CN110408698B - 肝癌的新诊治标志物lncRNA-LALR1及应用 - Google Patents

肝癌的新诊治标志物lncRNA-LALR1及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110408698B
CN110408698B CN201910524048.5A CN201910524048A CN110408698B CN 110408698 B CN110408698 B CN 110408698B CN 201910524048 A CN201910524048 A CN 201910524048A CN 110408698 B CN110408698 B CN 110408698B
Authority
CN
China
Prior art keywords
lncrna
lalr1
liver cancer
expression
diagnosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910524048.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110408698A (zh
Inventor
毛琳泓
李晓琴
何松
周智航
冉涛
胥峰
陈治吉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Original Assignee
Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University filed Critical Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University
Priority to CN201910524048.5A priority Critical patent/CN110408698B/zh
Publication of CN110408698A publication Critical patent/CN110408698A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110408698B publication Critical patent/CN110408698B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及肿瘤标志物，具体涉及一种肝癌的新诊治标志物及其应用，更具体的涉及lncRNA‑LALR1在诊治肝癌中的应用。本发明利用生物信息学分析探究证实了lncRNA‑LALR1与肝癌具有很好的相关性，为肝癌的临床诊治提供了新的诊治标志物，具有重要的临床意义。

Description

肝癌的新诊治标志物lncRNA-LALR1及应用
技术领域
本发明涉及肿瘤标志物，具体涉及一种肝癌的新诊治标志物及其应用，更具体的涉及lncRNA-LALR1在诊治肝癌中的应用。
背景技术
肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是恶性程度最高的肿瘤之一，死亡率极高。HCC是世界上第五大常见肿瘤之一，是癌症相关死亡的第二大常见原因，每年导致近74.5万人死亡。我国是HCC高发国家，HCC的发病率及死亡率均位居前三。虽然HCC的诊疗技术不断提高，但目前HCC的疗效依然很差。长链非编码RNA(Long noncoding RNAs，LncRNAs)是目前肿瘤研究的热点，但lncRNA在HCC发生发展中的作用及机制尚未阐明。
长链非编码RNA(Longnoncoding RNAs，LncRNAs)是一类长度大于200nt的非编码RNA。最近的研究揭示了LncRNA和肿瘤之间的关系：MEG-3、MALAT1、HULC、HOTAIR、H19等lncRNA在包括HCC在内的多种肿瘤中表达失调，调控细胞增殖、凋亡、上皮间质转化、侵袭转移、自噬等。lncRNA通过与DNA、RNA以及蛋白等结合调控靶分子的表达和功能，能够在转录水平及转录后水平发挥作用。在转录水平，lncRNA能够通过与转录复合物或者启动子区直接结合或者调节染色质结构调控基因转录。在转录后水平，lncRNA既能够调节mRNA稳定性、剪切、修饰，还能够调节蛋白质稳定性和mRNA翻译。国际知名杂志Hepatology发表的一项研究表明，肝脏再生相关lncRNA(An LncRNAAssociatedwith Liver Regeneration，lncRNA-LALR1)能够通过促进肝再生过程中的周期进程促进肝细胞增殖，但在HCC中的作用不清。
本发明利用生物信息学方法分析研究探讨了lncRNA-LALR1在HCC发生发展过程中的作用及分子机制，lncRNA-LALR1在HCC诊断及治疗方面的作用，为后续深入研究提供实验基础及研究方向，有望为肝癌的诊断和治疗提供新的策略。
发明内容
本发明的一个目的在于提供lncRNA-LALR1在制备肝癌诊断或预后预测产品中的应用。
为了实现上述技术目的，本发明首先对lncRNA-LALR1(基因序列如SEQ IDNo.8所示)在肝癌及旁癌组织中的表达进行研究，发现lncRNA-LALR1在肝癌组织中的表达高于对应癌旁组织；进一步对lncRNA-LALR1在
Huh7,HepG2,SK-Hep1,SMMC-7721,PLC/PRF/5,
MHCC-97H等六种肝癌细胞中的表达进行研究，发现lncRNA-LALR1在六种肝癌细胞中均具有表达；进一步对lncRNA-LALR1进行定位，发现lncRNA-LALR1主要表达于细胞核及核膜周围；进一步对lncRNA-LALR1对肝癌细胞生物学行为的影响进行研究，发现lncRNA-LALR1能够促进肝癌细胞的恶性表型；进一步对敲低lncRNA-LALR1后表达谱的变化进行研究，发现敲低lncRNA-LALR1后，转录调节信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路显著变化，敲低lncRNA-LALR1能显著下调SNORD72和ID2的表达；进一步对lncRNA-LALR1与SNORD72的相互作用进行研究，发现SNORD72在肝癌组织中的表达与分化程度负相关，分化程度越低，SNORD72的表达越高，且SNORD72在肝癌组织中的表达显著高于对应的癌旁组织。根据以上研究结果，可以初步将lncRNA-LALR1作为肝癌的标志物，用于肝癌的诊断或预后预测。
本发明提供了lncRNA-LALR1在制备肝癌诊断或预后预测产品中的应用。
进一步地，本发明提供了检测lncRNA-LALR1表达的试剂在制备肝癌诊断或预后预测产品中的应用。
进一步地，所述检测lncRNA-LALR1表达的试剂包括使用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测lncRNA-LALR1表达量时使用的PCR扩增引物。
在本发明的实施例中，所述PCR扩增引物包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F具有如SEQ ID No.1所示的序列，所述反向引物R具有如SEQ IDNo.2所示的序列。
进一步地，所述检测lncRNA-LALR1表达的试剂包括但不限于检测SNORD72表达或ID2表达的试剂。
本发明还提供了一种用于肝癌诊断或预后预测的产品，所述产品包括上述检测lncRNA-LALR1表达水平的试剂。
进一步地，所述肝癌诊断或预后预测产品包括基因芯片、试剂盒、或试纸。
所述基因芯片包括检测lncRNA-LALR1表达量的试剂，所述试剂包括与lncRNA-LALR1或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测lncRNA-LALR1表达量的探针。
所述试剂盒包括检测lncRNA-LALR1表达量的试剂，所述试剂包括与lncRNA-LALR1或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括使用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测lncRNA-LALR1表达量时使用的PCR扩增引物。
所述试纸包括检测lncRNA-LALR1表达量的试剂，所述试剂包括与lncRNA-LALR1或其DNA序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测lncRNA-LALR1表达量的探针。
本发明还提供了lncRNA-LALR1在筛选肝癌治疗药物组合物中的应用。
进一步地，可以通过在对肝癌细胞添加测试药物后或在对肝癌模型动物施用测试药物后的某个时期测量lncRNA-LALR1的表达水平来测定测试药物改善肝癌预后的效果。更具体地说，当lncRNA-LALR1的表达水平在添加或施用测试药物后降低或者恢复正常水平时，可选择该测试药物作为改善肝癌预后的治疗药物。
本发明还提供了lncRNA-LALR1在制备肝癌治疗药物组合物中的应用。
本发明还提供了一种用于治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括抑制lncRNA-LALR1转录的试剂或化合物。
本发明所述的药物组合物可以作为医药单独施用或与其他药物一起施用。
本发明所述的药物组合物可根据需要制备成各种制剂。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明所述的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明所述的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
本发明的有益效果为：本发明发现了一种诊治肝癌的分子标记物lncRNA-LALR1，使用该分子标记物可以对肝癌的发生和预后效果进行判断，为肝癌的诊断和治疗提供新的策略。
附图说明
图1为lncRNA-LALR1在肝癌中的表达及定位结果分析图；其中，A为lncRNA-LALR1在肝癌及旁癌组织中的表达结果分析图，B为lncRNA-LALR1在六种肝癌细胞系中的表达结果分析图，C为荧光原位杂交(FISH)的结果分析图；
图2为lncRNA-LALR1对肝癌细胞生物学行为的影响实验结果分析图；其中，A为CCK-8的结果分析图，B为Transwell细胞侵袭结果分析图，C为克隆形成结果分析图；
图3为lncRNA-LALR1敲低后表达谱变化结果分析图；其中，A为表达谱芯片检测结果分析图，B为KEGG结果分析图；
图4为lncRNA-LALR1与SNORD72的相互作用结果分析图；其中A为RNA pulldown结果分析图；B为SNORD72和ID2的表达结果分析图，C为SNORD72在HCC组织中的表达与分化程度结果分析图，D为SNORD72在HCC组织和对应旁癌组织中的表达结果分析图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
下列实施案例中若无特殊说明，所用技术手段为本领域技术人员熟知的常规手段。
实施例1细胞培养
将肝癌细胞系SMMC-7721,HepG2,SK-Hep1,SMMC-7721,PLC/PRF/5,MHCC-97H采用含10％FBS、双抗(青霉素、链霉素)的DMEM高糖培养基，置于5％CO2、37℃、95％湿度的细胞培养箱中分别培养。
实施例2细胞和组织总RNA的提取
(1)贴壁细胞弃去细胞培养瓶中的培养基，采用4℃预冷的PBS缓冲液轻柔清洗细胞两遍，弃掉缓冲液后吸尽瓶底液体，加入适量的RNA裂解液至细胞培养瓶或培养板中。轻轻晃动培养瓶或培养板，用移液器缓慢、轻柔地将细胞吹落瓶底，将裂解液吸至无RNA酶的EP管中，室温静止5min；肝癌组织称量后，在液氮预冷的研钵中用研杵将组织至研磨成粉末，按50-100mg组织每毫升RNA裂解液加入适量裂解液。再用研杵将其研磨至匀浆液呈透明状，在无RNA酶的EP管中加入匀浆液，室温下静置5min。
(2)向EP管中加入1/5裂解液体积的氯仿，剧烈震荡15sec，室温静止5min后，12000×g、4℃下离心15min。
(3)新的无RNA酶的EP管中加入上层水相，再在EP管中加入等体积异丙醇，轻轻上下颠倒、混匀，室温下静置10min，12000×g、4℃下离心10min。
(4)弃掉EP管中液体，加入75％的乙醇1ml，上下颠倒EP管，充分清洗后在7500×g、4℃下离心5min。
(5)弃净上清后室温放置10min干燥。
(6)加入适量RNase-free水使RNA充分溶解。
(7)超微量分光光度计检测RNA的纯度和浓度，OD260/OD280应在1.8至2.0之间。提取所得RNA应立即反转为cDNA保存于-20℃冰箱。
实施例3QRT-PCR检测肝癌细胞和组织中LncRNA-LALR1的表达
(1)RT-PCR(反转录PCR)
1)提取后的RNA逆转录等进一步操作需在冰上进行。本实验中采用一步法进行RNA逆转录实验。实验反应体系如下：
Figure GDA0004107412220000051
Figure GDA0004107412220000061
2)反应条件如下：37℃15min 85℃5s 4℃保存RNA逆转录结束后的cDNA稀释5倍后行Real-Time PCR或置于-20℃保存。
(2)Real-Time PCR分析检测LncRNA-LALR1的表达
根据roche公司Light Cycle 480Real-Time PCR System,使用美国Bio-Rad公司荧光定量PCR仪进行Real-Time PCR分析。
引物序列：
lncRNA-hLALR1正向引物F:5'-ACGGGTGCGGGTTTAGG-3'(SEQ ID No.1)
lncRNA-hLALR1反向引物R:5'-TCCAGGGCCGACTCCAT-3'(SEQ ID No.2)
H-18s RNA正向引物F：GGCCCTGTAATTGGAATGAGTC (SEQ ID No.3)
H-18s RNA反向引物R:CCAAGATCCAACTACGAGCTT (SEQ ID No.4)Real-Time PCR反应体系如下：
Figure GDA0004107412220000062
反应条件如下：
预变性：95℃，30s，1个循环；
PCR：95℃，5s，60℃，30s，40个循环；
溶解曲线：65.0℃到95℃,升温梯度为0.5℃,时间为5s。
实施例4荧光原位杂交(FISH)
1)将处于对数生长期的肝癌细胞系，胰蛋白酶消化细胞后制成单细胞悬液，按照1X104细胞/孔扽密度将细胞种于24孔板中(孔内提前放入已处理好的大小合适的载玻片)，混匀后于37℃5％CO2培养箱中培养过夜；
2)吸弃孔板中的培养基，PBS洗两次，每次5min，吸弃PBS每孔加入200ul无水乙醇；
3)吸弃无水乙醇，每孔加入200μl 0.1％TritonX-100室温处理细胞15min，吸弃，PBS洗两次，每次5min；
4)吸弃PBS，每孔加入200ul 2×SSC,37℃培养箱放置30min；
5)吸弃2×SSC，每孔加入200ul 70％乙醇，室温放置3min；
6)吸弃70％乙醇，每孔加入200ul 85％乙醇，室温放置3min；
7)吸弃85％乙醇，每孔加入200ul无水乙醇，室温放置3min；
8)吸弃无水乙醇，室温干燥；
9)杂交缓冲液提前在37℃水浴锅孵育2h；
10)1OD探针用40ul DEPC水溶解，浓度为1ug/ul，避光备用；
11)由吉玛基因合成的LncLALR1核苷酸探针并进行荧光预标记，探针序列：
hLALR1:5’-GAGAGGAGGGAGCTAGGGAGGAC-3’(SEQ ID No.5)
NC:5’-GTGTACACGTCTATACGCCCA-3’(SEQ ID No.6)
Bactin:5’-CCTCCTTGAGCGCAAGTACTCCGTGT-3’(SEQ ID No.7)
每孔配制200ul探针混合液，即探针10ul-1.2ul(可先做预实验确定所需的探针浓度)，杂交缓冲液140ul，加DEPC水补足至200ul。设置浓度为50ug/ml，20ug/ml，12.5ug/ml，6ug/ml四个梯度；
12)每孔加入200ul探针混合液，73℃水浴锅变性5min,于37℃培养箱杂交孵育过夜；
13)杂交次日，将样本从37℃培养箱取出，吸弃探针混合液，每孔加入100ul于65℃预热的0.3％Tween-20洗涤2min；
14)吸弃0.3％Tween-20，每孔加入200ul的0.1％Tween-20100ul，室温洗涤2min，吸弃洗涤液，于室温干燥；
15)每孔加入100ul稀释后的DAPI染液，避光染色20min，吸弃，加入100ul PBS，挑出盖玻片，于荧光显微镜下观察。
实施例5构建敲低lncLALR1功能获得的稳定的细胞株
1)培养肝癌细胞SMMC-7721至对数生长期，胰蛋白酶消化细胞后制成单细胞悬液，接种至6孔板，使每孔细胞数量约为2×104个，于37℃培养箱常规培养；
2)待细胞生长至融合度达到30％-50％时更换培养基为含5μg/ml polybrene的DMEM培养基；
3)根据和元生物技术公司的慢病毒感染说明书，按照其推荐的浓度的病毒液量进行细胞感染；
Figure GDA0004107412220000081
4)感染8至12小时后进行细胞换液，更换为含10％FBS的DMEM完全培养液；
5)感染3至4天后将细胞培养瓶置于荧光显微镜下观察，此时应观察到感染成功的细胞内有荧光表达。待细胞融合度达到80％即可进行细胞传代；
6)加入4uM的嘌呤霉素筛选感染成功的肝癌细胞；
7)实时荧光定量PCR鉴定慢病毒感染的效率。
实施例6敲低lncLALR1稳转株的体外功能实验
1)CCK-8法检测细胞生长曲线
(1)取处于对数生长期的敲低lncLALR1的肝癌细胞系7721-51，7721-52，7721-NC细胞，适量胰酶-EDTA混合液消化后用移液器调成单细胞悬液，按照不同的实验分组接种细胞至96孔板内，每孔加入单细胞悬液100μl，1000个细胞/孔，每天每组3复孔，按3天接种细胞；
(2)每次测量前将10μl CCK-8细胞显色剂加至每孔，细胞培养箱内培养2小时后上机检测每孔450nm处的吸光度值；
(3)绘制生长曲线，以时间作为横坐标，吸光度作为纵坐标。
2)Transwell细胞侵袭实验
(1)Matrigel凝胶4℃过夜后，使用DMEM培养基按1:3稀释Matrigel，在每个transwell小室的上室加入40μl混合液，将小室放入24孔板，于细胞培养箱中孵育4-6小时；
(2)取处于对数生长期的敲低lncLALR1的肝癌细胞系7721-51，7721-52，7721-NC细胞，适量胰酶-EDTA混合液消化后用含10％BSA的DMEM培养液重悬细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度为2×104个/ml；
(3)将单细胞悬液100μl加入transwell小室，在下层24孔板中加入含10％FBS的DMEM高糖培养基600μl，于37℃培养箱继续培养；
(4)48小时后，取出小室，吸去培养基，PBS清洗小室3遍，以4％多聚甲醛固定30min；
(5)吸去固定液，PBS清洗小室2遍，加入1％结晶紫染色30min；
(6)清洗小室2遍，棉签轻轻擦去小室内部细胞，光学显微镜下观察小室外层滤膜上的细胞，随机选取每个小室5个视野并计数。
3)平板克隆形成实验
(1)取处于对数生长期的敲低lncLALR1的肝癌细胞系7721-51，7721-52，7721-NC细胞，适量胰酶-EDTA混合液消化后用移液器调成单细胞悬液，按照分组接种至六孔板中，每组3个重复，每皿细胞数为1000个，接种细胞后轻微摇晃培养皿，使细胞分散均匀；
(2)培养皿置细胞培养箱中常规培养2-3周，其间每隔3-5天更换新鲜培养液；
(3)当肉眼下即可看见培养皿中出现克隆时即可停止培养，吸去培养液，PBS缓冲液洗3次；4％多聚甲醛固定30min；弃甲醇后PBS缓冲液洗3次；
(4)结晶紫染色液染色30min；弃去结晶紫染色液后流水缓慢洗去染液，空气中干燥；
(5)按照相同标准(克隆大小)计数培养皿上的细胞克隆数，拍照，采用ImageJ软件计数细胞克隆数。
实施例7敲低lncRNA-LALR1稳转株的体内实验
裸鼠移植瘤实验
1)取处于对数生长期的敲低lncRNA-LALR1的肝癌细胞系7721-51，7721-52，7721-NC细胞，适量胰酶-EDTA混合液消化后离心收集细胞；
2)用100μL含生长因子的Matrigel将2×105的肝癌细胞重悬，接种于裸鼠皮下，每两天测量肿瘤大小；
3)常规饲养裸鼠，定期观察裸鼠的健康状态、测量移植瘤体积以及裸鼠的体重；
4)30天后处死裸鼠，剥离移植瘤，测量移植瘤体积、重量，拍照并记录。
实施例8LncRNA-LALR1靶基因筛选测序分析步骤及方法
采用lncLALR1及阴性对照肝癌细胞系稳转株7721-51，7721-52，7721-NC，提取细胞的总RNA送至上海生工，通过Hiseq建库测序进行RNA-seq，筛选lncLALR1敲低后的差异表达基因
1.数据评估及质控:
1)对测序的原始数据通过FastQC进行质量评估。
2)通过Trimmomatic进行质量剪切，得到相对准确的有效数据。
2.RNAseq测序评估:
1)使用HISAT2将样本有效数据比对到参考基因组上，统计Mapping信息。
2)采用RSeQC根据比对结果进行冗余序列分析、插入片段分布等分析。
3)采用Qualimap根据比对结果进行均一性分布检查、基因组结构分布等分析。
4)利用BEDTools进行基因覆盖率统计分析和染色体上测序序列分布等分析。
使用BCFtools根据Mapping结果找出可能的SNP位点，并利用SnpEff确定SNP位点对基因的影响。
3.基因结构分析:
1)使用BCFtools根据Mapping结果找出可能的SNP位点，并利用SnpEff确定SNP位点对基因的影响
2)使用StringTie将Mapping到基因组上的序列进行组装，然后使用GffCompare和已知基因模型进行比较，发现新的转录区域。
3)使用ASprofier进行可变剪切分析。
4)使用EricScript进行融合基因分析。
4.表达水平分析:
1)使用StringTie和已知的基因模型评估基因的表达量。
2)使用WGCNA进行基因共表达分析。
3)基于样本的表达量矩阵进行样本比较分析等多方向的统计分析和探索。
5.表达差异分析:
1)使用DESeq2进行基因表达差异分析，对表达差异分析结果进行可视化。
2)将差异基因映射到STRING蛋白互作网络数据库上进行蛋白互作网络构建。
3)基于差异分析结果，绘制韦恩图、热图，并进行聚类分析。
6.基因富集分析:
1)使用topGO进行GO富集分析，并绘制显著性GO有向无环图。
2)使用clusterProfiler进行KEGG通路和KOG分类富集分析。
3)基于基因功能富集分析结果绘制关联分析网络图。
实施例9蛋白印迹试验(Western Blot)
1)取处于对数生长期的敲低lncRNA-LALR1的肝癌细胞系7721-51，7721-52，7721-NC细胞，弃去细胞培养板中的培养基，PBS洗涤2次，加入适量配置好(含蛋白酶抑制剂)的细胞裂解液，冰上裂解20min，然后在4℃，10000rpm条件下离心10min，收集上清液(即提取的蛋白)到EP管中。采用BCA蛋白定量分析试剂盒检测。配制工作液和标准品，按照说明书配置不同浓度梯度的牛血清白蛋白，根据样品数量配制适量BCA工作液；取待测样品和标准品25μl加入96孔板中；加入200μl工作液，振荡30sec；密封96孔板，37℃孵育30min；上机检测样品在562nm处的吸光度值，根据不同浓度样品对应不同吸光度值制作蛋白浓度的标准曲线，然后使用标准曲线公式计算样品的蛋白浓度。
2)SDS-PAGE电泳：根据蛋白分子量配置适当浓度的浓缩胶和分离胶；蛋白样品与上样缓冲液混合，沸水浴加热5min；待样品冷却至室温后将40μg蛋白样品加入加样孔内，进行电泳。浓缩胶电压80V，待溴酚蓝进入分离胶后使用120V电压，至溴酚蓝到达分离胶最下端即可终止电泳。
3)电转膜：按照正极-滤纸板-PVDF膜-电泳胶-滤纸板-负极的顺序放好，置于转膜槽内，加入足量的转膜缓冲液，冰浴中300mA转膜90min。
4)封闭:将转好的PVDF膜浸于5％BSA中，置于水平摇床，37℃封闭2小时
5)一抗：按抗体说明书用封闭液稀释一抗，4℃孵育过夜，洗涤一抗TBST洗三次，每次洗5min。
6)二抗：按适当浓度使用封闭液稀释二抗，室温孵育2小时；洗涤二抗TBST洗三次，每次洗5min。
7)曝光使用ECL化学发光试剂盒，暗室曝光。
实施例10 lncRNA-LALR1在肝癌及癌旁组织中的表达
为了探讨lncRNA-LALR1在HCC中的作用，首先参照上述实施例3描述的qRT-PCR方法检测了30对肝癌组织及对应的癌旁组织中lncRNA-LALR1的表达，实验结果分析如图1A所示，结果表明lncRNA-LALR1在肝癌组织中的表达高于对应的癌旁组织。
实施例11 lncRNA-LALR1在肝癌细胞中的表达及定位
参照实施例1至实施例3描述的细胞培养、RNA提取、qRT-PCR方法检测Huh7,HepG2,SK-Hep1,SMMC-7721,PLC/PRF/5,MHCC-97H等六种肝癌细胞中lncRNA-LALR1的表达，实验结果分析如图1B所示，结果表明，lncRNA-LALR1在Huh7,HepG2,SK-Hep1,SMMC-7721,PLC/PRF/5,MHCC-97H等六种肝癌细胞中均由较强表达。选择HepG2,SMMC-7721参照上述实施例5描述的方法转染lncRNA-LALR1敲低慢病毒构建敲低lncRNA-LALR1功能的稳定细胞株，参照上述实施例4描述的方法用荧光原位杂交(FISH)实验检测lncRNA-LALR1在肝癌细胞中的定位，实验结果分析所图1C所示，结果表明lncRNA-LALR1在细胞核及细胞质中均有表达，主要表达于细胞核及核膜周围。
实施例12 lncRNA-LALR1促进肝癌细胞增殖、侵袭和生长
为了研究lncRNA-LALR1对肝癌细胞生物学行为的影响，参照上述实施例5描述的方法构建lncRNA-LALR1敲低稳定转染细胞系。然后参照实施例6进行敲低lncLALR1稳转株的体外功能实验。CCK-8实验结果分析如图2A所述，结果表明，敲低lncRNA-LALR1的SMMC-7721细胞体外增殖能力低于对照组。Transwell细胞侵袭实验结果分析如图2B所述，结果表明，敲低lncRNA-LALR1的SMMC-7721细胞体外侵袭能力低于对照组。克隆形成实验结果分析如图2C所述，结果表明，敲低lncRNA-LALR1的SMMC-7721细胞体外生长能力低于对照组。综合上述实验结果，lncRNA-LALR1能够促进肝癌细胞的恶性表型。然后，参照实施例7进行敲低lncRNA-LALR1稳转株的体内实验，试验结果进一步表明，lncRNA-LALR1能够促进肝癌细胞的恶性表型。
实施例13敲低lncRNA-LALR1后表达谱变化。
为了探讨敲低lncRNA-LALR1后表达谱的变化，参照上述实施例8描述的方法进行表达谱芯片检测，实验结果分析如图3A所示，结果显示，敲低lncRNA-LALR1后，540个基因显著上调，145个基因显著下调；KEGG结果分析如图3B所示，结果显示，敲低lncRNA-LALR1后，转录调节信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路显著变化。qRT-PCR验证，结果分析如图4B所示，结果表明，敲低lncRNA-LALR1能显著下调SNORD72和ID2的表达。
实施例14.lncRNA-LALR1与SNORD72结合并上调其表达。
细胞核lncRNA能够调控基因的转录及转录后修饰，研究发现lncRNA-LALR1主要表达于细胞核及核膜周围，表达谱芯片显示敲低lncRNA-LALR1能显著下调SNORD72的表达，为了研究lncRNA-LALR1与SNORD72的相互作用，进行RNA pulldown实验，实验结果分析如图4A所示，参照实施例9描述的方法进行蛋白印迹试验，结果表明，lncRNA-LALR1与SNORD72相互结合。接下来我们进行生物信息学分析，SNORD72在HCC组织中的表达与分化程度结果分析如图4C所示，结果表明SNORD72在HCC组织中的表达与分化程度负相关，分化程度越低，SNORD72的表达越高；SNORD72在HCC组织中的表达结果分析如图4D所示，结果表明SNORD72在HCC组织中的表达显著高于对应的癌旁组织。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<120> 肝癌的新诊治标志物lncRNA-LALR1及应用
<140> 2019105240485
<141> 2019-06-12
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> artificial series
<400> 1
acgggtgcgg gtttagg 17
<210> 2
<211> 17
<212> DNA/RNA
<213> artificial series
<400> 2
tccagggccg actccat 17
<210> 3
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> artificial series
<400> 3
ggccctgtaa ttggaatgag tc 22
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> artificial series
<400> 4
ccaagatcca actacgagct t 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> artificial series
<400> 5
gagaggaggg agctagggag gac 23
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> artificial series
<400> 6
gtgtacacgt ctatacgccc a 21
<210> 7
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> artificial series
<400> 7
cctccttgag cgcaagtact ccgtgt 26
<210> 8
<211> 1114
<212> DNA/RNA
<213> human
<400> 8
taagctgcgg caggtggcca ggacaggtag gatgactggg ctagcaggtt ctgagcctct 60
tctcccccag ggctggtgct ggtcaccgat gccatccctg ccttgggcct gggcaacggc 120
cggcacacgc tgggacagca ggaagtggaa gtggacggtc tgacggccta cgtggcaggt 180
gagcgccctg acccactggg tcccaggtcc cagcccgcat gccaggtggc ccacgacccc 240
cccagagcct gccctctctg ctctcaaggc accaagacgc tgagtggcag catagcccca 300
atggacgtct gtgtccggca cttcctgcag gccacaggtc agtgagcagc acgggtgcgg 360
gtttaggtgg tctgtgagtg gtgggtcccc aaggggctgg accgggtgcc cggactgtag 420
cccaagctct gcccacagga gctcctgggc attgggtact tggtgactca ggcccagggt 480
gacaggcaga ccagcagggt ccttgttagc ctgctgcaga gtccctgaga cagggagtgc 540
tggtgtggtt gggggctgtt ggcaaagcca tgtgggcttg gggactgtca cctagctgtg 600
tcccccaagc aggctgcagc atggagtcgg ccctggaggc tgcatccctg caccccgccc 660
agttgctggg gctggagaag agtaagggga ccctggactt tggtgctgac gcaggtgagg 720
gcctgtcgca gggtcaccgg gcagcctggc cctgcctgta gactctgttg ttcctggggc 780
ggcctggaca gggccaggga gggtgggtcc tccctagctc cctcctctca ggtgggctgc 840
cggctgccag cctcagttgt agccccgtgt tgccatcagg ccgggctttc tggtgttgca 900
gacaaggcca ggcaaggggt tgcagggagc attgtccagt acctctgtcc atctgtgatg 960
ggtcagggtg tcttgcacta gtcgtgtccc tgggcctcag tttccccacc agcgtcgggt 1020
tgttggggag cagctctggg gtaggtgggc ggccccactc ctgcccccta ctcattgccc 1080
ggctctgtcc cagacttcgt ggtgctcgac gact 1114

Claims (5)

1.检测lncRNA-LALR1表达水平的试剂在制备肝癌诊断或预后预测产品中的应用，所述lncRNA-LALR1的序列为SEQ ID No .8；试剂包括检测SNORD72表达的试剂。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测lncRNA-LALR1表达水平的试剂包括使用SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、或复合探针检测lncRNA-LALR1表达量时使用的PCR扩增引物。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增引物包括正向引物F和反向引物R，所述正向引物F的序列为SEQ ID No .1，所述反向引物R的序列为SEQ ID No .2。
4.一种用于肝癌诊断或预后预测的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1-3中任一项所述的检测lncRNA-LALR1表达水平的试剂。
5.根据权利要求4所述的用于肝癌诊断或预后预测的产品，其特征在于，所述肝癌诊断或预后预测产品包括基因芯片、试剂盒、或试纸。
CN201910524048.5A 2019-06-17 2019-06-17 肝癌的新诊治标志物lncRNA-LALR1及应用 Active CN110408698B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910524048.5A CN110408698B (zh) 2019-06-17 2019-06-17 肝癌的新诊治标志物lncRNA-LALR1及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910524048.5A CN110408698B (zh) 2019-06-17 2019-06-17 肝癌的新诊治标志物lncRNA-LALR1及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110408698A CN110408698A (zh) 2019-11-05
CN110408698B true CN110408698B (zh) 2023-05-30

Family

ID=68359191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910524048.5A Active CN110408698B (zh) 2019-06-17 2019-06-17 肝癌的新诊治标志物lncRNA-LALR1及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110408698B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148337A (zh) * 2015-04-17 2016-11-23 复旦大学 长非编码rna ay927503及其用途
CN106995858A (zh) * 2017-06-01 2017-08-01 北京泱深生物信息技术有限公司 一种与肝癌诊疗相关的lncRNA
CA3032054A1 (en) * 2016-07-28 2018-02-01 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130079241A1 (en) * 2011-09-15 2013-03-28 Jianhua Luo Methods for Diagnosing Prostate Cancer and Predicting Prostate Cancer Relapse

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148337A (zh) * 2015-04-17 2016-11-23 复旦大学 长非编码rna ay927503及其用途
CA3032054A1 (en) * 2016-07-28 2018-02-01 Novartis Ag Combination therapies of chimeric antigen receptors and pd-1 inhibitors
CN106995858A (zh) * 2017-06-01 2017-08-01 北京泱深生物信息技术有限公司 一种与肝癌诊疗相关的lncRNA

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Decreased ID2 promotes metastatic potentials of hepatocellular carcinoma by altering secretion of vascular endothelial growth factor";Tsunedomi, R等;《CLINICAL CANCER RESEARCH》;20080215;第14卷(第4期);第1025页摘要 *
"LncRNA-LALR1 upregulates small nucleolar RNA SNORD72 to promote growth and invasion of hepatocellular carcinoma";Mao, LH等;《AGING-US》;20200315;第12卷(第5期);第4527-4546页 *
"Long noncoding RNAs associated with liver regeneration 1 accelerates hepatocyte proliferation during liver regeneration by activating Wnt/β-Catenin signaling";Xu, D等;《HEPATOLOGY》;20130831;第58卷(第2期);图S9A *
"THE EXPRESSION, FUNCTION AND MECHANISM OF LNCRNA-LALR1 IN HEPATOCELLULAR CARCINOMA";Mao, LH等;《GASTROENTEROLOGY》;20190506;第156卷(第6期);第S1308页摘要 *
"长链非编码RNA LALR1在肝细胞癌中的表达、功能及其机制研究";毛琳泓;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20210115(第1期);E072-353 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110408698A (zh) 2019-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101940657B1 (ko) 위암의 생물학적 특성에 기반한 군 구분 및 예후 예측 시스템
WO2021022888A1 (zh) 靶向长链非编码rna ddx11-as1的aso、试剂盒及在肝癌治疗中的应用
CN111518909B (zh) Mettl2基因在制备检测结直肠癌氟尿嘧啶类药物治疗敏感性的试剂盒中的应用
CN104946755B (zh) Brca1蛋白在制备逆转肿瘤细胞对mtx耐药性的药物中的应用
CN110029166B (zh) 长链非编码rna linc00205在制备诊断卵巢癌试剂或治疗卵巢癌药物中的应用
CN110408698B (zh) 肝癌的新诊治标志物lncRNA-LALR1及应用
CN112831497A (zh) 一种新型lncRNA及其抑制剂、诊断试剂、药物和应用
CN105483246B (zh) 基因的差异表达在口腔癌诊断中的应用
CN106148337B (zh) 长非编码rna ay927503及其用途
Li et al. Hydroxyacid Oxidase 2 (HAO2) Inhibits the Tumorigenicity of Hepatocellular Carcinoma and Is Negatively Regulated by miR‐615‐5p
CN109486816A (zh) 一种用于肿瘤治疗的多聚核苷酸及其应用
CN109666674A (zh) circCDYL2及其在制备鼻咽癌诊断制剂中的应用和诊断制剂
CN111139298A (zh) 4-LncRNA分子标签在肺癌预后评估中的应用
CN111172161B (zh) 一种长非编码rna及其在诊断/治疗子痫前期中的应用
CN112410429B (zh) Fxyd3作为胃癌诊断标志物和治疗靶标的应用
CN114703190A (zh) 一种靶向抑制KIAA1429基因表达的ShRNA在慢性髓细胞白血病中的应用
CN111471682A (zh) miR-23a作为诊断和治疗胃癌伪管生成标志物的应用
CN112501239A (zh) Tak1抑制剂抑制pdl1的检测方法及其在制备抗pdl1药物中的应用
CN105385781B (zh) Lce3e在诊治口腔癌中的应用
CN113699240B (zh) Nrk在肺癌治疗和预后诊断中的医药用途
CN114908172B (zh) Apobec3b在前列腺癌诊断、预后预测及治疗中的应用
CN104388541B (zh) miR‑1914*和miR‑1915的用途
CN117384856B (zh) 一种永生化copd人支气管上皮细胞株及其构建方法和应用
CN116855607B (zh) circCHPT1在制备非小细胞肺癌早期诊断或预后检测试剂盒中的应用
CN114214407A (zh) Dot1l突变作为癌症的生物标志物以及治疗靶点的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant