CN111118153B - 一种口腔癌标志物-taf1l基因表达及其应用 - Google Patents

一种口腔癌标志物-taf1l基因表达及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种口腔癌新分子靶标及其应用，所述标志物包括TAF1L基因及其表达产物在口腔癌研究领域中的应用。本发明通过免疫组化、Western blot和qPCR技术，发现并证实了TAF1L基因在口腔癌组织中异常高表达；其次，利用siRNA干扰技术，敲降TAF1L基因在口腔癌细胞中的转录和翻译，发现并证实了可以抑制口腔癌细胞的异常增殖。本发明提供了该基因或其表达产物在口腔癌基础研究与临床领域中的应用。

Description

一种口腔癌标志物-TAF1L基因表达及其应用
技术领域
本发明属于基因在肿瘤诊断和治疗技术领域的应用研究，涉及一种口腔癌标志物TAF1L基因及其表达调控在口腔癌的诊断、辅助诊断、药物疗效评估和预后中的应用价值。
背景技术
口腔癌是头颈部最常见的恶性肿瘤，多由上皮鳞状细胞恶变而来。全球每年新增约35万例口腔癌患者，其中2/3的发病人数来自东南亚。近年来，虽然外科手术结合放化疗和生物靶向治疗等联合治疗方案已很成熟，很大程度提高了治疗效果。但是，由于全球口腔癌的发病率仍呈缓慢上升趋势，而分子诊断和分子发病机制的研究并无重大突破，患者的5年生存率没有明显改善，始终波动在50％左右，因而开发早期分子诊断和个体化诊疗技术已成为口腔癌领域的研发的重点。已有越来越多的文献报道揭示了一些基因的突变、结构变异及异常表达与口腔癌的发生发展密切相关，例如：AEG-1、GSK3α/β、ALG-2、Alix、MMP9、NSD-1/2和APOBEC3A基因，lncRNAs和miRNAs等等。但是，因为口腔癌是一个多因素、多阶段、多机制的复杂病变过程，目前，尚无特异性针对口腔癌的相关分子诊疗的商品化产品上市。
发明内容
针对现有临床诊疗应用技术的不足，本发明提供了一种口腔癌的标志物及其应用，所述标志物为TAF1L基因，有利于辅助口腔癌的诊疗。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种口腔癌标志物，所述标志物包括TAF1L。
发明人在前期研究中已通过RNA-Seq技术，对两例口腔癌组织标本及其配对正常组织mRNA标本进行了测序和生物信息分析，结果提示：TAF1L基因在口腔癌组织和正常组织的比对中可能存在表达差异。在本发明中，发明人运用免疫组化、Western blot和qPCR技术，通过扩大样本量检测，发现并证实了TAF1L基因在口腔癌组织中确实存在早期的异常高表达，并随着病变恶化其表达量有增高趋势。另外，干扰TAF1L基因在癌细胞的表达，能够明显抑制口腔癌细胞的增殖。因而，本发明的分子标志物-TAF1L基因，其在口腔癌病变组织细胞的异常表达出现早，信号强，灵敏度高，具有潜在的临床诊疗应用价值，即可在口腔癌早期发生时辅助诊断癌变程度及范围，又可以评估治疗效果和警示预后。
根据本发明，所述标志物还包括TAF1L基因结构和表达异常，包括：SNP、Indel、CNV、mRNA和/或蛋白质。当TAF1L基因异常时，其转录的mRNA和翻译的蛋白质也会随之发生表达异常。通过检测TAF1L本身或其表达的mRNA和蛋白质均有助于对早期口腔癌的辅助诊断与鉴别诊断，以及对口腔癌治疗疗效的评估。
根据本发明，所述标志物在口腔原位癌细胞和/或口腔癌组织中高表达。
第二方面，本发明提供了一种TAF1L基因检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括TAF1L引物。
优选地，所述TAF1L引物的核酸序列如SEQ ID NO:1～2所示；
SEQ ID NO:1：AAGAGTAAAGATCGGCCACG；
SEQ ID NO:2：CATCCCTGTGCGTTTGAAGT。
优选地，所述基因检测试剂盒还包括qPCR预混液。
优选地，所述qPCR预混液包括PCR缓冲液、dNTPs、荧光染料或Taq DNA聚合酶中的任意一种或至少两种的组合。
第三方面，本发明提供了一种TAF1L免疫检测试剂盒，所述免疫检测试剂盒包括TAF1L单克隆抗体和/或多克隆抗体。
优选地，所述TAF1L多克隆抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
SEQ ID NO:3：PKQPFMLQHA SGEHKDGHG。
优选地，所述免疫检测试剂盒还包括酶标二抗。
优选地，所述酶标二抗包括HRP标记的抗鼠IgG和/或抗兔IgG。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的标志物、如第二方面所述的基因检测试剂盒、如第三方面所述的免疫检测试剂盒在制备口腔癌诊断与疗效评估试剂中的应用。
第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括TAF1L基因和/或其表达产物的抑制剂，所述抑制剂包括抑制TAF1L基因表达的产物，抑制TAF1L基因表达稳定性的产物，或抑制TAF1L基因表达产物活性的物质，进一步所述抑制剂是针对TAF1L基因的siRNA。
优选地，所述siRNA的核酸序如SEQ ID NO:4～5所示；
SEQ ID NO:4：5’-GACCCAACAACCCUUCAUTT-3’；
SEQ ID NO:5：5’-AUGAAGGGUUGUUUGGGUCTT-3’。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供了一种如第五方面所述的药物组合物在制备口腔癌治疗中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用TAF1L基因作为口腔癌的分子标志物，在癌灶局部组织中阳性信号强，并在癌变组织细胞早期可以检出，有利于辅助进行口腔癌的早期癌变病理判断；
(2)本发明以TAF1L作为分子标志物构建的试剂盒，通过检测TAF1L基因、mRNA与蛋白质的表达差异，与其他检测手段相互配合，提高了口腔癌检测的敏感性和准确性，有利于口腔癌的早期诊断、疗效评估与预后判定；
(3)本发明对口腔鳞癌发生发展的分子调控机制研究提供了新思路和新策略。
附图说明
图1.qPCR分析TAF1LmRNA在口腔癌组织中的表达情况；
图2.免疫组化分析TAF1L蛋白质在口腔癌组织中的表达情况；
图3.利用Western blot检测TAF1L蛋白质在口腔鳞癌细胞中的表达情况；
图4.利用Western blot检测siRNA对TAF1L蛋白质表达的影响；
图5.利用CCK8法检测TAF1L基因表达对口腔鳞癌细胞增殖活性的影响。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
样本：
口腔癌组织样本来自于口腔癌微阵列组织芯片(OR208，OR601b，US Biomax)，选购于西安艾丽娜生物科技有限公司，共包括口腔癌组织110例和癌旁口腔组织19例。
实施例1实时荧光定量PCR检测样本中的TAF1L mRNA的差异表达
(1)每份组织进行液氮研磨后，加入1mL Trizol试剂，室温放置5min，收集混合液至无RNA酶的1.5mL离心管中；
(2)加入200μL三氯甲烷，充分混匀后用手剧烈震荡20s，充分裂解后室温静置2min，4℃、12000rpm离心15min；
(3)小心吸取出上清至新的无RNA酶1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀30min，4℃、12000rpm离心10min；
(4)75％乙醇洗涤两次，操作台风干后加入40μL无酶水溶解，采用Nanodrop 2000测量RNA浓度，分装保存；
(5)以1μg总RNA为模板，进行反转录获得cDNA，体系(10μL)包括2×TransStartTip Green qPCR SuperMix 2μL，正反向引物SEQ ID NO:1～2(10μM)各0.5μL，cDNA模板1μL，双蒸水定容至10μL；反应条件为：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 45s，40个循环，循环结束后从55℃开始每10s上升0.5℃，取荧光值绘制曲线，确定扩增产物的特异性；
(6)以GAPDH为内参计算口腔鳞癌组织与正常组织荧光定量RT-PCR的实验结果，两者之间差异采用t检验，以p<0.05具有统计学差异。
结果如图1所示，与周围正常组织相比，TAF1L基因在口腔鳞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)。
实施例2免疫组化检测样本中的TAF1L蛋白质表达差异
将石蜡包埋的组织芯片置于60℃烘箱1h，TO透明剂脱蜡3次，每次10min；依次采用100％、95％和75％酒精梯度浸泡样本各5分钟，双蒸水清洗3次，PBS缓冲液清洗3次，每次5min；
将芯片置于抗原修复液中，置于蒸锅上加热30min，自然冷却至室温，PBS清洗3次，每次5min，3％过氧化氢液浸泡玻片30min，PBS清洗3次，每次5min；
TAF1L抗体(SEQ ID NO:3)孵育过夜，PBS清洗3次，滴加PV9000反应增强液，室温孵育20min，PBS清洗3次，每次5min；
滴加PV9000增强酶标抗兔IgG聚合物，室温孵育20min，PBS清洗3次，每次5min；
AEC检测试剂盒显色，显色后，PBS清洗3次，每次5min，将组织芯片置于苏木素染液中染色10-20s后，在自来水流缓冲10min，甘油明胶封片，显微镜进行扫描拍照，呈像软件统计阳性信号。
结果如图2所示，与周围正常组织相比，TAF1L蛋白质在口腔鳞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)。
实施例3蛋白质免疫印迹检测口腔鳞癌细胞系样本中TAF1L蛋白质的表达差异
(1)细胞培养
口腔鳞状癌细胞系Ca9-22，Tca-8113的培养基为RPMI-1640，发育不良的口腔角质形成细胞系DOK和正常口腔上皮细胞系HOEC的培养基为DMEM；以含有10％胎牛血清的培养基在含有5％CO2的37℃培养箱中培养。
(2)细胞中总蛋白质提取
采用4℃预冷的PBS洗涤组织三次后，加入适量RIPA裂解液，4℃旋转摇床孵育30min，充分裂解后移入离心管中，4℃，12000rpm，离心10min，上清即为总蛋白质，CBB法测定浓度后备用。
(3)蛋白质免疫印迹检测检测TAF1L蛋白质含量
蛋白质样品按照50-100μg蛋白质/孔上样，电泳SDS-PAGE胶，120V恒压电泳；电泳结束后转膜，4℃，300mA恒流转膜3h；
转膜后添加特异性TAF1L的一抗，4℃摇床孵育过夜，添加二抗后室温孵育1h，ELC化学曝光利用化学发光型凝胶成像系统拍照。
结果如图3所示，与正常口腔上皮细胞HOEC相比，TAF1L基因在口腔鳞癌细胞系中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)。
实施例4TAF1L基因的表达敲降
(1)细胞培养
口腔鳞状癌细胞系Tca-8113以含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基在含有5％CO2的37℃培养箱中培养，2-3天换液，以含有0.25％EDTA的胰酶消化传代。
(2)siRNA设计
针对沉默TAF1L基因，设计siRNA序列，如SEQ ID NO:4～5所示；
SEQ ID NO:4：5’-GACCCAACAACCCUUCAUTT-3’；
SEQ ID NO:5：5’-AUGAAGGGUUGUUUGGGUCTT-3’。
同时设置TAF1L基因阴性对照组的siRNA序列(siRNA-NC)，如SEQ ID NO:6～7所示；
SEQ ID NO:6：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；
SEQ ID NO:7：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。
将4-5×104细胞接种在24孔细胞培养板上，每孔加0.5mL含10％FBS无抗生素的RPMI1640细胞培养基培养24小时，转染按照转染试剂lipofectamine2000的说明书进行。
将实验分为三组：空白组(Tca8113)，对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA-TAF1L)，同时分别进行转染。
(3)蛋白质免疫印迹检测TAF1L蛋白质表达差异
具体步骤同实施例3。
结果如图4所示，相比空白组(Tca8113)和对照组(siRNA-NC)，实验组(siRNA-TAF1L)能够显著降低TAF1L基因的表达，差异具有统计学意义(p<0.05)。
实施例5CCK-8检测细胞增殖活性的比较
应用CCK-8法检测TAF1L基因沉默对Tca8113细胞增殖活性的影响。
(1)细胞培养
将Tca-8113细胞按1×103/孔接种入96孔板中，以含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基在含有5％CO2的37℃培养箱中培养。
(2)细胞转染步骤同实施例4。
(3)CCK-8检测
按照100μL培养基含10μL CCK-8的完全培养基，除去旧培养液，每孔加100μL含CCK-8的细胞培养液，37℃细胞培养箱中继续培养2小时。
在酶标仪450nm波长下测定各孔吸光度，根据所测得的OD值绘制细胞生长曲线，取其平均值，以OD值的相对数目表示肿瘤细胞的增殖能力。
如图5所示，与对照组相比，转染siRNA-TAF1L组的细胞增殖显著下降。
综上所述，本发明首次发现了TAF1L与口腔癌的发生发展相关，并验证了TAF1L在口腔癌中异常高表达，TAF1L可作为口腔癌的独立相关因子，也可以和其他标志物联合应用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 一种口腔癌标志物 - TAF1L基因表达及其应用
<130> 20200106
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
aagagtaaag atcggccacg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
catccctgtg cgtttgaagt 20
<210> 3
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Pro Lys Gln Pro Phe Met Leu Gln His Ala Ser Gly Glu His Lys Asp
1 5 10 15
Gly His Gly
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gacccaacaa cccuucautt 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
augaaggguu guuuggguct t 21
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (2)

1.一种药物组合物在制备治疗口腔鳞癌药物中的应用, 其特征在于，所述药物组合物包括TAF1L-siRNA，
所述TAF1L-siRNA的核酸序列如SEQ ID NO: 4~5所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
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