CN112410429A - Fxyd3作为胃癌诊断标志物和治疗靶标的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了FXYD3作为胃癌诊断标志物和治疗靶标的应用，涉及医学生物检测技术领域，本发明构建了能够用于胃癌诊断试剂或试剂盒的特异性检测引物，用于检测组织标本或血浆、血清、血小板等血液样本。本发明还包括FXYD3在制备预防或治疗胃癌的药物组合物中的应用，该药物为抑制FXYD3表达的药物。FXYD3在胃癌发生、进展中具有重要功能，能够作为诊断、治疗的靶标，具有良好的临床应用价值。

Description

FXYD3作为胃癌诊断标志物和治疗靶标的应用
技术领域
本发明属于医学生物检测技术领域，尤其涉及FXYD3作为胃癌诊断标志物和治疗靶标的应用。
背景技术
胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，尽管其发病率在全球呈普遍下降趋势，但在中国、日本和拉丁美洲地区仍维持较高的发病率。由于大多数胃癌患者就诊时已属于晚期，丧失手术时机，严重影响患者生存质量，预后极差。胃癌预后与早期诊断密切相关，阐明胃癌进展中特异性分子标记物对认识胃癌进展的分子机制及提供可能的治疗靶标至关重要。研究表明，已发现的早期的胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)分子，传统的肿瘤标记物癌胚抗原(CEA)、糖链抗原19-9(CA19-9)和CA72-4分子，以及三叶因子3(trefoil factors 3，TFF3)等，是反映胃癌进展的重要分子标记物，但对胃癌的诊断具有局限性，特异性不高。而且，不同地区因遗传背景和生活环境的不同，胃癌分子标记物往往存在差异。因此，继续发掘胃癌特异性的新型分子标记的研究显得尤为迫切。
FXYD3含有FXYD结构域，属于FXYD蛋白家族。据报道，FXYD3可作为Na+-K+ATP酶的调节剂，调节细胞增殖、细胞凋亡及肿瘤转移，影响细胞周期，参与肿瘤血管生成和进展。研究表明，FXYD3在各种类型的癌症中表达，包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、食管鳞状细胞癌、胰腺癌、子宫内膜癌、膀胱、胆管癌、神经胶质瘤和肝癌。然而，FXYD3在胃癌发生发展中的作用尚不清楚，报道较少。
发明内容
本发明的目的在于：针对上述现有技术中存在的不足，提供一种新型分子标记物作为胃癌诊断标志物，即FXYD3作为胃癌诊断标志物和治疗靶标的应用。
本发明采用的技术方案如下：
FXYD3在作为胃癌诊断标志物中的应用。
上述的FXYD3在制备检测或治疗胃癌的试剂或试剂盒中的应用。
上述的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒包括：对FXYD3及其内参照GAPDH基因具有检测特异性的基因芯片或PCR引物。
上述的应用，其特征在于：所述的对FXYD3具有检测特异性的PCR引物如下：
上游引物：5'-GCCCAAAGCTGATGAGGACAGAC-3'；
下游引物：5'-GAGTCCCAGCAGAGGAGGAAGAA-3'。
上述的应用，其特征在于：所述的对FXYD3的内参照GAPDH基因具有检测特异性的PCR引物如下：
上游引物：5'-ATGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'；
下游引物：5'-GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'。
FXYD3在筛选人胃癌诊治药物中的应用。
FXYD3在制备预防或治疗胃癌的药物组合物中的应用。
上述药物为抑制FXYD3表达的药物。
抑制FXYD3表达的抑制剂为shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽和抗体中的至少一种。
一种抗胃癌联合药物，上述药物，以及与其联用的化疗药物。
上述化疗药物为顺铂。
FXYD3作为标志物在制备胃癌对化疗药物的敏感性和/或预后评价试剂中的应用。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明通过实验，验证了FXYD3在胃癌组织中高表达水平；同时通过敲除其表达观察对胃癌细胞增殖、侵袭、迁移及耐药能力的影响，并利用FXYD3基因敲除的细胞系来建立裸鼠肿瘤模型，观察对肿瘤组织的血管生成、生长、转移能力的影响，确定了FXYD3在胃癌的形成、发展具有重要的作用，为其能够作为胃癌的诊断和治疗靶标提供了依据。
本发明通过研究发现对FXYD3敲除后，胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力显著下降，更重要的是，FXYD3的敲除增强了胃癌细胞的化疗药物敏感性。此外，进一步通过对FXYD3敲除的研究，表明其抑制了胃癌细胞在裸鼠体内的生长、转移，且瘤内血管形成也得到了抑制，为胃癌的治疗提供了方向，具有重要的临床应用价值。
本发明确定了FXYD3在胃癌中具有重要的功能，因此，FXYD3能够作为胃癌诊断及治疗的重要靶标，为胃癌的治疗提供新的靶点和策略。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为FXYD3在胃癌组织中高水平表达；a.qPCR检测6对胃癌组织和癌旁正常组织中FXYD3 mRNA的含量，以GAPDH为内参基因(Ca：胃癌组织；CaP：胃癌旁组织)；b.Westernblot检测6对胃癌组织和癌旁正常组织中FXYD3蛋白的含量，以tubulin为内参蛋白；c.b中各样本FXYD3蛋白条带的相对灰度值，与CaP组相比，*P<0.05，**P<0.01，n＝6。；*P<0.05，**P<0.01，n＝3；d.Western blot检测细胞系AGS、BGC-823、MGC-803、MKN-45及EGS1中FXYD3蛋白的表达；e.各样本FXYD3蛋白条带的相对灰度值，与正常胃上皮细胞系EGS1相比，*P<0.05，**P<0.01，n＝3；
图2为FXYD3基因敲低抑制胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力图；a.克隆实验测定FXYD3基因敲低对胃癌细胞增殖的影响；b.Transwell侵袭实验测定FXYD3基因敲低对胃癌细胞侵袭能力的影响；c(细胞划痕图片),d(迁移率).细胞划痕实验测定FXYD3基因敲低对胃癌细胞迁移能力的影响；(NC：正常对照组；NS：含阴性shRNA病毒感染组；FS:含FXYD3shRNA病毒感染组)；
图3为FXYD3基因敲低对化疗药物敏感性影响图；a.CCK-8法测定不同浓度的顺铂处理后两种胃癌细胞的细胞生存率的变化，以各自的未处理组为参照；b.CCK-8法测定不同浓度的阿霉素处理后两种胃癌细胞的细胞生存率的变化，以各自的未处理组为参照(NC：正常对照组；NS：含阴性shRNA病毒感染组；FS:含FXYD3 shRNA病毒感染组)；
图4为FXYD3基因的敲低抑制胃癌在体内的生长、转移及血管生成；a.各组MGC细胞在裸鼠体内的成瘤情况的检测；b.a中称量的各组裸鼠的成瘤重量；c.HE法测定各组裸鼠肿瘤内部的血管生成情况(HE,×400)；d.FXYD3基因敲低的MGC细胞在裸鼠体内向肝、肾及胃部转移情况的检测(HE,×400)(NC-NM：裸鼠接种正常MGC细胞；NS-NM：裸鼠接种感染含阴性shRNA的病毒后的MGC细胞；shFXYD3:裸鼠接种感染含FXYD3 shRNA的病毒后的MGC细胞)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，术语“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
FXYD3在作为胃癌诊断标志物中的应用。
上述的FXYD3在制备检测或治疗胃癌的试剂或试剂盒中的应用。
上述的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒包括：对FXYD3及其内参照GAPDH基因具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
上述的应用，其特征在于：所述的对FXYD3具有检测特异性的PCR引物如下：
上游引物：5'-GCCCAAAGCTGATGAGGACAGAC-3'；
下游引物：5'-GAGTCCCAGCAGAGGAGGAAGAA-3'。
上述的应用，其特征在于：所述的对FXYD3的内参照GAPDH基因具有检测特异性的PCR引物如下：
上游引物：5'-ATGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'；
下游引物：5'-GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'。
FXYD3在筛选人胃癌诊治药物中的应用。
FXYD3在制备预防或治疗胃癌的药物组合物中的应用。
上述药物为抑制FXYD3表达的药物。
抑制FXYD3表达的抑制剂为shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽和抗体中的至少一种。
一种抗胃癌联合药物，上述药物，以及与其联用的化疗药物。
上述化疗药物为顺铂。
FXYD3作为标志物在制备胃癌对化疗药物的敏感性和/或预后评价试剂中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例
胃癌组织及癌旁正常组织取自来院进行手术治疗的患者；胃癌细胞系AGS、BGC-823、MGC-803、MKN-45及正常胃上皮细胞系EGS1，均用含10％FBS的DMEM(高糖)培养基，在37℃、5％CO2及95％湿度条件下培养；BALB/c裸鼠，5周龄，饲养于SPF级环境。
(1)qPCR
收取组织标本和细胞样本，提取总RNA，并反转录成cDNA。设计合成FXYD3基因和内参照GAPDH基因的引物序列分别如下：
FXYD3-F:5'-GCCCAAAGCTGATGAGGACAGAC-3',
FXYD3-R:5'-GAGTCCCAGCAGAGGAGGAAGAA-3'；
GAPDH-F:5'-ATGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'，
GAPDH-R:5'-GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'。
扩增条件如下：95℃1min；95℃10s，60℃30s，40cycles，。Sequence Detectionsoft-ware version 1.2.3软件分析PCR过程各检测样本Ct值，采用2—△△Ct方法进行相对定量分析。
(2)Western Blot
收取组织标本和细胞样本，RIPA裂解液裂解，常规方法提取总蛋白。制备PAGE电泳胶，行蛋白质电泳(120V，1h)，并采用PVDF膜进行转膜(90V，90min)，后用5％BSA 4℃封闭过夜，洗膜，加抗FXYD3一抗(Anti-FXYD3 Antibody,1:200,Shanghai,China)，37℃下孵育2h，重新加入封闭液和辣根过氧化物酶标二抗(HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H+L),1:1000,Wuhan,China)，于37℃孵育2h，曝光并照相，采用Quantity One软件(Bio-Rad Laboratories,CA,USA)FXYD3蛋白及内参tubulin的表达。
本实施例对6对胃癌组织和癌旁正常组织检测。qPCR和免疫印迹结果显示，胃癌组织中FXYD3 mRNA转录水平和蛋白表达水平均显著高于癌旁正常组织(P<0.05)(图1)，这与全基因组表达谱结果相一致。进一步比较了4种胃癌细胞系AGS、BGC-823(以下简称MKN)、MGC-803(以下简称MGC)、MKN-45(以下简称MKN)和正常胃上皮细胞系EGS1中FXYD3的蛋白表达差异。免疫印迹结果显示，4种胃癌细胞中FXYD3的蛋白含量均高于正常胃上皮细胞(P<0.05)(图1)。
(3)慢病毒感染
针对两种FXYD3表达相对较高的胃癌细胞系MKN、MGC，设计3种FXYD3 shRNA序列(如下)，并由上海吉玛制药技术有限公司合成：
FXYD3-shRNA1:
F:5’-UGGACGCCAAUGACCUAGAAGAUAATT-3’,
R:5’-UUAUCUUCUAGGUCAUUGGCGUCCATT-3’；
FXYD3-shRNA2:
F:5’-GCCCGUUAAAUAAUUCCCUAUGCUATT-3’,
R:5’-UAGCAUAGGGAAUUAUUUAACGGGCTT-3’；
FXYD3-shRNA3:
F:5’-AAGGCAUGCGAAAUGUUCUCAUGAATT-3’,
R:5’-UUCAUGAGAACAUUUCGCAUGCCUUTT-3’
分别取MKN及MGC细胞铺于细胞板中，37℃培养过夜。实验中设计了正常细胞对照组：正常MGC/MKN细胞，简称NC组；阴性shRNA组：感染含Scrambled-shRNA-GFP病毒(阴性对照病毒)的MGC/MKN细胞，简称NS组；FXYD3-shRNA细胞组：感染含piLenti-FXYD3-shRNA-GFP病毒的MGC/MKN细胞，简称FS组。病毒滴度均为1×108TU/mL，MOI为2，病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度)，再加入Polybrene(终浓度2μg/mL)，混匀。后加入到培养板内，继续培养48h后去除病毒液，72h后利用qPCR和免疫印迹检测干扰效果。
qPCR和WB结果显示，FXYD3 shRNA1在MKN及MGC细胞中呈现出较好的干扰效果，FXYD3 mRNA转录水平和蛋白表达量均显著降低(P<0.01)，干扰率均在75％以上。
(4)克隆形成实验
分别将上述NC、NS、FS组1000个细胞接种于12孔板中，置于培养箱中培养2周左右。加4％多聚甲醛固定30min，后加400μL结晶紫染液染色20min，PBS洗1次，干燥，照相，计数每孔内形成的克隆数，克隆形成率＝(细胞克隆数/加入的细胞总数)×100％。
结果显示，与正常MKN、MGC细胞相比，感染含FXYD3 shRNA1的病毒后，细胞克隆形成明显降低(P<0.05)，而阴性对照组变化不大(P>0.05)(图2)，因此FXYD3与细胞增殖能力呈正相关。
(5)Transwell侵袭实验
分别取5×104个NC、NS、FS组细胞，用100μL无血清培养基重悬，接种于Matrigel侵袭小室，下室分别加入600μL含10％胎牛血清(Gibco,Australia)的培养基；培养24h后弃去旧的培养液，PBS洗小室上下部位2次；棉签擦去小室上面细胞，冰预冷的4％多聚甲醛固定30min，结晶紫染液染色15min；PBS洗小室下部1次，干燥，细胞面朝下置载玻片上；显微照相，计数。
结果表明，与正常MKN、MGC细胞相比，感染含FXYD3 shRNA1的病毒后，胃癌细胞侵袭能力明显减弱(P<0.05)，而阴性对照组变化不明显(P>0.05)(图2)。
(6)划痕实验
待NC、NS、FS组细胞长满后，分别用10μL微量加样吸头沿着孔的中轴划线，PBS洗去划掉的细胞，后加入培养基，分别在0h、24h、48h时进行显微拍照，计算不同时间点的细胞迁移速率，并绘制柱形图。N小时的迁移速率＝(0h的划痕宽度-Nh的划痕宽度)/0h的划痕宽度。
结果显示，感染含FXYD3 shRNA1的病毒后可以显著抑制MKN及MGC细胞的迁移(P<0.01)(图2)。这些结果显示，FXYD3在胃癌细胞的增殖、侵袭及迁移过程中起到重要作用。
(7)CCK-8
分别将NC、NS、FS组细胞接种至96孔板，5×103/孔。细胞贴壁后，加入不同浓度的顺铂(0，1，2，4，6，8，10，15，20μg/mL)及阿霉素(0，0.2，0.4，0.6，0.8，1，2，4，8μg/mL)，药物处理24h后，每孔加入10μL CCK8检测液(Cell Counting Kit-8,Dojindo Laboratories,Kumamoto,Japan)，37℃培养箱孵育4h，酶标仪测定450nm处的吸光度。细胞存活率(％)＝(OD实验组-OD空白孔)/(OD对照孔-OD空白孔)×100％
结果显示，与正常胃癌细胞相比，敲除FXYD3基因后，较小浓度化疗药处理时，MKN及MGC细胞的生存率明显降低(P<0.05)(图3)，提示FXYD3基因的敲除可以增强胃癌细胞对顺铂及阿霉素的化疗敏感性。
(8)裸鼠肿瘤模型建立
分别收集处于指数生长期的NC、NS、FS组细胞，设计正常对照裸鼠组：裸鼠接种正常MGC细胞，简称NC-NM组；阴性对照裸鼠组：裸鼠接种感染含阴性shRNA的病毒后的MGC细胞，简称NS-NM组；FXYD3 shRNA组：裸鼠接种感染含FXYD3 shRNA的病毒后的MGC细胞，简称shFXYD3组。以1×107/只接种量接种于BALB/c裸鼠右肩皮下，建立裸鼠肿瘤实验模型，成瘤后每一周测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积，连续测量4周，并于成瘤后第四周处死裸鼠，取瘤，测量大小/称重及拍照。结果显示，与NC-NM组相比，shFXYD3组裸鼠体内的成瘤减少，肿瘤大小和重量均明显较低(P<0.05)(图4)，且shFXYD3组与NC-NM组裸鼠肿瘤体积的差异随时间的推移逐渐加大，而NS-NM组变化并不明显(图4)。
(9)包埋、HE染色及观测
裸鼠肿瘤组织及肝、肾、胃等器官，经4％中性甲醛固定，石蜡包埋，后切厚5um切片，梯度乙醇脱水，苏木素-伊红染色，中性树胶封片。400倍显微镜下观察瘤内血管生成及器官内肿瘤转移情况。
结果显示，与NC-NM组相比，FXYD3基因敲除导致裸鼠体内的肿瘤内部血管数目明显减少，血管生成能力减弱(P<0.05)(图4)；研究中还对shFXYD3组裸鼠的肝、肾及胃的病理切片作了进一步分析，结果表明，上述器官内未发现淋巴结转移及结节形成，而NC-NM组裸鼠的肝、肾及胃均发生不同程度的淋巴转移(图4)。显示FXYD3基因敲除后，胃癌细胞在体内转移能力显著降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川大学华西医院
<120> FXYD3作为胃癌诊断标志物和治疗靶标的应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcccaaagct gatgaggaca gac 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagtcccagc agaggaggaa gaa 23
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgacatcaa gaaggtggtg aagcagg 27
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcgtcaaagg tggaggagtg ggt 23
<210> 10
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
uggacgccaa ugaccuagaa gauaatt 27
<210> 10
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
uuaucuucua ggucauuggc guccatt 27
<210> 11
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcccguuaaa uaauucccua ugcuatt 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
uagcauaggg aauuauuuaa cgggctt 27
<210> 13
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaggcaugcg aaauguucuc augaatt 27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
uucaugagaa cauuucgcau gccuutt 27

Claims (10)

1.FXYD3在作为胃癌诊断标志物中的应用。
2.FXYD3在制备检测或治疗胃癌的试剂或试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的试剂或试剂盒包括：对FXYD3及其内参照GAPDH基因具有检测特异性的基因芯片或PCR引物。
4.FXYD3在筛选人胃癌诊治药物中的应用。
5.FXYD3在制备预防或治疗胃癌的药物组合物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为抑制FXYD3表达的药物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制FXYD3表达的抑制剂为shRNA、siRNA、dsRNA、miRNA、cDNA、反义RNA/DNA、低分子化合物、肽和抗体中的至少一种。
8.一种抗胃癌联合药物，其特征在于，包括权利要求5所述药物，以及与其联用的化疗药物。
9.根据权利要求8所述的抗胃癌联合药物，其特征在于，所述化疗药物为顺铂。
10.FXYD3作为标志物在制备胃癌对化疗药物的敏感性和/或预后评价试剂中的应用。
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ZHEN-LONG ZHU等: ""Expression and significance of FXYD-3 protein in gastric adenocarcinoma"", 《DISEASE MARKERS》 *

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