：包含整合素αV启动子-795～+207区域的重组质粒。

图39.荧光素酶报告基因检测长非编码RNA-AY927503对整合素αV启动子活性的调节，其中，Mock：转染空载质粒pcDNA 3.1-basic；AY：转染过表达质粒pcDNA 3.1-basic-AY；Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染干扰质粒pSilencer 4.1-siAY；所有处理组均同时共同转染重组质粒pGL3-Basic-αV promoter(-1295/+207)。

图40.荧光素酶报告基因检测长非编码RNA-AY927503对整合素αV启动子活性的调节，其中，Mock：空载质粒pcDNA 3.1-basic；AY：转染过表达质粒pcDNA 3.1-basic-AY；Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染干扰质粒pSilencer 4.1-siAY；所有处理组均同时共同转染重组质粒pGL3-Basic-αV promoter(-795/+207)。

图41.荧光素酶报告基因检测脑硫脂对整合素αV启动子活性的影响，其中，sulfatide：脑硫脂处理；Gal-Cer：半乳糖基神经酰胺处理；Mock：转染空载质粒pcDNA 3.1-basic；AY：转染过表达质粒pcDNA 3.1-basic-AY。Scramble：转染空载质粒pSilencer 4.1；siAY：转染干扰质粒pSilencer 4.1-siAY；所有处理组均同时共同转染重组质粒pGL3-Basic-αV promoter(-1295/+207)。

图42.RNA pull-down实验研究与长非编码RNA-AY927503相结合的蛋白质，其中，Input：阳性对照组；AY：生物素标记的全长长非编码RNA-AY927503序列探针；-：不加任何探针；BC：加入生物素标记的无意义的探针。

图43.RIP(RNA immunoprecipitation)实验研究与长非编码RNA-AY927503相结合的蛋白质，其中，Input：阳性对照组；IgG：阴性对照组。

图44.分析长非编码RNA-AY927503与整合素αV的启动子的序列。

图45.RNA-DNA Interaction实验检测长非编码RNA-AY927503与整合素αV启动子序列的直接结合，其中，Input：阳性对照组；AY+：加入与长非编码RNA-AY927503互补的生物素标记的探针；AY-：不加任何探针；Nonsense：加入无意义的生物素标记的探针。

为了便于理解，以下将通过具体实施例和附图对本发明进行描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。另外，本发明引用了现有文献，它们全部纳入本文参考，就好像它们在本文中全部重复叙述过一样。

具体实施方式

以下结合具体的实施例进行说明，其中试剂以及样品均可通过商业渠道获得，实验步骤如有未尽之处，均可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(科学出版社，2002)等教课书和实验手册，并可以按照商业化的酶、试剂盒的厂商说明来进行。

实施例1

脑硫脂促进人肝癌细胞的迁移以及长非编码RNA-AY927503的表达实验

(一)材料和方法

1.材料

1.1细胞培养与处理

1.1.1细胞株

所有的细胞株的培养方法根据ATCC(American Type Culture Collection)建议的最佳条件进行；人肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7404、Hep3B、HepG2、Huh-7由本实验室保存；CST8(CST在SMMC-7721细胞株中过表达)及相应的空载对照Mock稳转细胞株，Chp2/siCST(CST在SMMC-7721细胞株中被干扰)及相应的空载对照Scramble稳转细胞株是由本实验室构建及保存；LM3细胞株获赠于上海肝癌研究中心；L02、Hela和HEK293T细胞株购自ATCC。

1.1.2细胞培养试剂耗材

1000mL PBS：8.0g NaCl，3.48g Na₂HPO₄·12H₂O(2.9g Na₂HPO₄)，0.2g KCl，0.2gKH₂PO₄，溶于1000mL蒸馏水。

0.25％胰酶：称0.25g胰酶，加入1mL 0.5mol/L EDTA，1×PBS定容到100mL，并以0.22μm滤膜过滤除菌，储存于4℃。

DMEM培养基：DMEM培养基干粉购自Gibco BRL公司，采用超纯水配制，每毫升加入3.7g碳酸氢钠调pH，并以0.22μm滤器抽滤除菌，分装，4℃保存。

新生牛血清购自PAA公司。胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司。

胰酶粉末购自Sigma公司。

二甲亚枫(DMSO)、无水乙醇、NaCl、Na₂HPO₄·12H₂O、KCl、KH₂PO₄、EDTA-2Na购自国药公司。

0.22μm滤膜购自上海实生生物有限公司。

10cm细胞培养板、6cm细胞培养板以及6孔、24孔、96孔细胞培养板购自Nest公司。

1.1.3外源性寡糖化合物

纯化的牛脑来源的半乳糖基神经酰胺(galactocerebroside，Gal-Cer)和脑硫脂(sulfatide)购自Sigma公司。

1.1.4细胞培养主要仪器

滤器(绍兴市卫星医疗设备有限公司)，真空抽滤泵(绍兴市卫星医疗设备有限公司)，CO₂培养箱(德国Heraeus公司)，超净工作台(上海上净净化设备有限公司)，倒置显微镜(安徽安庆市医疗器械有限公司)，37℃恒温水浴锅(上好医疗器械五厂)，荧光倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.2 RNA提取和PCR扩增

1.2.1 RNA提取和PCR扩增相关试剂和耗材

RAN提取相关试剂和耗材：Trizol试剂购自Invitrogen(USA)。M-MLV逆转录酶购自TAKARA公司。乙酸、氯仿、异丙醇、无水乙醇等化学试剂均为进口分装或国产分析纯试剂。

PCR相关试剂和耗材：Taq酶、dNTP等购自天根生化科技有限公司。Tris、甘氨酸、溴化乙锭(EB)为AMRESCO产品。琼脂糖粉末为Biowest公司产品。引物由上海生物工程技术有限公司合成。

50×TAE(1000mL)：Tris碱242g，冰乙酸57.1mL，0.5mol/L EDTA 100mL，蒸馏水定容到1000mL。

6×DNA琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液：0.25％溴酚兰，30％甘油水溶液。

1.2.2 RNA提取和PCR扩增相关仪器

低温离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司，T15RT)。T-gradient 96 PCR仪(德国Biometra公司)，核酸电泳槽(北京六一仪器厂)，凝胶成像仪(瑞典pharmaciaBiotech公司)。

2.方法

2.1细胞培养及处理

2.1.1细胞的培养方法

人肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7404、Hep3B、HepG2、Huh-7、LM3和CST8、Mock、Chp/siCST、Scramble稳转细胞株以及正常肝细胞株L02，培养在含10％新生牛血清或胎牛血清的DMEM培养基中，其中添加有100Ul/mL青霉素和100μg/mL链霉素，于37℃，5％CO₂的条件下培养。细胞传代时，使用0.25％胰蛋白酶进行消化，并根据需要以1∶2～4的细胞比例传代培养。

2.1.2细胞的寡糖化合物处理

半乳糖基神经酰胺(Gal-Cer)和脑硫脂(sulfatide)溶解于二甲亚枫溶液中，使用前用DMEM将其稀释至终浓度为2μm/L，细胞被培养12-48h，收集细胞进行细胞生物学实 验的检测。

2.2 RNA提取和PCR扩增

2.2.1总RNA的提取

总的RNA利用Trizol(Invitrogen)试剂盒进行提取。

(1)将培养在细胞培养板上的单层细胞用预冷的PBS洗3次。

(2)在培养皿中直接加入1mL Trizol，冰上裂解10min。

(3)将步骤2中的细胞裂解液转移到Rnase-free 1.5mL EP管中，再加入200μL氯仿，剧烈震荡混匀30s，4℃放置2～3min，12,000rpm低温离心10min。

(4)吸取上层无色水相，转移到另一Rnase-free 1.5mL EP管中(约0.5mL)，加入等体积的异丙醇，4℃放置10min后，12,000rpm低温离心10min。

(5)小心弃去上清，用70％的乙醇1mL洗涤，12,000rpm低温离心15min。

(6)彻底弃去上清，在室温下干燥10-15分钟，用40μL DEPC水溶解RNA。

(7)取1μL加入59μL DEPC水测量OD₂₆₀/OD₂₈₀。计算浓度与纯度，并于-70℃冰箱中保存。

2.2.2逆转录合成cDNA

进行OD₂₆₀和OD₂₈₀的紫外分光光度测定，计算RNA浓度，公式如下：

并根据OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值判断抽取RNA的纯度，纯度较好者进行下步的逆转录(RT)。各取2μg RNA按照Takara的RT-PCR试剂盒提供的操作步骤，进行逆转录和PCR扩增反应，并以GAPDH的mRNA水平为内参。

RT-PCR反应体系

反应条件为：预变性70℃10min，再加入逆转录酶，30℃15min，42℃1h，70℃10min，之后保存于-20℃冰箱中。

2.2.3PCR反应

(GAPDH)的循环数采用25Cycles，长非编码RNA-AY927503的循环数采用35Cycles。

具体引物序列和扩增产物的长度如下：

2.2.4凝胶电泳

取PCR产物8μL，加6×Loading Buffer 2μL，2％琼脂糖凝胶电泳120V、100mA、30min。溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像仪成像并保存结果。

2.3伤口愈合实验(wound healing)

(1)将细胞种入培养皿中，并进行各种处理，48小时后，细胞的融合率应已达到80％～90％。

(2)将培养基弃去，用无菌的PBS清洗细胞2～3次。

(3)用无菌的10μL枪头，在培养皿中划出3～4条相互平行的直线，垂直这些平行线再划出3～4条直线，然后用PBS冲洗1～2次，洗去脱落的细胞，换上新的培养基，同时加入新的处理药物，维持药物浓度不变，继续培养。

(4)在合适的时间点，如0h、24h、36h、48h、72h和96h，每次选取相同的3～4个区域进行拍照(×10倍)分析。

2.4转移培养皿实验(Transwell assay)

将8μm孔径的转移小室(Boyden chamber)放入24孔板中，进行转移培养皿实验(Transwell assay)，具体操作如下：

(1)制备细胞悬液：可先让细胞在无血清的条件下饥饿12-24h，以进一步去除血清对细胞迁移的影响。消化细胞，将完成消化的细胞转移至无菌的15mL离心管中，离心后弃去培养基，用无菌的PBS洗1-2遍，再将细胞用无血清的培养基重悬，调整细胞密度至5×10⁵个/mL。

(2)接种细胞：取100μL调整密度后的细胞悬液加入转移小室中。24孔板(下室)中加入500μL含10％胎牛血清的培养基，胎牛血清作为本次实验的趋化因子。注意上层转移小室和下层培养液之间无气泡产生。继续培养12-48h。

(3)细胞计数：用棉签擦去转移小室内的细胞。0.1％结晶紫染色，用Leica DC300F正置显微镜进行观察和拍照，随机选取3-5个视野或整个膜计数细胞个数。

(4)结果显示：脑硫脂能促进人肝癌细胞的迁移，

本实施例中，以人肝癌细胞系SMMC-7721和Hep3B作为研究对象，采用伤口愈合实验(wound healing)研究肝癌细胞的迁移，在6cm的细胞培养皿中接种细胞，待细胞贴壁后，用二甲亚枫(DMSO)和半乳糖基神经酰胺(Gal-Cer)处理细胞作为对照组，脑硫脂(Sulfatide)处理细胞作为实验组，药物浓度均为2μM。处理48h后，用10μL枪头制造划痕，换上新鲜的培养基，并维持药物浓度不变，分别在0h，24h，36h，48h和72h，在相同的位置拍照观察，结果显示，在脑硫脂的作用下，SMMC-7721细胞的伤口愈合速度明显加快，在72h时，处理组的伤口几乎完全愈合，而对照组则未出现此情况，处理组和对照组之间存在显著差异，两个对照组之间没有明显差异，该结果不仅在SMMC-7721中出现，在Hep3B中也观察到相同的现象；在48h时，脑硫脂处理的Hep3B细胞，划痕伤口几乎完全愈合，愈合率明显高于二甲亚枫(DMSO)和半乳糖基神经酰胺(Gal-Cer)处理的对照组；以上结果表明，脑硫脂能促进人肝癌细胞的迁移。

2.5采用转移培养皿实验(Transwell assay)方法检测细胞的迁移能力：二甲亚枫(DMSO)、半乳糖基神经酰胺(Gal-Cer)和脑硫脂(Sulfatide)处理SMMC-7721细胞48h后，消化离心，无血清培养基重悬细胞，调整细胞浓度至5×10⁵个/mL，取100μL接种于转移培养皿小室的上室中，并维持药物浓度不变，下室中加入含10％FBS的培养基作为趋化因子，12h后，结晶紫染色，检测迁移细胞的数目，结果显示，用脑硫脂处理后的SMMC-7721细胞迁移到下室的数目明显增多，与对照组之间存在显著差异，两个对照组 之间没有明显区别。在Hep3B细胞中也观察到相同的趋势，与对照组相比，处理组有更多的细胞迁移到下室，迁移能力显著高于对照组；结果再次证实脑硫脂能促进细胞的迁移；

2.6进一步，进行内源性的脑硫脂对细胞迁移的影响试验，采用现有技术的脑苷脂磺酰基转移酶(cerebroside sulfotransferase，CST)过表达稳定转染的SMMC-7721细胞株，相应的空载体作为对照，以及CST被干扰的稳定转染的SMMC-7721细胞株，相应的空载体作为对照，仍然采用伤口愈合实验(wound healing)和转移培养皿实验(Transwellassay)，研究细胞的迁移能力；将相同数量的CST过表达稳转细胞株(CST8)和相应的对照细胞株(Mock)，CST被干扰的稳转细胞株(Chp)和相应的对照细胞株(Scramble)，接种于6cm细胞培养皿中，待细胞融合率到达80％-90％时制造划痕，其余步骤与上述步骤相同，结果显示，CST8细胞株的伤口愈合率显著高于Mock细胞株，而Chp细胞株的伤口愈合率显著低于Scramble细胞株，说明内源性的脑硫脂能够促进人肝癌细胞的迁移；

CST8和Mock，Chp和Scramble四种细胞株经培养，消化离心后，制备成浓度为5×10⁵个/mL的无血清细胞悬液，取100μL接种于转移培养皿小室的上室中，其余步骤与上述步骤相同，结果显示，与Mock细胞株相比，有更多的CST8细胞株迁移到下室，两者之间存在显著的差异；与Scramble细胞株相比，迁移到下室中的Chp细胞株则显著减少，再次说明内源性的脑硫脂能够促进人肝癌细胞的迁移；

实验结果表明，不论是外源性的脑硫脂，还是内源性的脑硫脂，均能促进人肝癌细胞的迁移；

2.7脑硫脂促进长非编码RNA-AY927503的表达实验

进一步在SMMC-7721细胞中，以半乳糖基神经酰胺(Gal-Cer)处理作为对照，筛选在脑硫脂(Sulfatide)的处理下，表达发生异常的长非编码RNA，选取长非编码RNA-AY927503作为实验的研究对象，它在脑硫脂(Sulfatide)的作用下，与对照组相比，表达升高最为明显；

验证芯片的筛选结果，在SMMC-7721、HepG2、BEL-7404和Hep3B四种人肝癌细胞系中，检测外源性脑硫脂对长非编码RNA-AY927503的表达影响，用二甲亚枫(DMSO)和半乳糖基神经酰胺(Gal-Cer)处理细胞作为对照组，脑硫脂(Sulfatide)处理细胞作为实验组，药物浓度均为2μM。药物作用24h后，利用Trizol(Invitrogen)试剂盒提取细胞中总的RNA，然后逆转录合成cDNA，以GAPDH为内参，用长非编码RNA-AY927503的特异性引物，PCR检测在不同药物的作用下，长非编码RNA-AY927503的表达情况，结果显示，在SMMC-7721、HepG2、BEL-7404和Hep3B这四种人肝癌细胞系中，与对照组相 比，脑硫脂均能明显升高长非编码RNA-AY927503的表达，而在两个对照组之间长非编码RNA-AY927503的表达则没有明显的差别。

2.8为了进一步验证芯片筛选的结果，选用CST8和Mock，Chp/siCST和Scramble四种细胞株，检测内源性脑硫脂对长非编码RNA-AY927503的表达影响；利用Trizol(Invitrogen)试剂盒提取培养的这四种细胞株中总的RNA，然后进行RT-PCR实验，结果显示，在CST8细胞株中，由于脑苷脂磺酰基转移酶过表达，导致内源性脑硫脂增多，长非编码RNA-AY927503的表达也显著增多；在siCST细胞株中，由于脑苷脂磺酰基转移酶被干扰，导致内源性脑硫脂减少，长非编码RNA-AY927503的表达也显著减少。

实验结果说明，不论是外源性的脑硫脂，还是内源性的脑硫脂，都能促进的长非编码RNA-AY927503的表达。

实施例2长非编码RNA-AY927503促进人肝癌细胞的迁移以及整合素αV的表达实验

(一)材料和方法

1.材料

1.1质粒构建及转染

1.1.1菌株

大肠杆菌(E.coli.)菌株Top10由本实验室保存。

1.1.2质粒及相应载体

RNA干扰质粒载体pSilencer 4.1-CMV puro购自Ambion公司。

过表达质粒载体pcDNA3.1-basic购自Invitrogen公司。

引物由本实验室设计，上海生物工程技术有限公司合成，具体序列如下：

1.1.3质粒构建相关试剂

限制性内切酶HindIII、BamH I、EcoR I和Xba I，T4DNA连接酶，常用PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)公司。

逆转录试剂盒购自Promega公司。

胶回收试剂盒购自BIOMIGA公司，货号为DC3511。

质粒中提试剂盒购自上海天根生物科技有限公司。

质粒抽提试剂：Solution I：50mmol/L Glucose，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH 8.0)；Solution II：0.2mol/L NaOH，1％SDS；SolutionIII：3mol/LKAc，pH 4.8。

1.1.4细菌培养

0.1mol/L CaCl₂溶液：60mmol/L CaCl₂，15％(v/v)甘油，10mmol/L PIPES，pH 7.0。使用一次性滤器过滤除菌，或高压灭菌。

LB液体培养基：1％Tryptone，0.5％Yeast Extract，1％NaCl，pH 7.2。

LB固体培养基：1％Tryptone，0.5％Yeast Extract，1％NaCl，pH 7.2，1.5％Agar。

Tryptone和Yeast Extract等购自OXOID LTD.(Basingstoke，Hampshire，England)。NaCl购自国药集团化学试剂有限公司。Agar购自Genebase Gene-Tech CO，Ltd。

摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，TS I型脱色摇床)。

1.2病人样本

53例病人样本(肝癌组织与其对应的癌旁组织标本)取自中山医院临床手术的53个肝癌病人，所有病人均签署了同意协议。肿瘤分级根据美国criteria of Edmondson andSteiner，肝癌样本的筛选原则为有清楚的临床诊断，并且有至少80％在镜下确定的肿瘤细胞。取好的样本立即保存在-80℃，用于后续的实验。

1.3实时荧光定量PCR(real-time)相关试剂和仪器

Sybergreen Mix购自DBI生物技术有限公司。

iQ5实时PCR检测系统(美国BIO-RAD公司)。

1.4蛋白提取及Western Blot

1.4.1蛋白提取及Western Blot的相关试剂

标准蛋白质溶液：取适量牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/mL的标准蛋白质溶液。

1×SDS蛋白裂解缓冲液：50mmol/L Tris-Cl(pH 6.8)，2％SDS，10％glycerol，100μg/mL PMSF，10μg/mL leupeptin and 5mmol/L Na₃VO₄；其中相应的蛋白酶抑制剂在临用时加入即可。

10mM PMSF储存液：8.7mg PMSF溶于5mL异丙醇，分装，-20℃保存。

30％丙烯酰胺/N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶液：29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100mL水中，以0.45μm孔径滤膜过滤除菌，置于棕色瓶中室温保存。

10％过硫酸铵：即1g过硫酸铵溶于10mL水中，分装保存于4℃。

1.5M Tris-HCl(PH8.8)：Tris 18.17g加ddH₂O溶解，浓盐酸调pH至8.8，定容至100mL。

1.0M Tris-HCl(PH6.8)：Tris 12.11g加ddH₂O溶解，调pH至6.8，定容至100mL。

10％SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH₂O 68℃助溶，调至pH 7.2，定容至100mL。

2×SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH6.8)2.5mL，β-巯基乙醇1.0mL，SDS0.6g，甘油2.0mL，0.1％溴酚兰1.0mL，ddH₂O 3.5mL。

1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：(贮存液可以配制5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液)，25mmol/L Tris Base，250mmol/L Glysine(pH 8.3)，0.1％SDS。

湿式电转缓冲液(Bio-Rad方法)：3.03gTris-Cl，14.4g Glycine，200mLMethanol，定容至1000mL。

8％脱脂奶粉封闭液：8克脱脂奶粉溶解在100mL的1×PBS中。

丽春红染液：丽春红2g，三氯乙酸30g，磺基水杨酸30g，加水至100mL。用时上述储存液稀释10倍即成丽春红使用液。使用后应予以废弃。

0.02％NaN₃：取0.02g叠氮钠，溶于100mL PBS。

脱膜液：62.5mmol/L Tris-HCl(pH 6.7)，2％SDS，7％(V/V)β-巯基乙醇。

1×PBST：0.05％Tween-20in 1×PBS。

分离胶(10％)的配制

取1mL上述混合液，加入TEMED 4μL，混匀后灌入玻璃板间，以75％乙醇封顶，注意使液面平。凝胶完全聚合需10-30min。

5％ 积层胶的配制：

将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。

Tris Base，Glycine和SDS等购自Genebase Gene-Tech CO，Ltd。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺等均为AMRESCO产品。蛋白Marker购自Fermatas公司。ECL化学发光试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.4.2蛋白提取及Western Blot的相关仪器

722分光光度计(上海第三分析仪器厂)，恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)，XW-80A涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)，垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂)，稳压稳流电泳仪(德国安玛西亚公司)，脱色摇床(海门市麒麟医用仪器厂)，化学发光成像仪(上海天能科技有限公司)。

1.4.3 Western Blot的相关抗体

抗GAPDH单克隆抗体购自康成公司，整合素αV鼠单克隆抗体以及整合素αV兔多克隆抗体购自Santa Cruz公司。

1.5流式细胞术相关试剂及仪器

D-PBS配方：氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸氢二钠1.15g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钙0.1g，含6个结晶水的氯化镁0.1g，溶于1L ddH₂O中。

多聚甲醛购自国药公司。

细胞计数板(南京裕安仪器)，倒置显微镜(安徽安庆市医疗器械有限公司)，HX/G型旋转仪(上海强运科技有限公司)，流式细胞仪(美国beckman/COULTER EPICS XL)。

2.方法

2.1质粒构建及转染

2.1.1质粒DNA抽提

质粒DNA小量快速抽提步骤如下：

(1)接种新鲜的单个菌落到5mL LB培养基(含50μg/mL Ampicillin)，37℃震荡培养14-16h。室温下10,000×g离心1min，收集菌体，将菌液倒入1.5mL EP管，5000rmp离心5min，弃上清液，将残余液体去除，震荡。

(2)加入100μL solution I，使用移液器或者涡旋振荡器彻底悬浮沉淀的细菌

(3)加入100μL solution II，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解，此时菌液变得清亮粘稠。

(4)加入100μL solutionIII，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时出现白色絮状 沉淀。12,000rpm离心10分钟，将上清转移到新的干净的EP管中，尽量不要吸到沉淀。

(5)加入200μL异丙醇，室温放置2min。12,000rpm离心3分钟，小心弃上清。

(6)加入500μL 70％酒精洗沉淀。12,000rpm离心3分钟，小心弃上清，并用枪头尽量吸干，烤箱干燥。

(7)加入30μL TB buffer，枪头反复吹打溶解质粒。

质粒DNA中量抽提使用上海天根生物科技有限公司的高纯度质粒小量中提试剂盒。

2.1.2质粒DNA酶切

DNA限制性内切酶反应体系包含1-5μg DNA、1/10体积10×酶切反应缓冲液和适量限制性内切酶等。反应体积一般是20μL，并于37℃保温1-4小时。以EcoR I酶切反应为例，酶切体系如下：

37℃4h。加入等体积的异丙醇，4℃放置1h，4℃、12,000rpm离心15min，小心弃上清。加入1mL 70％乙醇洗沉淀，4℃、12,000rpm离心15min，小心弃上清，并用枪头尽量吸干，烤箱干燥。加入TB buffer溶解质粒。

胶回收后的PCR片段也要进行酶切，过程几乎相同，不做重复。

2.1.3质粒DNA的含量测定及琼脂糖凝胶电泳

取质粒样品2μL，使用美国Quawell公司的UV-Vis Spectrophotometer Q5000检测质粒浓度。

制备0.7％的琼脂糖凝胶。小心点样，并电泳。电泳完成后，取出凝胶，在紫外灯下，观察DNA的迁移位置，判断质粒酶切是否成功。

2.1.4 PCR片段的胶回收

胶回收试剂盒购自BIOMIGA公司，货号为DC3511。操作过程如下：

(1)酶切产物纯化：在1倍体积的PCR反应物中加入2倍体积的Buffer GC，涡旋充分混匀。对小于200bp的PCR产物，加入5倍体积的Buffer GC。

(2)胶回收：将含DNA片段的琼脂糖凝胶切下，转至1.5mL离心管中，再加入1倍体积的 Buffer GC(100mg的凝胶加入100μL Buffer GC)。在55～60℃下孵育8min左右，且每隔2min轻弹试管底部，直至胶溶解完全，放置使其冷却至室温。建议：为取得最好的实验结果，使用新鲜配制的电泳缓冲液制胶和电泳。切胶时，尽量缩短在紫外灯下照射的时间，以减少紫外对DNA的损伤，并尽量切除不含DNA的凝胶。若DNA片段小于200bp，请加入1体积的异丙醇。

(3)转移700μL DNA/Buffer GC混合溶液至离心柱中，室温下，13,000×g离心1min，弃废液，将离心柱放回收集管中。重复此步使剩余的溶液通过柱子。

(4)加300μL Buffer GC到离心柱中，室温下13,000rpm离心30-60s，弃废液。

(5)加入650μL DNA Wash Buffer(确保已将乙醇按说明书要求加入DNA WashBuffer中)，室温下13,000rpm离心30s，弃废液。重复此步骤。

(6)13,000×g开盖再次离心3min，以去除柱中残余的乙醇。

(7)将柱子放入干净的1.5mL试管中，向柱子中加入在60℃下预热的30-50μLElution Buffer或ddH₂O。在室温下放置1min。13,000rpm离心1min以洗脱DNA。将洗脱液重新上柱，再次离心洗脱。

建议：将洗脱缓冲液预热到65℃，加洗脱液后将柱子整个温育5min后再离心洗脱可以增加DNA回收效率。对大于8kb的片段，加洗脱液后将柱子整个温育15～30min可以提高回收效率。并于37℃孵育30min。使之降至室温，酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇各抽提一次。加入0.1体积的3M乙酸钠(pH7.0，在EDTA低于5mM情况下，也可使用pH5.2)，2倍体积无水乙醇后，充分混匀置于冰上15min。离心后以70％乙醇洗涤一次，室温干燥；30μL无菌水溶解，测浓度后保存于-20℃备用。

2.1.5 si-AY寡核苷酸序列

利用Ambion网站的插入序列设计工具软件设计出需要合成的寡核苷酸序列并在上海生工生物技术公司合成AY靶向序列。它们分别是：

5’-GATCCGGCCTCCCATCAAAGGTTTTTCAAGAGAAAACCTTTGATGGGAGGCCAGA-3’

3′-GCCGGAGGGTAGTTTCCAAAAAGTTCTCTTTTGGAAACTACCCTCCGGTCTTCGA-5’

每条链中包括与目的片断对应的一段回文序列，转录后其RNA能形成发夹结构。序列的上下游存在BamH I和HindIII位点以利于连接。将其分别溶解于退火溶液(20mM Tris，pH7.8，100mM NaCl，0.2mM EDTA)中至40pmol，各取10μL充分混合，75℃10分钟，然后慢慢冷却至室温，以备下一步连接。

2.1.6连接反应

连接反应体系

在16℃下连接10小时，连接产物直接用于转化。

2.1.7感受态细菌的制备

(1)将-80℃保存的大肠杆菌Top 10接种于无氨苄青霉素的LB平板上。

(2)挑取单克隆菌落到3.0mL无氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220r/min过夜。

(3)将一级培养菌液按2％的量接种于50mL新鲜LB液体培养基中，37℃，220r/min培养10h，使细菌进入对数生长期(OD为0.6左右)。

(4)将二级培养菌液分装到50mL离心管中，冰浴30min。4000rmp离心10min，弃上清。

(5)加7.5mL 0.1mol/L冷CaCl₂悬浮细菌。4000rmp，弃上清。

(6)加200μL 0.1mol/L冷CaCl₂悬浮细菌30min。制备好的感受态细菌分装100μL/EP管中，-70℃冰箱中保存。

2.1.8细菌转化

(1)将1-2μg质粒或连接产物(体积小于10μL)加入感受态细菌中，轻轻旋转离心管以混匀内容物，冰浴30min，促进DNA分子在感受态细菌表面的吸附。

(2)42℃热休克25s，通过热刺激增强CaCl₂的作用，使细胞膜产生通道，便于DNA分子的吸附进入，提高转化率。后迅速转入冰上冷却2-3min，修复细胞膜。

(3)无菌条件下加入1mL不含抗生素的LB培液，摇匀后37℃温箱培养45min以复苏细菌，使受体菌恢复正常生长状态，并且表达氨苄青霉素抗性基因。

(4)离心弃去部分上清，200μL菌液涂在含氨苄青霉素的LB平板上，将平板置于无菌台直至液体被吸收，37℃恒温培养箱倒置培养12-16h后观察结果，用于挑单克隆或保存于4℃。

2.1.9质粒瞬时转染

(1)在进行细胞转染前一天，将对数生长期细胞1-5×10⁵个接种到细胞培养皿中，培养24h以使转染时细胞融合达到60％-80％。

(2)取无菌的1.5mL EP管两支，分别平行配制转染试剂的无血清DMEM稀释液(每孔250 μL无血清DMEM和6-30μL转染试剂)和重组质粒的无血清DMEM稀释液(每孔250μL无血清DMEM和2-6μg重组质粒)，混合上述两管液体，轻轻混匀，室温静置20-30分钟，以形成转染复合体。

(3)孵育时，取出细胞培养板，弃去原有的细胞培养液，换上新鲜的细胞培养液。

(4)孵育结束后，将步骤2配制的转染复合体加入细胞培养皿中，混合均匀。

(5)37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育8h后，更换新鲜培养液，继续培养。

2.2实时荧光定量PCR(real-time)

反应体系

将样品加入Real-time PCR 96孔板(AXYGEN)中，在BIO-RAD IQ5中启动PCR反应，采用三步法进行反应：

三步法PCR扩增标准程序

实验结果分析：

反应结束后确认real-time PCR的扩增曲线和溶解曲线，分析Ct值，并进行琼脂糖凝胶电泳检测，验证目的条带的大小和特异性，以确定实验的准确性。

2.3琼脂滴实验(the agarose drop explants assay)

(1)将2％的琼脂糖在水浴中融化备用。

(2)取80％融合的细胞，用胰酶消化脱壁成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁶个细胞/mL，取10mL，离心弃上清，加入16.7μL 2％琼脂糖溶液，混匀制成0.3％琼脂糖细胞悬液。

(3)用加样器将1.5μL琼脂糖细胞悬液点入24孔培养板中，置4℃，30min冷却凝固，在显微镜下测量琼脂糖滴的半径(r)为基数。

(4)加入含10％血清的培养基，37℃培养24小时或48小时。琼脂滴中的肿瘤细胞可向周围作全方位移动，分别测量肿瘤细胞琼脂滴四个方位的半径值，计算平均值，以评价细胞的迁移能力。每组细胞记数5个琼脂滴，进行3次独立实验。拍照，取半个琼脂滴。

2.4蛋白提取及Western Blot

2.4.1样品制备

不同处理组的细胞培养一定时间后，弃去培养基，以预冷的PBS洗涤3次。再加入1mL预冷的PBS，用刮匙刮下细胞，转移到1.5mL EP管中，低温，3000rpm离心5分钟，尽可能的弃去液体。向EP管中加入相应体积的1×SDS蛋白裂解液，轻轻吹打混匀，-70℃保存。上样前，按1∶1加入2×SDS上样缓冲液(含5％β-巯基乙醇)。煮沸10min，即可上样或-70℃保存。

2.4.2 SDS-PAGE步骤

2.4.2.1 SDS-PAGE胶的制备

分离胶(10％)和浓缩胶(5％)的成分如前所示。分离胶混匀后灌入玻璃板间，以75％酒精封顶，注意使液面平直。凝胶完全聚合需10min左右，根据季节温度稍有不同。将分离胶上的75％酒精倒去，用滤纸小心吸干残留的酒精，加入混匀的浓缩胶，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合室温下需30min。

2.4.2.2上样及电泳

样品从-70℃取出后，室温平衡5min，12,000×g离心5min。取上清作SDS-PAGE分析，将样品加入胶孔中，并加入3μL蛋白标准品作参照。在电泳槽中加入250mL 1×电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端合适位置时停止。若用于初步观察，可以用考马斯亮兰染色进行鉴定蛋白的质量。

2.4.2.3转膜

蛋白样品转至PVDF膜上。具体步骤：根据上文中的配方配制转移缓冲液。切割与胶尺寸相符的PVDF膜，先放在甲醇里浸泡2min，然后转移到转移缓冲液浸泡，放置5min。准备6张滤纸将其浸泡在有转移缓冲液的容器中。电泳后，切取有用部分的胶，并很快地在转移缓冲液中洗涤。打开蛋白质转移槽的盖板，依次放入：用转移缓冲液浸泡过的滤纸3张；用转移缓冲液洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的所有气泡；PVDF膜；另3张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；小心地合上转移槽的盖板。插入电极，300mA恒流下转膜2-2.5h。

2.4.2.4封闭及免疫印记

将膜置于8％脱脂奶粉溶液中，置摇床上轻摇2h。一抗37℃孵育2h或4℃孵育过夜。去掉一抗溶液，并用PBST缓冲液洗膜6次，每次5min。将膜置于辣根过氧化酶标记的抗兔IgG二抗(1∶5000)或辣根过氧化酶标记的抗鼠IgG二抗(1∶10000)中，室温轻摇2h。去掉辣根过氧化酶标记的抗兔IgG二抗或抗鼠IgG二抗，并用PBST洗膜6次，每次5min。最后PVDF膜经ECLkits处理后，用自动凝胶成像仪检测特异性蛋白条带。

2.4.2.5 PVDF膜的脱膜处理

若已发过光的膜需要再孵育其他抗体，则将PVDF膜浸入脱膜液中，65℃或70℃水浴锅中振荡洗涤30min，以洗脱特异性抗体和二抗。然后在5％脱脂奶粉封闭液中缓慢摇动封闭1-4小时。后续操作同前，进行抗体孵育。

2.5流式细胞分析

(1)制备活性高的细胞悬液：将不同处理组的细胞用0.02％的EDTA消化下来，用消毒的PBS洗涤。

(2)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基调整细胞的浓度为5×10⁶～1×10⁷个/mL，通过细胞计数板来确定。

(3)取40μL细胞悬液置入另一EP管中，然后加入5μL含有fluoresceinisothiocyante(FITC)标记的整合素αV抗体，IgG抗体作为阴性对照，避光，置于4℃轻轻旋转1小时。

(4)用DPBS缓冲液洗涤2次，1000rpm，4℃离心5分钟。

(5)用500μL PBS重悬，然后立即用流式细胞仪分析，或者用1％多聚甲醛固定择期用流式细胞仪分析。

结果显示：长非编码RNA-AY927503调节人肝癌细胞的迁移，

(1)检测不同人肝癌细胞系中长非编码RNA-AY927503的表达

采用RT-PCR的方法，检测在多种人肝癌细胞系(SMMC-7721，BEL-7404，LM3，HepG，Huh-7，Hep3B)以及正常肝细胞株L02中长非编码RNA-AY927503的表达情况，结果显示，在SMMC-7721，BEL-7404，LM3，HepG，Huh-7，Hep3B这6种人肝癌细胞系中，有4种细胞的长非编码RNA-AY927503的表达高于正常肝细胞株L02中长非编码RNA-AY927503的表达，即SMMC-7721，HepG，Huh-7和Hep3B，占2/3；有2种细胞的长非编码RNA-AY927503的表达低于正常肝细胞株L02中长非编码RNA-AY927503的表达，即BEL-7404和LM3，占1/3，其中，SM MC-7721的长非编码RNA-AY927503的表达最高，LM3的长非编码RNA-AY927503的表达最低；

长非编码RNA-AY927503表达增多促进人肝癌细胞的迁移实验，

本实施例中构建长非编码RNA-AY927503全长的过表达质粒进一步研究长非编码RNA-AY927503对人肝癌细胞迁移的影响：将PCR、胶回收的长非编码RNA-AY927503全长片段用限制性内切酶EcoR I和Xba I酶切后，插入质粒载体pcDNA3.1-basic，在长非编码RNA-AY927503表达较低的BEL-7404和Hep3B细胞中，瞬时转染构建的重组质粒pcDNA3.1-basic-AY，转染相应的空载体质粒pcDNA3.1-basic作为对照，24h后，利用Trizol(Invitrogen)试剂盒提取细胞中总的RNA，RT-PCR检测不同处理的细胞中长非编码RNA-AY927503的表达情况，结果显示，与转染空载体pcDNA3.1-basic的BEL-7404细胞相比，转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY的BEL-7404中长非编码RNA-AY927503的表达显著升高，高于对照组3-4倍；同样，与转染空载体pcDNA3.1-basic的Hep3B细胞相比，转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY的Hep3B中长非编码RNA-AY927503的表达也显著升高，高于对照组2-3倍，说明本实验成功构建了长非编码RNA-AY927503全长的过表达质粒，重组质粒有较高的表达效率；

利用伤口愈合实验(wound healing)，转移培养皿实验(Transwell assay)和琼脂滴实验(the agarose drop explants assay)检测长非编码RNA-AY927503表达升高对人肝癌细胞迁移的影响，将BEL-7404和Hep3B接种于6cm细胞培养皿上，瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY，转染空载体质粒pcDNA3.1-basic作为对照，48h后，细胞的融合率达到80-90％时制造划痕。在0h，24h，36h，48h和72h，在相同的位置拍照，结果显示，在72h时，转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY的BEL-7404细胞，伤口愈合率显著高于转染空载体质粒pcDNA3.1-basic的BEL-7404细胞；在48h时，转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY的Hep3B细胞，伤口愈合率显著高于转染空载体质粒pcDNA3.1-basic的Hep3B细胞，结果显示，在人肝癌细胞细胞系中，长非编码RNA-AY927503的表达升高，其迁移能力增强，说明长非编码RNA-AY927503能促进人肝癌细胞的迁移；

用转移培养皿实验(Transwell assay)检测长非编码RNA-AY927503表达升高对人肝癌细胞迁移能力的影响，BEL-7404和Hep3B细胞中瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY作为处理组，转染空载体质粒pcDNA3.1-basic作为对照组，48h后，消化细胞，将用无血清培养基重悬的5×10⁴个细胞接种于转移培养皿小室的上室中，12h后，用结晶紫染色，计数迁移到下室中的细胞数目，结果显示，长非编码RNA-AY927503过表达的BEL-7404和Hep3B细胞，比对照组的细胞更多的迁移到转移培养皿小室的下室，两者之间有显著的差异，实验结果进一步说明，长非编码RNA-AY927503的表达升高，能促进人肝癌细胞的迁移。

本实施例采用另外一种方法——琼脂滴实验(the agarose drop explantsassay)。将瞬时转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY或空载体质粒pcDNA3.1-basic 48小时、融合率达到80％的BEL-7404和Hep3B细胞，消化离心，制成0.3％琼脂糖细胞悬液。取1.5μL琼脂糖细胞悬液点入24孔培养板中，4℃冷却凝固后，在显微镜下测量琼脂糖滴的半径为基数。加入含10％血清的培养基，37℃培养24小时或48小时后，在显微镜下分别测量肿瘤细胞琼脂滴四个方位的半径值。结果显示，转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY，即长非编码RNA-AY927503表达升高的BEL-7404和Hep3B细胞，比对照组细胞，向四周移动了更长的距离，提示其有更强的细胞迁移能力，说明长非编码RNA-AY927503的表达升高能促进人肝癌细胞的迁移。

本实验在Chp细胞株中，分别转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY，转染空载质粒pcDNA3.1-basic作为对照。伤口愈合实验(wound healing)的结果显示，Chp细胞株的迁移速度比相对应的Scramble细胞株的迁移速度显著下降；Chp细胞株中转染空载质粒pcDNA3.1-basic，其迁移能力没有改变；而Chp细胞株中转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY，其迁移能力得到显著提升；转移培养皿实验(Transwell assay)的结果也显示，迁移到转移小室的下室中的Chp细胞株，其数目明显少于迁移到下室中的Scramble细胞株，而在Chp细胞株中过表达长非编码RNA-AY927503后，与对照组相比，有更多的细胞迁移到下室，其迁移能力明显增强；琼脂滴实验(the agarose drop explants assay)也显示了相一致的结果；实验结果说明，脑硫脂的表达降低，减少了长非编码RNA-AY927503的表达，抑制了人肝癌细胞的迁移，外源表达长非编码RNA-AY927503后，细胞的迁移能力得到部分恢复；结果提示，脑硫脂可能通过长非编码RNA-AY927503调节人肝癌细胞的迁移。

本实验进一步构建了长非编码RNA-AY927503的特异性干扰质粒，将长非编码RNA-AY927503的特异性干扰寡核苷酸插入质粒载体pSilencer 4.1，经测序验证后，瞬时转 染长非编码RNA-AY927503表达较高的SMMC-7721和HepG2细胞，测定干扰效率，转染空载体质粒pSilencer 4.1作为对照，结果显示，与对照组相比，转染重组质粒pSilencer4.1-siAY的SMMC-7721和HepG2细胞，长非编码RNA-AY927503的表达显著下降，说明构建的重组质粒pSilencer 4.1-siAY能很好的降低长非编码RNA-AY927503的表达。

进一步，采用伤口愈合实验(wound healing)，转移培养皿实验(Transwellassay)和琼脂滴实验(the agarose drop explants assay)，检测细胞迁移能力：转染方法及之后的实验操作如前所述，结果显示，在伤口愈合实验(wound healing)中，转染重组质粒pSilencer4.1-siAY的SMMC-7721细胞，伤口愈合速率明显下降；在转移培养皿实验(Transwell assay)中，迁移到下室的转染重组质粒pSilencer 4.1-siAY的SMMC-7721细胞数目明显减少；在琼脂滴实验(the agarose drop explants assay)中，长非编码RNA-AY927503被重组质粒干扰表达下降后，向四周迁移的能力显著下降，结果说明，长非编码RNA-AY927503表达降低抑制人肝癌细胞的迁移。

进一步，对SMMC-7721细胞采取四种不同的处理：1.半乳糖基神经酰胺(Gal-Cer)；2.脑硫脂(Sulfatide)；3.脑硫脂(Sulfatide)处理的同时瞬时转染空载质粒pSilencer4.1；4.脑硫脂(Sulfatide)处理的同时瞬时转染重组质粒pSilencer 4.1-siAY，药物处理的浓度均为2μM，药物处理时间和瞬时转染时间均为48h，伤口愈合实验(woundhealing)，转移培养皿实验(Transwell assay)和琼脂滴实验(the agarose dropexplants assay)检测细胞迁移能力的实验结果均显示，外源性的脑硫脂能显著促进人肝癌细胞的迁移；外源性的脑硫脂与空载质粒pSilencer 4.1同时作用细胞，脑硫脂对细胞迁移的促进作用不发生改变；但是，当在脑硫脂处理的细胞中同时转染重组质粒pSilencer4.1-siAY时，由于长非编码RNA-AY927503被干扰，表达下降，与对照组相比，细胞的迁移能力显著下降，结果说明，长非编码RNA-AY927503表达降低消除了外源性的脑硫脂对人肝癌细胞迁移的促进作用，提示脑硫脂可能通过长非编码RNA-AY927503调节人肝癌细胞的迁移。

进一步，选用CST过表达稳定转染的SMMC-7721细胞株(CST8)，转染重组质粒pSilencer 4.1-siAY，干扰长非编码RNA-AY927503的表达，仍让采用上述三种实验方法检测细胞的迁移能力，结果与前述一致，CST8细胞株的迁移能力显著高于其对照细胞株Mock；但是，在CST8细胞株中转染重组质粒pSilencer 4.1-siAY后，其迁移能力显著下降，说明长非编码RNA-AY927503表达降低消除了内源性的脑硫脂对人肝癌细胞迁移的促进作用；以上结果均提示脑硫脂能通过长非编码RNA-AY927503调节人肝癌细胞的迁移。

本实验进一步检测了53例肝癌病人的癌旁组织和癌组织中，长非编码RNA-AY927503 的表达情况，用固定组织RNA提取试剂盒(CWBIO)抽提保存完好的石蜡包埋的病人组织中总的RNA，逆转录合成cDNA后，进行实时荧光定量PCR(real time-PCR)反应，结果经统计分析后显示，在53例病人中，有36例病人的癌组织中长非编码RNA-AY927503的表达高于癌旁组织，占总体标本的67.92％；有17例病人的癌组织中长非编码RNA-AY927503的表达低于癌旁组织，占总体标本的32.08％；肝癌组织中长非编码RNA-AY927503的表达水平高于癌旁组织，Mann Whitney统计学检验证明两者之间具有显著的差异(P＜0.001)。

进一步检测在不同转移潜能的细胞株中长非编码RNA-AY927503的表达情况，选用了高转移肝癌细胞株MHCC97H和低转移肝癌细胞株MHCC97L，real time-PCR的结果显示，与低转移肝癌细胞株MHCC97L相比，在高转移肝癌细胞株MHCC97H中，有更高的长非编码RNA-AY927503的表达，说明长非编码RNA-AY927503的表达与转移潜能有关；采用Pearson χ²检验，分析长非编码RNA-AY927503与整合素αV表达的相关性，结果显示，长非编码RNA-AY927503与整合素αV的表达有显著的相关性，p＜0.05。

本实验在BEL-7404和Hep3B细胞(两者长非编码RNA-AY927503的表达量较低)中，瞬时转染长非编码RNA-AY927503过表达质粒——pcDNA3.1-basic-AY，转染相应空载体作为对照，real time-PCR检测长非编码RNA-AY927503以及整合素αV的mRNA表达结果显示，在两种细胞中，转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY的细胞与对照组相比长非编码RNA-AY927503的表达量均升高10倍左右；并且，整合素αV的mRNA表达均升高2-3倍，结果说明，长非编码RNA-AY927503表达升高能在RNA水平促进整合素αV的表达。

本实验进一步检测整合素αV的表达在蛋白水平发生的变化，在BEL-7404和Hep3B细胞中转染重组质粒pcDNA3.1-basic-AY或空载质粒pcDNA3.1-basic后，提取细胞中的总蛋白，western blot结果显示，无论在BEL-7404细胞中，还是在Hep3B细胞中，当长非编码RNA-AY927503的表达升高时，整合素αV的表达也显著升高，说明长非编码RNA-AY927503能促进整合素αV的表达；

本实验在长非编码RNA-AY927503表达较高的SMMC-7721和HepG2两种细胞中，瞬时转染长非编码RNA-AY927503干扰质粒——pSilencer 4.1-siAY，转染相应的空载体pSilencer 4.1作为对照，real time-PCR结果显示，干扰质粒pSilencer 4.1-siAY有效的降低了SMMC-7721和HepG2中长非编码RNA-AY927503的表达，同时，两种细胞中整合素αV的mRNA表达也显著下降，说明长非编码RNA-AY927503表达下降能在RNA水平抑制整合素αV的表达；

本实验在SMMC-7721和HepG2细胞中瞬时转染干扰质粒pSilencer 4.1-siAY或空载质粒pSilencer 4.1，western blot的结果显示，当长非编码RNA-AY927503被干扰表达下降时，整合素αV的表达也受到了抑制，在SMMC-7721细胞中同样转染上述两种质粒，免疫荧光(immunofluorescence)染色发现，转染干扰质粒pSilencer 4.1-siAY的细胞中标记整合素αV的绿色荧光强度明显弱于转染空载质粒pSilencer 4.1的细胞，说明整合素αV在细胞膜上的表达分布减少，流式细胞术(flow cytometey analysis)的实验结果显示出相一致的趋势。

本实验中，在SMMC-7721和HepG2两种细胞中，进行下列4种处理：1.半乳糖基神经酰胺(Gal-Cer)；2.脑硫脂(Sulfatide)；3.脑硫脂(Sulfatide)处理的同时瞬时转染空载质粒pSilencer 4.1；4.脑硫脂(Sulfatide)处理的同时瞬时转染重组质粒pSilencer4.1-siAY。药物处理的浓度均为2μM，药物处理时间和瞬时转染时间均为24h，然后进行realtime-PCR实验，结果显示，在SMMC-7721和HepG2两种细胞中，外源性的脑硫脂(Sulfatide)能均显著提高长非编码RNA-AY927503和整合素αV的表达，这与之前的实验结果相符合；同时转染空载质粒pSilencer 4.1不能改变两者的表达量；但是，脑硫脂(Sulfatide)处理细胞的同时转染重组质粒pSilencer4.1-siAY，不仅长非编码RNA-AY927503的表达显著下降，同时显著下降的还有整合素αV的表达，结果提示，脑硫脂能通过长非编码RNA-AY927503在RNA水平调节整合素αV的表达。

本实验进一步在蛋白水平验证上述观点，在SMMC-7721和HepG2两种细胞中进行上述相同的4种处理，药物处理的浓度均为2μM，药物处理时间和瞬时转染时间均为48h，western blot的结果显示，外源性的脑硫脂(Sulfatide)显著提高了整合素αV的蛋白表达水平；脑硫脂(Sulfatide)处理并且同时转染空载质粒pSilencer 4.1的细胞与只用脑硫脂(Sulfatide)的细胞，两者整合素αV的表达量几乎相同；但是即使在脑硫脂处理的细胞中，当长非编码RNA-AY927503被干扰而表达下降时，整合素αV的表达也受到了抑制；在SMMC-7721细胞中，采用相同的处理方法，利用免疫荧光(immunofluorescence)和流式细胞术(flow cytometey analysis)，检测在脑硫脂处理的细胞中，当长非编码RNA-AY927503表达被干扰时，是否能消除脑硫脂对整合素αV表达的促进作用，免疫荧光(immunofluorescence)的实验结果显示，转染干扰质粒pSilencer 4.1-siAY的脑硫脂处理的细胞，相比较转染空载质粒pSilencer 4.1的脑硫脂处理的细胞，整合素αV的表达显著下降，流式细胞术(flow cytometey analysis)的实验结果显示出相同的趋势；以上实验结果说明，外源性的脑硫脂能通过长非编码RNA-AY927503在蛋白水平调节整合素αV的表 达；

进一步，选用CST过表达稳定转染的SMMC-7721细胞株(CST8)以及相应的对照细胞株(Mock)，采用real time-PCR，western blot和免疫荧光(immunofluorescence)的方法，检测整合素αV的表达，结果显示，无论在RNA水平还是蛋白质水平，CST8细胞株中整合素αV的表达显著高于Mock细胞株；当在CST8细胞株中瞬时转染干扰质粒pSilencer4.1-siAY后，与转染空载质粒pSilencer 4.1的CST8细胞株相比，整合素αV的表达显著下降；以上结果提示，内源性的脑硫脂也能通过长非编码RNA-AY927503调节整合素αV的表达；

本发明进行了长非编码RNA-AY927503通过整合素αV调节人肝癌细胞迁移实验，对BEL-7404细胞进行下面三种处理：1.只转染空载质粒pcDNA3.1-basic；2.转染长非编码RNA-AY927503的过表达质粒pcDNA3.1-basic-AY；3.共同转染过表达pcDNA3.1-basic-AY以及整合素αV的干扰质粒si Integrin αV；伤口愈合实验(wound healing)和转移培养皿实验(transwell assay)的结果显示，在转染过表达pcDNA3.1-basic-AY的细胞中，由于长非编码RNA-AY927503的表达升高，BEL-7404细胞的迁移能力增强，这与之前的结果相符合；然而，当转染过表达质粒pcDNA3.1-basic-AY的细胞中共同转染整合素αV的干扰质粒siIntegrin αV时，虽然长非编码RNA-AY927503的表达升高，并且刺激了整合素αV的表达，但由于干扰质粒si Integrin αV的作用，整合素αV的表达下降，细胞的迁移能力也出现下降，结果提示，长非编码RNA-AY927503可能通过调节整合素αV的表达调节人肝癌细胞的迁移。

本实验结果表明，脑硫脂能促进长非编码RNA-AY927503的表达，长非编码RNA-AY927503通过某种机制，调节整合素αV的表达，进而影响人肝癌细胞的迁移。

实施例3长非编码RNA AY927503调节整合素αV的启动子实验

(一)材料和方法

1.材料

1.1原位杂交

使用武汉博士德生物工程有限公司(BOSTER)的敏感性加强型原位杂交检测试剂盒II(碱性磷酸酶)(Enhanced Sensitive ISH Detection Kit II(AP))。

各种缓冲液：

3％柠檬酸：100mL蒸馏水中加柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)3g，PH 2.0左右。

2×SSC：1000mL蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠(C₆H₅O₇Na₃·2H₂O，分子量294)8.8g。

0.5×SSC：300mL蒸馏水加100mL 2×SSC即可。

0.2×SSC：270mL蒸馏水加30mL 2×SSC即可。

20％甘油：20mL甘油加80mL蒸馏水即可。

0.5M TBS：1000mL蒸馏水加氯化钠30g，TRIS 1.2g，纯乙酸0.4-0.5mL，PH 7.2-7.6。

0.01M TBS(PH9.0-9.5)：1000mL蒸溜水中加NaCl 9g，Tris 1.2g。

多聚赖氨酸购自上海普飞生物技术有限公司。

DEPC购自上海生工生物技术公司。

FITC-AVIDIN购自Invitrogen公司。

生物素标记的探针由上海生工生物技术公司合成，序列如下：

5’-AAATGCATCGAGCAGTGAGAGTCCATTTAGGAAGGGGCTTATGAGGGTAAG-3’

1.2荧光素酶实验

pGL3-Basic载体购自Promega公司。

荧光素酶报告基因试剂盒购自Promega公司。

化学光度计(Lumat LB 9507，Berthold，Germany)。

1.3RNA pull-down

限制性内切酶EcoR I购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)公司。

Biotin RNA Labeling Mix，10×conc.以及T7RNA Polymerase购自Roche公司。

Recombinant RNase inhibitor购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)公司。

RIPA buffer：0.25mL 1M Tris HCl(PH 8.0)，0.6mL 1M NaCl，0.25mL 10％NP-40，5μL 10μg/mL apntinm，0.2mL 50mM PMSF，5μL 1mM NaVO₄，0.5mL 1M NaF，3.2mL ddH₂O。

Buffer 1：5.62g Maleic acid，8.7g NaCl，加入蒸馏水定容至1L。

Northern block：10mL 10％Blocking Reagent，100mL Buffer 1。

Protease inhibitor cocktail购自MILLIPORE公司。

1.4 RIP(RNA immunoprecipitation)

SDS Lysis Buffer：1％SDS，10mM EDTA，50mM Tris(PH 8.0)，由DEPC水配制。

Magna RIP RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit购自MILLIPORE公司。

1.5 RNA-DNA Interaction

甲醛溶液购自中国医药集团上海化学试剂有限公司。

hybridization buffer：50％formamide；2×SSC；1×Denhardt’s solution；5％dextran sulfate； 10mM EDTA；0.01％Tween 20。

Formamide，Tween 20购自中国医药集团上海化学试剂有限公司。

Denhardt’s solution购自北京索宝生物科技有限公司。

dextran sulfate购自北京华迈科生物技术有限责任公司。

2.方法

2.1原位杂交

(1)玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。

(2)细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5％的CO₂，细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。

(3)培养细胞可用下述方法固定：固定液为4％多聚甲醛/0.1M PBS(PH7.2-7.4)，含有1/1000DEPC。室温固定20-30分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。

(4)暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3％柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1mL 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀)，37℃或室温消化5-120秒钟。有时也可以不消化。0.5M TBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。

(5)预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20％甘油20mL以保持湿度。按每张切片20μL加预杂交液。恒温箱37-40℃，2-4小时。吸取多余液体，不洗。

(6)杂交：用杂交稀释液稀释生物素标记的寡核苷酸探针，浓度一般0.5-2μg/mL。按每张切片加20μL杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭掉后，盖在切片上。恒温箱37-40℃杂交过夜。

(7)杂交后洗涤：去掉盖玻片，30-37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；0.5×SSC洗涤15分钟×1次；0.2×SSC洗涤15分钟×1次。必要时可重复0.2×SSC洗涤1次。

(8)滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗。

(9)滴加SABC-AP：37℃30分钟。0.5M TBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。

(10)BCIP/NBT显色：BCIP/NBT(×20)按1∶20的比例用0.01M TBS(PH9.5)稀释，混匀。显色液加至标本上。一般30-37℃显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。充分水洗。

(11)必要时核固红复染5-15分钟，水洗。

(12)水溶性封片剂封片。

2.2荧光素酶报告基因检测

SMMC-7721、Hela或HEK-293T细胞共转染pGL3-basic-αV promoter质粒和pSilencer4.1-siAY或pcDNA3.1-basic-AY质粒，相应的空载体分别作为对照。荧光素酶的活性使用Luciferase Assay kit(Promega)试剂盒进行检测，实验过程参照试剂盒说明书。至少三次独立的实验被重复取平均值。以下实验过程以HEK-293T细胞为例，其他细胞做法类似。

2.2.1转染过程

同上述瞬时转染过程。

2.2.2检测过程

(1)收集和裂解细胞：在96孔板中的细胞转染24h后，吸去旧的培养基，用消毒的PBS清洗两次，每孔细胞加入50μl的Cell Culture Lysis Reagent，室温下在96孔板振荡器上轻微振摇15min。

(2)用枪头反复吹打每个孔中的细胞，使细胞充分裂解，然后孵育在冰上。

(3)取10μL细胞裂解液上清转移到白色透光的200μL的小EP管中，然后快速加入15μL的LAR II(Luciferase Assay Reagent II)；并在小EP管中吹打均匀，用阅读仪测量可见光强度10s；记录下所得到的数据，标准化后进行分析。每组数据独立重复三次。

2.3RNA pull-down

2.3.1单链pcDNA3.1-basic-AY模板制备

(1)将长非编码RNA-AY927503全长构建到pcDNA3.1-basic载体上，这一部分工作已经在第二部分的实验中完成。

(2)限制性内切酶EcoR I酶切质粒pcDNA3.1-basic-AY，4h，制备长非编码RNA-AY927503正链模板，酶切体系如下：

(3)纯化酶切质粒：

A.在上述酶切体系中，加入等体积(即50μL)的氯仿∶苯酚(1∶1)，轻轻摇晃15s，禁止使用涡旋振荡器，室温静置5min，可瞬离，取上层水相置另一新EP管中。

B.加入等体积(即50μL)的氯仿，轻轻摇晃15s，禁止使用涡旋振荡器，室温静置5min，可瞬离，取上层水相置另一新EP管中。

C.加入1/10体积(即5μL)的3M醋酸钠，混匀。

D.加入两倍体积(即110μL)的预冷的无水乙醇，混匀。

E.-20℃孵育1h。

F.4℃，12,000rpm离心15min，小心移除上清。

G.加入500μL 75％酒精洗沉淀。4℃，12,000rpm离心5min，小心移除上清。

H.空气中充分晾干，大约需要1小时。TE buffer溶解质粒，并测定质粒的浓度。

2.3.2长非编码RNA-AY927503生物素标记

以上述酶切纯化的单链pcDNA3.1-basic-AY模板，制备生物素标记的全长长非编码RNA-AY927503，反应体系如下：

(1)将上述反应体系混匀后，瞬离，37℃孵育2h。

(2)加入2μL0.2M EDTA，终止反应。

2.3.3产物纯化

(1)加入2.5μL 4mol/L LiCl，75μL预冷的无水乙醇。

(2)-20℃孵育2h。

(3)4℃，12,000rpm离心10min，小心移除上清。

(4)加入50μL预冷的70％酒精。4℃，12,000rpm离心10min，小心移除上清。

(5)充分干燥后，加入100μL DEPC H₂O，1μL Recombinant RNase inhibitor，37℃，30min。测定浓度。

2.3.4蛋白样品制备

(1)10cm皿培养的细胞，培养一段时间后，弃去培养基，冰PBS洗两遍，冰上操作。

(2)加入1mL预冷的PBS，用刮匙刮下细胞，转移到1.5mL EP管中，低温，3000rpm离心5分钟，尽可能的弃去液体。

(3)加入1mL RIPA buffer，10μL Protease inhibitor cocktail，冰上放置5min，使细胞充分裂 解，-80℃保存。

2.3.5RNA pull-down

(1)洗涤珠子：取20μL亲和素结合的珠子，加入100μL RIPA buffer，充分混匀，3000rpm离心1min，小心弃掉上层液体，留下珠子。

(2)预澄清：在珠子中加入1mL细胞裂解液，4℃旋转1h。3000rpm离心1min，小心将上层液体转移到新的EP管中。

(3)加入探针：将预澄清之后的细胞裂解液，每300μL分成一组，共分为3组，分别进行下列处理：1.加入3μg生物素标记的全长长非编码RNA-AY927503探针；2.不加任何探针；3.加入3μg生物素标记的无意义探针。每种处理中均加入7.5μL Recombinant RNaseinhibitor。剩余的100μL细胞裂解液留作Input。

(4)pull-down：4℃旋转2h。

(5)封闭珠子：取120μL珠子，加入600μL RIPA buffer，充分混匀后，3000rpm离心1min，弃掉上层液体，留下珠子。再加入120μL Northern block，4℃旋转1h，然后将其均分成3个EP管，每管40μL，3000rpm离心1min，弃掉上层液体，留下封闭好的珠子。

(6)加入珠子：在3管珠子中，分别加入步骤3、4中的三个处理组样品，4℃旋转1h。

(7)洗涤：每个EP管中加入400μL新消毒的PBS，4℃旋转10min，3000rpm离心1min，弃掉上层液体。

(8)重复步骤7两次。

(9)加入40μL 2×loading buffer，煮沸5min，立即进行western blot，或是冻于-80℃保存

2.4 RIP(RNA immunoprecipitation)

步骤参考MILLIPORE公司的Magna RIP RNA-Binding ProteinImmunoprecipitation Kit，具体步骤如下：

2.4.1裂解细胞

(1)准备RIP Lysis Buffer：100μL RIP Lysis Buffer中加入0.5μL proteaseinhibitor，加入0.25μL RNase inhibitor。

(2)两个10cm培养皿培养的细胞，用冰PBS洗两遍。

(3)加入1mL PBS，用刮匙刮下细胞，转移到1.5mL EP管中，4℃，1500rpm离心5分钟，尽可能的弃去液体。

(4)加入100μL准备好的RIP Lysis Buffer，用枪头上下混匀，冰上孵育5min。若液体仍然浑浊，则采用超声的方法破碎裂解细胞，直至液体澄清，然后14,000rpm离心10min，取上清。保存在-80℃冰箱。

2.4.2准备免疫沉淀的磁珠

(1)上下颠倒，充分混匀重悬磁珠。

(2)取2个EP管，分为目标抗体组和阴性对照组，每组EP管中各加入50μL充分混匀的磁珠。

(3)磁珠中加入500μL RIP Wash Buffer，简单涡旋混匀，将EP管置于磁力分离器上，待磁珠聚集后，弃去上清。

(4)重复步骤3。

(5)每管加入100μL RIP Wash Buffer重悬珠子，其中一个EP管中加入5μg目的抗体，另一EP管中加入5μg阴性对照抗体。室温旋转孵育30min。

(6)将EP管置于磁力分离器上，待磁珠聚集后，弃去上清。

(7)加入500μL RIP Wash Buffer，简单涡旋混匀，将EP管置于磁力分离器上，待磁珠聚集后，弃去上清。

(8)重复步骤7两次。

2.4.3 RNA与蛋白形成复合物并沉淀下来

(1)准备RIP Immunoprecipitation Buffer，每组需要900μL，900μL RIPImmunoprecipitation Buffer＝35μL 0.5M EDTA+5μL RNase inhibitor+860μL RIP WashBuffer。

(2)在步骤2.4.2弃去上清留下的珠子-抗体复合物中，每管加入900μL RIPImmunoprecipitation Buffer。

(3)加入步骤2.4.1中的100μL细胞裂解液。

(4)留取10μL作为Input，冻回-80℃冰箱。

(5)其余4℃旋转孵育3h。

(6)将EP管置于磁力分离器上，待磁珠聚集后，弃去上清。

(7)加入500μL RIP Wash Buffer，4℃旋转10min，将EP管置于磁力分离器上，待磁珠聚集后，弃去上清。

(8)重复步骤7五次。共洗六次。

2.4.4 RNA纯化

(1)准备蛋白酶K Buffer，每管需150μL，150μL蛋白酶K Buffer＝117μL RIP WashBuffer+15μL 10％SDS+18μL 10mg/mL蛋白酶K。

(2)在步骤2.4.3洗涤完全的珠子中，加入150μL蛋白酶K Buffer，重悬。

(3)在步骤2.4.3留取的Input中，加入150μL蛋白酶K Buffer。

(4)55℃振荡孵育30min。

(5)将EP管置于磁力分离器上，待磁珠聚集后，将上清转移到新的EP管中，加入250μL RIP Wash Buffer。

(6)加入400μL苯酚∶氯仿∶异戊醇＝125∶24∶1，涡旋15s，室温，14,000rpm，离心10min。

(7)将350μL上层水相转移至新的EP管中，加入400μL氯仿，涡旋15s，室温，14,000rpm，离心10min。

(8)将300μL上层水相转移至新的EP管中.

(9)每管加入50μL Salt Solution I，15μL Salt Solution II，5μL PrecipitateEnhancer，850μL无水乙醇，混匀，-80℃，1h～过夜，沉淀RNA。

(10)4℃，14,000rpm，离心30min。小心弃上清。

(11)加入80％酒精洗沉淀，4℃，14,000rpm，离心15min。小心弃上清。空气中晾干。

(12)加入10～20μL RNase-free water。

2.5 RNA-DNA Interaction

2.5.1交联

(1)加入浓度37％的甲醛溶液，使得甲醛溶液的终浓度为1％。室温混匀，放置10min。

(2)加入1.25M甘氨酸溶液，使得甘氨酸的终浓度为0.125M。室温混匀，放置5min。

(3)尽可能的弃去培养基，冰PBS洗两遍，再加入1mL PBS，将细胞刮至1.5mL EP管中，4℃，2000rpm，离心5min。

(4)弃上清，4个10cm培养皿的细胞量加入500μL SDS Lysis Buffer。

(5)充分混匀裂解后，留取50μL作为unshear，其余的细胞裂解产物可冻于-80℃保存。

2.5.2超声

(1)超声采用60W，10s超声，30s间隙，共10～20次。

(2)2％琼脂糖凝胶电泳检测超声结果，与unshear对照，拖带200-700左右为最佳。

(3)4℃，12,000rpm，离心10min。将上清转移至新的EP管中。

2.5.3提取细胞裂解液中的总DNA/RNA

(1)以500μL细胞裂解液为例，加入等体积(500μL)的水平衡苯酚，于室温轻轻摇荡2min，与细胞裂解液充分混匀，细胞DNA形成白色丝状沉淀。

(2)室温，2000rpm离心5min，有机相和水相分层，两相之间可见致密的DNA层。

(3)将上层水相和两相之间的DNA转移至新的EP管，加入等体积(500μL)的苯酚∶氯仿(1∶1)，上下轻轻震荡15s，禁止使用振荡器，室温静置5min，取上层水相至另一新的EP管。

(4)加入等体积(500μL)的氯仿，上下轻轻震荡15s，禁止使用振荡器，室温静置5min，取上层水相至另一新的EP管。

(5)加入1.5倍体积(750μL)异丙醇，轻轻摇晃混匀，-20℃静置1h。

(6)室温，12,000rpm离心10min，小心弃上清。

(7)轻轻加入1mL预冷的75％乙醇，室温，12,000rpm离心5min，小心弃上清。

(8)晾干后，加入40～50μL DEPC水溶解，

2.5.4 RNA-DNA杂交

(1)洗珠子：充分混匀珠子后取30μL，加入300μL hybridization buffer，涡旋混匀，3000rpm离心1min，弃掉杂交液。

(2)预澄清：离心留下的珠子中加入270μL hybridization buffer，40μL提取的DNA/RNA混合物。4℃，震摇1h，3000rpm离心1min，将上清转移到新的EP管中。

(3)分组：将预澄清之后的液体，每100μL分成一组，共分为3组，分别进行下列处理：1.加入3～5μg生物素标记的长非编码RNA-AY927503探针；2.不加任何探针；3.加入3～5μg生物素标记的无意义探针。剩余的10μL DNA/RNA混合液留作Input。

(4)杂交：37℃，震摇过夜。

(5)封闭珠子：取150μL珠子，加入500μL hybridization buffer，1mg/mL BSA，0.2mg/mL yeast tRNA，4℃，震摇1h，均分成3个EP管后，3000rpm离心1min，弃上清。

(6)加入珠子：在各个有珠子的EP中，加入步骤3、4的三种处理样品，4℃旋转6h。

(7)洗涤：30-37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；0.5×SSC洗涤15分钟×1次；0.2×SSC洗涤15分钟×2次。

(8)洗脱：加入NaCl，终浓度为0.2M，75℃，5min，吸取上清为核酸样品。

结果显示：

(1)长非编码RNA-AY927503的亚细胞定位

在SMMC-7721细胞中，大多数的长非编码RNA-AY927503位于细胞质中，但是，仍有一部分的长非编码RNA-AY927503位于细胞核中，不仅如此，用脑硫脂(sulfatide)处理SMMC-7721细胞后，相比于用半乳糖基神经酰胺(Gal-Cer)处理的细胞，细胞核中的长非编码RNA-AY927503明显增多，无论是碱性磷酸酶检测系统，还是免疫荧光染色，均显示此结果；

(2)长非编码RNA-AY927503调节整合素αV的启动子

荧光素酶报告结果显示，pGL3-Basic-αV promoter(-1295/+207)具有较强的启动子活性；长非编码RNA-AY927503表达升高时，整合素αV启动子(-1295/+207)的活性增强；长非编码RNA-AY927503表达降低时，整合素αV启动子(-1295/+207)的活性减弱，说明长非编码RNA-AY927503能在整合素αV启动子的-1295～+207区域发挥调节后者转录活性的作用，但是，将整合素αV启动子被截断后，只剩-795～+207区域的片段，即转染重组质粒pGL3-Basic-αV promoter(-795/+207)，其他的转染质粒不变，荧光素酶报告结果发现，长非编码RNA-AY927503不能调节-795～+207区域的整合素αV的启动子活性，说明，长非编码RNA-AY927503的调节作用的发挥是在整合素αV的启动子的-1295～-795区域；不仅如此，当SMMC-7721和HEK-293T细胞中，转染重组质粒pGL3-Basic-αV promoter(-1295/+207)的同时，用半乳糖基神经酰胺(Gal-Cer)或脑硫脂(sulfatide)处理，或是转染过表达质粒pcDNA3.1-basic-AY或干扰质粒pSilencer 4.1-siAY，荧光素酶报告结果发现，脑硫脂能增强整合素αV启动子的活性，但是当长非编码RNA-AY927503表达被干扰后，这种增强作用消失；

实验结果表明：长非编码RNA-AY927503对整合素αV启动子的调节，是通过与其直接结合，而非通过与某种转录因子相结合。

Claims (5)

1.长非编码RNA AY927503在制备肝癌转移评估和防治的制剂中的用途；

所述的长非编码RNA-AY927503直接结合整合素αV的启动子，调节整合素αV转录活性，影响细胞的行为。

2.按权利要求1的用途，其特征在于，所述的长非编码RNA-AY927503 作为人肝癌细胞的靶标分子。

3.按权利要求2的用途，其特征在于，所述的长非编码RNA-AY927503表达升高促进人肝癌细胞的迁移，长非编码RNA-AY927503表达降低抑制人肝癌细胞的迁移。

4.按权利要求2或3的用途，其特征在于，所述的长非编码RNA-AY927503的表达降低，消除外源性的脑硫脂对人肝癌细胞迁移的促进作用。

5.按权利要求2或3的用途，其特征在于，所述的长非编码RNA-AY927503 的表达降低，消除内源性的脑硫脂对人肝癌细胞迁移的促进作用。

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