CN108676892B - 结直肠癌诊断标志物mettl11a及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及结直肠癌诊断标志物METTL11A及其应用。发明通过高通量测序分析，寻找到与结直肠癌相关的分子标志物METTL11A基因，进一步通过分子实验及细胞实验研究METTL11A基因与结直肠癌的相关性及对结直肠癌的影响。本发明的METTL11A基因不仅可用于结直肠癌早期检测还可作为其治疗靶点，具有重要的应用价值。

Description

结直肠癌诊断标志物METTL11A及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤精准诊断领域，更具体地，本发明涉及结直肠癌诊断标志物METTL11A及其在诊断结直肠癌中的应用。
背景技术
结直肠癌发病率在我国恶性肿瘤中位居第4位，近年呈现显著上升态势，尤其低龄化趋势值得引起临床的重点关注。纤维内镜以及病理检查为结直肠癌的诊断的主要方法，但均难以推广作为临床普查方法，所以结直肠癌的早期诊断一直为临床面临的难题，结直肠癌的早期诊疗对其预后有重要的临床意义，目前我国结直肠癌的5年生存率为50％-60％之间。早期诊断是关键，随着诊疗技术的发展以及对肿瘤发病机制研究的不断深入，肿瘤标志物逐渐应用于临床肿瘤的早期诊断并取得了良好的临床效果，肿瘤标志物为肿瘤发生、进展过程中由肿瘤细胞合成、分泌或者机体对肿瘤反应性变化的一类物质，其种类繁多，以蛋白、糖类、酶以及基因多见，但到目前为止，尚未发现针对某一类肿瘤具有很好的灵敏以及特异的肿瘤标志物，临床多趋向于多种肿瘤标志物联合检测，联合检测可大幅提高各类肿瘤标，发明人曾通过测序技术发现与直肠腺癌相关的一些基因，如MANBA(CN201511005822.X)、SLC26A9基因(CN201511004503.7)、TMIGD2基因(2015110045215)等，但还远远不够，故而，需要发掘更多的结直肠癌相关的基因诊断标志物以提高基因检测的准确度和灵敏度。
本发明通过对结直肠癌组织及癌旁组织进行高通量测序及分析，寻找到与结直肠癌相关的分子标志物METTL11A基因，进一步通过分子实验及细胞实验研究METTL11A基因与结直肠癌的相关性及对结直肠癌的影响，结果表明METTL11A能够作为结直肠癌的诊断标志物，用于疾病的早期分子诊断，并且METTL11A与结直肠癌细胞的增殖和转移相关，有可能成为结直肠癌新的治疗靶点。本申请具有重要的临床应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供检测METTL11A基因或蛋白的制剂在制备诊断结直肠癌试剂中的应用。
进一步，检测METTL11A基因或蛋白的制剂包括检测METTL11A基因表达的试剂。
更进一步，检测METTL11A基因或蛋白的制剂包括能够定量METTL11A基因mRNA的试剂，和/或能够定量METTL11A蛋白的试剂。
优选的，定量为相对定量或绝对定量。
本发明的定量METTL11A基因mRNA的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、半定量地、或定量地实施分析。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
所述能够定量METTL11A基因mRNA的试剂可以是METTL11A基因或转录本的特异性引物，也可以是METTL11A基因或转录本的特异性识别探针，或同时包括引物和探针。
引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增来制备。
本发明的定量METTL11A蛋白的试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的定量METTL11A蛋白的试剂包括特异性结合METTL11A蛋白的抗体。
所述的抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，基于小鼠/兔子的杂交瘤技术和基于噬菌体抗体展示库的抗体筛选技术等。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍认可的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或多肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或多肽，添加用DMSO、缓冲剂等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒，诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
本发明用于METTL11A基因表达检测的样品的获得是本领域的常规技术，优选可选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。
在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
本领域技术人员公知，肿瘤组织的细胞会脱落到体液中，这些脱落的细胞称之为循环肿瘤细胞，循环肿瘤细胞的性质同肿瘤组织中肿瘤细胞的性质相同，因此检测体液中尤其是血液中循环肿瘤细胞的性质就可以代表肿瘤组织的性质。就本发明而言，通过检测肿瘤组织中METTL11A基因表达可以用于诊断结直肠癌转移，也可以通过检测循环肿瘤细胞中METTL11A基因表达来诊断结直肠癌转移。
本发明还提供了一种用于结直肠癌诊断的工具，所述工具能够检测METTL11A基因表达。
进一步，所述工具包括能够定量METTL11A基因mRNA的试剂，和/或能够定量METTL11A蛋白的试剂。
进一步，所述用于结直肠癌转移诊断的工具包括但不限于芯片、试剂盒。
本发明的试剂盒中还可包括用于提取核酸和/或蛋白的试剂，例如用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。
此外，所述的试剂盒中还可包括描述检测结直肠癌转移的方法的说明书等。
本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于METTL11A基因或其转录本、或METTL11A蛋白的检测来判断结直肠癌转移的试剂均包含在本发明范围内。
本发明还提供了一种结直肠癌转移诊断的方法，所述方法包括但不限于免疫组织化学法、Western印迹等，能够判断结直肠癌已经发生转移。
在本发明的上下文中，“结直肠癌转移诊断”包括判断受试者是否已经发生结直肠癌转移、判断受试者是否存在结直肠癌转移的风险。
如本文所用，术语”抗体”，意指特异性结合至特定抗原或与特定抗原相互作用的任意抗原-结合分子或分子复合体。
如本文所用，术语“抗体”还包括整个抗体分子的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段可以利用任何适宜的标准技术，例如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变区和任选恒定区的DNA的操纵和表达的重组基因改造技术，从例如完整的抗体分子衍生。这样的DNA是已知的及/或很容易从例如市售来源、DNA库(包括例如噬菌体-抗体库)获得，或可以被合成。该DNA可以被测序且以化学方法或分子生物学技术加以操纵，从而例如将一个或多个可变区和/或恒定区排列成适宜的构型，或引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或删除氨基酸等。
本发明的目的在于提供抑制METTL11A基因或蛋白表达的制剂在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
进一步，所述治疗结直肠癌药物是指可以抑制METTL11A基因的表达的制剂。本领域人员熟知抑制基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种：通过激活METTL11A基因的抑制基因、激活METTL11A基因的抑制基因表达的蛋白、采用RNA干扰技术抑制METTL11A基因表达、激活促进METTL11A基因mRNA降解的microRNA、导入促进METTL11A基因编码蛋白降解的分子、抑制促进METTL11A基因表达的因子及蛋白的表达。
RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA特异性降解，导致转录后基因沉默的现象，是一种使用小的双链RNA高效、特异地阻断体内某种特定基因的表达，促使mRNA降解，使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。siRNA设计完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体，制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉淀法、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene法、显微注射或基因枪等机械法、阳离子脂质体试剂法等途径转染细胞。
进一步，抑制METTL11A基因表达的siRNA靶点选自下列序列中的一种和/或几种：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9。优选siRNA靶点序列为SEQ ID NO.3。
进一步，所述抑制METTL11A基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种：SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11。优选siRNA序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5。
本发明的目的在于提供一种治疗结直肠癌药物，所述治疗结直肠癌药物抑制METTL11A基因的表达。
进一步，治疗结直肠癌药物还包含药剂学上能接受的载体。
优选的，所述药物抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移或侵袭。
包含在本发明的药剂学上能接受的载体为在制剂时通常利用的载体，该载体包含乳糖(lactose)、右旋糖(dextrose)、蔗糖(sucrose)、山梨醇(sorbitol)、甘露醇(mannitol)、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐(alginate)、凝胶(gelatin)、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、纤维素(cellulose)、水、糖浆、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、丙基羟基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)、滑石、硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油(mineral oil)等，但并非局限于此。
本发明的组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、湿润剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。药剂学上能接受的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。
本发明的组合物能通过口服或非口服进行给药，作为非口服给药时，能通过静脉内注射，鼻腔内注射，局部注射，脑室内注射，脊髓腔注射，皮下注射，腹腔注射，经皮给药等方式进行给药。
本发明的组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、食物、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，通常，熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。
本发明的组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法，利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化，从而能够以单位用量形态制备或者内装在多容量容器内来制备。此时，剂型是油性或者水性介质中的溶液、悬浮液或乳化液形态，或者也可以是浸膏剂、粉末剂、颗粒剂、片剂或者胶囊剂形态，还可以包括分散剂或者稳定剂。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现并证实METTL11A基因表达与结直肠癌发生和转移密切相关性。该相关性的提出为结直肠癌转移的诊断与治疗提供了新的途径。
附图说明
图1是荧光定量检测不同siRNA干扰效果图
图2是干扰METTL11A表达后细胞增殖图
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1样品的收集及总RNA提取
收集医院2014年1月到2015年6月结肠腺癌患者癌组织及对应癌旁组织各6例。患者术前未经放疗和化疗，术中取材，立即放入液氮中保存，随后转入-80℃长期保存，以用于RNA提取。标本经病理诊断确诊为结肠癌。
RNA提取标准：RNA纯度：OD260/280≧1.8，28S/18S≧1；RNA完整性：RIN值≧7.0。RNA完整性检测方法：Agilent 2100(RNA 6000 Nano kit)、琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶浓度：1％琼脂糖胶；电压：5V/cm；时间：20min)。
实施例2测序及数据分析
测序：运用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量测序技术对mRNA进行测序，通过去接头、去低质量、去污染等过程完成数据的处理，得到最终数据。
测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台，进行高通量转录组深度测序，测序后我们运用Fast-QC软件对测序数据的质量进行整体评估，包括碱基的质量值分布，质量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差异基因表达分析时，根据得到的FPKM值，采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。其中，筛选时，LOG2FC>1或<-1,FDR<0.05。为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对差异表达基因进行了Gene Onlogy和信号通路分析，并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网络分析，鉴于以上数据分析的结果，结合文献我们从候选的差异表达mRNA中挑选到METTL11A基因进行后期验证。
实施例3 Real-time PCR检测结直肠癌组织中METTL11A基因的表达
1样品采集：
28例结肠癌肿瘤患者癌组织及癌旁组织，19例直肠癌肿瘤患者癌组织及癌旁组织(采集时间2014年1月-2016年12月)，对其进行分组及编号，放入-80℃冰箱中保存。
2总RNA提取：
相关实验物品的去Rnase的处理：
①将所有玻璃器皿应用前均用DEPC冲洗侵泡，120℃高压20min，180℃高温烤干2小时以上。
②将塑料器皿(如：EP管/枪头)使用前需用0.1％DEPC水侵泡过夜，后控干液体，120℃高压20min，烤箱烤干备用。
使用
Figure BDA0001736006630000081
Reagent提取样本RNA，操作参考说明书，具体如下：
取出冻藏组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：
①加入Trizol，室温静置5min；
②每毫升Trizol加0.2ml氯仿，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10min；
③4℃12000rpm高速离心15min后EP管分3层，吸取上层水相到另一新离心管管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20℃预冷过的异丙醇，充分颠倒混匀，冰上静置10min；
④4℃12000rpm高速离10min后小心弃掉上清液，加入75％DEPC乙醇洗沉淀，振荡混合，4℃12000rpm高速离心5min；
⑤弃去乙醇液体，室温下放置5分钟以充分晾干沉淀，加入20-40微升DEPC处理过的水溶解沉淀；
⑥用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
3一步法Real-Time PCR
3.1仪器及分析方法
用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
3.2引物设计
采用在线引物设计软件，基因序列参照NCBI:NM_001286796.1，GAPDH为内参，引物设计后由invitrogen公司合成。具体引物序列如下：
METTL11A基因引物：
5’-ATCGTGGTGCTTGAGTAG-3’(SEQ ID NO.1)
5’-GCCTTGGAATAGAATTGCTT-3’(SEQ ID NO.2)
UltraSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒(货号：CW2624S)操作步骤：
1.将RNA模板、引物、2×UltraSYBR One Step Buffer、UltraSYBR One StepEnzymeMix和RNase-Free Water溶解并置于冰上备用。
2.反应体系：
试剂 反应体系(μl)
2×UltraSYBR One Step Buffer 12.5μl
上游引物(10μM) 0.5μl
下游引物(10μM) 0.5μl
UltraSYBR One Step EnzymeMix 0.5μl
RNA模板 1μl
50×low ROX 0.5μl
RNase-Free Water 补平至25μl
3.涡旋震荡混匀，短暂离心，将溶液收集到管底。
4.RT-qPCR反应条件(荧光定量PCR为两步法)，反转录45℃10min；预变性96℃5min；30个循环(变性95℃10s，退火和延伸60℃45s)；反应结束后4℃恒温。
二、实验结果
实时定量PCR扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，扩增曲线拐点清楚，极限平而无上扬现在，曲线指数期斜率较大，说明扩增效率较高；样本扩增产物溶解曲线为单峰，表明扩增产物唯一，是特异性扩增；根据qRT-PCR的相对定量公式：2-ΔCt×100％，比较METTL11A基因在结肠癌和癌旁组织表达水平、直肠癌和癌旁组织表达水平。结果显示：METTL11A基因在癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，约为癌旁的两倍，以上结果验证了转录组高通量测序表达数据的结果。结肠癌和直肠癌统称为结直肠癌，二者发病机制非常相似，涉及的分子标志物多有交叉，验证结果显示METTL11A基因在结肠癌和直肠癌组织中都有明显差异表达，28对结肠癌肿瘤患者癌组织基癌旁组织中METTL11A基因在癌组织高表达的样本为23例，有3对样本癌组织和癌旁组织差异表达不明显，不具有统计学意义，19对直肠癌肿瘤患者癌组织及癌旁组织中METTL11A基因在癌组织高表达的样本为16例，有2对样本癌组织和癌旁组织差异表达不明显，不具有统计学意义，验证结果表明METTL11A基因可作为结直肠癌诊断标志物。
实施例4 siRNA干扰实验
4.1材料
结直肠癌细胞株HT29购自美国ATCC公司，RPMI1640培养基、胎牛血清和胰酶购自life technologies公司。
4.2细胞培养
HT29细胞采用含10％胎牛血清RPMI 1640完全培养基培养，细胞放置于37℃5％CO2孵箱内培养，待细胞长至融合度为80-90％左右时，胰酶消化并传代或冻存，取生长状态良好的细胞用于实验。
4.3 siRNA设计与转染
siRNA设计后由上海吉玛公司设计合成。
Figure BDA0001736006630000101
Figure BDA0001736006630000111
siRNA转染，转染试剂为Powerfect siRNA Transfection Reagent(signagen)，步骤如下：
(1)每孔约3.0×105个细胞均匀接种在六孔板，接种24小时后观察，密度达到约30％，状态良好时准备转染。
(2)转染前30min，使用l.0ml PBS洗涤细胞，加入1ml含10％FBS的培养基。
(3)将100μl 1×Powerfect Transfection Buffer加入RNase-free的EP管中，将5μl siRNA加至100μl 1×Powerfect Transfection Buffe：中，轻轻吹打约10次混匀，再加入2.4μl Powerfect Reagent，轻轻吹打约10次混匀，室温条件下静置大约10min，最多不超15min；
(4)将上述siRNA-转染试剂的混合物加入细胞培养上清中，轻微晃动六孔板混匀，于37℃，5％CO2湿化培养箱中培养，6h后将每孔加2m1含10％FBS的培养基。
(5)转染48h或72h后收集细胞，在RNA水平检测目的基因表达。
4.4荧光定量检测干扰效果
具体引物及操作步骤参照实施例3。针对METTL11A设计3个干扰靶点，在结直肠癌细胞系HT29中转染siRNA，检测其对METTL11A的干扰效果，结果显示，与空白对照组相比，转染siRNA的细胞中METTL11A的表达水平明显下降，其中转染METTL11A-siRNA1下降最为明显，表达量仅为对照的45％，具体见图1。采用METTL11A-siRNA1进行后续的实验。
实施例5抑制METTL11A表达对结直肠癌细胞功能的影响
5.1细胞增殖实验
设置METTL11A-siRNA1干扰组和空白对照组。以每孔1×103个细胞种于96孔培养板孔中，每孔培养基体积200μl，每组5孔，边缘的孔利用无菌PBS填充，然后分别培养1、2、3、4天。在每孔中加入10μl CCK8试剂后，37℃孵育培养2h后终止培养，并以空白对照孔调零，在酶标仪上450nm测定各孔的吸光度值(OD值)，然后用相对应的OD比值来表示细胞增殖能力大小。每组取的各孔平均值，然后绘制增殖曲线，该试验重复3次。
采用析因设计的方差分析和单因素方差分析。CCK8细胞增殖实验结果表明，与空白对照组相比，METTL11A-siRNA1干扰组细胞的增殖能力下降，两组间增殖能力差异具有统计学意义(P<0.001)，具体见图2。
5.2 Transwell体外迁移实验
设置METTL11A-siRNA1干扰组和空白对照组。接种200μl无血清培养基稀释的细胞((0.1-1×106个/mL)，在下室中加入500μl含10％胎牛血清的1640培养液；37℃，5％CO2的条件下培养36h后，移出培养小室，并用4％多聚甲醛固定30min，风干，苏木素染色30-60min用浸湿的棉签擦拭掉上室底部的基质胶以及未侵袭细胞，然后将培养小室倒置控干，在光学显微镜下观察和照相，并且每组随机地选取5个视野，然后计数每个中倍视野中的细胞数，然后取平均数。
采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。Transwell体外迁移实验结果显示，METTL11A-siRNA1干扰组细胞的迁移能力明显下降，对照组发生迁移细胞平均为163，干扰组发生迁移细胞平均为17，两组相差近10倍，差异具有统计学意义。
5.3 Transwell体外侵袭实验
设置METTL11A-siRNA1干扰组和空白对照组。用已预冷的不含血清的1640培养基来稀释Matrigel基质胶(培养基：Matrigel＝3:1)，快速充分混匀后立即包被Transwell小室内室，37℃干燥2h。接种200μl无血清培养基的稀释细胞((0.1-1×106个/mL)，在下室中加入500μl含10％血清的1640培养液37℃，5％CO2条件培养36-48h后，移出培养小室，然后用4％多聚甲醛固定30min，风干，苏木素染色30-60min，用浸湿的棉签擦拭掉上室底部的基质胶以及未侵袭细胞，然后将培养小室倒置控干，在光学显微镜下观察和照相，并且每组随机地选取5个视野，然后计数每个中倍视野中细胞数，然后取平均数。
采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。Transwell体外侵袭实验结果显示，METTL11A-siRNA1干扰组细胞的侵袭能力明显下降，对照组发生迁移细胞平均为104，干扰组发生迁移细胞平均为23，两组相差近5倍，差异具有统计学意义。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 结直肠癌诊断标志物METTL11A及其应用
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcgtggtgc ttgagtag 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccttggaat agaattgctt 20
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcatttaaa gtaaaaaata aaa 23
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uuauuuuuua cuuuaaaugc c 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cauuuaaagu aaaaaauaaa a 21
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcccttaaa gtgttacaac agc 23
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uguuguaaca cuuuaagggc c 21
<210> 8
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccuuaaagu guuacaacag c 21
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caggcattta aagtaaaaaa taa 23
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
auuuuuuacu uuaaaugccu g 21
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggcauuuaaa guaaaaaaua a 21

Claims (11)

1.检测METTL11A基因的制剂在制备诊断直肠癌试剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测METTL11A基因的表达。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测为定量检测。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用PCR、Southern 杂交、Northern 杂交、点杂交、荧光原位杂交、DNA微阵列、ASO法、高通量测序法检测METTL11A基因的表达。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，定量检测METTL11A基因的试剂包括METTL11A基因特异性扩增引物和/或特异性探针。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测样本为癌组织或外周血。
7.抑制METTL11A基因表达的制剂在制备治疗直肠癌药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，采用下述方法中的一种或几种抑制METTL11A基因表达：通过激活METTL11A基因的抑制基因、采用RNA干扰技术抑制METTL11A基因表达、激活促进METTL11A基因mRNA降解的microRNA、抑制促进METTL11A基因表达的因子的表达。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，抑制METTL11A基因表达的siRNA靶点选自下列序列中的一种和/或几种：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.9。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，siRNA靶点序列为SEQ ID NO.3。
11.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物抑制直肠癌细胞的增殖、迁移或侵袭。
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Investigating the role of N-terminal protein methylation in colon cancer progression.;John G et,al.;《Cancer Res.》;20130430;第73卷(第8suppl期);摘要 *
NRMT is an a-N-methyltransferase that methylates RCC1 and retinoblastoma protein;Christine E. Schaner Tooley et,al.;《Nature》;20100826;第465卷;1125-1130 *

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