CN116200494A - Ythdf3在制备诊断和治疗宫颈癌产品中的应用 - Google Patents

Ythdf3在制备诊断和治疗宫颈癌产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了YTHDF3在制备诊断和治疗宫颈癌产品中的应用。具体公开了：YTHDF3作为生物标记物在制备诊断宫颈癌和宫颈癌淋巴结转移的试剂中的应用；YTHDF3蛋白在制备宫颈癌预后评估试剂盒中的应用，该试剂盒以上述蛋白作为预后评估标记物；用于治疗宫颈癌的药物，包括能特异性抑制SREBF1基因或蛋白、能特异性抑制YTHDF3基因或蛋白、用于抑制LRP6的m6A修饰的转录本翻译、用于抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的药物中的任一种。上述产品用于诊断和治疗宫颈癌，特异性好。此外，YTHDF3可促进宫颈癌淋巴结转移，因此以该分子为标记物的产品，可有效治疗具有淋巴结转移的宫颈癌。

Description

YTHDF3在制备诊断和治疗宫颈癌产品中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及YTDHF3在制备诊断和治疗宫颈癌产品中的应用。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一，是仅次于乳腺癌发病率的第二高发肿瘤。其主要发病原因为高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染。目前，对于早期宫颈癌而言，主要以手术治疗为主，术后根据危险因素的情况而决定是否予以辅助放化疗；对于中晚期宫颈癌，根治性同步放化疗是其主要治疗方式。然而，虽然经过标准治疗后，宫颈癌平均5年生存率约45％；但一线治疗失败后的复发转移性宫颈癌的5年生存率仅为15％。因此，提高宫颈癌的早期诊断效率和治疗效率迫在眉睫。
理想的生物标记物不仅有助于肿瘤的早期诊断和预后判断，对于制定肿瘤的精准治疗方案也至关重要。迄今为止，对于宫颈癌，基于生物标记物的有效的早期诊断和预后判断方法较少。因此，提供一种理想的生物标记物，并制备基于该生物标记物的诊断和治疗宫颈癌的产品，具有重要的临床价值。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出YTHDF3作为生物标记物在制备诊断宫颈癌的试剂中的应用。
本发明还提出YTHDF3作为生物标记物在制备诊断宫颈癌淋巴结转移的试剂中的应用。
本发明还提出YTHDF3蛋白在制备诊断宫颈癌预后评估试剂盒中的应用。
本发明还提出用于治疗宫颈癌的药物。
N6-甲基腺苷(m6A)是真核信使RNA(mRNA)中含量最丰富的修饰，在细胞分化和组织发育中起着重要作用。它调节多个RNA生命过程：通过识别选择性结合蛋白，m6A调节RNA生命周期包括RNA加工、翻译和降解。YTH结构域家族蛋白作为一种m6A的“阅读器(reader)”蛋白，直接结合和识别mRNA中m6A的甲基化。YTH家族的第三个成员YTHDF3，是一种胞质m6A结合蛋白，可结合m6A。
在前期研究中通过运用RNA测序(RNA-seq)技术对宫颈癌细胞株SiHa和正常永生化上皮细胞H8进行转录本水平测序，且运用m6A特异性的甲基化RNA免疫共沉淀及测序技术(MeRIP-seq)，一方面发现SiHa细胞株较H8细胞中多个mRNA位点发生了m6A-RNA甲基化修饰，并且KEGG分析发现差异甲基化基因所在通路主要是重要癌症调控通路-Wnt信号通路等，另一方面对于宫颈癌细胞株SiHa和敲除YTHDF3的宫颈癌细胞株SiHa的RNA-seq中也发现，GO、KEGG分析显示差异基因如LRP5、LRP6、FZD3等Wnt信号通路相关基因。因此本发明在后续分析中主要关注Wnt信号通路。基于以上研究，通过收集116个临床样本(其中19个正常宫颈上皮、13个宫颈上皮瘤变3级(C1N3)、84个宫颈鳞状细胞癌样本)进行组织芯片分析，发现相较于正常宫颈上皮组织，YTHDF3蛋白在C1N3和宫颈癌组织中的表达是升高的，且m6A修饰丰度是增加的(p＜0.05)，此外发现YTHDF3表达与患者预后不良相关(p＜0.05)。目前对YTHDF3在宫颈癌中的功能和作用尚无报道，且其上下游调控机制也尚未阐明，尤其与HPV病毒感染的关系尚不清楚。基于此，提出了本发明。
根据本发明的一个方面，提出了YTHDF3作为生物标记物在制备诊断宫颈癌的试剂中的应用。
根据本发明的第二个方面，提出了YTHDF3作为生物标记物在制备诊断宫颈癌淋巴结转移的试剂中的应用。
根据本发明的第三个方面，提出了YTHDF3蛋白在制备宫颈癌预后评估试剂盒中的应用，所述宫颈癌预后评估试剂盒以所述YTHDF3蛋白作为预后评估标记物。
在本发明的一些实施方式中，所述宫颈癌预后评估试剂盒是通过免疫组化技术检测宫颈癌患者的手术切除组织中所述YTHDF3蛋白的表达情况，所述YTHDF3蛋白在癌内表达的程度与宫颈癌患者的预后生存率呈负相关。
在本发明的一些实施方式中，所述YTHDF3蛋白在癌内的表达水平高于癌旁或正常组织与宫颈癌的发生呈正相关。
根据本发明的第四个方面，提出了用于治疗宫颈癌的药物，所述药物包括下述A～D中的任一种：
A.能特异性抑制SREBF1基因或蛋白的药物；
B.能特异性抑制YTHDF3基因或蛋白的药物；
C.用于抑制LRP6的m6A修饰的转录本翻译的药物；
D.用于抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的药物。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为干扰YTHDF3转录和翻译过程的抑制剂。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为SREBF1抑制剂，用于抑制YTHDF3基因转录或蛋白表达，以治疗所述宫颈癌。
SREBF1，固醇调控元件结合蛋白1，是固醇通路上的关键转录因子，可通过感受环境固醇的浓度来调控一系列重要脂质合成基因的表达。发明人通过染色质开放性测序(ATAC-seq)和染色质免疫沉淀后测序(ChIP-seq)技术预测并通过实验进一步验证了SREBF1为调控YTHDF3分子表达的上游调控因子。因此，所述药物通过抑制SREBF1，可以抑制YTHDF3基因或蛋白表达，进一步可以治疗所述宫颈癌。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为特异性抑制所述YTHDF3基因或蛋白发挥活性的药物。
具体地，特异性抑制所述YTHDF3基因或蛋白发挥活性的药物包括针对所述YTHDF3基因的敲低药物、敲除药物或针对YTHDF3蛋白的受体阻断药物中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述敲低药物包括靶向所述YTHDF3基因的shRNA、siRNA或CRISPR/Cas药物中的任一种。
在本发明的一些实施方式中，所述敲除药物为包括Cre/LoxP系统的药物，用于特异性敲除所述YTHDF3基因。
在本发明的一些实施方式中，所述受体阻断药物包括小分子化合物或多肽中的任一种。
所述受体阻断药物通过与所述YTHDF3蛋白特异性结合，以阻断所述YTHDF3蛋白发挥相应的作用。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为YTHDF3抑制剂，用于抑制所述宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，以治疗所述宫颈癌。
具体地，在敲除YTHDF3蛋白后，所述宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭都会降低。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为YTHDF3抑制剂，用于抑制所述LRP6的m6A修饰的转录本翻译，以抑制LRP6的表达，进而治疗所述宫颈癌。
LRP6，低密度脂蛋白(LDL)受体相关蛋白6，为LDL受体基因家族的一个成员，LDL受体是参与受体介导的脂蛋白和蛋白配体内吞的跨膜细胞表面蛋白。LRP6作为Wnt的受体或与frizzled一起作为Wnt的共同受体，从而传递典型的Wnt/β-catenin信号级联。通过与Wnt/β-catenin信号级联的相互作用，LRP6基因在调节细胞分化、增殖、迁移和多种癌症类型的发展中发挥作用。
具体地，YTHDF3通过促进LRP6的翻译效率，从而影响LRP6蛋白的表达。因此，所述药物通过特异性抑制YTHDF3，以抑制LRP6的m6A，进一步抑制LRP6的m6A修饰的转录本的翻译，抑制LRP6的翻译效率，进而抑制LRP6蛋白的表达，实现对宫颈癌的治疗。
更具体地，宫颈癌的晚期往往会发生淋巴结转移，恶性程度较高且治愈率很低，本发明研究发现YTHDF3可以促进淋巴结转移和淋巴小管形成。因此，使用上述药物，通过抑制YTHDF3，可以抑制LRP6蛋白的表达，进而抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，以及抑制淋巴结转移和淋巴小管形成，实现对宫颈癌的治疗。
在本发明的一些实施方式中，所述药物为LRP6抑制剂，用于抑制所述宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，进而治疗所述宫颈癌。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
本发明提出的以YTHDF3作为生物标记物制备的产品，能够以较高的特异性进行宫颈癌的诊断、治疗和预后评估，以及进行宫颈癌淋巴结转移的诊断。以YTHDF3作为生物标记物制备的试剂，能够快速有效地对宫颈癌和宫颈癌淋巴结转移进行早期诊断，便于医务工作者为宫颈癌患者或具有淋巴结转移的宫颈癌患者制定精准的治疗方案，以达到早发现早治疗，提高生存率的目的。以YTHDF3蛋白作为预后评估标记物制备的试剂盒，对判断宫颈癌患者预后具有重要作用，对宫颈癌病人术后随访和序贯治疗具有重要的指导意义。另外，本发明提出的药物，能够特异性抑制SRERF1或YTHDF3，以抑制LRP6的m6A，进一步抑制LRP6的m6A修饰的转录本的翻译，抑制LRP6的翻译效率，进而抑制LRP6蛋白的表达，从而抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，以实现对宫颈癌的治疗。该药物的特异性好，可有效治疗宫颈癌。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中正常宫颈上皮组织和宫颈鳞状细胞癌组织中YTHDF3蛋白表达的组织微阵列检测图；其中，上为组织微阵列的化学染色图，第二行为第一行的局部放大图，放大部分为矩形圈起来的部分；下为组织微阵列中YTHDF3蛋白的定量图，Normal-正常宫颈上皮组织，CCa-宫颈鳞状细胞癌组织；
图2为本发明实施例1中YTHDF3蛋白表达对宫颈癌患者生存影响的生存曲线图；其中，左为273例宫颈癌患者的生存曲线图，右为98例宫颈癌患者的生存曲线图；
图3为本发明实施例2的Western-blotting检测图；其中，WT-未敲除YTHDF3的宫颈癌细胞，KO Y3-敲除YTHDF3的宫颈癌细胞，shNC-未敲低YTHDF3的人宫颈癌上皮细胞，shY3-敲低YTHDF3的人宫颈癌上皮细胞，下同，GAPDH-内参基因；
图4为本发明实施例2中用CCK-8法检测YTHDF3对SiHa和Caski细胞增殖的影响图；
图5为本发明实施例2中YTHDF3对SiHa和Caski细胞克隆数的影响结果图；其中，A为对SiHa细胞克隆影响的结果图，B为对A中细胞克隆数的统计图，C为对Caski细胞克隆影响的结果图，D为对C中细胞克隆数的统计图；
图6为本发明实施例2中YTHDF3对SiHa和Caski细胞迁移影响的结果图；其中，A为对SiHa细胞迁移影响的结果图，B为对A中细胞迁移率的统计图，C为对Caski细胞迁移影响的结果图，D为对C中细胞迁移率的统计图；标尺为250μm；
图7为本发明实施例2中YTHDF3对SiHa和Caski细胞侵袭影响的结果图；其中，A为对SiHa细胞侵袭影响的结果图，B为A的每个视野中细胞数的统计图，C为对Caski细胞侵袭影响的结果图，D为C的每个视野中细胞数的统计图；标尺为100μm；
图8为本发明实施例2中YTHDF3对小鼠足底-腘窝淋巴结转移的影响图；左为活体成像仪观察图，右为照片图；
图9为本发明实施例2中YTHDF3对小鼠淋巴小管形成影响的免疫组化图；
图10为本发明实施例2中YTHDF3对淋巴小管形成影响的检测图；左为显微成像图，右为对淋巴小管管长的定量图；标尺为250μm；
图11为本发明实施例3中的ChIP-qPCR和双荧光素酶报告实验的结果图；左为ChIP-qPCR的结果图，右为双荧光素酶报告实验检测图；anti-IgG为用IgG抗体沉淀的样品，anti-SREBF1为用SREBF1抗体沉淀的样品；
图12为本发明实施例3中SREBF1对YTHDF3蛋白影响的WB检测图；si-NC为对照组，si-SREBF1#2和si-SREBF1#3分别为两个敲除SREBF1的样品；
图13为本发明实施例3中SiHa和Caski细胞中YTHDF3和LRP6在RNA水平的相对表达结果图；
图14为本发明实施例3中SiHa和Caski细胞中YTHDF3和LRP6在蛋白水平的表达结果图；
图15为本发明实施例3中MeRIP-qPCR的结果统计图；其中，左为LRP6 mRNA在SiHa和Caski细胞中的相对表达量；右为SiHa细胞中LRP6 mRNA的相对丰度；
图16为本发明实施例3中经RIP-qPCR后检测YTHDF3蛋白表达的WB检测图；
图17为本发明实施例3中经DAA处理SiHa和Caski细胞后检测LRP6蛋白表达的WB结果图；
图18为本发明实施例3中经放线菌素-D处理WT和KO Y3组的SiHa细胞后，LRP6mRNA的表达量统计图；
图19为本发明实施例3中经放线菌素酮处理WT和KO Y3组的SiHa细胞后，检测LRP6蛋白和YTHDF3蛋白表达的WB结果图；
图20为本发明实施例4中正常宫颈上皮组织和宫颈鳞状细胞癌组织中LRP6蛋白表达的检测图；其中，上为免疫组化染色图；下为对免疫组化染色图中LRP6蛋白的定量图，Normal-正常宫颈上皮组织，CCa-宫颈鳞状细胞癌组织；
图21为本发明实施例4的Western-blotting检测图；其中，shNC-未敲除LRP6组，shLRP6-敲除LRP6组，下同，GAPDH-内参基因；
图22为本发明实施例4中用CCK-8法检测LRP6对SiHa和Caski细胞增殖的影响图；
图23为本发明实施例4中LRP6对SiHa和Caski细胞迁移影响的结果图；其中，A为对SiHa细胞迁移影响的结果图，B为对Caski细胞迁移影响的结果图，C为对A和B中细胞迁移率的统计图；标尺为250μm；
图24为本发明实施例4中LRP6对SiHa和Caski细胞侵袭影响的结果图；其中，左为对SiHa细胞和Caski细胞侵袭影响的结果图，右为每个视野中细胞数的统计图；标尺为100μm。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明的描述中，除非另有明确的限定，培养、测序等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。
实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
在前期研究中通过运用RNA测序(RNA-seq)技术对宫颈癌细胞株SiHa和正常永生化上皮细胞H8进行转录本水平测序，且运用m6A特异性的甲基化RNA免疫共沉淀及测序技术(MeRIP-seq)，一方面发现SiHa细胞株较H8细胞中多个mRNA位点发生了m6A-RNA甲基化修饰，并且KEGG分析发现差异甲基化基因所在通路主要是重要癌症调控通路-Wnt信号通路等，另一方面对于宫颈癌细胞株SiHa和敲除YTHDF3的宫颈癌细胞株SiHa的RNA-seq中也发现，GO、KEGG分析显示差异基因如LRP5、LRP6、FZD3等Wnt信号通路相关基因。因此本发明在后续分析中主要关注Wnt信号通路。基于以上研究，通过收集116个临床样本(其中19个正常宫颈上皮、13个宫颈上皮瘤变3级(C1N3)、84个宫颈鳞状细胞癌样本)进行组织芯片分析，发现相较于正常宫颈上皮组织，YTHDF3蛋白在C1N3和宫颈癌组织中的表达是升高的，且m6A修饰丰度是增加的(p＜0.05)，此外发现YTHDF3表达与患者预后不良相关(p＜0.05)。
实施例1
本实施例测试了YTHDF3蛋白在宫颈癌组织中的表达，及该蛋白与宫颈癌预后的关系，具体过程为：
1.表达：取正常宫颈上皮和宫颈鳞状细胞癌临床样本，对两组的组织样本进行石蜡包埋，制成石蜡包埋的组织微阵列；切片，用抗YTHDF3蛋白的抗体进行孵育，再用辣根过氧化物酶标记的二抗进行染色，以检测YTHDF3蛋白在宫颈癌组织中的表达情况，结果如图1所示。图1上代表组织微阵列的化学染色图，图1下代表对组织微阵列中YTHDF3蛋白的定量图；结果显示，正常宫颈癌上皮组织中YTHDF3蛋白的表达量很低，宫颈鳞状细胞癌组织中YTHDF3蛋白的表达显著高于正常宫颈上皮组织的；定量图中也显示了相同的结果。表明YTHDF3蛋白在宫颈癌组织中是高表达的，因此其可以作为诊断、检测和治疗宫颈癌的生物标记物。
2.预后：根据病例跟踪对上述宫颈鳞状细胞癌临床样本对应的患者进行访问，以统计生存率，并绘制生存曲线，如图2所示。图2中，左为利用TCGA数据对273例宫颈癌患者进行生存分析的结果图，右为对组织芯片结果中的98例宫颈癌患者进行生存分析的结果图；结果显示，低YTHDF3表达(Low，L)患者的生存率显著高于高YTHDF3表达(High，H)患者的生存率，即YTHDF3在癌内的表达程度与宫颈癌患者的预后生存率呈负相关。表明YTHDF3蛋白可以作为宫颈癌预后评估标记物，以此为基础又可以制备宫颈癌预后评估试剂盒。
实施例2
本实施例检测了YTHDF3对宫颈癌细胞、淋巴结转移和淋巴小管形成的影响，具体过程为：
1.敲除/敲低宫颈癌细胞株(SiHa)和人宫颈癌上皮细胞(Caski)中的YTHDF3蛋白。
将SiHa(2组：未敲除YTHDF3的宫颈癌细胞(WT)、敲除YTHDF3的宫颈癌细胞(KOY3))和Caski细胞(2组：未敲低YTHDF3的人宫颈癌上皮细胞(shNC)、敲低YTHDF3的人宫颈癌上皮细胞(shY3)，以下出现类似的简称均代表这几种细胞)分别铺于不同的培养皿中，加入培养基(DMEM高糖培养基+10％胎牛血清+1％青霉素/链霉素)，待细胞长满培养皿底部后，收细胞，并提取相应的总蛋白。将总蛋白配制成样品，进行Western-blotting(WB)，以检测YTHDF3蛋白的表达情况，检测结果如图3所示。图3显示，以GAPDH作为内参基因，无论是SiHa细胞，还是Caski细胞，与未敲除/未敲低YTHDF3组的细胞相比，敲除/敲低组细胞的YTHDF3蛋白的表达量显著降低，表明KO Y3和shY3细胞中的YTHDF3蛋白敲除/敲低成功。
2.CCK-8法检测宫颈癌细胞的增殖。
将1中构建好的2组细胞：SiHa(WT、KO Y3)和Caski细胞(shNC、shY3)培养至长满培养皿底部后，消化细胞，接种于96孔板中，分别在接种后的24h、48h、72h加入CCK-8试剂，2h后于450nm波长下测OD值，结果如图4所示。图4显示，在接种0～72h期间，两组细胞均处于增殖状态；但从24h开始，SiHa的KO Y3组的OD值显著小于WT组的；Caski的shY3组的OD值显著小于shNC组的。表明敲除或敲低宫颈癌细胞中的YTHDF3蛋白后，宫颈癌细胞的增殖下降，即YTHDF3促进宫颈癌细胞的增殖。
3.通过克隆形成实验检测宫颈癌细胞的增殖。
将处于对数生长期的2组细胞(SiHa(WT、KO Y3)和Caski细胞(shNC、shY3))用胰酶消化后，加入完全培养基，重悬成细胞悬液，并计数；将2组细胞分别接种于6孔板中，每孔接种400～1000个细胞；继续培养到14天或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途每隔3天进行换液并观察细胞状态；克隆完成后，在显微镜下对细胞进行拍照，然后PBS洗涤1次，每孔加入1mL 4％多聚甲醛固定30～60min，PBS洗涤1次；每孔加入结晶紫染液1mL，染细胞10～20min；PBS洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照，结果如图5所示。图5中，A为对SiHa细胞克隆影响的结果图，B为对A中细胞克隆数的统计图，C为对Caski细胞克隆影响的结果图，D为对C中细胞克隆数的统计图；结果显示，在SiHa细胞组中，与WT组细胞相比，敲除YTHDF3蛋白显著减少了细胞克隆数；在Caski细胞组中，与shNC组细胞相比，敲低YTHDF3蛋白也显著减少了细胞克隆数。表明敲除或敲低宫颈癌细胞中的YTHDF3蛋白后，会抑制宫颈癌细胞的克隆，即抑制宫颈癌细胞的增殖。
4.通过细胞划痕实验检测宫颈癌细胞的迁移。
首先使用marker笔在6孔板背后，均匀地划横线，大约每隔0.5～1cm划一条，横穿过孔；将2组细胞(SiHa(WT、KO Y3)和Caski细胞(shNC、shY3))铺于6孔板中，过夜培养；第二天待细胞融合率达到100％时，用枪头或无菌牙签垂直于细胞平面，沿着平板背面的横线在细胞层上进行划痕；划痕完成后，使用无菌PBS洗涤细胞3次，洗去不贴壁的细胞，即划线时划下的细胞，使划线后留下的间隙清晰可见，然后更换新鲜无血清培养基；将细胞放入37℃，5％CO2培养箱培养，分别在0h和24h于显微镜下观察并测量划痕的宽度，并拍照；使用Image J软件取6至8条水平线，计算细胞间距离的均值，结果如图6所示。图6中，A为对SiHa细胞迁移影响的结果图，B为对A中细胞迁移率的统计图，C为对Caski细胞迁移影响的结果图，D为对C中细胞迁移率的统计图；结果显示，在SiHa细胞组中，在培养24h后，WT组细胞的划痕宽度的减小显著小于KO Y3组的，即WT组细胞的迁移率比KO Y3组细胞的迁移率高，与统计图的结果相一致；同样，在Caski细胞组中，在培养24h后，shNC组细胞的划痕宽度的减小显著小于shY3组的，即shNC组细胞的迁移比shY3组细胞的迁移快，与统计图的结果相一致。表明敲除或敲低宫颈癌细胞中的YTHDF3蛋白后，会抑制宫颈癌细胞的迁移。
5.通过transwell实验检测宫颈癌细胞的侵袭能力。
用Matrigel包被transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶；消化细胞，终止消化后离心去培养液，PBS洗涤1～2次，用含BSA的无血清培养基重悬；取细胞悬液加入transwell小室，下室加入培养基，培养细胞；培养结束后，取出transwell小室，弃去孔中的培养液，用无钙的PBS洗涤2次，甲醇固定30min，将小室适当风干；加入0.1％结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗涤3次，于显微镜下随机取5个视野观察细胞，拍照、计数，并统计，结果如图7所示。图7中，A为对SiHa细胞侵袭影响的结果图，B为A的每个视野中细胞数的统计图，C为对Caski细胞侵袭影响的结果图，D为C的每个视野中细胞数的统计图；结果显示，在SiHa细胞组中，与WT组细胞相比，敲除YTHDF3蛋白显著减少了细胞数量，每个视野中观察到的细胞数也显著减少；在Caski细胞组中，与shNC组细胞相比，敲低YTHDF3蛋白也显著减少了细胞数量，每个视野中观察到的细胞数也显著减少。表明敲除或敲低宫颈癌细胞中的YTHDF3蛋白后，会抑制宫颈癌细胞的侵袭能力。
综上，敲除YTHDF3蛋白，可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。因此制备能特异性抑制YTHDF3基因转录或蛋白表达的药物，或能特异性抑制YTHDF3基因或蛋白发挥活性的药物，可以抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，可以用来靶向治疗宫颈癌。
6.YTHDF3对淋巴结转移和淋巴小管形成的影响。
宫颈癌的晚期往往会发生淋巴结转移，恶性程度较高且治愈率很低，因此，这里检测了敲除YTHDF3蛋白对淋巴结转移和淋巴小管形成是否有影响。首先根据组织芯片的数据，进行Cox回归分析，发现淋巴结转移是宫颈癌病人的危险因素。其次，在体内利用带有荧光的未敲除YTHDF3的宫颈癌细胞(SiHa)和敲除YTHDF3的宫颈癌细胞(KO Y3-SiHa)建立裸鼠的足底-腘窝淋巴结转移模型，利用活体成像仪观察其中淋巴结转移情况，结果如图8所示，图8左为活体成像仪观察图，右为照片图，可以看出，在转入SiHa细胞的小鼠中，发生了足底-腘窝淋巴结转移，而敲除YTHDF3蛋白后，淋巴结转移减少，集中在足底；并使用免疫组化观察淋巴小管的形成情况，结果如图9所示，敲除YTHDF3蛋白的组织中淋巴小管的数量显著低于未敲除组的。最后，在体外利用培养的SiHa/KO Y3-SiHa的细胞上清液共培养淋巴内皮细胞，进行小管形成实验，观察其中淋巴内皮细胞的成管能力的变化，结果如图10所示，图10显示，敲除YTHDF3后，淋巴内皮细胞的成管能力下降，淋巴小管的形成减少。表明YTHDF3可以促进淋巴结转移和淋巴小管的形成。
实施例3
本实施例检测了YTHDF3影响宫颈癌的分子机制，具体过程为：
首先，检测了调控YTHDF的上游调控因子，通过染色质开放性测序(ATAC-seq)和染色质免疫沉淀后测序(ChIP-seq)技术预测SREBF1为YTHDF3的上游调控因子；接着，进行了染色质免疫共沉淀技术-定量PCR(ChIP-qPCR)和双荧光素酶报告实验，结果如图11所示，图11中，左为ChIP-qPCR结果图，可以看出，在对照组(si-NC)中，用抗SREBF1的抗体沉淀的样品中，YTHDF3的表达量较高；而敲除SREBF1(si-SREBF1)后，用抗SREBF1的抗体沉淀的样品中，YTHDF3的表达量显著降低。右为双荧光素酶报告实验检测图，可以看出，与只加入YTHDF3组的SiHa相比，同时加入YTHDF3和SREBF1，可显著提高YTHDF3的表达量。表明SREBF1上调YTHDF3的mRNA的表达。WB实验结果如图12所示，可以看出，与未敲除SREBF1的SiHa细胞相比，敲除SREBF1的SiHa细胞中YTHDF3蛋白的表达显著降低，表明下调SREBF1会导致YTHDF3蛋白的表达下降。以上实验证明SREBF1是YTHDF3的上游调控因子。
其次，构建了2组SiHa细胞：未敲除YTHDF3的SiHa(WT)和敲除YTHDF3的SiHa(KOY3)进行了RIP-seq，RNA-seq，Ribo-seq等测序，综合分析预测了以下靶向基因FZD3、LRP6、LRP5。对于预测的靶向基因分别进行了实时荧光定量PCR和免疫印迹(WB)检测，发现在敲除YTHDF3后，只有LRP6蛋白的表达明显下调。
1.实时荧光定量PCR(Q-PCR)检测YTHDF3对LRP6 RNA表达的影响。
分别提取2组细胞(SiHa(WT、KO Y3)和Caski细胞(shNC、shY3))的RNA，经反转录得到cDNA，配制Q-PCR的反应体系，将配制好的反应体系放入荧光定量PCR仪中，设置好程序进行Q-PCR反应，反应结束后对数据进行分析，并作相应的统计，统计结果如图13所示。图13显示，在SiHa细胞组中，与WT细胞相比，KO Y3细胞中YTHDF3 mRNA的表达显著降低，而LRP6mRNA的表达量与WT细胞中的无明显差异；同样，在Caski细胞组中，与shNC细胞相比，shY3细胞中YTHDF3 mRNA的表达显著降低，而LRP6 mRNA的表达量与shNC细胞中的无明显差异。表明敲除或敲低宫颈癌细胞中的YTHDF3后，对LRP6 RNA的表达无显著影响。
2.WB检测YTHDF3对LRP6蛋白表达的影响。
分别提取2组细胞(SiHa(WT、KO Y3)和Caski细胞(shNC、shY3))的总蛋白，将总蛋白配制成样品，进行WB实验，以检测YTHDF3蛋白和LRP6蛋白的表达情况，检测结果如图14所示。图14显示，在SiHa细胞组和Caski细胞组中，与WT细胞或shNC细胞相比，KO Y3细胞或shY3细胞中YTHDF3蛋白的表达和LRP6蛋白的表达均显著降低。表明敲除或敲低宫颈癌细胞中的YTHDF3后，显著下调LRP6蛋白的表达。
由于m6A调节多个RNA生命过程：通过识别选择性结合蛋白，m6A调节RNA生命周期包括RNA加工、翻译和降解。YTH结构域家族蛋白作为一种m6A的“阅读器”蛋白，直接结合和识别mRNA中m6A的甲基化，因此推测YTHDF3会影响LRP6的m6A修饰。为验证这一推测，进行了以下实验：
3.RNA甲基化免疫共沉淀-qPCR(MeRIP-qPCR)、RNA结合蛋白免疫沉淀-qPCR(RIP-qPCR)和甲基化抑制剂3-脱氮腺苷(DAA)处理宫颈癌细胞来检测YTHDF3对LRP6的m6A修饰的影响。
MeRIP-qPCR：提取2组细胞(SiHa和Caski)的RNA，将RNA进行超声破碎片段化；取50μL RNA样品作为Input样品，剩余400μL RNA样品为免疫沉淀(IP)组；IP组样品分为2份，其中一份加入20μL IP buffer 2、4μg m6A抗体，另一份加入20μL IP buffer 2、4μg IgG抗体，分别置于垂直混匀器上4℃孵育4h；取25～50μL磁珠悬液到离心管中，加入200μL结合缓冲液，把离心管放到磁力架上静置1min，待溶液澄清后弃上清，重复2次，加入200μL洗脱缓冲液，并与Input样品一起用酚氯仿进行RNA抽提；取等体积的RNA进行反转录，并进行qPCR验证，对结果进行统计，统计图如图15所示。图15左为LRP6 mRNA在2组细胞中的相对表达量，结果为将Input归一化后LRP所占的比例，结果显示，在SiHa细胞组和Caski细胞组中，与用IgG抗体沉淀的IP组相比，用m6A抗体沉淀的IP组中LRP6 mRNA有显著表达；图15右为SiHa细胞组中LRP6 mRNA的相对丰度，结果显示，在SiHa细胞组中，用m6A抗体沉淀的IP组中LRP6蛋白的相对丰度显著高于用IgG抗体沉淀的IP组中的丰度。表明LRP6有m6A的修饰。
RIP-qPCR：收集2组细胞(SiHa和Caski)，分离细胞核，将重悬的细胞核分成两份，每份500μL，对染色质进行机械剪切，离心，收集上清，其中一部分作为Input样品，剩余的进行IP；向上清中分别加入IgG抗体和m6A抗体，于4℃孵育2h，加入protein A/G磁珠，4℃孵育1h；洗涤磁珠，加入RIP缓冲液重悬磁珠，重复2次，随后在PBS中清洗1次，洗脱磁珠上的蛋白复合物，进行WB，以检测YTHDF3蛋白的表达，结果如图16所示。图16显示，在SiHa和Caski细胞中，用IgG抗体沉淀的IP组中几乎没有YTHDF3蛋白的表达，而在用m6A抗体沉淀的IP组中有YTHDF3蛋白的表达。表明YTHDF3可结合LRP6的m6A。
甲基化抑制剂3-脱氮腺苷(DAA)处理：在培养SiHa和Caski细胞时，将2组细胞各分成3组，分别加入不同浓度(0μM、100μM、200μM)的DAA，使甲基化被抑制，即抑制了m6A，培养细胞结束后，提取各组的总蛋白，进行WB，以检测LRP6蛋白的表达，结果如图17所示。图17显示，在SiHa和Caski细胞中，随着DAA浓度的升高，LRP6的表达显著降低，在200μM时几乎被抑制。表明宫颈癌的确与LRP6的m6A修饰有关。进一步说明，宫颈癌细胞中YTHDF3影响LRP6的m6A修饰。
4.有研究报道，YTHDF3既能促进m6A修饰的目标转录本的翻译，又能促进其衰退，因此接下来用放线菌素-D和放线菌素酮(CHX)来验证在宫颈癌细胞中YTHDF3影响的是LRP6的mRNA稳定性还是蛋白稳定性：
放线菌素-D处理宫颈癌细胞：培养WT和KO Y3组的SiHa细胞，在培养的不同时间点(0h、6h、9h)加入放线菌素-D，并检测LRP6 mRNA的含量，结果如图18所示。图18显示，随着培养时间的延长，WT组和KO Y3组细胞中LRP6 mRNA的表达均降低，但二者无显著性差异，表明YTHDF3对LRP6 mRNA的稳定性无影响。
放线菌素酮(CHX)处理宫颈癌细胞：培养WT和KO Y3组的SiHa细胞，在培养的不同时间点(0h、3h、6h、12h)加入CHX，收取细胞，提取蛋白质，进行WB，以检测LRP6蛋白和YTHDF3蛋白的表达量，结果如图19所示。图19显示，KO Y3组细胞中由于敲除了YTHDF3，因此该蛋白的表达量显著降低；但是，在WT和KO Y3细胞中，LRP6蛋白的表达无明显差异，表明YTHDF3对LRP6蛋白的稳定性也无影响。
从上述实验可以得出，在宫颈癌细胞中，YTHDF3通过影响LRP6蛋白的翻译效率来影响LRP6蛋白的表达。因此，提供一种药物，该药物通过特异性抑制YTHDF3，以抑制LRP6的m6A修饰的转录本的翻译，抑制LRP6的翻译效率，进而抑制LRP6蛋白的表达，可实现对宫颈癌的治疗。
实施例4
本实施例检测了LRP6对宫颈癌细胞的影响，具体过程为：
1.检测了LRP6蛋白在宫颈癌组织中的表达。方法同实施例1，在进行免疫组化时用抗LRP6的抗体进行孵育，结果如图20所示。图20上代表免疫组织化学染色图，图20下代表对图20上中LRP6蛋白的定量图；结果显示，正常宫颈癌上皮组织中LRP6蛋白的表达量很低，宫颈鳞状细胞癌组织中LRP6蛋白的表达显著高于正常宫颈上皮组织的；定量图也显示了相同的结果。表明LRP6蛋白在宫颈癌组织中是高表达的。
2.敲除SiHa和Caski细胞系中的LRP6。
采用慢病毒构建了敲除LRP6的细胞系，得到2组细胞：SiHa(未敲除LRP6的宫颈癌细胞(shNC)、敲除LRP6的宫颈癌细胞(shLRP6)，Caski(未敲除LRP6的人宫颈癌上皮细胞(shNC)、敲除LRP6的人宫颈癌上皮细胞(shLRP6))，以下出现类似的简称均代表这几种细胞。
与实施例2的第一部分相同，先培养细胞，然后提取总蛋白，进行WB，以检测LRP6蛋白的表达情况，检测结果如图21所示。图21显示，无论是SiHa细胞，还是Caski细胞，与shNC组的细胞相比，shLRP6组细胞的LRP6蛋白的表达量显著降低，表明shLRP6细胞中的LRP6蛋白敲除成功。
3.与实施例2第2部分的方法相同，采用CCK-8法检测LRP6对宫颈癌细胞增殖的影响，结果如图22所示。图22显示，在接种0～72h期间，两组细胞均处于增殖状态；但从24h(Caski)或48h(SiHa)开始，shLRP6组的OD值显著小于shNC组的。表明敲除宫颈癌细胞中的LRP6蛋白后，宫颈癌细胞的增殖下降，即LRP6促进宫颈癌细胞的增殖。
4.与实施例2第4部分的方法相同，采用细胞划痕实验检测LRP6对宫颈癌细胞迁移的影响，结果如图23所示。图23中，A为对SiHa细胞迁移影响的结果图，B为对Caski细胞迁移影响的结果图，C为对A和B中细胞迁移率的统计图；结果显示，在SiHa细胞组中，在培养24h后，shNC组细胞的划痕宽度的减小显著小于shLRP6组的，即shNC组细胞的迁移率比shLRP6组细胞的迁移率高，与统计图的结果相一致；同样，在Caski细胞组中，在培养24h后，shNC组细胞的划痕宽度的减小显著小于shLRP6组的，即shNC组细胞的迁移比shLRP6组细胞的迁移快，与统计图的结果相一致。表明敲除宫颈癌细胞中的LRP6蛋白后，会抑制宫颈癌细胞的迁移。
5.与实施例2第5部分的方法相同，采用transwell实验检测LRP6对宫颈癌细胞迁移的影响，结果如图24所示。图24中，左为对SiHa细胞和Caski细胞侵袭影响的结果图，右为每个视野中细胞数的统计图；结果显示，在SiHa细胞组和Caski细胞组中，与shNC组相比，敲除LRP6蛋白显著减少了细胞数量，每个视野中观察到的细胞数也显著减少。表明敲除宫颈癌细胞中的LRP6蛋白后，会抑制宫颈癌细胞的侵袭能力。
综上，敲除LRP6蛋白，可抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，提供一种药物，该药物通过特异性抑制YTHDF3，以抑制LRP6的m6A修饰的转录本的翻译，即抑制LRP6的翻译效率，进而抑制LRP6蛋白的表达，从而抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，以实现对宫颈癌的治疗。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.YTHDF3作为生物标记物在制备诊断宫颈癌的试剂中的应用。
2.YTHDF3作为生物标记物在制备诊断宫颈癌淋巴结转移的试剂中的应用。
3.YTHDF3蛋白在制备宫颈癌预后评估试剂盒中的应用，其特征在于，所述宫颈癌预后评估试剂盒以所述YTHDF3蛋白作为预后评估标记物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌预后评估试剂盒是通过免疫组化技术检测宫颈癌患者的手术切除组织中所述YTHDF3蛋白的表达情况，所述YTHDF3蛋白在癌内表达的程度与宫颈癌患者的预后生存率呈负相关。
5.用于治疗宫颈癌的药物，其特征在于，所述药物包括下述A～D中的任一种：
A.能特异性抑制SREBF1基因或蛋白的药物；
B.能特异性抑制YTHDF3基因或蛋白的药物；
C.用于抑制LRP6的m6A修饰的转录本翻译的药物；
D.用于抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的药物。
6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物为干扰YTHDF3转录和翻译过程的抑制剂。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物为SREBF1抑制剂，用于抑制YTHDF3基因转录或蛋白表达，以治疗所述宫颈癌。
8.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物为特异性抑制所述YTHDF3基因或蛋白发挥活性的药物。
9.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物为YTHDF3抑制剂，用于抑制所述宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，以治疗所述宫颈癌。
10.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物为YTHDF3抑制剂，用于抑制所述LRP6的m6A修饰的转录本翻译，以抑制LRP6的表达，进而治疗所述宫颈癌；
优选地，所述药物为LRP6抑制剂，用于抑制所述宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭，进而治疗所述宫颈癌。
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