CN116271043A - 过表达ints10基因的试剂在治疗和/或预防肝癌中的应用 - Google Patents

过表达ints10基因的试剂在治疗和/或预防肝癌中的应用 Download PDF

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CN116271043A CN202310122561.8A CN202310122561A CN116271043A CN 116271043 A CN116271043 A CN 116271043A CN 202310122561 A CN202310122561 A CN 202310122561A CN 116271043 A CN116271043 A CN 116271043A
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李元丰
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Abstract

本发明提供了过表达INTS10基因的试剂在治疗和/或预防肝癌中的应用，属于基因工程技术领域。所述试剂用于过表达或激活INTS10，所述药物用于下列的至少之一：促进细胞周期阻滞和细胞凋亡；抑制细胞的生长；抑制细胞迁移；促进P21的表达；抑制CDC25A或CDK4的表达。用于过表达或激活INTS10的试剂在促进细胞周期阻滞和细胞凋亡；抑制细胞的生长；抑制细胞迁移；促进P21的表达；抑制CDC25A或CDK4的表达方面效果显著。

Description

过表达INTS10基因的试剂在治疗和/或预防肝癌中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是涉及过表达INTS10基因的试剂在治疗和/或预防肝癌中的应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是世界上第六大常见恶性肿瘤，也是全球癌症相关死亡的主要原因之一，近几十年来发病率不断上升。虽然外科技术的发展改善了肝细胞癌患者的预后，但由于死亡率高，HCC患者的总体生存率仍然处于很低的比例，全世界每年约造成超过70万人死亡。国内近五年的生存率也小于12.5％。目前的研究表明HCC最常见的危险因素是乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)，同时酒精性肝病(ALD)、肥胖和非酒精性脂肪肝(NAFLD)也是HCC重要危险因素，这些病因的发病率处于一个上升的趋势。临床上，虽然计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)技术可以极大的提高HCC的诊断性能并及时治疗，但由于其程序过于昂贵，并不能广泛筛查，而且HCC也具有发病性隐匿、高侵袭性和转移能力的特点，会导致患者失去了很多治疗的机会。因此，发掘肝癌的相关基因，了解其在肝癌发生发展中的分子机制，有助于寻找可靠的生物标志物，为HCC患者提供更多有效治疗。
整合因子复合体(Integrator Complex)是一个多亚基复合体，至少由14个进化上保守的亚基(Integrator Complex Subunits，INTS1～INTS14)组成，与磷酸化RNA聚合酶II(RNAPII)结合。最初被描述为是作用于U-rich小核RNA(snRNA)3'端的复合物，其作用现已扩展到全基因组水平上RNAPII转录的调控。在mRNA编码基因转录的背景下，整合因子被证明在RNAPII启动子近端暂停向生产性延长和终止的过渡中起着重要作用。Integrator与促进RNAPII暂停的负延伸因子NELF及其相互作用因子DSIF发生物理相互作用，DSIF有助于在NELF存在时暂停，并在NELF从聚合体中释放后作为正延伸因子。此外，Integrator还与P-TEFb相互作用，P-TEFb是RNAPII CTD激酶，负责ser-2磷酸化，伴随从暂停到转录延伸的转变，并与超延伸复合物(SEC)相互作用。P-TEFb也可以促使NELF磷酸化，触发其从转录复合体中释放并重新启动转录。同时在缺乏Integrator的情况下，转录对刺激的反应被抑制，RNAPII不能从暂停状态过渡到生产性延伸。INTS10是整合因子复合体家族中的一员。在人类染色体中，INTS10的编码基因位于8p21.3。根据前期RNA-SeqAtlas数据库，INTS10在包括肝组织在内的广泛组织类型中表达。但是，INTS10在肝癌发生发展中的作用尚未见报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了过表达INTS10基因的试剂在治疗和/或预防肝癌中的应用，INTS10基因可在肝癌细胞中作为抑癌基因发挥功能。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
过表达INTS10基因的试剂在治疗和/或预防肝癌中的应用。
本发明还提供了过表达INTS10基因的试剂在抑制肝癌细胞生长和/或迁移中的应用。
本发明还提供了过表达INTS10基因的试剂在促进肝癌细胞凋亡中的应用。
本发明还提供了过表达INTS10基因的试剂在促进P21的表达、抑制CDC25A或CDK4表达中的应用。
优选的，所述肝癌细胞为HepG2细胞和/或HCC97H细胞。
本发明还提供了INTS10蛋白在制备治疗和/或预防肝癌药物中的应用。
本发明还提供了INTS10蛋白在制备抑制肝癌细胞生长和/或迁移药物中的应用。
本发明还提供了INTS10蛋白在制备促进肝癌细胞凋亡药物中的应用。
本发明还提供了INTS10蛋白在制备促进P21的表达、抑制CDC25A或CDK4表达药物中的应用。
优选的，所述肝癌细胞为HepG2细胞和/或HCC97H细胞。
有益效果：
本发明探索了INTS10在肝癌细胞中的功能和机制，初步提示其可能通过抑制细胞周期相关通路发挥抑癌基因的作用。未来将进一步研究INTS10在肝癌发生发展中详细的功能和分子机制，为肝癌的临床诊治提供依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为INTS10在肿瘤组织和正常组织中的表达，(A)在GEPIA平台中通过TCGA分析31种肿瘤组织及邻近非肿瘤组织中INTS10mRNA的表达；(B)利用GEPIA数据库，分析肝癌组织(n＝369)和正常组织(n＝160)中INTS10的表达；(C)INTS10在肝癌和正常肝组织中的代表性免疫组化图像(Human Protein Atlas Database)；*P<0.05；
图2为构建稳定过表达或敲降INTS10基因表达的细胞株，(A,B)通过qRT-PCR和Western blot分别检测HepG2和HCC97H细胞中INTS10的mRNA水平及蛋白水平，来鉴定INTS10的过表达或敲低效果。
图3为INTS10对肝癌细胞生长增殖的影响(C,D)使用CCK-8试验评估INTS10过表达(C)或敲低(D)后HepG2和HCC97H细胞的生长能力。(E,F)通过HepG2和HCC97H细胞的集落形成试验评估INTS10过表达(E)或敲低(F)后的细胞生长能力。(G,H)HepG2和HCC97H细胞在INTS10过表达(G)或敲低(H)后，采用Brdu法评估细胞增殖情况。数据以三次独立实验的均数±SEM(均数标准误差)表示，采用双尾Studentt检验；n sP>0.05，*P<0.05，**P<0.1，***P<0.001；
图4为INTS10对肝癌细胞迁移能力的影响，(A,B)Transwell法检测了INTS10过表达(A)或敲低(B)对HCC细胞的迁移能力的影响；数据以三个独立实验的均数±均数标准误差(standard error of mean,SEM)表示，采用双尾Student t检验；**P<0.01；
图5为INTS10对HCC细胞周期进展的影响，(A,B)在HepG2和HCC97H细胞中，通过流式细胞术评估INTS10过表达(A)或敲低(B)后的细胞周期；数据以三次独立实验的均数±SEM(均数标准误差)表示，采用双尾Student t检验；ns P>0.05，*P<0.05，**P<0.01；
图6为INTS10对HCC细胞凋亡的影响，(A,B)通过流式细胞术评估过表达INTS10(A)或下调INTS10(B)后HepG2和HCC97H细胞的凋亡能力；数据以三次独立实验的均数±SEM(均数标准误差)表示，采用双尾Student t检验；ns P>0.05，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；
图7为INTS10调控HCC相关信号通路，(A)火山图显示，与对照细胞相比，INTS10缺失的HepG2细胞中差异表达基因(log2[fold-change]>0.3,p<0.05)；(B)INTS10敲低的HepG2细胞中所有基因的功能富集分析(FR＝knockdown/control,FR<0.7,FR>1.3)；(C,D)HepG2和HCC97H细胞INTS10过表达(C)或敲低(D)后指示基因的qRT-PCR和Westernblotting分析。数据以均数±标准差(n＝3)表示，双尾Student t检验；**P<0.01，***P<0.001。
具体实施方式
本发明提供了过表达INTS10基因的试剂在治疗和/或预防肝癌中的应用。本发明对所述试剂的种类没有特殊限定，能够过表达INTS10基因即可。
在本发明中，所述INTS10基因的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，具体如下：
ATGTCTGCCCAGGGGGACTGCGAGTTCCTGGTGCAGCGAGCCCGGGAGTTGGTGCCGCAAGACCTGTGGGCAGCCAAGGCGTGGCTGATCACGGCCCGCAGCCTCTACCCGGCAGACTTTAACATCCAGTATGAGATGTACACCATCGAGCGGAATGCAGAGCGGACCGCCACCGCCGGGAGGCTGCTGTACGACATGTTTGTGAATTTCCCAGACCAGCCGGTGGTGTGGAGAGAAATCAGCATTATTACATCAGCATTAAGGAACGATTCACAGGACAAACAAACCCAATTTTTAAGAAGTTTATTTGAAACTCTTCCTGGTCGGGTCCAGTGTGAAATGTTACTAAAGGTCACGGAACAATGCTTCAACACGTTAGAACGATCAGAAATGTTGCTTCTACTTTTGAGGCGCTTCCCTGAAACGGTGGTGCAGCATGGGGTTGGCCTTGGGGAGGCACTATTAGAGGCTGAAACTATTGAAGAACAAGAATCTCCAGTGAACTGCTTTAGAAAATTATTTGTTTGTGATGTCCTTCCTCTAATAATTAACAACCATGATGTTCGATTACCTGCCAATTTATTGTATAAGTACTTGAACAAAGCAGCTGAATTTTATATCAATTATGTCACTAGGTCTACTCAAATAGAAAATCAGCATCAAGGCGCCCAGGATACATCTGATTTAATGTCACCTAGCAAACGTAGCTCTCAGAAGTACATAATAGAAGGGCTGACGGAAAAATCATCCCAGATCGTGGACCCTTGGGAGAGGTTGTTTAAGATTTTGAATGTTGTTGGAATGAGATGTGAATGGCAGATGGATAAAGGAAGACGAAGCTATGGAGATATTTTGCATAGAATGAAGGATCTCTGCAGATACATGAACAACTTTGATAGTGAAGCACATGCAAAATATAAAAACCAAGTGGTGTATTCCACCATGCTGGTCTTCTTTAAGAATGCATTCCAGTATGTCAACAGCATACAGCCATCTCTCTTCCAAGGTCCTAATGCCCCGAGCCAAGTTCCACTGGTTCTTCTTGAAGATGTATCGAATGTGTATGGTGATGTAGAAATTGATCGTAATAAACACATCCATAAAAAGAGGAAACTAGCTGAAGGAAGAGAAAAAACCATGCAGAGTTCAGACGATGAAGACTGTTCGGCGAAAGGAAGAAATCGTCACATTGTAGTCAATAAAGCCGAACTTGCTAACTCCACTGAAGTGTTAGAAAGCTTTAAATTGGCCAGGGAGAGCTGGGAGTTGCTCTATTCCCTAGAATTCCTTGACAAAGAATTTACAAGGATTTGCTTGGC CTGGAAGACGGATACTTGGCTTTGGTTAAGAATCTTCCTCACTGATATGATCATCTATCAGGGTCAATATAAAAAGGCGATAGCCAGCCTGCATCACTTAGCAGCTCTCCAGGGATCCATTTCTCAGCCACAGATCACAGGGCAGGGGACCCTGGAGCATCAGAGGGCGCTCATCCAGCTGGCGACGTGCCACTTTGCGCTAGGGGAGTACAGAATGACATGTGAAAAAGTCCTTGATTTGATGTGCTACATGGTACTCCCCATTCAAGATGGAGGCAAATCCCAGGAGGAACCCTCGAAAGTAAAGCCCAAATTTAGAAAAGGTTCGGATCTGAAGCTCCTGCCTTGTACCAGCAAGGCTATCATGCCATACTGCCTCCATTTAATGTTAGCCTGTTTTAAGCTTAGAGCTTTCACAGACAACAGAGACGACATGGCATTGGGGCATGTGATTGTGTTGCTTCAGCAAGAGTGGCCACGGGGCGAGAATCTTTTCCTGAAAGCTGTCAATAAAATTTGCCAACAAGGAAATTTCCAATATGAGAATTTTTTCAATTACGTTACAAATATTGATATGCTGGAGGAATTTGCCTACTTGAGAACTCAGGAAGGTGGGAAAATTCATCTGGAATTACTACCCAATCAAGGAATGCTGATCAAGCCTTCTAGCCCTCCCATGGGGTTACTGCAGCAGGAATTCTTACCTGTGCTTCAGCCCAGCATACAGACTGCTGACAGGCACCACACTGTAACTCGAGGCATCACCAAAGGCGTGAAGGAGGACTTTCGCCTGGCCATGGAGCGCCAGGTCTCCCGCTGTGGAGAGAATCTGATGGTGGTTCTGCACAGGTTCTGCATTAATGAGAAGATCTTGCTCCTTCAGACTCTGACCTGA。
本发明还提供了过表达INTS10基因的试剂在抑制肝癌细胞生长中的应用。本发明对所述试剂的种类没有特殊限定，能够过表达INTS10基因即可。
本发明还提供了过表达INTS10基因的试剂在抑制肝癌细胞迁移中的应用。本发明对所述试剂的种类没有特殊限定，能够过表达INTS10基因即可。
本发明还提供了过表达INTS10基因的试剂在促进肝癌细胞凋亡中的应用。本发明对所述试剂的种类没有特殊限定，能够过表达INTS10基因即可。
本发明就还提供了过表达INTS10基因的试剂在促进P21的表达、抑制CDC25A或CDK4表达中的应用。
在本发明中，所述肝癌细胞优选为HepG2细胞和/或HCC97H细胞。
本发明还提供了INTS10蛋白在制备治疗和/或预防肝癌药物中的应用。本发明对所述药物的种类没有特殊限定，INTS10蛋白在医学上可接受即可。
本发明还提供了INTS10蛋白在制备抑制肝癌细胞生长药物中的应用。本发明对所述药物的种类没有特殊限定，INTS10蛋白在医学上可接受即可。
本发明还提供了INTS10蛋白在制备抑制肝癌细胞迁移药物中的应用。本发明对所述药物的种类没有特殊限定，INTS10蛋白在医学上可接受即可。
本发明还提供了INTS10蛋白在制备促进肝癌细胞凋亡药物中的应用。本发明对所述药物的种类没有特殊限定，INTS10蛋白在医学上可接受即可。
本发明还提供了INTS10蛋白在制备促进P21的表达、抑制CDC25A或CDK4表达药物中的应用。
在本发明中，所述肝癌细胞为HepG2细胞和/或HCC97H细胞。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1材料与方法
1.1细胞系与载体
人肝癌细胞系HepG2和HCC97H，人胚肾细胞系HEK293T(三种细胞均购买于ATCC上海细胞库)；用于基因过表达的载体pLV-3×Flag-mCherry(2A)Puro-INTS10及对照载体pLV-3×Flag-mCherry(2A)Puro和用于基因敲低的载体pLV-shRNA-EGFP(2A)Puro、pLV-shRNA-EGFP(2A)Puro-INTS10#1、pLV-shRNA-EGFP(2A)Puro-INTS10#2和pLV-shRNA-EGFP(2A)Puro-INTS10#3(英茂盛业科技有限公司)。
1.2主要试剂
细胞培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)及传代用0.25％胰蛋白酶(北京细工生物科技公司)；胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS，Gibco公司)；CCK-8检测试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；Transwell小室(353097)购自美国BD-Biocoat；SYBR Green荧光定量试剂盒购自美国Kapa；INTS10抗体(1∶1000，NovusBiologicals公司)等。
1.3主要仪器
二氧化碳细胞培养箱(Thermo Fisher)，无菌超净台(北京哈东联)，高速离心机(Thermo Scientific)，电泳槽(Bio-Rad)，电转槽(Tanon)，蛋白印迹成像仪(Tanon 5200)，荧光定量PCR仪(Bio-Rad)等。
1.4细胞培养
实验所用培养基均为10％FBS和1％青链霉素双抗的DMEM，培养条件为37℃、5％CO2，并保持一定的湿度。
1.5构建稳定过表达和敲低INTS10的肝癌细胞系
分别将慢病毒包装质粒pMD2.G、pSPAX2与目的质粒(3×Flag和3×Flag-INTS10及shNC、shINTS10#1、shINTS10#2、shINTS10#3)按1∶2∶3的比例共转染于HEK293T细胞系，8h(hour，小时)后更换为正常培养基继续培养，48h时收集富含病毒颗粒的细胞培养上清液，用0.45μm滤器过滤以除去细胞碎片，加入6×的病毒浓缩液，混匀后静置2h以上。4℃离心机3000rpm(r/min，转每分)离心30min(minute，分钟)，用1mL含10％FBS的DMEM重悬沉淀混匀，加5μg/mL的Polybrene感染HCC97H和HepG2，48h时后加入终浓度为2μg/mL嘌呤霉素进行筛选。
1.6蛋白质提取及蛋白质免疫印迹(Western blotting，WB)实验
收集对照组和实验组细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，置于冰上裂解30min，12000rpm离心10min，转移上清至新的离心管中，按比例加入适量的蛋白上样缓冲液，煮沸10min，得到细胞总蛋白样品。配制适宜浓度的SDS-PAGE胶，随后进行上样、电泳和转膜，转膜完毕后将含有目的蛋白的醋酸纤维膜置于含5％脱脂乳的封闭液中，室温封闭1h。4℃条件下孵育一抗过夜，TBST漂洗3次，每次5min，二抗室温孵育1h，再用TBST洗3次，最后进行显影。
1.7RNA提取及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
按照试剂盒说明书进行细胞总RNA的提取(北京康为世纪生物科技有限公司)。采用分光光度计测量浓度后，取500ngRNA使用MonScriptTM RTIll All-in-One Mix试剂盒逆转录为cDNA，以5μL cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)扩增实验(详细引物信息见表1)。所有样本均设3个重复，以ACTB基因为对照，对mRNA定量结果进行归一化处理。根据Ct值和标准曲线的分析对INTS10模板进行定量分析。
1.8 CCK-8检测细胞增殖
收集处于生长对数期的细胞，计数细胞后调整细胞密度，按每孔2000个细胞接种于96孔板，每组3个重复，细胞培养一定时间后加入含10％CCK-8试剂的无血清DMEM培养基，采用酶标仪在450nm处检测吸光度OD值，收集数据，根据记录的数据进行统计分析并绘制细胞生长曲线。
1.9平板细胞克隆形成实验检测细胞增殖
取对数生长期细胞，按2000个/孔细胞量接种于6孔板中。培养14d(day，天)，期间每隔3d换液1次。待出现肉眼可见的克隆时，终止培养，用甲醇固定30min，0.5％结晶紫溶液染色30min。最后洗净并晾干平板，对克隆进行拍照、计数和统计分析。
1.10 BrdU法检测细胞增殖
取对数生长期的细胞重悬后，加入浓度为10μM的BrdU，37℃细胞培养箱培养30min-2h，1％BSA/PBS清洗后，滴加至预冷的无水乙醇中，-20℃固定1小时。清洗后加入1mL2N HCl/0.5％Triton X-100，室温缓慢涡旋处理1h；加入1mL 0.1M Na2BO4(pH8.5)重悬，中和酸；离心弃上清，0.5％Tween20/1％BSA/PBS洗1次后加入BrdU-PE抗体(1:100稀释)，室温缓慢涡旋孵育1h；0.5％Tween20/1％BSA/PBS洗3次，加入适量的300-500μL PBS，进行流式检测分析数据。
1.11流式细胞术检测细胞周期
收集对照组和实验组细胞，用300μL PBS重悬后悬滴置700μL预冷的无水乙醇中，-20℃固定过夜。离心后，将细胞沉淀悬浮于300～500μL含有20μg/mL RNAaseA(1：200)和40μg/mL PI的PBS中，室温孵育15min；采用流式细胞仪检测并用FlowJo软件分析数据。
1.12流式细胞术检测细胞凋亡
取处于对数生长期的实验组和对照组细胞，以2×105个/孔的密度接种于12孔板中，置于细胞培养箱中培养，其中第24h用800μM的H2O2对细胞进行损伤刺激。收集细胞，加入100μL 1×Binding Buffer重悬细胞，然后加入5μL V-FITC和10μL PI，轻混，室温避光孵育15min，加入400μL 1×Binding Buffer，置于冰上，采用流式细胞仪检测细胞凋亡，FlowJo软件分析数据。
1.13细胞迁移能力的检测
将对数生长期的细胞计数并稀释至5×105个/mL，在24孔板的每个孔中加含20％FBS培养基800μL，将Transwell小室轻轻放入24孔板的孔中，取200μL上述稀释后的细胞悬液加到Transwell小室内，在培养箱中继续培养18-24h。将小室移至含1mL4％多聚甲醛的24孔板中，固定15min，接着移至加1mL0.5％结晶紫溶液的孔中染色10min。PBS轻轻冲洗小室，用棉签小心将小室内部的结晶紫及未穿过膜的细胞擦拭干净。在显微镜下对穿过小室的细胞拍照并进行统计分析。
1.14临床相关性分析
本发明采用基因表达谱交互分析(gene expression profiling interactiveanalysis，GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/detail)平台和Human Protein Atlas数据库展示了mRNA和蛋白水平上INTS10在肝癌和正常肝组织中的表达差异。
1.15统计学分析
本发明所有实验均收集3对样品进行检测，用Graphpad Prism 8.0分析各组Mean±SD，采用t检验进行统计检验，P>0.05标记为“ns”；P＜0.05标记为“*”；P＜0.01标记为“**”；P＜0.001标记为“***”。
表1用于qRT-PCR实验的引物序列
引物 核苷酸序列(5’-3’)
ACTB-F SEQ ID No.1 GAGAGGGAAATCGTGCGTGACA
ACTB-R SEQ ID No.2 ACCCAAGAAGGAAGGCTGGAAA
INTS10-F SEQ ID No.3 AAGACTGTTCGGCGAAAGGA
INTS10-R SEQ ID No.4 AGGCTGGCTATCGCCTTTTT
CDC25A-F SEQ ID No.5 GTGAAGGCGCTATTTGGCG
CDC25A-R SEQ ID No.6 TGGTTGCTCATAATCACTGCC
CDKN1A-F SEQ ID No.7 TGTCCGTCAGAACCCATGC
CDKN1A-R SEQ ID No.8 AAAGTCGAAGTTCCATCGCTC
CDK4-F SEQ ID No.9 ATGGCTACCTCTCGATATGAGC
CDK4-R SEQ ID No.10 CATTGGGGACTCTCACACTCT
F,forward；R,reverse
2结果
2.1 INTS10的mRNA水平和蛋白水平在肝癌组织中低表达
为了探究INTS10在肝癌组织中的表达水平，采用基因表达谱交互分析(geneexpression profiling interactive analysis，GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/ detail)平台，在TCGA的31种癌组织及其相应癌旁组织中分析了INTS10mRNA的表达水平。结果显示，约1/5癌症类型的癌组织中INTS10的表达均显著低于对应的癌旁非肿瘤组织(图1中A)。其中，INTS10在肝癌组织中的mRNA表达水平显著低于癌旁组织(图1中B)。同时，为了研究INTS10在肝癌组织中的蛋白水平，通过Human Protein Atlas数据库展示了INTS10在肝癌和正常肝组织中的表达差异，INTS10在肝癌组织中的表达低于正常肝组织(图1中C)。因此，本文推测INTS10可能在肝癌中发挥抑癌基因的功能。
2.2INTS10可抑制肝癌细胞的生长能力
为了进一步研究INTS10在肝癌发生发展过程中的生物学功能，本发明通过慢病毒包装的方法构建了稳定过表达或敲低INTS10的肝癌细胞株，并采用qRT-PCR及Westernblotting技术验证INTS10的过表达或敲低效果。结果显示，在HepG2和HCC97H细胞中，与对照组(pLV-mCherry)相比，过表达组(pLV-mCherry-INTS10)中INTS10的mRNA和蛋白质水平均显著增加；与敲低的对照组(pLV-EGFP)相比，敲低组(pLV-shINTS10#2和pLV-shINTS10#3)中INTS10的表达显著降低，证明成功构建了稳定干扰INTS10的细胞株(图2中A,B)。本发明首先采用CCK-8实验评价INTS10对肝癌细胞生长能力的影响。结果显示，过表达INTS10可抑制HepG2和HCC97H细胞的生长能力(图3中A)，而敲低INTS10则显著促进肝癌细胞的生长能力(图3中B)。其次，本发明还通过细胞平板克隆实验，检测INTS10对肝癌细胞克隆生长能力的影响。结果显示，过表达INTS10可显著抑制HepG2和HCC97H细胞的克隆生长能力(图3中C)，而敲低INTS10则显著促进肝癌细胞的克隆生长能力(图3中D)。最后，采用Brdu染色法检测增殖期细胞数量，Brdu阳性率越高说明细胞增殖能力越强。与对照组细胞Brdu的阳性率相比，过表达INTS10组细胞的阳性率降低，敲低组细胞阳性率升高(图3中E,F)，说明稳定干扰INTS10明显促进HepG2和HCC97H细胞S期DNA合成能力。这些结果表明，INTS10抑制肝癌细胞的生长能力。
2.3INTS10可抑制肝癌细胞的迁移能力
为了评价INTS10是否影响肝癌细胞系的迁移能力，本发明在肝癌细胞HepG2和HCC97H中稳定过表达或敲低INTS10，进行Transwell迁移实验。结果显示，INTS10过表达可明显抑制癌细胞的迁移能力(图4中A)，而敲低INTS10则显著抑制肝癌细胞的迁移能力(图4中B)。上述结果表明，INTS10抑制肝癌细胞的生长及迁移能力，在肝癌进展中发挥抑癌基因的功能。
2.4INTS10可抑制肝癌细胞的周期进程
细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞周期紊乱是肿瘤发生发展的重要生物学机制之一。为了探索INTS10的异常表达对肝癌细胞周期的影响，本发明采用流式细胞术，观察在HepG2和HCC97H细胞中扰动INTS10基因后细胞周期的变化。结果显示，过表达INTS10后，处于G1期的肝癌细胞数量显著增加，处于S期的细胞数量显著减少，而处于G2/M期的细胞数量无显著改变(图5中A)。反之，敲低INTS10使处于G1期肝癌的细胞数量减少，增加了S期的细胞数量，而对G2/M期的细胞数量无显著影响(图5中B)。以上结果提示，INTS10能够抑制肝癌细胞的周期G1/S进程。
2.5 INTS10可显著促进肝癌细胞的凋亡
肿瘤细胞凋亡异常也是肿瘤发生发展的重要生物学机制之一。为了探索INTS10的异常表达对肝癌细胞凋亡的影响，采用Annexin V-APC/PI染色法，检测扰动INTS10基因后对HepG2和HCC97H细胞凋亡的影响。结果显示，与未刺激的细胞相比，过表达INTS10后促进了HepG2和HCC97H细胞的凋亡(图6中A)；而敲低INTS10后相对抑制了肝癌细胞的凋亡(图6中B)。
2.6 INTS10通过介导细胞周期相关调节因子而发挥抑癌基因的功能
癌细胞最显著的特征之一是生长不受调控。这往往是由于基因突变导致癌细胞的增殖和抗凋亡能力的失调，而这种失调能力主要与细胞周期相关。本发明通过研究发现干扰INTS10基因对肝癌细胞的周期生长有显著的影响。细胞周期生长主要是通过蛋白质的磷酸化和去磷酸化进行调节，蛋白磷酸酶在其中起着重要的作用，有研究表明磷酸酶在调节细胞周期进程和信号转导中也起着关键作用。为了探索INTS10对肝癌的作用机制，本发明在HepG2细胞中敲低INTS10并进行RNA-seq分析，通过差异表达基因分析显示，敲低INTS10显著上调1881个基因的表达，下调1443个基因的表达(图7中A)。随后，本文分别对所有的表达基因进行功能富集分析。结果显示，INTS10负调控的基因显著富集于细胞周期和凋亡等抑癌信号通路(图7中B)。研究发现CDC25A、CDKN1A这两个基因被公认为是细胞周期进展的关键调节因子。在不同的癌症中CDC25A、CDKN1A都会影响细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent-kinase，CDK4)的表达，进而影响细胞周期过程。本发明接下来通过qRT-PCR和Western Blotting在HepG2和HCC97H细胞系中验证了INTS10对CDC25A、CDKN1A和CDK4表达的影响，过表达INTS10后，CDC25A和CDK4的mRNA水平和蛋白水平均显著减少，而CDKN1A的水平显著增加；同样地，敲低INTS10后，CDC25A和CDK4的mRNA水平和蛋白水平均显著增加，而CDKN1A的水平显著减少(图7中C,D)。综上所述，本发明初步揭示了INTS10在肝癌细胞中可能是通过影响周期G1/S期相关蛋白的转录从而发挥抑癌的功能，为INTS10对肝癌影响的深入研究提供了基础。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.过表达INTS10基因的试剂在治疗和/或预防肝癌中的应用。
2.过表达INTS10基因的试剂在抑制肝癌细胞生长和/或迁移中的应用。
3.过表达INTS10基因的试剂在促进肝癌细胞凋亡中的应用。
4.过表达INTS10基因的试剂在促进P21的表达、抑制CDC25A或CDK4表达中的应用。
5.根据权利要求2～4任一项所述的应用，其特征在于，所述肝癌细胞为HepG2细胞和/或HCC97H细胞。
6.INTS10蛋白在制备治疗和/或预防肝癌药物中的应用。
7.INTS10蛋白在制备抑制肝癌细胞生长和/或迁移药物中的应用。
8.INTS10蛋白在制备促进肝癌细胞凋亡药物中的应用。
9.INTS10蛋白在制备促进P21的表达、抑制CDC25A或CDK4表达药物中的应用。
10.根据权利要求7～9任一项所述的应用，其特征在于，所述肝癌细胞为HepG2细胞和/或HCC97H细胞。
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