CN114214407A

CN114214407A - Dot1l突变作为癌症的生物标志物以及治疗靶点的应用

Info

Publication number: CN114214407A
Application number: CN202111563713.5A
Authority: CN
Inventors: 王立辉; 吴春福; 韩梅; 王小璇; 张嘉玉; 杨静玉
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2021-12-20
Filing date: 2021-12-20
Publication date: 2022-03-22

Abstract

本发明涉及用于癌症诊断和用药判断的分子标志物，还涉及用于检测该分子标志物的引物和试剂盒。所述分子标志物为存在于组蛋白甲基转移酶DOT1L上的一系列病理性突变I232N、Y216C、F243L、N241T、E186A、S225L、R231Q、A1003S、A1003G中的一种或多种，该病理性突变与癌症的发生发展相关，其可以作为诊断、预后和用药判断的肿瘤生物标志物，并且能够作为多种恶性肿瘤的治疗靶点。

Description

DOT1L突变作为癌症的生物标志物以及治疗靶点的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及DOT1L病理性突变在作为诊断、用药判断的肿瘤生物标志物，以及作为多种恶性肿瘤治疗靶点的应用。

背景技术

癌症是世界范围内最主要的公共卫生问题，也是导致全球人口死亡的主要原因，对于癌症的治疗一直是人们不断研究的重点和难点。近年来，表观遗传学修饰成为癌症研究的热点。在真核生物中，核小体是组成染色体的基本单位，核小体是由组蛋白八聚体与缠绕在其上的DNA所组成。在核小体上可以发生多种修饰，主要包括DNA甲基化修饰、组蛋白修饰和RNA调控等，这些修饰可以在不改变碱基序列的情况下使基因的表达发生改变，且这种改变是可以遗传的，这种现象被称为表观遗传修饰。其中组蛋白H3第79位的赖氨酸甲基化修饰，可以导致染色体松弛，使其下游基因更易表达，与癌症相关基因的转录激活密切相关。催化H3K79发生甲基化的酶是DOT1，在人类基因中被称为DOT1-like(DOT1L)，在啤酒酵母中筛选端粒沉默因子时被首次发现。它是一类新的组蛋白赖氨酸甲基转移酶，同时也是迄今为止发现的唯一可以使H3K79发生甲基化的酶。作用机制为DOT1L以S-(5'-腺苷)-L-甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，将SAM的甲基转移到ε-NH₂上，生成甲基化的底物以及S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)。DOT1L参与多种生理过程并被证明与癌细胞的增殖、迁移和干细胞蓄积相关。

目前大量的研究均停留在关注DOT1L的表达情况与肿瘤发生发展的关系，然而近年来有报道称组蛋白甲基转移酶DOT1L自身会发生突变，但对于组蛋白甲基转移酶DOT1L自身的各个突变位点与癌症发生发展的关系却缺乏研究。本发明研究DOT1L突变如何对DOT1L生物学功能产生影响，从而探讨癌症的发病机制，并为探寻选择性的抑制DOT1L突变的靶向药物奠定基础。

发明内容

发明要解决的问题

本发明的第一个目的在于：提供用于诊断和治疗癌症的分子标志物，该分子标志物为组蛋白甲基转移酶DOT1L不同位点的病理性突变。

本发明的第二个目的在于：提供抗肿瘤药物研究的作用靶点。

用于解决问题的方案

本发明找到存在于肺癌中的9种组蛋白甲基转移酶DOT1L病理性突变，分别为I232N、Y216C、F243L、A1003G、N241T、E186A、A1003S、S225L、R231Q，其中A100G和A1003S这两种突变位点属于多发突变位点，而其余7种突变均为存在于DOT1L功能活性域DOT区域上的病理性突变。

然后，通过载体构建的方式，将存在于细胞中的野生型组蛋白甲基转移酶DOT1L构建到基因工程常规表达载体pCMV6空载体中。随后再利用点突变试剂盒依次进行9种突变位点的点突变，最后成功构建带有9种病理性突变的组蛋白甲基转移酶DOT1L表达载体。

本发明首次发现，I232N、Y216C、F243L、A1003G、N241T、E186A、A1003S、S225L、R231Q这9种类型的突变与癌症的发生发展相关，从而完成了本发明。

本发明在上述研究的基础上进一步通过慢病毒表达载体构建的方式构建稳定表达DOT1L-R231Q突变的肺癌细胞，从而在另一个层面验证瞬时转染的结果。研究表明，稳转肺癌细胞株的恶性行为与瞬时转染结果一致，这不仅确定了组蛋白甲基转移酶DOT1L病理性突变R231Q为功能获得型基因突变，并且证明本发明所发现的9种DOT1L病理性突变可以作为癌症诊断和用药判断的分子标志物。进一步的，本发明研究发现组蛋白甲基转移酶DOT1L功能获得型基因突变R231Q稳转肺癌细胞株在应用DOT1L小分子抑制剂EPZ004777和SGC0946后，细胞的生长受到明显的抑制作用，并且呈现剂量依耐性的抑制癌细胞的生长，因此，本发明所发现的DOT1L病理性突变可以作为靶位点在治疗癌症。

基于以上发现，本发明提出了以下技术方案：

(1)一种用于诊断和治疗癌症的分子标志物，所述分子标志物为位于组蛋白甲基转移酶DOT1L功能活性域DOT区域内的病理性突变位点，所述病理性突变位点选自I232N、Y216C、F243L、N241T、E186A、S225L、R231Q、A1003S、A1003G中的1种或多种。

在一种实施方式中，所述病理性突变位点选自I232N、Y216C、F243L、E186A、S225L、R231Q、A1003G中的1种或多种，更优选选自F243L、S225L、R231Q中的1种或多种，进一步优选选自R231Q。

(2)检测上述分子标志物的引物在制备癌症诊断与预后检测的试剂中的应用。

在一种实施方式中，组蛋白甲基转移酶DOT1L在病理性突变位点发生突变，引起癌细胞恶性表型，所述病理性突变位点选自I232N、Y216C、F243L、N241T、E186A、S225L、R231Q、A1003S、A1003G中的1种或多种。

在一种实施方式中，所述E186A、S225L、R231Q、A1003G的突变促进组蛋白甲基转移酶DOT1L的酶底物H3K79me2的表达水平，所述I232N、Y216C、F243L、E186A、S225L、R231Q、A1003S的突变增强癌细胞增殖能力，所述F243L、S225L、R231Q的突变增强癌细胞的克隆形成能力，所述I232N、Y216C、F243L、N241T、R231Q、A1003G的突变增加癌细胞的迁移能力，所述R231Q的突变为功能获得型基因突变。

在一种实施方式中，上述癌症包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、胶质瘤。

(3)一种用于检测上述分子标志物的引物，所述引物包括：

用于检测I232N的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示；用于检测Y216C的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示；用于检测F243L的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示；用于检测N241T的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示；用于检测E186A的引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.33和SEQ ID NO.34所示；用于检测S225L的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.35和SEQ IDNO.36所示；用于检测R231Q的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示；用于检测A1003S的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示；用于检测A1003G的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示。

(4)一种用于检测上述分子标志物的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物。

(5)上述分子标志物作为药物靶标在离体筛选抗肿瘤药物中的应用。

(6)DOT1L小分子抑制剂在制备抗癌药物中的应用，所述DOT1L小分子抑制剂用于抑制上述分子标志物所引起的癌细胞的恶性表型，优选地，所述抗癌药物包括治疗肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、胶质瘤的药物，优选地，所述癌细胞的恶性表型包括癌细胞的增殖。

发明的效果

本发明首次发现，位于组蛋白甲基转移酶DOT1L功能活性域DOT区域内的病理性突变I232N、Y216C、F243L、N241T、E186A、S225L、R231Q、A1003S、A1003G与癌症的发生发展相关。其可以作为诊断、预后和用药判断的肿瘤生物标志物，并且能够作为多种恶性肿瘤的治疗靶点。

并且首次发现了一个位于组蛋白甲基转移酶DOT1L功能活性域DOT区域内的功能获得型病理性突变R231Q，为后续肺癌病人诊断和临床指导用药方面提供了理论基础，同时发现的该靶点可以作为制备治疗肺癌药物方面的应用。

附图说明

图1A是DOT1L野生型表达载体琼脂糖凝胶电泳结果；

图1B是DOT1L野生型表达载体的测序结果；

图1C是9种不同类型的DOT1L病理性突变琼脂糖凝胶电泳结果；

图1D是9种突变的测序结果(9种突变依次为：DOT1L-I232N、DOT1L-Y216C、DOT1L-F243L、DOT1L-A1003G、DOT1L-N241T、DOT1L-E186A、DOT1L-A1003S、DOT1L-S225L、DOT1L-R231Q测序结果)。

图2A是DOT1L-R231Q和野生型(WT)慢病毒表达载体琼脂糖凝胶电泳结果；

图2B是DOT1L-R231Q的测序结果；

图2C是野生型(WT)慢病毒表达载体的测序结果；

图2D是对构建成功的慢病毒表达载体进行包装之后的验证结果。

图3A是将9种突变的表达载体转染至细胞后目的蛋白DOT1L的表达结果；

图3B是对转染成功的9种突变细胞进行DOT1L底物蛋白H3K79me2表达水平的检测，其中柱状图横坐标自左至右依次为H460/I232N、H460/Y216C、H460/F243L、H460/A1003G、H460/N241T、H460/E186A、H460/A1003S、H460/S225L、H460/R231Q、H460/空白载体、H460/WT；

图3C是9种突变细胞增殖能力(24小时)的结果，其中柱状图横坐标自左至右依次为H460/I232N、H460/Y216C、H460/F243L、H460/A1003G、H460/N241T、H460/E186A、H460/A1003S、H460/S225L、H460/R231Q、H460/空白载体、H460/WT；

图3D是9种突变细胞增殖能力(48小时)的结果，其中柱状图横坐标自左至右依次为H460/I232N、H460/Y216C、H460/F243L、H460/A1003G、H460/N241T、H460/E186A、H460/A1003S、H460/S225L、H460/R231Q、H460/空白载体、H460/WT；

图3E是9种突变细胞增殖能力(72小时)的结果，其中柱状图横坐标自左至右依次为H460/I232N、H460/Y216C、H460/F243L、H460/A1003G、H460/N241T、H460/E186A、H460/A1003S、H460/S225L、H460/R231Q、H460/空白载体、H460/WT；

图3F是9种突变细胞克隆形成能力的结果，其中柱状图横坐标自左至右依次为H460/I232N、H460/Y216C、H460/F243L、H460/A1003G、H460/N241T、H460/E186A、H460/A1003S、H460/S225L、H460/R231Q、H460/空白载体、H460/WT；

图3G是对转染成功的9种突变细胞进行细胞迁移能力的考察，其中柱状图横坐标自左至右依次为DOT1L/I232N、DOT1L/Y216C、DOT1L/F243L、DOT1L/A1003G、DOT1L/N241T、DOT1L/E186A、DOT1L/A1003S、DOT1L/S225L、DOT1L/R231Q、DOT1L/空白载体、DOT1L/WT。

图4A是检测R231Q突变的DOT1L对其底物H3K79me2表达水平的影响；

图4B是对DOT1L-R231Q稳转细胞株进行细胞增殖能力的考察；

图4C是对DOT1L-R231Q稳转细胞株进行细胞克隆形成能力的考察；

图4D是对DOT1L-R231Q稳转细胞株进行细胞迁移能力的考察。

图5A是EPZ004777对H460-R231Q突变细胞的抑制作用；

图5B是EPZ004777对H1299-R231Q突变细胞的抑制作用；

图5C是EPZ004777对H1975-R231Q突变细胞的抑制作用；

图5D是EPZ004777对H446-R231Q突变细胞的抑制作用；

图5E是SGC0946对H460-R231Q突变细胞的抑制作用；

图5F是SGC0946对H1299-R231Q突变细胞的抑制作用；

图5G是SGC0946对H1975-R231Q突变细胞的抑制作用；

图5H是SGC0946对H446-R231Q突变细胞的抑制作用。

图6A是DOT1L突变对人乳腺癌细胞MCF-7和人前列腺癌细胞PC-3成活率的影响；

图6B是DOT1L突变对人肝癌细胞Hep3B和人结肠癌细胞Colo205成活率的影响；

图6C是DOT1L突变对人胃癌细胞AGS和人胶质瘤细胞U251成活率的影响；

图7是本发明实验所用慢病毒空载体pLVX-Puro图谱；

图8是本发明实验例2检测R231Q突变的琼脂糖凝胶电泳结果。

具体实施方式

[癌症]

肺癌(Lung cancer)在恶性肿瘤中的发病率和死亡率均居世界首位，且有逐年增长的趋势。肺癌的病理类型主要包括非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)两大类，其中非小细胞肺癌主要分为腺癌、鳞癌和大细胞肺癌；小细胞肺癌主要分为燕麦细胞癌和混合癌。非小细胞肺癌约占全部肺癌病例的85％，其5年的存活率只有15％；而小细胞肺癌虽然所占比重小，但其分化程度低，恶性程度更高。目前对于肺癌发生的病因尚不明确，大量研究表明，吸烟是诱发肺癌的最主要因素，其次职业和环境接触、空气污染、电离辐射、饮食和营养和慢性肺部疾病等也与肺癌的发生有一定的关联。目前对于肺癌的治疗手段主要包括：手术治疗、放射治疗和化学治疗。但这些治疗手段通常都具有较大的副作用，使得患者在治疗过程中出现极大的痛苦并且容易产生耐受性，因此迫切的需要去寻找肺癌新的生物学标志物，因此，对于肺癌DOT1L突变的研究也就显得尤为重要。

乳腺癌(Breast cancer)的发病机制尚未阐明，雌激素长期作用、家族遗传倾向、环境因素和长时间大剂量接触放射线和乳腺癌发病有关。乳腺癌组织形态十分复杂，类型较多，大致上分为非浸润性癌和浸润性癌两大类。目前，雌二醇受体、孕酮受体和乳腺癌原癌基因HER2生物学标记已成为指导乳腺癌临床治疗与预后判定的常规检测手段。

前列腺癌(Prostate cancer)是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤。前列腺癌早期常无症状。临床诊断前列腺癌主要依靠直肠指诊、血清PSA、经直肠前列腺超声和盆腔MRI检查。

肝癌(Liver cancer)可分为原发性和继发性两大类。原发性肝癌是干细胞或肝内胆管上皮细胞发生的恶性肿瘤。其在我国发生率较高，为我国常见肿瘤之一。其发病印尼，早期无临床症状，故临床发现时多已为晚期，死亡率较高。继发性肝癌或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。

结肠癌(Colon cancer)常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，好发于直肠与乙状结肠交界处。结肠癌发病的主要与高脂肪和低纤维素饮食有关。早期可以没有任何症状，中晚期可表现为腹胀、消化不良，而后出现排便习惯改变，腹痛，黏液便或黏血便。

胃癌(Stomach cancer)是由胃黏膜上皮和腺上皮发生的恶性肿瘤。占我国恶性肿瘤的第一或第二位。其病因尚未完全阐明。可能与饮食与环境因素、亚硝基类化合物、幽门螺杆菌有关。可通过血清CEA、CA50、CA72-4、CA19-9等肿瘤相关抗原升高来判别，但敏感性和特异性均不高。

胶质瘤(Glioma)源自神经上皮的肿瘤统称为脑胶质瘤，占颅脑肿瘤的40％～50％，同其他肿瘤一样，胶质瘤也是由于先天的遗传高危因素和环境的致癌因素相互作用所导致。例如神经纤维瘤病(I型)以及结核性硬化疾病等，为脑胶质瘤的遗传易感因素。胶质瘤很难根治，往往会复发。

[组蛋白H3赖氨酸79(H3K79)甲基转移酶DOT1L]

组蛋白H3赖氨酸79(H3K79)甲基转移酶DOT1L在激活和维持基因转录过程中起着十分重要的作用；同时，在维持个体胚胎发育和造血系统、心脏及肾脏的正常功能方面具有不可替代的作用。但是DOT1L的过表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关，受到了广泛的关注。

与上述关注不同，DOT1L自身的突变对癌症的发生发展的影响并没有被揭示。本发明发现，DOT1L特定位点的突变与癌症的发生发展相关。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实验例1：组蛋白甲基转移酶DOT1L的9种突变位点表达载体的构建和突变R231Q慢病毒表达载体的构建及慢病毒的产生

1.材料

细胞株

人非小细胞肺癌细胞NCI-H460；人肾上皮细胞293T，购自ATCC。

菌种与质粒

TOP10感受态细胞；pCMV6空载体；pLVX-Puro慢病毒载体，购自Addgene。

2.方法

1)DOT1L野生型表达载体的构建

磁珠法mRNA抽提及cDNA第一链合成

(1)准备样品和磁珠，取出Bead Preservation Solution，涡旋30s，立即取出100μL加入1.5mL离心管中磁性分离(离心管置于磁力架上静置2min)弃上清。取下离心管后加入100μL预冷灭菌的PBS缓冲液，涡旋10s，使磁珠均匀分散，进行磁性分离，弃上清液。

(2)制备细胞样品，细胞用新鲜培养液吹打下来，计数后取10⁶cells/ml，1000rpm/min，离心5min，500μL预冷灭菌PBS清洗细胞，1000rpm/min，离心5min，弃上清液。加入100μL预冷灭菌的PBS缓冲液，分散细胞。加入200μL Lysis Buffer，混匀后加入步骤(1)得到的磁珠悬液中，反复吹打20次，室温静置10min(静置过程中翻转2次，使磁珠均匀分散在溶液中)。磁性分离，保留磁珠，弃上清液。

(3)纯化mRNA，超净工作台中进行，取下离心管，加入1mL的Washing Buffer，涡旋10s，使磁珠均匀分散，然后进行磁性分离，弃上清液。取下离心管加入25μL的ElutionBuffer，涡旋10s使磁珠分散均匀。将离心管置于50℃，水浴3min，立即置于磁力架上等待15s，小心吸取上清液至新的离心管中，即为纯化好的mRNA，立即放在冰上，进行下游实验；

(4)合成cDNA第一链，无菌净化台中进行，冰上操作，加入4μL 5×cDNA SynthesisSuperMix、1μL mRNA、15μL RNase-free Water，建立20μL的反应体系。反应体系混匀离心后置于PCR仪，设定如下程序：42℃10min，85℃10s，反应完毕后储存至-20℃备用。

PCR扩增

(1)根据质粒上的双酶切位点sgf1和mlu1设计引物，引物序列如下：

DOT1L Forward

GAGGCGATCGCCATGGGGGAGAA(SEQ ID No.1)；

DOT1L Reverse

GCGACGCGTGTTACCTCCAACTGA(SEQ ID No.2)。

(2)按照以下顺序向微量离心管中加入反应体系，25μL Prime STARHS(Premix)、1μL DOT1L Forward、1μL DOT1L Reverse、1μL Template、20μL DEPC Water，建立50μL的反应体系。(3)反应体系混匀离心后置于PCR仪，设定程序如下：98℃10s，55℃5s，72℃5min，30个循环之后，4℃Forever。扩增获得的序列连入经双酶切后的pCMV6-EntryVector质粒中，-20℃保存。

转化

(1)从-80℃超低温冰箱中取出TOP10感受态菌(100μL)，立即37℃融化后插入冰上，冰浴5-10min。

(2)加入0.5-5μL连接好的质粒混合液(DNA含量不超过100ng)，轻轻震荡后放置冰上20min。

(3)轻轻摇匀后插入42℃水浴中45s进行热休克(为保证转化效率，42℃水浴应提前预热)，然后迅速放回冰中，静置3-5min。

(4)在超净工作台中向上述各管中分别加入200μL-500μL LB培养基(不含卡那霉素)轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h。

(5)在超净工作台中取上述转化混合液1/5，分别滴到含合适卡那霉素的固体LB平板培养皿中(37℃预热)，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀，至无流动状。先放置在37℃恒温培养箱中30-60min直到表面的液体都渗透到培养基里后，再倒置过来放入37℃恒温培养箱过夜。

(6)观察平板上长出的菌落克隆，以菌落之间能互相分开为好。封口膜密封后倒置放于4℃冰箱保存。

菌液培养

(1)小心用10μL移液枪头从LB平板中挑出单克隆菌落，吹散于3mL含卡那霉素的液体LB培养基中，置于37℃恒温摇床中，200～300r/min培养3h。

(2)待菌液稍显浑浊时，每次吸取500μL菌液于20mL含卡那霉素的液体LB培养基中，共五次使总菌液量达100mL，(分5管扩增，使菌液充分接触空气)，置于37℃恒温摇床中，200～300r/min培养16至18h。

质粒提取

(1)向吸附柱CP6中(吸附柱放入50ml收集管中)加入2.5mL的平衡液BL，8,000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)取100mL过夜培养的菌液加入离心管，室温8,000rpm离心3min收集细菌，弃上清。向留有菌体沉淀的离心管中加入8mL溶液P1使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

(3)向离心管中加入8mL溶液P2，立即温和地上下翻转6-8次，室温放置5min。向离心管中加入8ml溶液P4，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，至溶液出现白色絮状沉淀，然后室温放置10min后，8000rpm离心5-10min，使白色沉淀离心至管底，将全部溶液小心倒入过滤器中，慢慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的50mL的管中。

(4)向滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP6中(吸附柱放入50mL收集管中)。室温8,000rpm(～8,228×g)离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP6重新放回收集管中。

(5)向吸附柱CP6中加入10mL漂洗液PW，8,000rpm离心2min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中(此步骤重复两次)。向吸附柱CP6中加入3mL无水乙醇，室温8,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CP6重新放回收集管中，8,000rpm离心5min吸附材料中残余的漂洗液。

(6)将吸附柱CP6置于一个干净的50mL收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2mL洗脱缓冲液TB，室温放置5min，然后室温8,000rpm(～8,228×g)离心2min。将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5mL离心管，-20℃保存制得的DOT1L野生型表达载体，。

琼脂糖凝胶电泳验证及质粒DNA测序

(1)取PCR扩增产物5μL，加入溴酚蓝1μL，于含0.5μg/mL溴化乙啶(EB)的1.2％琼脂糖凝胶中电泳，扩增条带与标准DNA分子量条带比较。

(2)胶回收后送至公司测序。

2)9种突变型DOT1L表达载体的构建

(1)设计突变引物

采用同源重组法分别设计突变引物，引物序列如下表1：

表1.构建DOT1L突变的引物

(2)PCR扩增

分别用表1示出的9对引物扩增DOT1L野生型质粒，扩增体系与条件均一致，使用东洋纺公司KOD-NEO-PLUS扩增试剂盒扩增，体系及条件如下表2、表3所示：

表2.DOT1L点突变反应体系

表3.DOT1L突变PCR程序设定如下：

随后按照与上述“1)DOT1L野生型表达载体的构建”中相同的步骤进行转化、菌液培养、质粒提取(由此制得9种突变型DOT1L表达载体)及琼脂糖凝胶电泳验证及质粒DNA测序。

3)功能获得型突变R231Q慢病毒表达载体的构建

(1)引物的设计与合成

根据DOT1L突变型与野生型的基因序列以及pLVX-Puro载体上的双酶切位点XhoI和EcoRI设计引物，通过Primer Premier 5.0软件设计引物，并在yeastgenome网站上筛选优化，引物序列设计如下表4：

表4.DOT1L基因的引物

该序列委托上海生工生物技术公司合成。

(2)PCR扩增及双酶切目的片段

PCR扩增

将上述引物用ddH₂O配制成100μM的储备液，再用ddH₂O稀释成10μM待用。以前期构建的pCMV6-DOT1L-R231Q质粒为模板，采用上述引物(SEQ ID No.21和SEQ ID No.22)和2×Super Pfx MasterMix试剂盒进行PCR反应；以及以前期构建的pCMV6-DOT1L-WT质粒为模板，采用上述引物(SEQ ID No.23和SEQ ID No.24)和2×Super Pfx MasterMix试剂盒进行PCR反应，PCR反应体系如下表5所示：

表5.PCR反应体系

将上述混合物置于200μL的EP管中，放入PCR仪中运行以下程序完成PCR扩增：以98℃预变性3min，98℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s为一个循环，进行30次循环后，72℃终延伸5min。

PCR产物纯化

①使用前向Washing Buffer中加入40mL无水乙醇，摇晃均匀。

②取50-100μL PCR产物，加入5倍体积的溶液Binding Buffer，混匀后加入到离心柱中，为提高纯化产量可以选择静置1min，10000×g离心1min，弃去流出液。

③加入650μL溶液Wash Buffer，10000×g离心1min，弃去流出液。

④于10000×g离心1-2min，彻底去除残留的Washing Buffer。

⑤将离心柱置于一干净的离心管中，在柱的中央加入30-50μL Elution Buffer。为提高纯化产量，可选择60℃-70℃预热Elution Buffer或去离子水室温静置1min，10000×g离心1min，洗脱DNA。洗脱出的DNA于-20℃保存。

产物浓度测定：在NanDrop 2000程序中测定纯化产物浓度，用Buffer EB作为空白对照，每次用2μL样品测定。

双酶切目的片段

采用XhoI和EcoRI限制性内切酶切割目的片段，切除保护碱基暴露粘性末端，酶切反应体系如下表6所示：

表6.目的基因的双酶切反应体系

将上述混合物置于200μL的EP管中，放入PCR仪中运行以下程序完成酶切反应：37℃，15min。

(3)线性化载体的回收

本实验所用慢病毒空载体pLVX-Puro图谱如图7所示：

pLVX-Puro慢病毒载体的转化

①从-80℃冰箱中取出Trans10感受态菌(50μL)，插在冰上使其慢慢融化。加入适量质粒(总量不超过25ng)，轻轻混匀后冰浴30min。

②42℃水浴45s进行热休克，迅速转移到冰上，冰浴2min，此时不要摇晃菌液。在超净台中向每50μL菌液加入不含抗生素的SOC培养基，轻轻混匀后，于37℃恒温摇床上200rpm/min，培养60min。

③将含有氨苄青霉素的平板培养皿37℃预热10min，吸取上述混合液适量，滴到培养基上，立即用消毒后冷却至室温的玻璃涂布棒涂布均匀，至无明显流动液体。

④将LB培养基正置放入37℃恒温培养箱中60min后，将平皿倒置于培养箱中过夜。

⑤观察平板上的菌落克隆，要求菌落之间互相分开，大小适中，且无杂菌产生。密封后倒置4℃保存。

pLVX-Puro慢病毒载体的扩增与提取

观察平板上菌落的生长状况，用枪头挑起生长良好的菌落，在含抗生素的液体培养基中进行培养，使其大量扩增，具体步骤如下：

①按照1:1000的比例配制含有氨苄青霉素的LB液体培养基适量，要求每50mL离心管中LB培养基不超过15mL。

②用10μL枪头在LB平板中挑出单克隆菌落，放到3mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，置于恒温摇床上，37℃，200r/min培养3～8h；

③向每15mL液体培养基中加入200μL菌液，置于37℃恒温摇床上，200r/min培养16～18h。

将结束培养的菌液使用质粒小提中量试剂盒进行抽提，具体操作步骤如下：

①柱平衡步骤：向吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(使用当天处理过的柱子)

②取5-15mL过夜培养的菌液加入离心管中，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，尽量吸除上清。注意：菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中。收集的菌体量以能够充分裂解为佳，菌体过多裂解不充分会降低质粒的提取效率。

③向留有菌体沉淀的离心管中加入500μL溶液P1(在使用前加入RNase A)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

④向离心管中加入500μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。注意要温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果菌液没有变清亮，可能是由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

⑤向离心管中加入700μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心30min，此时在离心管底部形成沉淀。P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

⑥将上一步收集的上清液分次加入吸附柱CP4中(吸附柱放入收集管中，其容量为750-800μL)，尽量不要吸出沉淀。12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

⑦向吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW(在使用之前加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4放入收集管中。

⑧重复操作步骤⑦。

⑨吸附柱CP4放入收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。为确保下游实验不受残留乙醇的影响，应将吸附柱CP4开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

⑩将吸附柱CP4置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加60-100μL洗脱缓冲液EB，室温放置30min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，可直接使用或保存于-20℃。

pLVX-Puro慢病毒载体线性化

根据pLVX-Puro质粒图谱选择XhoI和EcoRI限制性酶对载体进行切割，酶切反应体系如下表7所示：

表7.慢病毒载体的双酶切反应体系

将上述混合物置于200μL的EP管中，放入PCR仪中运行以下程序完成pLVX-Puro质粒的线性化：37℃，15min。线性化载体可以立即使用或者保存于-20℃。

琼脂糖凝胶回收

①琼脂糖凝胶电泳

a.制胶：配制足量的1×TAE电泳缓冲液，配胶和电泳用的电泳缓冲液需为同一次配制的；称量0.3g琼脂糖于锥形瓶中，加入1×TAE电泳缓冲液30ml，在微波炉中煮沸，多次少时煮沸，直至溶液澄清透明，加入3μL(万分之一)核酸染色剂混匀，降温至60℃左右时，倒入已经洁净并干燥的塑料模具板上，等待40min。

b.上样：将制备好的胶放入电泳槽中，加入适量的1×TAE电泳缓冲液。泳道中加入DL 10000DNA marker，吸取酶切产物与6×loading Buffer以5:1的比例混合，使上样体系中loading Buffer最终达到1×。

c.电泳：接通电源，设置电压为80V，时间为60min进行电泳。

d.成像：在紫外分析仪254nm和365nm下检视电泳结果，在凝胶成像系统中拍照。

②线性化载体胶回收

a.在紫外灯下将上一步骤中带有荧光条带的琼脂糖凝胶迅速切下，尽量得到只含线性化载体的凝胶，将胶块切碎，称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1mg＝1μL进行大致计算。向胶块中加入GSB溶液进行胶溶解，GSB溶液的体积与胶块体积之比为3:1。

b.于55℃水浴中融胶6min，间断(2-3min)混合，确保胶块完全融化。

c.待融化的凝胶溶液降至室温，加入离心柱中静置1min，10000×g离心1min，弃滤液。

d.吸取650μL的Washing Buffer于离心柱中，室温下，10000×g离心1min，弃滤液。

e.室温下，10000×g离心2min，彻底去除残留的Washing Buffer。

f.将离心柱置于一个新的EP管中，开盖静置1min，使残留乙醇挥发干净。

g.在柱的中央加入50μL去离子水，室温静置1min，10000×g离心1min，洗脱DNA，于-20℃保存。

(4)连接反应及连接产物的鉴定与扩增

连接反应：将双酶切后得到的目的片段与上述②得到的胶回收后的线性化载体进行连接，连接反应体系如下表8所示：

表8.连接反应体系

将上述混合物置于200μL的EP管中，放入PCR仪中运行以下程序完成连接反应：16℃连接过夜。

连接产物的鉴定和扩增：连接产物的转化、扩增、提取步骤同上述步骤“(3)线性化载体的回收”中的pLVX-Puro慢病毒载体的转化、扩增与提取的步骤，采用XhoI和EcoRI限制性酶对上述重组表达载体进行双酶切初步验证，酶切反应体系如下表9所示：

表9.重组慢病毒表达载体的双酶切反应体系

将上述混合物置于200μL的EP管中，放入PCR仪中运行以下程序完成酶切：37℃，15min。

以上制得的功能获得型突变R231Q重组慢病毒表达载体以及野生型(WT)慢病毒表达载体委托上海生工测序做进一步验证，测序结果采用ContingExpress和SnapeGene软件进行序列对比。

4)DOT1L野生型及R231Q突变型慢病毒的包装

(1)重组慢病毒的包装

1、转染前一天，取对数生长期的293T细胞用0.05％胰酶消化细胞1-2min，用含10％的DMEM培养基重悬293T细胞，铺2-3×10⁶个细胞至10cm皿中(密度为70％-80％)。

2、取准备好转染的293T细胞进行换液，加入不含双抗的培养基(DMEM+10％FBS)，抗生素对转染中细胞损伤大。

3、预先将质粒恢复到室温，按如下比例配置：

表10.慢病毒包装体系

4、取一支干净无菌的4mL EP管用于稀释质粒，加入不含血清的Opti-MEM的体积为1mL，按上表所示三种质粒的质量加入相应体积的目的质粒。

5、取48μL的TransIntro^TM EL加入到稀释好的质粒DNA中，轻柔混匀。

6、室温静置15-20min。

7、将质粒-TransIntro^TM EL复合物按同心圆的方法慢地滴加到待转染的293T细胞中，按十字架的方式轻晃匀10cm皿后，于培养箱中进行产毒。

8、细胞经转染试剂作用4-6h后，换成完全培养基，放在细胞培养箱中继续产毒48h。

9、转染48h后(此时293T长满)，收集上清液于10mL离心管中，3000rpm 4℃离心20min，或将上清液用0.45μm的低蛋白结合无菌针式滤器过滤。再向10cm大皿中加10cm培养液，24h之后，可以再次收集上清液，按照每次用量分装，保存于-80℃冰箱中(勿反复冻融)。

(2)目的细胞的感染

1、NCI-H460细胞(ATCC)、NCI-H1299细胞(ATCC)、NCI-H1975细胞(ATCC)和NCI-H446细胞(ATCC)为目的细胞，需要提前一天铺板至60mm皿，以保证感染时的密度为30-40％，同时准备一个对照组细胞不感染病毒。

2、提前取出病毒在冰上溶解，去除待转染细胞的培养液，每个皿中加入5mL病毒上清，同时加入破膜剂Polybrene，使其最终的浓度为5μg/mL(也可以根据自己的具体情况加入一定浓度的破膜剂)。

3、24h后，弃去病毒上清液，再向每个皿中加入5mL病毒上清，同时加入破膜剂Polybrene，使其最终的浓度为5μg/mL。

4、24h后，弃去病毒上清液，向每个皿中加入5mL完全培养基继续培养24h，目的是让细胞适应一段时间，后续加入相应浓度的抗生素进行筛选。

(3)目的细胞的筛选

1、最低致死浓度筛选

①将NCI-H460细胞(ATCC)、NCI-H1299细胞(ATCC)、NCI-H1975细胞(ATCC)和NCI-H446细胞(ATCC)以适当密度接种于24孔板中，以RPMI-1640培养液作为基础培养液，加入相应浓度的胎牛血清，在饱和湿度以及37℃，5％CO₂培养箱中培养，直至细胞密度达到50％左右。

②弃去24孔板中的培养液，用PBS清洗一次，更换为嘌呤霉素终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2μg/mL的完全培养液，做好标记，在饱和湿度以及37℃，5％CO₂培养箱中培养。

③加药细胞每隔一天用PBS清洗一次，并更换含有相应嘌呤霉素的完全培养液，在饱和湿度以及37℃，5％CO₂培养箱中连续培养3天。

④3天之后，观察24孔板中各个孔细胞的生长状态，选择3天能杀死孔内全部细胞的最低嘌呤霉素浓度为其对以上四种肺癌细胞的最低致死浓度。

2、将(2)中感染完成的目的细胞用PBS清洗一次，并更换含有嘌呤霉素最低致死浓度的完全培养液，在饱和湿度以及37℃，5％CO₂培养箱中连续培养3天，收取部分细胞，提蛋白，Western Blot实验验证转染效率，验证成功后的细胞进行大量冻存备用，用于后续实验。

5)免疫印迹考察蛋白的表达

(1)蛋白提取

1、待上述步骤“(3)目的细胞的筛选”中得到的贴壁细胞长至合适的密度，将细胞收集于10mL离心管中，离心5min(1500rpm/min)，弃去上清。

2、向管中沉淀加入2mL PBS冲洗，离心5min(1500rpm/min)，弃去上清，重复两次。

3、向管中沉淀加入适量含蛋白酶抑制剂(1:100)及磷酸酶抑制剂(1:100)的1×RIPA裂解液重悬细胞，将细胞重悬液迅速置于液氮中冷冻，然后取出后在室温快速摇晃融化，待液体融化后再将细胞重悬液重新置于液氮中迅速冷冻，反复冻融3次。

4、将反复冻融后的样品置于4℃离心机，离心15min(12000g/min)，尽可能只吸取上清液于1.5mL离心管中，置于冰上待用或保存于-80℃备用。

(2)蛋白浓度测定(BCA法)

BCA蛋白定量法是目前广泛使用的蛋白定量方法之一。该方法对蛋白质浓度的检测具有快速、稳定、灵敏的特点。在碱性环境下，蛋白质分子中的肽链结构能与Cu²⁺络合生成络合物，同时将Cu²⁺还原成Cu⁺。BCA试剂可敏感特异地与Cu⁺结合，形成稳定的有颜色的复合物。在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来测定蛋白质的含量。蛋白溶液可精确测定浓度为2.5-200μg/ml。操作步骤如下：

1、BSA标准品稀释：按说明书将BSA标准品稀释，最终使其形成0、0.0625、0.125、0.25、0.5、1和2μg/μL梯度液。

2、BCA工作液：按照说明书将BCA的A液和B液以50:1的比例配置。

3、吸光度检测：取20μL标准品梯度液或样品于96孔板中，每个样本设置3个复孔。然后加入180μL BCA工作液，充分混匀，于37℃恒温箱孵育30min。取出样品冷却至室温，用酶标仪检测562nm处的吸光度。

4、计算蛋白浓度：根据标准品梯度液吸光度绘制标准曲线，计算待测样品浓度。

5、蛋白变性：根据计算出的蛋白浓度，用PBS配平各个样品，再加入1/4总体积的5×SDS-PAGE上样缓冲液，涡旋混匀，使上样缓冲液最终达到1×浓度，100℃金属浴加热5min，可立即上样或-80℃保存备用。

(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

1、分离胶和浓缩胶配制：根据目的蛋白和内参蛋白的分子量选择适合浓度的分离胶和浓缩胶。将分离胶各组分依次快速加入到50mL EP管中混合均匀，迅速灌入电泳玻璃板，并预留适当高度用于配制浓缩胶。灌好分离胶后，缓慢加入ddH₂O进行液封，室温放置40-60min使分离胶充分凝固。将胶架倾斜，用滤纸吸去分离胶上方的水分，然后按照表中配制浓缩胶并涡旋混匀，迅速灌入电泳玻璃板中，插上梳子，室温静置30-40min凝固。

2、上样：待浓缩胶凝固之后，将凝胶放入电泳槽中加入适量的1×电泳液(现配现用)，将梳子取出，用移液枪反复吹打样品孔赶走气泡，将上述步骤“(2)蛋白浓度测定(BCA法)”中配好的蛋白准备好，在边孔中加入1×上样缓冲液，然后将蛋白样品与合适分子量的Marker按照需求加入到剩余的上样孔中；

3、电泳：上样完成后，将电泳仪的电压调整至60V进行电泳，大约40min左右。待Marker分开后，将电压调至120V继续电泳，大约1h，待上样缓冲液电泳至合适位置，即可终止电泳。

(4)蛋白印迹

1、提前准备电转滤纸分别浸泡于阳I、阳II和阴极电转缓冲液中，4℃预冷待用。在转膜前，用甲醇将PVDF膜活化，然后放入阳II电转缓冲液进行平衡。

2、将电泳后的凝胶取出，从下往上依次按照阳I、阳II、PVDF膜、凝胶及阴极的顺序，将其放入半干转仪器中，排尽气泡。

3、根据目标蛋白分子量及内参蛋白分子量设置转膜时间，恒压22V，20-50min进行转膜。

(5)免疫检测

1、将电转完成的PVDF膜置于封闭液中，再放置在摇床上，室温封闭1h。

2、用5％BSA将一抗(Abcam)稀释至适当浓度，将含有目的条带的PVDF膜放入一抗稀释液中孵育，置于摇床上4℃过夜。

3、将过夜孵育的PVDF膜置于摇床上恢复室温1h，回收一抗。用TBST清洗3次，每次10min。

4、用5％BSA将二抗(Abcam)稀释至适当浓度，将含有目的条带的PVDF膜放入二抗稀释液中孵育，室温置于摇床上孵育1h。

5、弃去二抗，用TBST清洗3次，每次10min。

6、将PVDF膜转移到铺有保鲜膜的曝光夹上，在暗室中滴加适量ECL化学发光液，放入X胶片，或者用成像系统进行曝光。

7、选取适当曝光时间，取出胶片置于显影液中显影1min，清水漂洗，定影液中定影30s，流水冲洗，晾干，扫描成图片。

3.实验结果

图1A-图1D所示，在构建完DOT1L野生型表达载体和突变型表达载体后采用琼脂糖凝胶电泳和测序进行结果分析。如图1A所示，将连接成功的重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示条带位于7500至10000bp之间，与预期的载体大小一致。图1B为对连接成功的载体进行测序的结果，测序结果分析显示目的片段成功连入空载体，且无突变碱基。

如图1C所示，对9种突变的组蛋白甲基转移酶DOT1L(I232N、Y216C、F243L、A1003G、N241T、E186A、A1003S、S225L、R231Q)进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示9种突变的载体条带位于7500至10000bp之间，与预期的载体大小一致。随后也将9种突变载体送测序，如图1D所示，测序结果表明9种突变的DOT1L目的片段均已成功连入空载体中，且无额外突变的碱基。

如图2A-图2D所示，在构建9种突变的DOT1L后，经过生物学功能实验的筛选，发现一个功能获得型基因突变R231Q，随后对该突变进行慢病毒表达载体的构建，将构建成功的慢病毒载体包装成病毒颗粒，再将其感染目的细胞后进行蛋白免疫印迹实验检测目的蛋白的表达。如图2A所示，对构建成功的慢病毒表达载体进行双酶切验证，从琼脂糖凝胶电泳的初步结果中可以看出，目的片段已经成功连入慢病毒空载中，PCR目的片段的位置大小大约在1200bp左右，而线性化载体片段大小位置在8000bp左右，与预期结果一致。随后对载体进行基因测序，如图2B-图2C所示，无论是野生型慢病毒表达载体还是突变型慢病毒表达载体，测序结果均显示目的片段成功连入慢病毒空载中，并且均未发生碱基突变。再将构建成功的慢病毒载体进行包装成病毒颗粒用于感染目的细胞，从图2D的结果中可以看出，目的细胞中的蛋白均表达，从而验证了慢病毒包装成功。

4.结论

1.本发明成功构建出9种突变的DOT1L表达载体，分别为I232N、Y216C、F243L、A1003G、N241T、E186A、A1003S、S225L、R231Q的DOT1L表达载体。

2.在瞬时表达载体的基础上，成功构建出稳定表达R231Q突变的DOT1L慢病毒表达载体。

3.在构建成功的慢病毒表达载体的基础上，成功包装出用于感染目的细胞的慢病毒颗粒。

实验例2：组蛋白甲基转移酶DOT1L的9种突变位点的检测

(1)引物设计与合成

根据DOT1L突变的基因序列设计引物，通过Primer Premier 5.0软件设计引物，并在yeastgenome网站上筛选优化，引物序列设计如下：

表11.检测DOT1L突变的引物

该序列委托上海生工生物技术公司合成。

(2)PCR扩增

将上述引物用ddH₂O配制成100μM的储备液，再用ddH₂O稀释成10μM待用。分别以前期9种突变型DOT1L表达载体为模板，采用上述引物和2×Super Pfx MasterMix试剂盒进行PCR反应，PCR反应体系如下所示：

表12.PCR反应体系

将表12中的PCR反应体系置于200μL的EP管中，放入PCR仪中运行以下程序完成PCR扩增：以98℃预变性3min，98℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸15sec为一个循环，进行30次循环后，72℃终延伸5min。

(3)琼脂糖凝胶电泳验证

取R231Q的PCR扩增产物5μL，加入溴酚蓝1μL，于含0.5μg/mL溴化乙啶(EB)的1.2％琼脂糖凝胶中电泳，扩增条带与标准DNA分子量条带比较，其结果如图8所示。

(4)实验结果

本申请针对9种突变的组蛋白甲基转移酶DOT1L(I232N、Y216C、F243L、A1003G、N241T、E186A、A1003S、S225L、R231Q)的突变位点设计检测引物，选取其中的R231Q引物进行验证，由图8所示，该引物可以用于检测R231Q突变。

(5)结论

本发明成功构建出能够检测9种突变(I232N、Y216C、F243L、A1003G、N241T、E186A、A1003S、S225L、R231Q)的引物。

实验例3：9种突变位点的组蛋白甲基转移酶DOT1L对肺癌恶性表型的影响

1.材料

细胞株

人非小细胞肺癌细胞NCI-H460，购自ATCC；

2.方法

1)细胞转染

(1)细胞培养：接种汇合度为50％的H460细胞于60mm培养皿中，以RPMI-1640培养液作为基础培养液，常规加入10％胎牛血清，在饱和湿度，37℃，5％CO₂培养箱中培养至细胞汇合度达到70％～90％，转染前弃去原培养液，PBS清洗两次，加入适量Opti-MEM培养基放入培养箱待用。

(2)Opti-MEM培养基稀释lipofectamine 3000，根据倍增系数。取Opti-MEM培养基250μL，加入lipofectamine 3000脂质体8.25μL并充分混匀。另取Opti-MEM培养基250μL，加入8μg质粒，充分混匀。将上述两支离心管内液体混合，轻轻吹打，混匀后室温孵育5min，使DNA-脂质体复合物形成。

(3)转染：从培养箱中取出细胞，将上步制备的DNA-脂质体复合物逐滴加入培养皿中，轻轻混匀放入培养箱。转染6h之后弃去培养液，换成含血清的培养基，在饱和湿度，37℃，5％CO₂培养箱中继续培养48h，培养48h期间可更换培养基一次。

(4)按上述步骤分别转染实验例1制备的I232N、Y216C、F243L、A1003G、N241T、E186A、A1003S、S225L、R231Q，9种突变型表达载体，空载体及野生型表达载体的质粒，分别将以上细胞命名为H460/I232N、H460/Y216C、H460/F243L、H460/A1003G、H460/N241T、H460/E186A、H460/A1003S、H460/S225L、H460/R231Q、H460/pCMV6-EntryVector和H460/WT细胞。

2)MTT检测细胞不同时间点的增殖

(1)接种细胞：取上述步骤“1)细胞转染”中的对数生长期的H460/I232N、H460/Y216C、H460/F243L、H460/A1003G、H460/N241T、H460/E186A、H460/A1003S、H460/S225L、H460/R231Q、H460/pCMV6-EntryVector和H460/WT细胞，分别用胰酶消化，将细胞重悬于培养液，计数3次，取均值，调整细胞悬液至等密度。用含10％血清培养液制成单个细胞悬液，分别以5000个/孔、4000个/孔、3000个/孔，2000个/孔的密度接种于96孔板，100μL/孔。分别于饱和湿度，37℃，5％CO₂培养箱中培养24h、48h、72h、96h。

(2)呈色：到达时间点后，每孔加入MTT溶液10μL，继续孵育3～5h，终止培养，弃去上清，每孔加入二甲基亚砜溶液100μL，震荡溶解结晶物；

(3)比色：将96孔板置于酶标仪中，492nm波长处检测各孔OD值，与H460/pCMV6-EntryVector相比计算各组细胞增殖率。

细胞增殖率％＝待测组OD值平均值/(H460/pCMV6-EntryVector组OD值得平均值)×100％

3)平皿克隆实验

(1)取上述步骤“1)细胞转染”中的对数生长期的H460/I232N、H460/Y216C、H460/F243L、H460/A1003G、H460/N241T、H460/E186A、H460/A1003S、H460/S225L、H460/R231Q、H460/pCMV6-EntryVector和H460/WT细胞，用胰酶消化各表达载体细胞，将细胞重悬于培养液，计数3次，取均值，调整细胞悬液至等密度。将细胞以每孔500个的密度接种于含10％血清培养基的六孔板中培养，每孔2mL完全培养基，接种时十字方向晃动培养皿，使细胞尽量均匀分布。在饱和湿度，37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

(2)细胞在饱和湿度，37℃，5％CO₂的培养箱中培养2-3周，每3天更换一次培养基，直至显微镜下观察到各组集落形成，且每个集落至少由50个细胞组成。

(3)待集落长成后，终止细胞培养。弃去培养基，用PBS轻轻清洗6孔板底3次，弃去PBS，然后用4％多聚甲醛室温固定15min。弃去固定液后，PBS清洗6孔板底3次，弃去PBS，每孔加入500μL 0.2％结晶紫染色液，室温染色30min。染色后，用流水轻轻洗掉染色液(以细胞被染色，空白处干净透明为标准)，放置于通风处自然晾干。照相，并计数分析(超过50个细胞的克隆数)。实验独立重复三次，取均值和方差。

4)划痕实验

(1)将上述步骤“1)细胞转染”的细胞铺于24孔板内，每孔25万个细胞，37℃培养箱培养过夜。

(2)用枪头进行划痕，PBS缓冲液清洗细胞三次，洗掉细胞碎片，置于倒置显微镜进行拍照，记为0h划痕找照片。换无血清的培养液(排除细胞增殖的影响)。

(3)将细胞置于饱和湿度，37℃，5％CO₂的培养箱中培养，定期进行拍照处理。Image J软件，统计每组细胞的划痕情况，分析计算各时间点的划痕面积，将软件边缘计算处理后的结果图片倒出。细胞迁移率计算方法：细胞迁移率＝(划痕面积0h-划痕面积24h)/划痕面积0h×100％

3.实验结果

DOT1L9种功能获得型基因突变对肺癌细胞恶性表型的影响

首先将构建成功的9种突变型表达载体经转染至H460细胞中，如图3A所示，Western结果表明各组突变细胞的目的蛋白均表达，说明构建成功的9种突变载体已成功转染至目的细胞中。随后对构建成功的目的细胞进行底物水平的检测(操作步骤同实验例1的“5)免疫印迹考察蛋白的表达”)，如图3B所示，Western结果表明，A1003G、E186A、S225L、R231Q突变转染的H460细胞与对照组细胞(H460/WT、H460/Vector)相比，H3K79me2表达显著升高。

如图3C-图3E所示，MTT结果显示，R231Q突变转染的H460细胞与对照组细胞(H460/WT、H460/Vector)相比，在24、48和72小时三个时间点的细胞增殖能力均显著增强，说明R231Q突变的DOT1L在一定程度上可以促进肿瘤细胞的增殖。

如图3E所示，MTT结果显示，F243L和S225L突变转染的H460细胞与对照组细胞(H460/WT、H460/Vector)相比，在72小时的时间点的细胞增殖能力也均显著增强。

接下来对各突变组细胞进行了克隆形成能力的考察，如图3F所示，平皿克隆实验结果表明F243L、S225L和R231Q突变转染的H460细胞与对照组细胞(H460/WT、H460/Vector)相比，克隆形成能力显著增强。

最后又考察了9种DOT1L突变对肺癌细胞迁移能力的影响，如图3G所示，划痕实验结果说明与对照组细胞(H460/WT、H460/Vector)相比，I232N、Y216C、F243L、A1003G、N241T、R231Q突变转染的H460细胞的迁移能力显著增加。

4.结论

1.在组蛋白甲基转移酶DOT1L9种病理性突变转染的肺癌细胞中，A1003G、E186A、S225L、R231Q这四种突变促进该酶底物H3K79me2的表达水平。

2.在组蛋白甲基转移酶DOT1L9种病理性突变转染的肺癌细胞中，F243L、S225L、R231Q突变在一定程度上可以促进肿瘤细胞的增殖；F243L、S225L和R231Q突变可以增强肺癌细胞的克隆形成能力；I232N、Y216C、F243L、N241T、R231Q、A1003G突变使得肺癌细胞的迁移能力显著增加。

实验例4：DOT1L功能获得型突变R231Q对肺癌细胞恶性表型的影响

从上述9种突变的DOT1L中筛选出可以显著促进肺癌细胞恶性表型的突变R231Q，对其功能进行进一步的确证。

(1)DOT1L病理性突变R231Q对其底物水平的影响

DOT1L是一种进化上保守的组蛋白甲基化转移酶，可以使组蛋白H3第79位赖氨酸(H3K79)甲基化，并且是迄今为止发现的唯一可以使H3K79发生甲基化的酶。DOT1L通过使H3K79甲基化，引起细胞生物学功能的改变。本发明检测了病理性突变的稳转肺癌细胞的H3K79的双甲基化水平(操作步骤同实验例1的“5)免疫印迹考察蛋白的表达”)，确定R231Q突变对DOT1L功能的影响。

结果如图4A所示，在H460肺癌细胞中，突变组(NCI-H460/R231Q)与野生型组(NCI-H460/WT)细胞相比，H3K79me2表达升高。这说明DOT1L病理性突变R231Q在一定程度上增强了DOT1L酶的活性。

(2)DOT1L病理性突变R231Q对肺癌细胞增殖能力的影响

采用实时无标记细胞分析技术(RTCA)检测NCI-H460/R231Q细胞和NCI-H460/WT细胞0-96h中增殖能力的实时变化情况。

实时无标记细胞分析实验(RTCA实验)

1)细胞增殖板E-Plate装配及基线测量

1、E-Plate装配：在超净台内将细胞增殖板从包装袋中取出，将夹具放在超净台上，使蓝色标志点位于夹具的左上方，将其平稳地放到夹具对应的凹槽中。

2、在细胞增殖板中加入50μL完全培养基，注意加液时不要产生气泡，可以使用反相移液法，实验组培养液中含10％FBS，对照组的培养液中不加FBS。

3、轻拍板四周，使培养基分布均匀。将E-plate板置于37℃，5％CO₂培养箱平衡1h。

4、基线测量：将平衡1h的E-plate板置于RTCA DP Analyzer上，开始基线检测。

2)细胞悬液准备

从培养箱中取出H460空白、DOT1L-WT及DOT1L-R231Q这3种稳转细胞株，弃去培养液，PBS涮洗1遍，胰酶消化，离心5min后，用细胞自动计数仪计数，用完全培养液稀释细胞使其细胞密度达到3×10⁴cells/ml。

3)接种细胞

将测好基线的E-plate板从仪器上取出，在孔中加入100μL细胞悬液，于超净台中室温放置30min后，放入设定好程序的仪器中实时自动检测。

结果如图4B所示，其中突变型组细胞(NCI-H460/R231Q细胞)与野生型组细胞(NCI-H460/WT细胞)相比，突变组细胞的增殖能力无论是在哪一个时间点都明显强于野生组，说明R231Q突变在一定程度上使细胞的增殖能力增强。然而由于R231Q突变细胞的H3K79me2水平增强，说明突变对H3K79me2的调节可能影响着细胞的增殖能力。

(3)DOT1L病理性突变R231Q对肺癌细胞克隆形成能力的影响

克隆形成能力是考察肺癌细胞恶性程度的重要指标，本发明通过克隆形成实验(操作步骤同实验例3的“3)平皿克隆实验”)考察DOT1L病理性突变R231Q对肺癌细胞克隆形成能力的影响。结果如图4C所示，在培养7-10天后，与野生型组相比，H460/R231Q突变组细胞的集落形成数量显著升高，提示组蛋白甲基转移酶DOT1L病理性突变R231Q会导致肿瘤细胞增殖能力增强。

(4)DOT1L病理性突变R231Q对肺癌细胞迁移能力的影响

细胞迁移能力的增强是肿瘤恶性程度增加的特性之一，Transwell迁移实验是检测细胞迁移能力的实验方法。通过细胞Transwell迁移实验考察DOT1L病理性突变R231Q对肺癌细胞迁移能力的影响。

Transwell迁移实验

1)Transwell小室准备

将Transwell小室从包装中取出后放入已经准备好的新的无菌24孔板中，并做好标记。

2)制备细胞悬液

分别制备H460空白、DOT1L-WT及DOT1L-R231Q这3种稳转细胞株悬液前将细胞血清饥饿12-24h，进一步去除血清的影响，该步骤为可选步骤。从培养箱中取出细胞，弃去原培养液，PBS涮洗1遍，用0.25％胰酶消化，离心5min后，用细胞自动计数仪计数，用不含血清培养液稀释细胞使其细胞密度达到1×10⁶cells/ml。

3)接种细胞

1、取已经制备好的细胞悬液100μL加入到Transwell小室中。

2、24孔板下室加入50μL含血清的培养液，特别注意的是下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至是消失，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起去除气泡，再将小室放回板中。

3、培养细胞：常规培养12-48小时(主要根据癌细胞的迁移能力而定)，时间点的选择除了要考虑到细胞的迁移能力外，处理因素对细胞数目的影响也不容忽视。

4)染色

待细胞培养48h结束后，将小室取出放入到含有钙黄绿素乙酰甲酯的PBS中37℃染色15-20min，待染色结束后用棉签轻轻擦去上室中未迁移的细胞，PBS洗三遍。荧光显微镜下随机五个视野观察细胞并计数。

在培养48小时后，荧光显微镜下随机选取5个视野计算迁移细胞数的平均值，三次生物学重复后统计结果如图4D所示：与野生型组(NCI-H460/WT)相比，H460突变组(NCI-H460/R231Q)细胞的迁移个数显著增加，NCI-H460/R231Q、NCI-H460/WT以及H460/pLVX-puro细胞的迁移个数分别为：221±4.10％、195±0.58％、190±0.58％；提示DOT1L病理性突变R231Q会导致肺癌细胞迁移能力增强。

结论

1.在瞬时转染结果的基础上，筛选出的功能获得型基因突变R231Q可以使得DOT1L的底物H3K79me2水平增加，与前述结果一致。

2.功能获得型突变R231Q使得肺癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力均显著增强，该突变可以增加肺癌的恶性表型，与瞬时转染结果一致。

由实验例3-4的实验结果显示，在瞬时转染的结果中筛选出了A1003G、N241T、E186A、S225L、F243L、I232N、Y216C、R231Q在一定程度上可以影响肺癌的恶性表型，并且首次发现DOT1L的一个功能获得型基因突变R231Q；在瞬时转染的基础上，通过构建慢病毒表达载体建立稳转肺癌细胞株，进一步确证了R231Q突变促进了肺癌细胞的增殖、克隆形成和迁移能力，提示R231Q突变可能作为肺癌新的生物学标志物，并且靶向该突变的药物可能对肺癌的治疗具有重要意义。

实验例5：DOT1L小分子抑制剂对稳定表达DOT1L-R231Q突变的稳转肺癌细胞株的抑制作用

1.材料

细胞株

人非小细胞肺癌细胞NCI-H460-R231Q、NCI-H1299-R231Q、NCI-H1975-R231Q，NCI-H446-R231Q，为本实验室自我构建。

药物

DOT1L小分子抑制剂EPZ004777、SGC0946(MCE官网购入)

2.方法

1)药物配制

(1)EPZ004777(100mM)：用分析天平称取适量EPZ004777白色粉末溶于一定体积的DMSO中，配制成100mM母液，0.22μm滤膜过滤，分装于200μL的离心管中，避光避免反复冻融，-20℃保存。临用前用完全培养液稀释到所需浓度，需保证药品溶液中DMSO在完全培养液中的终浓度不超过0.1％。该药物较为难溶，一般临用前在水浴锅中加热使其溶解。

(2)SGC0946(100mM)：用分析天平称取适量SGC0946白色粉末溶于一定体积的DMSO中，配制成100mM母液，0.22μm滤膜过滤，分装于200μL的离心管中，避光避免反复冻融，-20℃保存。临用前用完全培养液稀释到所需浓度，需保证药品溶液中DMSO在完全培养液中的终浓度不超过0.1％。

2)克隆形成实验

操作步骤同实验例3的平皿克隆实验

3)加药处理

待克隆稳定48小时后，将配置好的药物按照所需浓度加入培养皿中，每48小时换液加药处理，待空白组出现明显克隆时，显微镜下观察克隆形成情况，以每个克隆大小为50个细胞为宜。

3.实验结果

1)EPZ004777对R231Q突变细胞的抑制作用

克隆形成能力是考察肺癌细胞增殖情况的重要指标。因小分子抑制剂发挥作用通常需要较长的一段时间，所以在实验例中主要利用克隆形成实验考察小分子抑制剂对DOT1L突变的肺癌细胞的抑制作用。结果如图5A-图5D所示，每两天对突变细胞换液并加药，培养7-10天后，与对照组相比，四种肺癌细胞不同加药组的集落形成数量减少。其中在NCI-H460和NCI-H1975突变细胞中，当药物浓度为30μM时，抑制作用最好；在NCI-H1299突变细胞中，抑制作用最强的浓度为25μM；而在NCI-H446突变细胞中，抑制作用最强的浓度却为10μM。从以上结果可以得出，小分子抑制剂EPZ004777对肺癌突变细胞具有一定的抑制作用，但抑制作用并不是随着其浓度的增加而增强，并且在每种类型的肺癌突变细胞中，最佳抑制浓度不同。

2)SGC0946对R231Q突变细胞的抑制作用

克隆形成能力是考察肺癌细胞增殖情况的重要指标。因小分子抑制剂发挥作用通常需要较长的一段时间，所以在本章中主要利用克隆形成实验考察小分子抑制剂对DOT1L突变的肺癌细胞的抑制作用。结果如图5E-图5H所示，每两天对突变细胞换液并加药，培养7-10天后，与对照组相比，四种肺癌细胞不同加药组的集落形成数量减少。在这四种突变的肺癌细胞中，小分子抑制剂SGC0946对其抑制作用较为明显，并且呈现剂量依耐性的抑制四种突变细胞的增殖。其中在NCI-H460突变细胞中，当药物浓度为15μM时，突变细胞已经被明显的抑制；在NCI-H1975和NCI-H446突变细胞中，突变细胞在药物浓度为20μM时被明显的抑制；而在NCI-H1299突变细胞中，SGC0946也表现出较好的抑制作用，在药物浓度为30μM时，抑制作用最强。从以上结果可以得出，小分子抑制剂SGC0946对肺癌突变细胞具有较强的抑制作用，并且呈现剂量依耐性的抑制突变细胞的增殖。

4.结论

1.DOT1L小分子抑制剂EPZ004777对稳定表达DOT1L-R231Q突变的稳转肺癌细胞株具有较强的抑制作用。

2.DOT1L小分子抑制剂SGC0946对稳定表达DOT1L-R231Q突变的稳转肺癌细胞株具有显著的抑制作用，并且呈现剂量依耐性的抑制突变细胞的增殖。

实验例6：选取组蛋白甲基转移酶DOT1L的7种突变位点考察其对多种恶性肿瘤细胞增殖的影响

1.材料

细胞株

人乳腺癌细胞MCF-7(购自ATCC)；人前列腺癌细胞PC-3(购自ATCC)；人肝癌细胞Hep-3B(购自ATCC)；人结肠癌细胞Colo-205(购自ATCC)；人胃癌细胞AGS(购自ATCC)；人胶质瘤细胞U251(购自ATCC)

2.方法

1)细胞转染

(1)细胞培养：接种汇合度为50％的细胞于60mm培养皿中，以RPMI-1640培养液作为基础培养液，常规加入10％胎牛血清，在饱和湿度，37℃，5％CO₂培养箱中培养至细胞汇合度达到70％～90％，转染前弃去原培养液，PBS清洗两次，加入适量Opti-MEM培养基放入培养箱待用。

(4)按上述步骤分别转染I232N、Y216C、F243L、N241T、S225L、R231Q、A1003S，7种突变型表达载体，空载体及野生型表达载体的质粒。

2)MTT检测细胞不同时间点的增殖

(1)接种细胞：取对数生长期的细胞，分别用胰酶消化，将细胞重悬于培养液，计数3次，取均值，调整细胞悬液至等密度。用含10％血清培养液制成单个细胞悬液，分别以5000个/孔、4000个/孔、3000个/孔，2000个/孔的密度接种于96孔板，100μL/孔。分别于饱和湿度，37℃，5％CO₂培养箱中培养24h、48h、72h、96h。

(3)比色：将96孔板置于酶标仪中，492nm波长处检测各孔OD值，与pCMV6-DOT1L野生型(WT)相比计算各组细胞增殖率。

细胞增殖率％＝待测组OD值平均值/(pCMV6-DOT1L野生型组OD值得平均值)×100％

3.实验结果

DOT1L的7种功能获得型基因突变对多种恶性肿瘤细胞(乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌和胶质瘤细胞)增殖的影响

如图6A-图6C所示，MTT结果显示，I232N、Y216C、F243L、E186A、S225L、R231Q、A1003S突变转染的细胞与对照组细胞相比，在72小时时间点的细胞增殖能力均显著增强，说明上述突变的DOT1L在一定程度上可以促进肿瘤细胞的增殖。

4.结论

在组蛋白甲基转移酶DOT1L9种病理性突变转染的肿瘤细胞中，I232N、Y216C、F243L、E186A、S225L、R231Q、A1003S突变在一定程度上均可以促进肿瘤细胞的增殖。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对DOT1L突变位点作为肺癌中检测的生物标记物以及作为治疗肺癌中治疗药物靶点的可能性作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

产业上的可利用性

本发明提供的DOT1L病理性突变能够作为诊断、预后和用药判断的肿瘤生物标志物，并且能够作为多种恶性肿瘤治疗靶点。

序列表

<110> 沈阳药科大学

<120> DOT1L突变作为癌症的生物标志物以及治疗靶点的应用

<130> 6660-2053482I

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L Forward

<400> 1

gaggcgatcg ccatggggga gaa 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L Reverse

<400> 2

gcgacgcgtg ttacctccaa ctga 24

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-I232N-F1

<400> 3

gaaacgccaa cacgagtgtt atatttgtga at 32

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-I232N-R1

<400> 4

actcgtgttg gcgtttcgct ccctccactc ttctg 35

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-Y216C-F1

<400> 5

tgcagaatgc acattggaga gaggcgattt cc 32

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-Y216C-R1

<400> 6

ccaatgtgca ttctgcatgc tttttttcat acca 34

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-F243L-F1

<400> 7

taatctggcc tttggtcctg aggtggatca cc 32

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-F243L-R1

<400> 8

gaccaaaggc cagattattc acaaatataa cactcgtgtt gg 42

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-N241T-F1

<400> 9

ttgtgaccaa ttttgccttt ggtcctgagg tg 32

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-N241T-R1

<400> 10

ggcaaaattg gtcacaaata taacactcgt gttggcg 37

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-E186A-F1

<400> 11

actatggcgt cgccaaagca gacatcccgg cc 32

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-E186A-R1

<400> 12

tttggcgacg ccatagtgat gtttgcagtt gg 32

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-S225L-F1

<400> 13

tttcctcctg gaagagtgga gggagcgaat cg 32

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-S225L-R1

<400> 14

actcttccag gaggaaatcg cctctctcca at 32

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-R231Q-F1

<400> 15

agggagcagc agatcgccaa cacgagtgtt atattt 36

<210> 16

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-R231Q-R1

<400> 16

ttggcgatct gctccctcca ctcttctgag agga 34

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-A1003S-F1

<400> 17

tctcccagcc accagctctc ctccagtccc cg 32

<210> 18

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-A1003S-R1

<400> 18

agctggtggc tgggagaggc aggaagcgag tt 32

<210> 19

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-A1003G-F1

<400> 19

tctcccggcc accagctctc ctccagtccc cg 32

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-A1003G-R1

<400> 20

agctggtggc cgggagaggc aggaagcgag tt 32

<210> 21

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-R231Q-Forward

<400> 21

ccgctcgaga tgggggagaa gctggagc 28

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-R231Q-Reverse

<400> 22

cggaattctt acttcttggg gcgcccgcg 29

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-WT-Forward

<400> 23

ccgctcgaga tgggggagaa gctggagc 28

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-WT- Reverse

<400> 24

cggaattctt acttcttggg gcgcccgcg 29

<210> 25

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-I232N-F2

<400> 25

cagaagagtg gagggagcga aacgccaa 28

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-I232N-R2

<400> 26

aatataacac tcgtgttggc gtttcgct 28

<210> 27

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-Y216C-F2

<400> 27

atgaaaaaaa gcatgcagaa tgcacatt 28

<210> 28

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-Y216C-R2

<400> 28

aaatcgcctc tctccaatgt gcattctg 28

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-F243L-F2

<400> 29

gtgttatatt tgtgaataat ctggcctt 28

<210> 30

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-F243L-R2

<400> 30

tccacctcag gaccaaaggc cagattat 28

<210> 31

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-N241T-F2

<400> 31

acacgagtgt tatatttgtg accaattt 28

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-N241T-R2

<400> 32

tcaggaccaa aggcaaaatt ggtcacaa 28

<210> 33

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-E186A-F2

<400> 33

gcaaacatca ctatggcgtc gccaaagc 28

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-E186A-R2

<400> 34

ttggccggga tgtctgcttt ggcgacgc 28

<210> 35

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-S225L-F2

<400> 35

tggagagagg cgatttcctc ctggaaga 28

<210> 36

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-S225L-R2

<400> 36

attcgctccc tccactcttc caggagga 28

<210> 37

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-R231Q-F2

<400> 37

tctcagaaga gtggagggag cagatcgc 28

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-R231Q-R2

<400> 38

ataacactgt gttggcgatt cgctccc 27

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-A1003S-F2

<400> 39

actcgcttcc tgcctctccc agccacca 28

<210> 40

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-A1003S-R2

<400> 40

ggactggagg agagctggtg gctgggag 28

<210> 41

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-A1003G-F2

<400> 41

actcgcttcc tgcctctccc ggccacca 28

<210> 42

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DOT1L-A1003G-R2

<400> 42

ggactggagg agagctggtg gccgggag 28

Claims

1.一种用于诊断和治疗癌症的分子标志物，其特征在于，所述分子标志物为位于组蛋白甲基转移酶DOT1L功能活性域DOT区域内的病理性突变位点，所述病理性突变位点选自I232N、Y216C、F243L、N241T、E186A、S225L、R231Q、A1003S、A1003G中的1种或多种。

2.根据权利要求1所述的分子标志物，其特征在于，所述病理性突变位点选自I232N、Y216C、F243L、E186A、S225L、R231Q、A1003G中的1种或多种，更优选选自F243L、S225L、R231Q中的1种或多种，进一步优选选自R231Q。

3.检测权利要求1或2所述的分子标志物的引物在制备癌症诊断与预后检测的试剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，组蛋白甲基转移酶DOT1L在病理性突变位点发生突变，引起癌细胞恶性表型，所述病理性突变位点选自I232N、Y216C、F243L、N241T、E186A、S225L、R231Q、A1003S、A1003G中的1种或多种。

5.根据权利要求3或4所述的应用，所述E186A、S225L、R231Q、A1003G的突变促进组蛋白甲基转移酶DOT1L的酶底物H3K79me2的表达水平，

所述I232N、Y216C、F243L、E186A、S225L、R231Q、A1003S的突变增强癌细胞增殖能力，

所述F243L、S225L、R231Q的突变增强癌细胞的克隆形成能力，

所述I232N、Y216C、F243L、N241T、R231Q、A1003G的突变增加癌细胞的迁移能力，

所述R231Q的突变为功能获得型基因突变。

6.根据权利要求1或2所述的分子标志物或根据权利要求3-5中任一项所述的应用，所述癌症包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、胶质瘤。

7.一种用于检测权利要求1或2所述的分子标志物的引物，其特征在于，所述引物包括：

用于检测I232N的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示；

用于检测Y216C的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示；

用于检测F243L的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示；

用于检测N241T的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示；

用于检测E186A的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示；

用于检测S225L的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示；

用于检测R231Q的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示；

用于检测A1003S的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示；

用于检测A1003G的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示。

8.一种用于检测权利要求1或2所述的分子标志物的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求7所述的引物。

9.权利要求1或2所述的分子标志物作为药物靶标在离体筛选抗肿瘤药物中的应用。

10.DOT1L小分子抑制剂在制备抗癌药物中的应用，所述DOT1L小分子抑制剂用于抑制权利要求1或2所述的分子标志物所引起的癌细胞的恶性表型，优选地，所述抗癌药物包括治疗肺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌、胶质瘤的药物，优选地，所述癌细胞的恶性表型包括癌细胞的增殖。