CN106102772A - 用于预防和/或治疗与dennd1a变体2相关疾病的组合物和方法 - Google Patents
用于预防和/或治疗与dennd1a变体2相关疾病的组合物和方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供用于治疗与DENND1A.V2相关的疾病(如PCOS)的药物组合物和方法。特别是，本发明提供特异性针对DENND1A.V2的人源化和小鼠单克隆抗体以及使用它们的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请涉及2013年11月19日申请的美国临时申请61/906,078号和2014年8月28日申请的美国临时申请62/042,852号，它们所公开的内容通过引用并入本文。
技术领域
本发明基本涉及与DENND1A.V2(含DENN/MADD域的1A变体2)的mRNA和/或蛋白质的表达相关的疾病，包括但不限于多囊卵巢综合征(PCOS)，更具体地，涉及用于预防和/或治疗这些疾病的组合物和方法。
背景技术
多囊卵巢综合征(PCOS)是影响全球5-7％育龄女性的最常见的内分泌病之一[1]。它与高雄性激素血症/雄激素过多症、排卵停止、不孕以及一种包含内嵌于双侧增大卵巢的多个小皮质下卵泡“囊肿”的特有卵巢形态相关[2-5]。血液循环中睾酮水平的升高的存在主要来自卵巢所产生的雄激素的增加，并且它是患有PCOS女性的经典内分泌表型。虽然有关PCOS的诊断标准还存在争论，但不能用其他原因所解释的高雄性激素血症/雄激素过多症和排卵停止是该疾病的一种标志，并在所有“共识”诊断方案中作为一种关键要素而被包含在内[6-10]。一致认为卵巢卵泡膜细胞是患有PCOS女性中雄激素过多生物合成的主要来源[11-13]。有关来自正常和患有PCOS的女性的新鲜分离的卵泡膜组织或卵泡膜细胞的培养物研究已证明，与来自定期排卵女性的卵泡膜组织或细胞相比，PCOS卵泡膜分泌更多数量的雄激素[12，14-19]。在PCOS卵泡膜细胞中所增加的卵泡膜雄激素生物合成是由参与雄激素生物合成的关键酶的表达增加所引起的，其中，所述关键酶为细胞色素P450 17α羟化酶(由CYP17A1基因编码)和细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(由CYP11A1基因编码)[15-17，20]。
发明内容
用于繁殖从个体中分离出的卵泡膜细胞以及来自正常周期和PCOS女性的卵巢的大小相匹配的卵泡的条件的形成提供了首个证据，即，与正常卵泡膜细胞相比，连续传代的PCOS卵泡膜细胞仍保有产生雄激素和黄体酮水平增加的能力[15，16，21]。PCOS卵泡膜细胞中的这种雄激素和黄体酮生物合成的增加部分归因于CYP17A1和CYP11A1基因转录和RNA稳定性的增加[17，20，22]。通过微阵列分析和定量PCR对来自多个个体的正常和PCOS卵泡膜细胞进行的分子表征也确认了正常和PCOS细胞具有特定的分子标志物[16，23，24]。这些发现与PCOS卵泡膜中的固有异常观念相一致，其中，该异常可促进响应于向性(tropic)刺激的雄激素分泌过多。卵泡膜细胞培养系统提供了一种用于识别PCOS女性中的基因异常背后的生化和分子机制的独特平台。
在本公开中，提供以下的数据：其表明替代性拼接和截短形式的DENND1A和DENND1A.V2[25，26]在正常和PCOS卵泡膜细胞中存在差异性表达。这些数据表明，DENND1A.V2有助于PCOS卵泡膜细胞的CYP17A1和CYP11A1基因表达增加以及雄激素和黄体酮生物合成增加的病理生理状态[17，20，22]。另外，本文所提供的数据也表明，使用shRNA或基于抗体途径中的任一种方式来靶向DENND1A.V2可抑制PCOS卵泡膜细胞中呈现的CYP17A1和CYP11A1基因表达以及增加的雄激素产量。因此，抑制作为PCOS标志的雄激素表达量的增加将会在PCOS患者以及患有与DENND1A.V2表达正相关的其他疾病的个体中产生预防和/或治疗效果。
本发明的一个方面包括向需要的个体施用一种组合物，该组合物包含有效量的靶向DENND1A.V2的试剂，以获得预防和/或治疗效果。示例性的靶向试剂包括但不限于：抗体或抗原结合片段、RNAi、shRNA或包含其它核苷酸的组合物。在一些实施方式中，所述个体是需要治疗与DENND1A.V2表达正相关的任何疾病的受试者。在一些实施方式中，所述疾病与DENND1A.V2相关，且该DENND1A.V2相对于对照是增加的。在另外的实施方式中，所述个体具有PCOS的风险、怀疑患有PCOS或已被诊断患有PCOS。
本发明的其它方面涉及药物组合物，其包含特异性识别DENND1A.V2蛋白质而不能特异性识别DENND1A.V1(含DENN/MADD结构域的1A变体1)蛋白质的抗体或其抗原结合片段。抗原结合片段的例子包括但不限于：Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段以及它们的组合。在优选的实施方式中，抗体或抗原结合片段特异性识别存在于下述独特的DENND1A.V2的C-末端氨基酸序列中的至少一个表位：NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：5)。
本发明的其它特征和优点将在以下的本发明说明书中进行阐述，且部分根据说明书是显而易见的或可通过本发明的实践而得知。本发明可通过在此处书面的说明书及其权利要求中特别指出的组合物和方法来实现或获得。
附图说明
图1A-F.DENND1A.V2蛋白质在PCOS卵泡膜细胞中增多。在来自正常和PCOS卵泡膜细胞的全细胞提取物中进行的～62kD的DENND1A.V2和～112kDDENND1A.V1的代表性Western分析，所述正常和PCOS卵泡膜细胞在20μM毛喉素存在(+)或缺少(-)的条件下进行处理。总mTOR用于蛋白质标准化(图1A)。来自分离于5个具有正常周期和5个PCOS个体的卵泡膜细胞的Western分析的定量数据以平均值+SEM表示，并表明与正常卵泡膜细胞相比，DENND1A.V2蛋白质在基底(basal)和毛喉素刺激(*，P<0.01)的PCOS卵泡膜细胞中均增多(图1B)。如图1C中所示，通过在正常卵泡膜细胞中进行毛喉素处理，DENND1A.V1增加(*，P<0.01)。与正常细胞相比，毛喉素刺激的DENND1A.V1在PCOS卵泡膜细胞中下降(**，P<0.01)(图1C)。在对照和毛喉素刺激的条件下，PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2/V1的比率增加(*，P<0.01)(图1D)。在图1E中，通过使用来自经上述处理的正常和PCOS卵泡膜细胞的全细胞提取物，执行Western分析来评价兔多克隆抗体的功效，该抗体针对对DENND1A.V2具有特异性的21个氨基酸的肽(QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH)(SEQNO：6)而产生。如图1E所示，代表性的Western印迹分析显示，在基底和毛喉素刺激的条件下进行处理的PCOS卵泡膜细胞中的62kD DENND1A.V2均增加。总mTOR用于蛋白质标准化。如图1F所示，从4个独立正常和4个独立PCOS女性分离的卵泡膜细胞获得的全细胞裂解物的累积分析表明，与正常卵泡膜细胞相比，在对照和毛喉素刺激情况下，PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2均显著增加(*P<0.01)。毛喉素处理没有显示会影响正常或PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2蛋白质的积累。
图2A-B.正常周期和PCOS卵巢中的DENND1A.V2的免疫组化定位。在图2A中，DENND1A.V2蛋白质定位于卵巢卵泡的卵泡内膜，并且与正常卵泡膜(顶部)相比，其在PCOS卵泡膜(底部)中增加。在图2B中，在PCOS卵泡膜和颗粒细胞中的DENND1A.V2染色如左图(40X)所示。染色(主要是在PCOS卵泡膜细胞的细胞核、细胞质和细胞膜中的染色)显示于右图(油下100X)。
图3A-B.PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2 mRNA的丰度增加，并与增加的雄激素产生相关。采用qRT-PCR，比较由6个独立正常和6个独立PCOS女性繁殖的卵泡膜细胞中的DENND1A.V2(图3A)mRNA的丰度，其中，所述卵泡膜细胞在缺少(C)和存在(F)20μM毛喉素的条件下处理16小时。与正常细胞相比，在基底(*，P<0.05)和毛喉素(**，P<0.01)刺激条件下，PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2mRNA显著增加(图3B)。来自6个正常和6个PCOS女性的卵泡膜细胞制剂的对照(C)和毛喉素(F)刺激的DHEA积累与相同条件下的DENND1A.V2 mRNA比较(图3B)。
图4.与正常女性相比，从PCOS女性中分离出的尿液外泌体中的DENND1A变体2mRNA增加。采用实时qPCR分析，比较DENND1A.V2RNA在从中午尿液中纯化和分离的外泌体mRNA中的积累，其中，所述尿液收集于孤立的5个正常周期和6个PCOS女性(*，P<0.001)。
图5A-E.正常卵泡膜细胞中的DENND1A.V2被迫表达导致雄激素和黄体酮产量的增加。为了检测被迫表达的DENND1A.V2对正常卵泡膜细胞中的雄激素生物合成的影响，通过用空(零)或DENND1A.V2腺病毒以0.3、1.0、3.0和10pfu/细胞感染代表性的正常卵泡膜细胞所产生的DHEA的结果如图5A所示，所述正常卵泡膜细胞在缺少(C)或存在(F)20μM毛喉素的条件下处理72小时。如图所示，与对照空腺病毒相比，DENND1A.V2腺病毒感染和被迫的DENND1A.V2表达增加了正常卵泡膜细胞中的毛喉素刺激的DHEA产量。在随后的研究中，用3pfu/细胞的DENND1A.V2或对照、空腺病毒感染正常卵泡膜细胞，并在缺少(C)或存在(F)20μM毛喉素的条件下处理72小时。然后，测定DHEA(图5B)、17OHP4(图5C)、T(图5D)和黄体酮(图5E)，并通过细胞计数进行标准化。如图所示，与对照的空腺病毒相比，DENND1A.V2腺病毒感染显著增加基底的17OHP4(图5C；*，P<0.01)、T(图5D；*，P<0.05)和P4(图5E；*，P<0.05)的积累。此外，与对照的空腺病毒相比，DENND1A.V2腺病毒感染显著增加了毛喉素刺激的DHEA(图5B；*，p<0.001)、17OHP4(图5C；*，p<0.001)和P4(图5E；*，P<0.001)。因此，正常卵泡膜细胞中的DENND1A.V2被迫表达增加了雄激素和黄体酮的生物合成，并促进PCOS表型。
图6A-D.正常卵泡膜细胞中的DENND1A.V2被迫表达导致CYP17和CYP11A1 mRNA积累增加以及CYP17A1和CYP11A1启动子调控增加。为了检测DENND1A.V2对CYP17和CYP11A1mRNA积累的影响，用3pfu/细胞的DENND1A.V2或对照、空腺病毒感染正常卵泡膜细胞，并在缺少(C；对照)或存在(F；毛喉素)20μM毛喉素的条件下处理16小时。随后进行RNA分离，通过qRT-PCR对CYP17和CYP11A1 mRNA进行定量，并通过TBP mRNA进行标准化。如图所示，正常卵泡膜细胞中的DENND1A.V2被迫表达显著增加了毛喉素刺激的CYP17mRNA(图6A；*，P<0.01)和CYP11A1 mRNA(图6B；*，P<0.05)的积累。为了检测DENND1A.V2对CYP17A1转录的影响，用CYP17A1启动子基因质粒(-770CYP17A1/LUC)转染正常卵泡膜细胞，并用DENND1A V2或空腺病毒感染正常卵泡膜细胞(图6C)。如图6C所示，与空的对照腺病毒相比，DENND1A.V2腺病毒感染增加基底(*，P<0.05)和毛喉素刺激(**，P<0.05)这两种情况下的-770CYP17A1启动子活性。图6D中，CYP11A1启动子构建物(-160/-90CYP11A1/LUC)赋予PCOS卵泡膜细胞中的CYP11A1表达增加，以检测DENND1A.V2对卵泡膜细胞中的CYP11A1转录的影响。用带有DENND1A.V2/pCMV-XL4的-160/-90CYP11A1/LUC质粒或对照pCMV-XL4质粒转染正常卵泡膜细胞。如图6D所示，与空质粒相比，DENND1A.V2显著增加毛喉素刺激(*，P<0.001)的-160/-90CYP11A1/LUC启动子活性。这些组合数据说明DENND1A.V2诱导CYP17A1和CYP11A1基因表达转录活性的增加。
图7A-F.敲减(knock-down)PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2导致CYP17A1和CYP11A1表达显著下降，并导致雄激素和黄体酮的生物合成降低。与Scrambled质粒相比，在敲减PCOS卵泡膜细胞中的内源性DENND1A.V2后、用沉默DENND1A.V2 shRNA1和shRNA2质粒转染PCOS卵泡膜细胞能显著抑制基底(P<0.05)和20μM毛喉素(*，P<0.01)刺激这两种情况下的CYP17mRNA的积累(图7A)。用沉默DENND1A.V2 shRNA质粒对PCOS卵泡膜的转染也显著抑制毛喉素刺激(*，P<0.05)的CYP11A1 mRNA的积累(图7B)。如图7C所示，与ScrambledshRNA相比，用DENND1A.V2 shRNA1和shRNA2质粒共转染融合至pGL3质粒(-235CYP17A1/LUC)中的萤光素酶基因的CYP17A1启动子的-235/+44导致显著抑制PCOS卵泡膜细胞中的毛喉素依赖性CYP17A1报告基因活性(P<0.05)。与对照的非沉默慢病毒相比，用沉默shRNADENND1A.V2慢病毒颗粒进行的感染显著抑制毛喉素刺激的17OHP4(图7D；*，P<0.001)、DHEA(图7E；*，P<0.001)和黄体酮的生物合成(图7F；*，P<0.001)。因此，敲减PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2可将PCOS卵泡膜细胞转换为正常表型。
图8A-F.兔多克隆DENND1A.V2特异性IgG显著降低PCOS卵泡膜细胞中的雄激素生物合成以及CYP17和CYP11A1 mRNA。用浓度渐增(0.1-3.0μg/mL)的亲和纯化的针对DENND1A.V2独特的C-末端21个氨基酸序列(即QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH)(SEQ ID NO：6)所产生的兔多克隆IgG或者非特异性IgG在缺少(C)或存在20μM毛喉素(F)的条件下处理PCOS卵泡膜细胞。图8A中，与非特异性IgG相比，兔多克隆DENND1A.V2 IgG显著抑制毛喉素刺激的DHEA的生物合成，其ID50大约为0.25μg/mL。进行实验，以检测0.5μg/mL的多克隆DENND1A.V2特异性IgG或0.5μg/mL非特异性IgG在缺少(C)或存在20μM毛喉素(F)的条件下对CYP17(图8B)和CYP11A1 mRNA(图8C)积累的影响，结果表明DENND1A.V2特异性IgG显著抑制在对照条件下PCOS卵泡膜细胞中CYP17A mRNA的积累(*，P<0.01)以及毛喉素刺激条件下PCOS卵泡膜细胞中CYP17mRNA和CYP11A1(**，P<0.01)的积累，而在正常卵泡膜细胞中未产生作用。进行平行实验，以检测0.5μg/mLDENND1A.V2 IgG或0.5μg/mL对照IgG对基底(basal)和毛喉素刺激的DHEA(图8D)、17OHP4(图8E)和P4(图8F)的生物合成的影响，结果同样表明，与对照IgG相比，多克隆DENND1A.V2特异性IgG显著抑制PCOS卵泡膜细胞中的毛喉素刺激的DHEA(图8D，*，P<0.001)和17OHP4(图8E，*，P<0.001)，且不影响正常卵泡膜细胞。
图9A-B.用DENND1A.V2肽进行人噬菌体文库的噬菌体展示筛选识别了两个具有相似ScFv序列(SEQ ID NOs：52-53)的克隆。为了获得人源化单克隆抗体，采用新鲜制备的人噬菌体文库，并用生物素化的C-末端DENND1A.V2的21个氨基酸的肽(即QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH)(SEQ ID NO：6)进行噬菌体展示筛选。在随后的ELISA筛选中识别了两个ScFv克隆，即克隆16和79(表2-5)。这些克隆的序列分析表明，克隆16和79的核苷酸(图9A)(SEQ ID NO：52)和氨基酸(图9B)(SEQ ID NO：53)的序列是相同的。如图9B所示，VH序列包含氨基酸残基1-116。接头包含残基117-132，而VL序列包含残基133-240。图9A和9B这两个图中，重链的可变区(VH)用大写字母表示；接头用小写字母表示；轻链的可变区(VL)用带下划线的斜体大写字母表示。互补决定区(CDRs)表示于框内(图9B)。
图10A-D.针对DENND1A.V2肽(SEQ ID NOs：56-59)的人源化单克隆(重组)抗体的重链和轻链的序列。在噬菌体展示后识别的scFv的VL和HL序列被克隆到表达质粒pIgG1-L和pIgG1-L内。确定人源化单克隆或重组DENND1.V2 IgG1中的IgG1重链(图10A；SEQ ID NO：56)和IgG1轻链的全长序列(图10B；SEQ ID NO：57)。这两个轻链和重链的分泌信号肽(SP)序列在图10A-10B中均以斜体表示。对于图10A中的重链，重链的可变区(VH)用大写字体(即大写字母)表示，人IgG1重链剩余部分的恒定区用小写字母表示。对于图10B的轻链，轻链的可变区(VL)用斜体且带下划线的大写字母表示，人IgG1轻链恒定区的剩余部分用小写字母表示。重链和轻链的蛋白质序列如图10C-D所示。对于这两个重链和轻链，分泌信号肽(SP)序列用斜体的大写字母表示，CDR用下划线和加括号的方式表示。对于图10C中的重链(SEQID NO：58)，重链的可变区(VH)用大写字母表示，人IgG1重链剩余部分的恒定区用大写字母表示。对于图10D中的轻链(SEQ ID NO：59)，重链的可变区(VL)是用斜体的大写字母表示，人IgG1轻链剩余部分的恒定区用大写字母表示。
图11A-C.人重组DENND1A.V2特异性IgG1的表达和纯化。为了进一步评估在噬菌体筛选后获得的人源化单克隆抗体，编码重组人DENND1A.V2特异性IgG1的重链和轻链的质粒载体被转染至并表达于293E细胞中。转染96小时后，收集悬浮培养物。通过HiTraprProteinA FF纯化产物，并进行0.2μm过滤。如图11A所示，人源化单克隆抗体或重组DENND1A.V2特异性IgG1的计算浓度为126μg/ml。还原性SDS-PAGE分析表明，重组DENND1A.V2 IgG1的重链和轻链具有适当的尺寸(图11B)。ELISA结果表明，人重组DENND1A.V2 IgG1特异性结合至21个氨基酸的生物素化的DENND1A.V2序列(Bio-CH-22)，并示于图11C。
图12A-B.重组人DENND1A.V2特异性IgG1以剂量依赖性方式功能性地抑制PCOS卵泡膜细胞中的DHEA生物合成。为了研究对DENND1A.V2具有特异性的重组人IgG1是否功能性地抑制雄激素的生物合成，用浓度递增(.01-6μg/mL)的对DENND1A.V2(V2hmAB)具有特异性的人重组单克隆IgG1或者非特异性IgG1，并在缺少(C)和存在20μM毛喉素(F)的情况下处理PCOS卵泡膜细胞72小时。如图12A所示，与对照IgG1相比，V2hmAB显著降低(*，P<0.01)毛喉素刺激的DHEA生物合成，且ID50大约为1.8μg/mL。图12B中，与对照IgG1相比，用V2hmAB处理后，基底和毛喉素(*，P<0.1)刺激的DHEA生物合成均被抑制。
图13.重组人DENND1A.V2特异性IgG1对正常和PCOS卵泡膜细胞中的DHEA生物合成的影响。兔多克隆和人重组DENND1A.V2均减少PCOS卵泡膜细胞中的DHEA生物合成。进行实验，以比较9μg/mL人重组DENND1A.V2 IgG1(V2hmAB)和非特异性IgG1在经缺少(C；对照)和存在20μM毛喉素处理后的正常和PCOS卵泡膜细胞中的功效。如图13A所示，最大剂量的V2hmAB显著(*，P<0.01)抑制PCOS卵泡膜细胞中的毛喉素刺激的DHEA生物合成，而对正常卵泡膜细胞的影响极小。比较兔DENND1A.V2多克隆抗体(V2多克隆)与人重组DENND1A.V2IgG1(V2hmAB重组体)的功效，结果表明，相比于对照IgG，这些抗体都能同样地降低DHEA生物合成(图13B)。
图14.在ELISA中，所选杂交瘤的小鼠单克隆抗体对DENND1A肽的反应性。执行针对所选杂交瘤的小鼠克隆抗体上清液的ELISA扫描。检测每个杂交瘤上清液(1：10稀释)对DENND1A.V2抗原、对照肽和BSA的结合反应性，其中，DENND1A.V2抗原包括：游离肽(V2-肽，QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH)(SEQ ID NO：6)、标记为V2-KLH-肽和V2-BSA-肽。针对HPV16L2(L2肽)序列(aa17-36)的对照肽和对该肽(L216.1A)有反应性的单克隆用作内部阴性对照单克隆抗体。第二对照单克隆(BSA-1)对BSA有反应性。一些单克隆抗体被鉴定为对DENND1A.V2游离肽以及V2-KLH-和V2-BSA标记的肽(包括P1B2、P1C5、P4F1、P5F9和P2F5)具有特定反应性。
图15.小鼠单克隆DENND1A.V2 IgG1对雄激素生物合成的抑制作用。进行实验，以检测DENND1A.V2小鼠单克隆抗体、P1B2和P1C5的功能作用，它们在ELISA筛选(图14)中显示对PCOS卵泡膜细胞中的雄激素生物合成具有反应性。在存在和缺少20μM毛喉素的条件下，用40μL的P1B2(mV2.A)和P1C5(mV2.B)小鼠IgG1或阴性对照小鼠IgG1的组织培养物上清液处理PCOS卵泡膜细胞72小时。如图15所示，与阴性对照小鼠IgG1相比，DENND1A.V2特异性P1B2和P1C5小鼠IgG1抑制PCOS卵泡膜细胞中的毛喉素刺激的DHEA积累(*，P<0.05)。
图16A-F.DENND1A.V2特异性小鼠单克隆抗体P1B2和P1C5的序列(SEQ ID NO：60-65)。确定小鼠单克隆DENND1A.V2特异性IgG1、P1B2重链(图16A)(SEQ ID NO：60)、P1B2轻链(图16B)(SEQ ID NO：61)以及P1C5的重链(图16E)(SEQ ID NO：64)的核苷酸序列。P1B2的重链的DNA序列用大写字母表示，P1B2的轻链用带下划线的斜体大写字母表示。P1B2的重链的蛋白质序列(图16C)(SEQ ID NO：62)和P1C5的重链的蛋白质序列(图16F)(SEQID NO：65)用大写字母表示，P1B2的轻链的蛋白质序列(图16D)(SEQ ID NO：63)用斜体表示。CDR残基以下划线和加括号的方式表示。不确定的氨基酸序列以斜体表示。
详细说明
本发明的实施方式涉及包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段能特异性识别DENND1A.V2蛋白质而不能特异性识别DENND1A.V1蛋白质。本发明的另外实施方式涉及用于预防和/或治疗与DENND1A.V2mRNA和/或蛋白质的表达正相关的疾病的方法，所述方法包含向所需要的个体施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段能特异性识别DENND1A.V2蛋白质而不能特异性识别DENND1A.V1蛋白质。
DENND1A.V2cDNA的序列如下：
DENND1A.V2的氨基酸序列如下：
MGSRIKQNPETTFEVYVEVAYPRTGGTLSDPEVQRQFPEDYSDQEVLQTLTKFCFPFYVDSLTVSQVGQNFTFVLTDIDSKQRFGFCRLSSGAKSCFCILSYLPWFEVFYKLLNILADYTTKRQENQWNELLETLHKLPIPDPGVSVHLSVHSYFTVPDTRELPSIPENRNLTEYFVAVDVNNMLHLYASMLYERRILIICSKLSTLTACIHGSAAMLYPMYWQHVYIPVLPPHLLDYCCAPMPYLIGIHLSLMEKVRNMALDDVVILNVDTNTLETPFDDLQSLPNDVISSLKNRLKKVSTTTGDGVARAFLKAQAAFFGSYRNALKIEPEEPITFCEEAFVSHYRSGAMRQFLQNATQLQLFKQFIDGRLDLLNSGEGFSDVFEEEINMGEYAGSDKLYHQWLSTVRKGSGAILNTVKTKANPAMKTVYKFAKDHAKMGIKEVKNRLKQKDIAENGCAPTPEEQLPKTAPSPLVEAKDPKLREDRRPITVHFGQVRPPRPHVVKRPKSNIAVEGRRTSVPSPEQNTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：2)
DENND1A.V1cDNA的序列如下：
DENND1A.V1的氨基酸序列如下：
MGSRIKQNPETTFEVYVEVAYPRTGGTLSDPEVQRQFPEDYSDQEVLQTLTKFCFPFYVDSLTVSQVGQNFTFVLTDIDSKQRFGFCRLSSGAKSCFCILSYLPWFEVFYKLLNILADYTTKRQENQWNELLETLHKLPIPDPGVSVHLSVHSYFTVPDTRELPSIPENRNLTEYFVAVDVNNMLHLYASMLYERRILIICSKLSTLTACIHGSAAMLYPMYWQHVYIPVLPPHLLDYCCAPMPYLIGIHLSLMEKVRNMALDDVVILNVDTNTLETPFDDLQSLPNDVISSLKNRLKKVSTTTGDGVARAFLKAQAAFFGSYRNALKIEPEEPITFCEEAFVSHYRSGAMRQFLQNATQLQLFKQFIDGRLDLLNSGEGFSDVFEEEINMGEYAGSDKLYHQWLSTVRKGSGAILNTVKTKANPAMKTVYKFAKDHAKMGIKEVKNRLKQKDIAENGCAPTPEEQLPKTAPSPLVEAKDPKLREDRRPITVHFGQVRPPRPHVVKRPKSNIAVEGRRTSVPSPEQPQPYRTLRESDSAEGDEAESPEQQVRKSTGPVPAPPDRAASIDLLEDVFSNLDMEAALQPLGQAKSLEDLRAPKDLREQPGTFDYQRLDLGGSERSRGVTVALKLTHPYNKLWSLGQDDMAIPSKPPAASPEKPSALLGNSLALPRRPQNRDSILNPSDKEEVPTPTLGSITIPRPQGRKTPELGIVPPPPIPRPAKLQAAGAALGDVSERLQTDRDRRAALSPGLLPGVVPQGPTELLQPLSPGPGAAGTSSDALLALLDPLSTAWSGSTLPSRPATPNVATPFTPQFSFPPAGTPTPFPQPPLNPFVPSMPAAPPTLPLVSTPAGPFGAPPASLGPAFASGLLLSSAGFCAPHRSQPNLSALSMPNLFGQMPMGTHTSPLQPLGPPAVAPSRIRTLPLARSSARAAETKQGLALRPGDPPLLPPRPPQGLEPTLQPSAPQQARDPFEDLLQKTKQDVSPSPALAPAPDSVEQLRKQWETFE(SEQ ID NO：4)
对于本文所出现的每个cDNA序列，本发明包括等效于cDNA的mRNA，这意味着本发明包括每个T被U取代的cDNA序列。
在一个方面，本发明公开的内容包括一个或多个分离和/或重组或其他合成的(例如，化学合成)结合伴侣，其特异性识别DENND1A.V2蛋白质而不能特异性识别DENND1A.V1蛋白质。
这种结合伴侣包括可特异性结合至DENND1A.V2蛋白质的独特C-末端的抗体及其抗原结合片段，例如，Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段、适体(aptamers)、双抗以及它们的组合。单链Fv或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中，这些结构域存在于单个多肽链中。优选地，Fv多肽还包含在VH和VL结构域之间的一个多肽接头，该接头能使scFv形成所期望的结构，以用于抗原结合。抗体及其抗原结合片段被定向到DENND1A.V2蛋白质C-末端独特的33个氨基酸中的一个或多个表位。33个氨基酸的DENND1A.V2序列在DENND1A变体1和2之间是独特的，即NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：5)。
本申请公开的内容包括制造针对这种独特DENND1A.V2 C-末端氨基酸序列片段抗体的示范。在这方面，制备一个靶向以下独特21个氨基酸序列片段的DENND1A.V2多克隆抗体(兔)：QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：6)。该序列是基于以下分析而选定的：所述分析能预测该序列是最佳抗原且不可能会导致抗体产生，其中，该抗体具有与其他蛋白质具有非特异性交叉反应性。
在本申请公开的内容中，证实了靶向DENND1A.V2蛋白质C-末端21个氨基酸的抗体显著降低PCOS卵泡膜细胞中的雄激素生物合成以及CYP17和CYP11A1mRNA(例如，参见图8A-B)。
本文所用的术语“单克隆抗体”是指从一群实质上均质的抗体中获得的抗体，即，群体中包含的个体抗体是相同的，除了可能天然产生的突变，该突变可能少量存在。单克隆抗体具有高度特异性的，其针对单一抗原位点。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性，单克隆抗体还具有优势，因为它们可在不被其它抗体污染的条件下进行合成。修饰语“单克隆”是指作为从一群实质上均质的抗体中获得的抗体的特征，而不应被解释为通过任何特定方法生产所需的抗体。
抗体和用于制备抗体的方法在本领域是公知的。制备抗体和从所制备的抗体中筛选出用于实质上特异性结合至抗原的抗体的方法的细节在标准参考文献中已有描述，例如，E.Harlow和D.Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，1988；F.Breitling和S.Dübel，Recombinant Antibodies，John Wiley&Sons，纽约，1999；H.Zola，Monoclonal Antibodies：Preparation and Use of MonoclonalAntibodies and Engineered Antibody Derivatives，Basics：From Background toBench，BIOS Scientific Publishers，2000；以及B.K.C.Lo，Antibody Engineering：Methods and Protocols，Methods in Molecular Biology，Humana Press，2003。
在一个说明性方法中，单克隆抗体可通过使用位于DENND1A.V2 C-末端的多肽NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：5)或其任何免疫原性片段以标准方法进行制备。在一个实施方式中，一个单克隆抗体是针对SEQ ID NO：5中的21个氨基酸序列片段所制备的，该氨基酸序列是由QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：6)或者是针对SEQ IDNO：6中的一个或多个决定簇所构成。
本申请公开的抗体可识别存在于NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ IDNO：5)序列或QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：6)中的构象表位和/或线性表位。
在实施方式中，抗体和抗原结合片段特异性识别至少一个表位，该表位存在于DENND1A.V2 C-末端序列的33个氨基酸中的至少约4个连续氨基酸，且起始和终止于33个氨基酸序列中的任一位置。在实施方式中，所述表位具有至少约4、5、6或7个存在于DENND1A.V2 C-末端序列的33个氨基酸(SEQ ID NO：5)的连续氨基酸。所述表位还定义为更长的序列，例如，多达约12个氨基酸(例如，8、9、10、11或12个氨基酸)。因此，该表位可包括以下或由以下所构成：33个氨基酸DENND1A.V2 C-末端序列的中多达任何约12个氨基酸片段或更长片段。在实施方式中，抗体或抗原结合片段特异于一个表位，该表位部分或完全存在于DENND1A.V2 C-末端序列的33个氨基酸中的以下示例性片段中的任一种内：NTIATPA(SEQ ID NO：7)；TIATPAT(SEQ ID NO：8)；IATPATL(SEQ ID NO：9)；ATPATLH(SEQ ID NO：10)；TPATLHI(SEQ ID NO：11)；PATLHIL(SEQ ID NO：12)；ATLHILQ(SEQ ID NO：13)；TLHILQK(SEQ ID NO：14)；LHILQKS(SEQ ID NO：15)；HILQKSI(SEQ ID NO：16)；ILQKSIT(SEQ ID NO：17)；LQKSITH(SEQ ID NO：18)；QKSITHF(SEQ ID NO：19)；KSITHFA(SEQ ID NO：20)；SITHFAA(SEQ ID NO：21)；ITHFAAK(SEQ ID NO：22)；THFAAKF(SEQ ID NO：23)；HFAAKFP(SEQ ID NO：24)；FAAKFPT(SEQ ID NO：25)；AAKFPTR(SEQ ID NO：26)；AKFPTRG(SEQ ID NO：27)；KFPTRGW(SEQ ID NO：28)；FPTRGWT(SEQ ID NO：29)；PTRGWTS(SEQ ID NO：30)；TRGWTSS(SEQ ID NO：31)；RGWTSSS(SEQ ID NO：32)；GWTSSSH(SEQ ID NO：33)；以及它们的组合。在实施方式中，本发明公开的抗体特异性识别一个表位，该表位存在于21个氨基酸序列QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：6)中的至少约4个连续氨基酸内(例如，包含约4、5、6、7、8、9、10、11或12个连续氨基酸的片段)，其被包含于或包括上述公开的7个氨基酸序列的组。例如，起始于SEQ ID NO：7的以下4个连续氨基酸可包括一个能被抗体识别的表位：NTIA(SEQ ID NO：66)、TIAT(SEQ ID NO：67)、IATP(SEQ ID NO：68)和ATPA(SEQ ID NO：69)。另外，这些表位可为较长序列中的部分。例如，起始于SEQ ID NO：66的序列XXNTIAX(SEQ IDNO：70)包括一个能被抗体识别的表位，其中，X是本文所述的任意氨基酸。在实施方式中，抗体识别以下的表位：与部分或完全存在于SEQ ID NO：5中的序列具有至少约65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％序列一致性的序列。本发明公开的内容包括结构(例如，结合分子，如本文所描述的抗体或其片段)，该结构具有至少一个互补位(该互补位能识别至少一个上述氨基酸片段)或至少两个互补位(该互补位能识别至少一个上述片段)。
当其显示不超过5％结合至其它表位时，并且优选显示其通过例如酶联免疫吸附方法进行测定不能测得其与其它表位的结合时，本发明的抗体或抗原结合片段能够特异性识别或结合靶表位。若其显示超过5％与其它表位的结合，则抗体或抗原结合片段不能特异性识别或结合靶表位。非特异性结合的抗体或抗原结合片段仍具有结合选择性，例如，一种抗体可结合靶表位，并显示出与一些其它表位的非特异性结合。
可通过本领域已知的各种方法(例如，化学肽合成)来制备抗体。在一个方法中，为了制备一个单克隆抗体，本文所描述的DENND1A.V2 C-末端多肽被导入一种实验室动物内，例如小鼠，进行时间跨度为几周的一段时间的一系列施用。典型地，从小鼠脾脏中分离出脾细胞，从而获得分离的B细胞，并将其与骨髓瘤细胞融合，该骨髓瘤细胞通过使用任何适宜的方法(例如电融合)已使其永生化。骨髓瘤细胞特征性地缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)基因，其结果是，对HAT培养基(次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷培养基)敏感。该融合物通常暴露于HAT培养基一段时间，例如10至14天，在此期间，如氨基喋呤的化合物被用来抑制核苷酸的合成，导致未融合细胞死亡而B细胞-骨髓瘤杂交物(杂交瘤)生存，该杂交瘤已被永生化并其能产生抗体。将细胞稀释以分离成如多孔板的单孔中的单一杂交瘤。然后，筛选杂交瘤，以识别那些产生特异性识别DENND1A.V2 C-末端的抗体的杂交瘤，因此，这些抗体不会与DENND1A.V1蛋白质产生交叉反应。一旦分离出合适的杂交瘤，那么编码分泌的免疫球蛋白(Ig)的DNA就可被测序，因此，可确定Ig的氨基酸序列。Ig的重链和轻链的互补决定区(CDR)也可被确定，且可被用于制备由杂交瘤所产生的抗体的合成版或用于制备如本文进一步描述的抗原结合部分。可选择地，产生抗体的细胞可被克隆，以产生相同子代克隆，该子代克隆将提供单克隆抗体的持续来源。当需要大量抗血清时，较大的动物，例如，山羊或绵羊，可被用作产生抗体的宿主物种。
由非人哺乳动物衍生的杂交瘤所产生的任何抗体可被修饰，以提供嵌合或者部分或完全人源化的形式，并且本发明公开的内容中包括这样的修饰。通常，非人(例如，小鼠)抗体的“人源化”形式为嵌合抗体，其包含来自非人抗体的最小序列。人源化抗体本质上是人免疫球蛋白(也称为“受体”抗体)，其中，来自受体的高变区残基可被来自非人物种(也称为“供体”抗体)的高变区残基替代，该非人物种例如为有所期望抗体的特异性、亲和力以及功能的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物。在某些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基可被相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含那些在受体抗体或供体抗体中未被找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体将基本上包含所有的、至少一个、通常两个可变结构域，其中，全部或基本上全部的高可变环对应于那些非人免疫球蛋白，并且全部或基本上全部的FRs是那些人免疫球蛋白序列。视需要，人源化抗体也可包括至少一部分免疫球蛋白的恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的部分。欲了解更多详情，请参见Jones等人，[27]；Riechmann等人，[28]；以及Presta，[29]。
用于制备人源化非人抗体的方法是本领域所公知的。按照本发明公开的内容所产生的抗体的人源化可基本遵循以下的方法进行操作：Winter及其同事通过将小鼠CDR序列替换成相应的人抗体序列，Jones等人[27]；Riechmann等人，[28]；以及Verhoeyen等人，[30]。
在另一实施方式中，公开的内容包括本文所描述的抗体的抗原结合区或可变区片段。适宜的抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段。各种技术已被开发用于产生抗体片段。传统上，这些片段经由完整抗体的蛋白水解消化而得。然而，现在这些片段可直接由重组宿主细胞产生。例如，抗体片段可从如下所述的抗体噬菌体文库中分离出。可选择地，Fab'-SH片段可直接从细菌表达系统中回收并进行化学偶联以形成F(ab')2片段。
在一个实施方式中，筛选具有抗原结合区的蛋白质文库以识别候选物，该候选物可根据本发明公开的内容进行修饰以用于治疗目的。例如，可针对本文所述的DENND1A.V2C-末端多肽进行噬菌体展示或其它抗体文库的筛选，并能识别出DENND1A.V2 C-末端特异性结合蛋白。通过使用本领域技术人员所公知的技术，可确定由噬菌体DNA或任何其它编码抗原结合区的DNA所编码的轻链和重链的CDR序列。然后，CDR序列可被克隆到表达载体中，以产生如上所述的DENND1A.V2 C-末端特异性抗体或其DENND1A.V2 C-末端特异性片段。因此，在实施方式中，如上所述的DENND1A.V2 C-末端特异性抗体或其DENND1A.V2 C-末端特异性片段将不同于文库中的多肽。在一个实施方式中，DENND1A.V2 C-末端特异性抗体或其DENND1A.V2 C-末端特异性片段不包含任何噬菌体/噬菌粒蛋白质，而包括但不一定限于噬菌体外壳蛋白质。用于产生抗体或抗原结合片段，如骆驼化纳米抗体的非限制性例子的较新方法，在本文进行了仔细考虑。
本发明还提供编码抗DENND1A.V2抗体的分离的核酸、包含所述核酸的载体和宿主细胞以及用于产生抗体的重组技术。分离的核酸能以可操作性的方式连接至异源启动子。本发明进一步提供了分离的核酸分子和它们的互补物，其包含基因序列(基因)，该基因序列编码与本文所公开的蛋白质/多肽序列具有至少约65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性的氨基酸序列。提供示例性的编码核苷酸的序列，但本领域的技术人员将意识到，由于遗传密码的冗余，其它核苷酸序列也可编码相同的蛋白质/多肽。为了重组产生抗体，分离出编码抗体的核酸，并将其插入到用于进一步克隆(例如，用于DNA扩增)或用于表达的可复制载体内。编码单克隆抗体的DNA易于被分离，并用常规方法(例如，通过使用寡核苷酸探针，该探针能特异性结合至编码抗体重链和轻链的基因中)进行测序。许多载体可供使用且它们是本领域所公知的，例如，pIgG1-H和PIgG1-L等载体。载体成分通常包括但不限于以下的一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
杂交瘤细胞用作这种DNA的优选来源。一旦分离，可将该DNA置于表达载体内，然后，将该载体转染到不另外产生抗体蛋白质的宿主细胞中，例如，大肠杆菌细胞、猿猴(simian)COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，从而获得在重组宿主细胞中进行的单克隆抗体合成。示例性表达载体包括但不限于CMV或β-肌动蛋白驱动质粒(即，pcDNA、pCM6和pDRIVE-β-act等)。
仔细考虑了本文所描述的抗DENND1A.V2抗体的氨基酸序列修饰。例如，它可能需要提高抗体的结合亲和力和/或其它生物特性。通过在抗DENND1A.V2抗体核酸中引入适当的核苷酸变化或通过肽合成制备抗DENND1A.V2抗体的氨基酸序列变体。这样的修饰包括，例如，对抗DENND1A.V2抗体的氨基酸序列中的残基进行缺失和/或插入和/或替代操作。替代可以是保守的或非保守的。只要最终的构建物具有所期望的特征，可进行缺失、插入和替代的任意组合，以获得最终的构建物。氨基酸变化还可改变抗DENND1A.V2抗体的翻译后加工，例如，改变糖基化位点的数量或位置。通常，这种变体的氨基酸序列与衍生出变体的序列具有至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％同一性，或者对于片段，它与衍生出变体的序列的连续部分具有至少约50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98或99％同一性。
识别作为优选突变位置的抗DENND1A.V2抗体的特定残基或区域的一种有用的方法称作“丙氨酸扫描突变形成”。此处，残基或目标残基组被识别(例如，带电荷的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)，并被中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以影响氨基酸与DENND1A抗原的相互作用。然后，表明对取代具有功能敏感性的那些氨基酸位置通过将进一步的或其它变体引入至取代位点或用于取代以进行改善。因此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预定的，但突变本身的性质不需要预先确定。例如，为了分析在给定位点的突变性能，在目标密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机突变形成，并筛选所表达的具有所期望的活性的抗DENND1A.V2抗体变体。
氨基酸序列的插入包括：氨基末端和/或羧基末端的融合(长度范围从一个残基至包含100个或更多残基的多肽)以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N-末端甲硫氨酰的抗DENND1A.V2抗体。抗DENND1A.V2抗体分子的其它插入变体包括融合到酶或多肽的抗DENND1A.V2抗体的N-末端或C-末端，该酶或多肽增加抗体的血清半衰期。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体具有至少一个抗DENND1A.V2抗体分子中的氨基酸残基，且该残基被不同的残基替换。替代突变形成的最感兴趣的位点包括高变区，但也可考虑FR改变。
抗体生物学特性中的实质性修饰可通过对维持以下产生显著不同作用的选择替换来完成：
(a)替换区域中的多肽主链结构，例如，作为折叠(sheet)或螺旋构象；
(b)靶位点上的分子的电荷或疏水性；或者
(c)侧链体积(bulk)。
不参与维持抗DENND1A.V2抗体适当构象的任何半胱氨酸残基可被取代，通常被丝氨酸取代，以改进分子的氧化稳定性并防止异常交联。例如，可用如下所示的丝氨酸替换SEQ ID NO：58的VH中的两个半胱氨酸：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSSAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSIIGTDGDDTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYSAKAEASFDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO：71)。相反地，能形成二硫键的残基可被加入到抗体，以改善其稳定性(特别是当抗体为抗体片段，如Fv片段)。
替代变体的特别优选类型包括替换一个或多个亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的高变区残基。通常，相对于产生变体的亲本抗体，所选的用于进一步开发的所得变体具有改进的生物学特性。形成这种替代变体的便利方法包括使用噬菌体展示的亲和力成熟。简而言之，将数个高变区位点(例如，6-7个位点)进行突变，以在每个位点产生所有可能氨基替换。然后，对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如，结合亲和力、对细胞功能的适当作用)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描突变形成，以识别显著有利于抗原结合的高变区残基。可选择地，或另外，丙氨酸扫描突变形成可有益于分析抗原抗体复合物的晶体结构，以识别抗体和人DENND1A.V2之间的接触点。这种接触残基和邻近残基是依照本文详述技术的替代候选物。一旦产生这种变体，按照本文所述的方法对变体组进行筛选，在一个或多个相关检测中选定具有优异性能的抗体用于进一步开发。另一类型的抗体的氨基酸变体改变抗体的原始糖基化模式。关于“改变”，我们是指删除能被糖基化的一个或多个残基，或者替代通常被糖基化的一个或多个残基或替代不易进行糖基化的一个或多个残基，和/或添加作为糖基化位点的一个或多个氨基酸。例如，如下所示，在VH IDNO：58的VH中可添加N-连接的糖基化基序：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSSAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSIIGTDGDDTNYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYSAKAEASFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：72)。
本发明的实施例涉及DENND1A.V2相关病症的治疗。术语“治疗”是指治疗性处理和预防性或防范性措施这两种。那些需要治疗的对象包括那些已患有该病的对象和那些需要预防该病的对象。因此，本文中待治疗的哺乳动物可为已被诊断患有该病的或者倾向于患有该病或易患(例如，具有遗传倾向)该病。
用于治疗目的的术语“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括：人，家养和农场动物，动物园、运动场或宠物型动物，如狗、马、猫和牛等。优选地，所述哺乳动物是人。
在一些实施方式中，本发明的抗体和/或抗原结合片段是以药物制剂的方式提供，该制剂可包含如药学上可接受的载体、赋形剂和稳定剂等成分。抗体和/或抗原结合片段还可与其它药物或治疗剂组合，以治疗与DENND1A.V2 mRNA表达或蛋白质相关的疾病。例如，针对DENND1A.V2的单克隆抗体能与激素疗法组合来治疗PCOS。
PCOS、与PCOS相关的II型糖尿病以及为DENND1A.V2表达(DENND1A.V2表达可导致过多的类固醇的生物合成)的直接结果的其它男性和女性的疾病是与DENND1A.V2 mRNA或蛋白质表达正相关的疾病或病症的例子。受影响的组织包括但不限于：卵巢、血管平滑肌、骨骼肌、脂肪组织以及子宫内膜。
术语“治疗有效量”是指能够有效治疗受试者的疾病或病症的药物或药物组合物的量。在PCOS或另一DENND1A.V2相关病症的情况下，治疗有效量的抗体能在一定程度上减少和/或防止与该病症相关的一个或多个症状。例如，来自经本文所述处理的对象的生物样品(例如，血液样品)中的可测定的睾酮(全部和游离)、雄烯二酮和硫酸脱氢表雄酮(DHEAS)的量降低，例如，降低至少约10、20、30、40、50、60、70、80或90％或更多；和/或其它症状被改善，例如，排卵周期将恢复、卵巢形态正常化(包括多个卵泡囊肿消失)以及高胰岛素血症和胰岛素抵抗减少。
在进一步的实施方式中，抗体或其抗原结合片段可通过任何适宜的下述方式进行施用，包括但不限于：皮下、肠胃外、阴道、腹膜内、肺内和鼻内。肠胃外输注包括：静脉内、肌内、动脉内、腹膜内、淋巴内或皮下施用。此外，单克隆抗体和/或其抗原结合片段可通过脉冲输注(pulse infusion)进行施用，例如，以剂量下降的方式。口服给药的方法也可考虑。缓释制剂能以修饰的方式进行施用，如进行聚乙二醇化来延长药物组合物的半衰期。
为了预防或治疗疾病，抗体的合适剂量将取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、抗体是否用于预防和/或治疗的目的、先前疗法、患者的临床史和对抗体的应答以及主治医师的判断。抗体能以一次性或一系列治疗的方式适当施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，约1μg/kg至15mg/kg(例如，0.1-20mg/kg)的抗体是施用于患者的初始候选剂量，例如，可通过一次或多次分开施用，或者通过连续输注。通常的每日剂量可在1μg/kg～100mg/kg或更多的范围内，其取决于上述因素。对于持续数天或更长的重复施用，根据状况，持续治疗直至产生针对疾病症状的期望的抑制。抗体的优选剂量将在约0.5mg/kg～约10mg/kg的范围内。因此，约0.5mg/kg、2mg/kg、4mg/kg或10mg/kg(或它们的任意组合)中的一个或多个剂量的可被施用于患者。这种剂量可间歇施用，例如，每周或每三周。可按照一个较高的初始负荷剂量、接着以一个或多个较低剂量的方式进行施用。示例性的剂量方案包括：施用初始负荷剂量约4mg/kg抗DENND1A.V2抗体，然后，以每周维持剂量为约2mg/kg抗DENND1A.V2抗体的方式进行施用。然而，其它剂量方案也可能是有用的。此疗法的进展易于通过常规技术和方法进行监测。除了将抗体蛋白质施用于患者，本申请还仔细考虑通过基因疗法施用抗体。这种编码抗体的核酸的施用包含于“施用治疗有效量的抗体”的表述中。
本发明的实施方式包括：编码抗体及其抗原结合片段的多核苷酸、包含这些多核苷酸的表达载体、体外细胞培养物(其中，所述细胞包含表达载体，并表达抗体或其抗原结合片段)以及使用这种表达载体和细胞培养物的方法，以用于制备抗体及其抗原结合片段。其它实施方式包括：RNAi、shRNA或其它核苷酸(其包含用于治疗与DENND1A.V2表达正相关的病症的组合物)。
将核酸(可选地，被包含在载体内)递送入患者细胞的操作，存在两种主要途径，即体内(in vivo)和活体外(ex vivo)。对于体内，核酸递送的方式是直接注射到患者，例如，注射到血液或需要抗体的部位。对于活体外治疗，去除患者细胞，将核酸导入这些分离的细胞中，并将修饰的细胞直接施用于患者，或者，例如，在多孔膜中进行胶囊化后，重新植入到患者内。对于将核酸导入活细胞的技术，存在多种可供使用的技术。该技术根据核酸是否被转移到体外(in vitro)培养的细胞或体内(in vivo)预期宿主细胞中的细胞内而发生变化。适于将核酸转移到体外哺乳动物细胞的技术包括：使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。用于离体递送基因的常用载体是逆转录病毒。
示例性的体内核酸转移技术包括：使用病毒载体(如腺病毒、单纯疱疹I病毒或腺相关病毒)的转染和和基于脂质的系统(用于脂质介导转移基因的有用的脂质如DOTMA、DOPE和DC-Chol)。在某些情况下，期望提供带有靶向靶细胞的试剂的核酸来源，例如，特异于靶细胞的细胞表面膜蛋白的抗体、针对靶细胞的受体的配体等。使用脂质体的情况下，结合至与胞吞作用相关的细胞表面膜蛋白的蛋白质可被用来靶向和/或促进摄取；例如，衣壳蛋白或其片段趋向特定细胞类型、在循环中经历内化的蛋白的抗体、以及靶向细胞内定位并增强胞内半衰期的蛋白质。
在一些实施方式中，靶细胞是卵泡膜细胞，并且通过卵泡膜细胞与本文描述的抗体或抗原结合片段接触，能减少卵泡膜细胞中的雄激素和/或黄体酮的生物合成，和/或降低CYP17A1和/或CYP11A1基因的表达以及细胞中的CYP17和CYP11A1 mRNA和/或蛋白质。这些下降能减少或预防与CYP17A1和/或CYP11A1的基因调控以及CYP17和/或CYP11A1 mRNA和/或蛋白质的过度表达相关的症状；例如，过多雄激素的产生。可被减轻或解决的过多雄激素产生的示例性症状，包括但不限于：与高雄激素血症相关的排卵停止、多毛症、卵巢形态和不孕。在一些实施方式中，本文描述的抗体或抗原结合片段能减少或防止与PCOS相关的其它表型，例如，异常胰岛素信号传导，在脂肪、骨骼肌和子宫内膜组织中的胰岛素抵抗，颗粒细胞中的异常FSH信号传导，以及它们的组合。
本发明的实施方式还提供通过细胞内的细胞表面受体来改变信号的方法，其中，所述细胞与对照细胞相比具有增加的DENND1A V.2表达。所述方法包括将这种细胞与本文所描述的抗体或其抗原结合片段进行接触的步骤，其中，所述抗体或抗原结合片段特异性识别DENND1A.V2蛋白质而不能特异性识别DENND1A.V1蛋白质。
本发明还提供制品，其包含对治疗本文所描述的疾病有用的材料。制品包括：容器以及插在容器上或与容器相关的标签或包装。适宜的容器包括：如瓶子、小瓶和注射器等。所述容器可由各种材料(如玻璃或塑料)制成。该容器装有一个有效治疗症状的组合物，并可具有无菌接入口(例如，所述容器可为静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文所描述的抗DENND1A.V2抗体或抗体片段。所述标签或包装说明书指明该组合物选择用于治疗的条件，并可提供使用该组合物的说明。
抗DENND1A.V2抗体对于DENND1A.V2蛋白质的诊断检测是有用的，例如，检测其在特定细胞、组织或血清中的表达。本发明还提供诊断疾病的方法并比较参考的阴性对照与所检测到的DENND1A.V2量，该疾病与个体中的DENND1A.V2 mRNA的表达和/或蛋白质呈正相关，该个体包含来自所述个体的生物样品与一个或多个抗体的接触，该抗体包含SEQ IDNO：53、58、59、62、63或65所表示的氨基酸序列。所述疾病可为PCOS。参考值可从来自健康正常的无该疾病患者的样品中获得。如果测量值大于正常参考值，则可以得出个体患有该疾病的结论；如果测量值等同于或小于正常参考值，则可以得出该个体未患有该疾病的结论。在某些实施方式中，相比于参考值，认为样品中的DENND1A变体2mRNA具有统计学显著增加的值为至少1.5倍而DENND1A变体2蛋白质具有统计学显著增加的值为2-3倍，以这种方式来诊断PCOS或帮助PCOS的诊断。在某些实施方式中，相对于参考值的增加为包含至少2.0、3.0或4.0倍，并包括所有在其之间的数字，且至第一小数位。参考值也可为从已诊断患有该疾病或病症的患者中获得的阳性对照值。在这种情况下，如果测量值等于或大于阳性参考值，那么可得出个体患有该病的结论。如果测量值较低，例如，至少统计学上显著降低1.5倍，那么就可得出该个体未患有该病的结论。在一些实施方式中，阳性和阴性参考值均用于诊断中。如果得出个体患有该疾病，那么其可继续进行本文所描述的治疗步骤或方法。
生物样品的例子包括但不限于：尿液、血液、血浆、血清和唾液。在一些实施方式中，生物样品是卵巢、子宫内膜、脂肪组织或骨骼肌的活体组织切片或者手术样本。对于诊断应用，所述抗体通常用可检测的部分进行标记。大量标记可供使用，且它们是本领域所公知的(例如，各种荧光或比色标签)。在本发明的另一实施方式中，抗DENND1A.V2抗体不需要标记，且该抗体的存在可通过使用结合到DENND1A.V2抗体的标记抗体来检测。本发明的抗体可用于任何已知的测定方法中，例如，竞争性结合测定法、直接和间接夹心测定法以及免疫沉淀测定法。
如果检测DENNDIA变体2mRNA，可通过各种本领域已知的技术来完成。确定存在或不存在或定量DENND1A变体2mRNA的适宜技术包括但不限于：针对DENND1A变体2mRNA的探针或引物的杂交，或者使用各种芯片技术，多核苷酸或寡核苷酸阵列，以及它们的组合。因此，在各种实施方式中，针对DENND1A变体2mRNA或其DNA等价物的探针可被布置和/或固定在固体载体上。
DENND1A变体2mRNA可被直接检测，或者可通过以下方式在体外进行酶扩增：例如，使用聚合酶链式反应(PCR)，包括定量实时(qRT-PCR)PCR分析的实时(RT)PCR，或任何其它在体外扩增的方法。对于扩增反应，设计与DENND1A变体2mRNA进行杂交和形成复合物的引物，且该引物被用于获得核酸扩增产物(即，扩增子)。那些本领域的技术人员将认识到如何设计合适的引物并进行扩增和/或杂交反应以执行本发明方法的各种实施例。通常，引物应该足够长，以用于扩增反应，并且通常具有至少12个碱基长度的引物被认为是适合于这种目的的，但缩短至8个碱基的引物可根据反应条件进行使用。用于检测DENND1A变体2RNA的引物/探针可包含修饰，如可被偶联至一个或多个可检测的标记，如以报告基因染色形式的荧光素和/或反应(如实时(RT)-PCR)中使用的淬灭部分，该实时(RT)-PCR允许对由RNA扩增的DNA进行定量，其中，可以随着时间的推移进行定量，并同时进行扩增。在一个实施方式中，扩增反应包括至少一种特异于DENND1A变体2mRNA的多核苷酸探针，其中，所述探针包括一个被修饰成包含荧光标签的末端核苷酸以及被修饰成包含猝灭来自荧光标签的荧光部分的其它末端核苷酸。例如，对于在qRT-PCR中的使用，这种探针可被设计成其能特异性结合DENNDA1变体2或其补体，即，其在与两个RT-PCR引物杂交的序列之间且不与该序列重叠。采用这种设计，来自荧光标签的信号将被淬灭直到探针通过扩增期间的聚合酶的核酸外切酶活性被降解，在扩增点荧光核苷酸将从淬灭部分中分离，且其信号将会被检测到。
如果需要，DENNDIA变体2mRNA和/或蛋白质的测定可与参考值比较。来自个体的变体2mRNA和/或蛋白质水平可与之比较的参考值可为任何适宜的参考值，其例子包括但不限于：从不具备所要诊断的(如PCOS)的特定症状的个体获得的样品。这些参考可包括匹配的对照(即，匹配的年龄、性别或其它人口统计资料)、标准曲线和/或实验性设计的对照，如已知的输入RNA或蛋白质，以用于进行标准化实验数据来定性或定量测定样品的DENND1A变体2的质量、摩尔浓度和浓度等。参考水平也可作为图形上的区域进行图形描述。在某些实施方案中，确定样品中的DENND1A变体2mRNA和/或蛋白质在参考值以上的量时，可被诊断为PCOS，或作为医生诊断PCOS的协助。在某些实施方案中，参考是正常卵泡膜细胞，其与PCOS卵泡膜细胞进行比较。在另一个实施方式中，参考是包含来自不患有PCOS的个体的外泌体的样品。
在本发明的示例性实施方式以更详细的方式进行描述之前，应当理解本发明并不局限于所述的特定实施方式，即本发明可为这些实施方式，当然，也可改变。也应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定的实施方式，且不旨在进行限定，因为本发明的范围将由所附的权利要求来进行限定。
当提供数值范围时，应理解每个中间值包含在本发明内，该中间值为下限值的10倍(除非上下文另有明确说明)且在该范围的上限和下限之间以及在所述范围内的任何其它规定或介于中间的值。这些较小范围的上限和下限可独立地被包含在较小范围内，且也被包含在本发明内，但受限于所述范围中的任何明确排除的限值。当所述范围包括一个或两个限值时，排除那些包含限值中的任一个或两个的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与一个本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。虽然类似或等同于本文所描述的任何方法和材料也可被用于本发明的实践或检测中，但现对代表性的说明性方法和材料进行描述。
本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用并入于此，即每个单独的出版物或专利被特别和单独地指明通过参考而被并入，并通过参考并入本发明中，以公开和描述与被引出版物相关的方法和/或材料。引用的任何出版物的公开内容先于申请日，且不应被解释为因为在先发明而承认本发明不能享有先于这种出版物的资格。此外，所提供的出版物的日期可能不同于实际出版日期，其可能需要单独进行确认。
应注意的是，本文和所附权利要求书中所使用的单数形式“一”、“一个”以及“该”包括复数对象，除非上下文清楚地另有规定。进一步需要注意的是，权利要求可以撰写成排除任何任选的元素。因此，该声明旨在充当使用与权利要求元件的叙述相关的这类排除性术语如“仅”、“只”等或者使用“负”限制的先行基础。
对于那些阅读本公开内容的本领域技术人员是显而易见的，本文描述和说明的各个实施例具有分立的组分和特征，其可易于被分离或与不脱离本发明范围或精神的任何其它一些实施方式的特征进行组合。任何叙述的方法可按照事件叙述的顺序或逻辑上可能的任何其它顺序进行实施。
本发明将通过下列实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式被解释为限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例1.过表达DENND1A.V2产生PCOS卵泡膜表型
材料和方法
正常和PCOS卵泡膜细胞。在对宾夕法尼亚州立大学医学院的机构审查委员会批准的协议获得知情同意后，从女性经子宫切除的卵泡中获得人卵泡膜内组织。如先前所述[31]，从卵巢基质中切下个体卵泡，切开，并用带0.05％胶原酶I、0.05％胶原酶IA和0.01％脱氧核糖核酸酶在含10％胎牛血清(FBS)的培养基中分散。分离的卵泡大小选择直径范围为3-5mm的卵泡，因此，从来源于正常和PCOS个体的具有类似大小的卵泡获得的卵泡膜细胞可进行比较。利用先前所述的生长培养基(Dulbecco's Eagles培养基(DME)和Hams F-12培养基的1:1混合物，其包含5％FBS、5％马血清(HS)、2％UltroSer GTM、20nM胰岛素、20nM硒、1μM维生素E和抗生素)，将卵泡膜细胞在纤连蛋白包被的培养皿中进行培养。血清和生长因子从以下来源中获得：FBS和DME/F12(Irvine，尔湾，加利福尼亚州)：马血清(Life Technologies，Grand Island，纽约)；UltroSer GTM(Reactifs IBF，新城-拉加伦，法国)：从购买的其它化合物(圣路易斯，密苏里州)。细胞在降低的氧张力(5％O2、90％N2和5％CO2)中生长，并给予补充抗氧化剂(维生素E和硒)，以防止氧化损伤。
这些研究中所利用的卵泡膜细胞培养物先前已被描述和功能性表征[15，17，32]。利用从年龄匹配个体获得的大小相匹配的卵泡中分离出的第4代(31-38群体倍增数)卵泡膜细胞，进行PCOS与正常卵泡膜的比较实验。使用第4代的细胞，其是由冷冻储存的第2代细胞在如上所述的媒介中繁殖所得，允许在同一患者群体中进行多个实验。对于所有的研究，检测来自至少5个独立正常和5个独立PCOS患者的卵泡膜细胞培养物。所有正常和PCOS细胞的传代条件和分流(split)比是相同的。
PCOS和正常卵巢组织来自年龄匹配的38-40岁的女性。PCOS的诊断是根据NIH共识指南进行的[10]，其包括：高雄激素血症、排卵过少、多囊卵巢、21-羟化酶缺乏的排除、库欣氏(Cushing)综合征以及高泌乳素血症。如前所述，所有研究的PCOS卵泡膜细胞制剂来自每年少于六次月经且具有增高的血清总睾酮或生物可利用的睾酮水平的女性卵巢[15，33]。每个PCOS卵巢包含小于10mm直径的多个皮层下卵泡。对照(正常)卵泡膜细胞制剂来自以下育龄女性的卵巢：具有正常月经史、月经周期为21-35天、以及无雄激素过多症的临床征状。无论是PCOS、还是正常个体均未在手术时接受荷尔蒙药物。手术适应症是功能失调性子宫出血、子宫内膜癌和/或骨盆疼痛。
免疫印迹分析。第4代正常和PCOS卵泡膜细胞生长，直到分汇合并转移到存在与缺少毛喉素处理24小时的无血清培养基。在处理后，在冰冷改性的RIPA缓冲液(30mM Tris、150mM NaCl、50mM NaF、0.5mM EDTA、0.5％脱氧胆酸、1.0％Nonident P-40和0.1％SDS)中收集卵泡膜细胞，该缓冲液包含1mM原钒酸钠、0.1mM苯甲基磺酰氟、1mM二硫苏糖醇、0.2mM苄脒、1μM微囊藻素、1μg/ml亮肽素和1μg/ml胃酶抑素A。使用BCA蛋白测定法(Pierce，Rockford，伊利诺伊州，美国)测定蛋白质浓度。全细胞裂解液(35μg/ln)在10％SDS-PAGE中分离，并转移到PVDF膜上，并按照先前所述进行Western分析[32][34]。
DENND1A.V2的免疫组化定位。通过采用能特异性针对DENND1A.V2的SigmaDENND1A抗体，在Ventana Discovery XT染色机(Ventana Medical Systems，图森，亚利桑那州)对福尔马林固定、石蜡包埋的组织的4-5μm厚的切片上执行DENND1A的免疫组化分析。染色操作简要地由以下组成：以1：300稀释比例在第一抗体中温育30分钟，随后，用VentanaOmniMap DAB抗兔检测试剂盒(Ventana Medical Systems，图森，亚利桑那州)进行检测和可视化。肾上腺皮质的FFPE样品用作阳性组织对照[34]。McAllister等人已发布了DENND1A.V2免疫组化的彩色图像[34]。
定量DENND1A.V1、DENND1A.V2、CYP17A1和CYP11A1单步超快速qRT-PCR。定量DENND1A.V1和V.2、CYP17A1和CYP11A1 mRNA丰度是通过以下进行的：使用Single StepBrilliantTM III超快速qRT-PCR试剂(Agilent)，并采用50-100ng总RNA/管，终浓度为200nM的正向和反向引物，以及100nM探针。所使用的特定引物和探针序列详情如下。“ZEN”部分表示为探针中的一个示例性位置，但根据需要，可被定位在探针的其它地方。按照以下实施基因特异性一步PCR：每个mRNA样品一式两份，并根据制造商对该仪器的说明，将一系列稀释液放入Mx3000p热循环仪系统(Stratagene)中。卵泡膜RNA模板的任意值被分配给每个系列稀释(即，1000、300、100、30、10、3、1、0.3、0.1ng)并针对Ct值作图(y轴＝Ct；x轴＝值，对数刻度)，以产生标准曲线。每个未知数被指定为基于标准曲线的斜率和y轴截距的任意值。对于TATA盒结合蛋白(TBP)也进行相同操作，以使用TBP值以标准化每个反应。每个未知的平均目标值除以每个未知的平均TBP值，以产生每个样品的目标标准化值[34]。
引物和探针组
DENND1A变体2特异性mRNA引物和探针组[25]特定于3’UTR，正向引物(5’GGGCTGACTTCGGAGTGTGT 3’)(SEQ ID NO：34)，反向引物(5’GGG CTG ACT TCG GAG TGTGT3’)(SEQ ID NO：35)，探针(5’/56-FAM/CCAAAGAGC/ZEN/CGG TGT CTG ATA ATC CCA/3iA3AbkFQ/-3’)(SEQ ID NO：36)。
第二个验证性DENND1A变体2特异性mRNA引物和探针组特定于33aa 3’CDS，正向引物(5’TCCACATGTTGTTAAGA GACCAAAG 3’)(SEQ ID NO：37)，反向引物(5’CCGCAAAATGGGTAATGCTT 3’)(SEQ ID NO：38)，探针(5’/56-FAM/AGCCCTGAG/ZEN/CAAAACACCATTGCAA/3iA3AbkFQ/-3’)(SEQ ID NO：39)。
DENND1A变体1特异性mRNA引物和探针组中，正向引物(5’GGATTCATTTCCATAAACCAAGTTAAAG3’)(SEQ ID NO：40)，反向引物(5’CACAATTTCCTGCGTGTCTCA3’)(SEQ ID NO：41)，探针(5’/56-FAM/ATGGCCCGA/ZENCCATTT AAGAAAACAACCA/#IA3BkFQ/-3)(SEQ ID NO：42)。
CYP17mRNA引物和探针组中，正向引物(5’-GGCCTCAAA TGGCAAC TCTAGA-3’)(SEQ IDNO：43)，反向引物(5’-CTTCTGATCGCCATCCTTGAA-3')(SEQ ID NO：44)，探针(5'6-FAM-TCGCGTCCAACAACCGTAAGGGTATC-3'BHQ-1)(SEQ ID NO：45)。
CYP11A1 mRNA引物和探针组中，正向引物(5’GAGGGAGACGGGCACACA-3’)(SEQ ID NO：46)，反向引物(5’-TGACATAAA CCGACTCCACGTT-3')(SEQ ID NO：47)，探针(5'6-FAM-TCCACCTTCACCATGTCCAGAATTTCCA-3'BHQ-1)(SEQ ID NO：48)。
TATA盒结合蛋白(TBP)mRNA引物和探针组中，对于每个标准化后的cDNA样品也进行TBP确认。正向引物(5'-CACGGC ACTGATTTTCAGTTC-3')(SEQ ID NO：49)，反向引物(5'-TCTTGCTGCCAGTCTGGACT-3')(SEQ ID NO：50)，探针(5'JOE-TGTGCACAGGAGCCAAGAGTGAAGA-3'BHQ-1)(SEQ ID NO：51)。
定量类固醇的生物合成。不经有机溶剂萃取，采用DRG国际公司(斯普林菲尔德，新泽西州)的试剂盒，并按照制造商的描述操作，进行脱氢表雄酮(DHEA)、17羟孕酮(17OHP4)、睾酮(T)和黄体酮(P4)的ELISA，并通过细胞计数进行标准化。
外泌体RNA提取和纯化。在知情同意与上述相同的宾夕法尼亚州立大学医学院的机构审查委员会批准的IRB协议下，从正常女性和患有PCOS的女性中获取中午尿样，并对正常和PCOS卵泡膜细胞采用上述相同的临床标准。收集尿样，并置于4℃直到进行处理，然后，分装到15mL管中，并放入Sorvall Super T21桌面离心机的摆动桶中在4℃、300g下离心10分钟，以去除颗粒物质。然后，上清液连续在4℃、2000g下离心10分钟，以清除细胞碎片，将上清液转移至17x100mm培养管中，并用地面Beckman Coulter J-E离心机在4℃、12000g下离心30分钟。该最终澄清的上清液冷冻于-80℃，并用(索罗尔德，加拿大)的“尿外泌体RNA分离试剂盒”的改进操作进行萃取。所得RNA用纳米滴定进行定量。然后，通过qRT-PCR定量DENND1A.V2mRNA，并用5S mRNA丰度进行标准化[34]。
复制缺陷型腺病毒感染。对于这些研究，从Applied Biological Materials公司(Vancouver，BC)获得DENND1A.V2腺病毒(hDENND1A.V2-pADenoG)，其是通过以下构建：从编码DENND1A.V2的pCMV6-XL4质粒中克隆DENND1A.V2至来自Origene(Rockville，MD)的pADenoG[34]。对照空NULL非表达腺病毒(pAdenoG Null)也从Applied BiologicalMaterials公司(温哥华，不列颠哥伦比亚省)获得[35-37]。在HEK293T单层细胞中繁殖并扩增这些重组腺病毒，使用VirabindTM腺病毒Miniprep试剂盒(Cell Biolabs，Inc，圣地亚哥，加利福尼亚州)进行纯化，并通过QuickTiter腺病毒效价Elisa试剂盒(Cell Biolabs，Inc.，圣地亚哥，加利福尼亚州)进行效价检测。DENND1A.V2或对照空NULL非表达腺病毒(pAdenoG Null)均被用于如前所述的感染正常卵泡膜细胞[34][38]。涉及腺病毒感染的第4代卵泡膜细胞生长至75％汇合、用磷酸盐缓冲盐洗涤细胞以及在50％的正常处理体积的无血清培养基中将腺病毒加在细胞上面60分钟。接着，根据指示，在经处理或不处理的无血清培养基中培养该细胞。
正常和PCOS卵泡膜细胞的瞬时转染。从正常周期女性和患有PCOS的女性中分离出的人卵泡膜细胞按照如前所述进行转染[17，22，39]。转染前1小时，将细胞转移到含有20mmol/LHEPES和2％热灭活小牛血清(Atlanta Biologicals，Inc.，亚特兰大，乔治亚州)的DME高葡萄糖培养基中，并转移到3％CO2、95％环境空气的37℃培养箱中。每30mm孔添加含有磷酸钙沉淀的2μg/盘的萤光素酶质粒和1μg/盘的β-半乳糖苷酶表达载体，pSVβ-gal(Promega，麦迪逊，威斯康星州)。转染后，用15％甘油/HBSS冲洗细胞后，用PBS冲洗，在含媒介或10μM毛喉素的转染培养基中处理48小时。用胰蛋白酶收集细胞，沉淀，用报告基因裂解缓冲液(Promega)中重悬。用萤光素酶检测系统(Promega)在Sirius光度计(Zylux Corp.，橡树岭，田纳西州)上检测荧光素酶的活性。通过化学发光检测Galacto-Light PlusTM(Tropix，贝德福德，马萨诸塞州)测量β-半乳糖苷酶活性，并用于转染功效的标准化。转染是在卵泡膜细胞中以一式三份的方式进行，其中，卵泡膜细胞分离自4个或更多独立正常对照患者以及4个或更多独立PCOS患者，除非在本实施例的文本中另有说明。
统计分析。本实施例中的数据是以一式三份的平均值±SEM的方式表示和描述。收集个体患者的qRT-PCR、类固醇和转染分析的结果，并用Prism 5.0c(GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚州)进行ANOVA分析。当由ANOVA显示存在显著差异时，通过用于多重比较的Boniferri法来确定P值[34]。
DNA提取。从独立的正常周期(n＝6)和PCOS女性(n＝6)中分离和增殖的卵泡膜细胞培养物中提取DNA。从-80℃复苏冷冻的卵泡膜细胞培养物，并将1mL裂解液加到每个板中，其中，该裂解液包含0.10μL 1M Tris-HCl pH8.0(Invitrogen，卡尔斯巴，加利福尼亚州)、0.01μL 0.5M EDTA pH8.0(Promega，麦迪逊，威斯康星州)、0.02μL10％SDS(FisherBiotech，费尔劳恩，新泽西州)、0.04μL 5M NaCl(Promega，麦迪逊，威斯康星州)、0.01μL10mg/mL蛋白酶K(Life TechnologiesTM，卡尔斯巴，加利福尼亚州)和0.82mL水[34]。刮板，回收溶液中的细胞。含有细胞的裂解液转移到1.5mL微离心管中，并在55℃的管旋转器中温育过夜。样品在室温下以12000rpm的转速离心5分钟。约400μL样品转移至含有500μL异丙醇的1.5mL微离心管中，颠倒几次，以沉淀DNA。DNA用70％乙醇洗涤两次，并转移至含有400μL1X Tris-EDTA pH7.4(FisherBiorReagents，Fair Lawn，NJ)的微离心管中。离心管在55℃的管旋转器中温育2小时，溶解DNA[34]。
全外显子组测序。在以下条件下，对DNA样品进行全外显子组测序：1亿个读值，100X覆盖范围，使用带有Illumina HiSeq 2000测序的Agilent SureSelect 51M捕获试剂盒，并与BGI Americas(Cambridge，MA)连用。
外显子组序列分析。获得的序列读值通过BGI对照至参考基因组[34]。通过BGI，进行所产生数据的变体识别(Variant calling)和总结。使用IGV(Integrative GenomicViewer)软件，完成数据的可视化和所谓变体的识别[40]。从正常和PCOS卵泡膜细胞样品中仅选择次要等位基因中的支持数>15(唯一映射的碱基数量)的那些变体用于进行进一步分析。识别DENND1A中的单核苷酸多态性(SNPs)，并计算它们的次要等位基因频率。数据示于表1[34]。
表1显示了通过从独立的正常周期(n＝6)和PCOS女性(n＝6)中提取的DNA的全外显子组测序分析所确定的DENND1A变体：表中列出了变体和snps(先前已在dbSNPs中被列出和识别)的rs标识符、染色体位置、基因中的变体的位置/功能、人参考基因组Hg19中的参考等位基因。对我们样本组(6个正常，6个PCOS)中的SNP的次要等位基因频率进行了计算，并与欧美人群中的等位基因频率进行比较，如果存在[34]。
表1：通过从独立的正常周期和PCOS女性中提取的DNA的全外显子测序分析所识别的DENND1A变体。
外显子组数据比较。使用联机数据库Exome 6500，比较由我们WES分析确定的DENND1A变体的次要等位基因频率与人群中的这些变体的等位基因频率[34]。采用欧美人群频率进行比较，因为本研究中的卵泡膜细胞样品是从西欧血统的患者中提取的[34]。
结果
PCOS卵泡膜细胞中DENND1A.V2蛋白质表达增加。为了检测DENND1A的可选择性拼接形式在正常和PCOS卵泡膜细胞中是否存在差异表达[34]，对来自由正常和PCOS女性分离的卵泡膜细胞的全细胞提取物进行免疫(Western)印迹分析，其中，该卵泡膜细胞进行生长，直到分汇合和转移到无血清培养基中，并用或不用20μM毛喉素进行处理24小时。利用中间物N-末端DENND1A抗体(Sigma)，我们期望在约112kD的带对应于DENND1A.V1，而62kD的带对应于DENND1A.V2。如图1A所示，代表性的Western印迹分析显示，与正常卵泡膜细胞相比，在基底和毛喉素刺激下进行处理的PCOS卵泡膜细胞中62kD DENND1A.V2增加。然而，在PCOS卵泡膜细胞中112kDDENND1A.V1并没有显著增加。图1B中，对从5个独立正常和5个独立的PCOS个体分离的卵泡膜细胞获得的全细胞裂解物的累积分析表明，与正常卵泡膜细胞相比，在对照和毛喉素刺激情况下，DENND1A.V2蛋白质在PCOS卵泡膜细胞中均增加(*，P<0.01)。毛喉素处理并未显示会对正常或PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2蛋白质积累产生影响。与此相反，在正常和PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V1累积分析显示，通过毛喉素处理的正常细胞中的DENND1A.V1蛋白质水平升高(*，P<0.01)(图1C)。此外，与正常细胞相比，在毛喉素刺激的PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V1显著减少。在对照和毛喉素刺激的条件下，PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2/V1蛋白质比率增加(**，P<0.01)(图1D)[34]。在使用以下抗体进行的Western分析中获得类似结果：特异性针对N-末端的Abcam抗体和针对DENND1A的肽内序列的Sigma抗体。将DENND1A Western数据定量并通过总mTOR进行标准化，该mTOR在正常和PCOS卵泡膜细胞中并没有显著不同，且不由毛喉素处理调控。不能利用肌动蛋白和GAPDH来标准化Western数据，因为在卵泡膜细胞中它们是由毛喉素调控的，且在正常和PCOS卵泡膜细胞中具有差异表达。
Western分析还用于评价兔多克隆抗体的功效，该抗体是针对特异于DENND1A.V2的21个氨基酸的肽(QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH)(SEQ NO：6)所产生的。使用从正常和PCOS女性中分离和增殖的卵泡膜细胞的全细胞提取物进行Western印迹分析，其中，卵泡膜细胞在无血清培养基中以用与不用20μm毛喉素的方式处理24小时。如图1E所示，代表性的Western印迹分析显示，在基底和毛喉素刺激条件下处理的PCOS卵泡膜细胞中，62kD DENND1A.V2均增加。在这些实验中，通过总mTOR标准化蛋白上样量。这些数据与用N-末端DENND1A抗体的图1A呈现的平行Western印迹分析相一致。如图1F所示，在对照和毛喉素刺激情况下，PCOS卵泡膜细胞中的62kD DENND1A.V2均增加。在图1F中，从4个独立正常和4个独立PCOS患者分离的卵泡膜细胞获得的全细胞裂解物的累积分析表明，在对照和毛喉素刺激情况下，与正常卵泡膜细胞相比，PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2蛋白质均显著增加(*，P<0.01)。毛喉素处理并未显示影响正常或PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2蛋白质累积。
DENND1A.V2免疫组化染色在卵巢卵泡膜隔室中增加。为了进一步检测DENND1A.V2在卵巢中的定位，利用从正常周期和PCOS患者人群获得的卵巢组织的石蜡包埋块和特异性针对DENND1A.V2的抗体[34]。如图2A所示，卵巢卵泡膜隔室中的免疫染色显著(4X)，且与正常卵巢中的卵泡膜细胞相比，PCOS卵泡膜中的染色增加(10X)。图2B显示了PCOS卵泡膜和颗粒细胞中的DENND1A.V2染色(40X)。如图2B所示，染色主要在PCOS卵泡膜核、细胞质和细胞膜中(100X，Oil mag)[34]。
与正常卵泡膜细胞相比，PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2 mRNA丰度增加，且其与PCOS卵泡膜细胞产生的雄激素增加相关。在从6个正常和6个PCOS患者分离的卵泡膜细胞(该细胞用与不用20μM毛喉素处理)中检测DENND1A.V2mRNA的丰度(图3A)，用QRT-PCR分析进行定量，并用TATA盒结合蛋白(TBP)mRNA进行标准化。与正常细胞相比，在基底和毛喉素刺激情况下，PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2 mRNA均显著增加。在响应毛喉素刺激中，DENND1A.V2 mRNA积累没有显著增加。为了检测DENND1A.V2 mRNA是否与增加的雄激素生物合成相关，我们在相同条件下检测了匹配的6个正常和6个PCOS卵泡膜细胞制剂中的DHEA积累。如图3B所示，具有较低DHEA合成的正常卵泡膜细胞中的DENND1A.V2 mRNA减少，而在基底和毛喉素刺激下PCOS卵泡膜细胞中DHEA产量增加与增加的DENND1A.V2mRNA丰度相关[34]。
尿液外泌体的DENND1A.V2 mRNA在PCOS女性中增加。外泌体是小核酸丰富的囊泡，其流入血液和尿液，并提供用于个性化医学和临床诊断中的稳定RNA来源。因此，为了检测PCOS卵泡膜细胞中增加的DENND1A.V2是否反映相应的PCOS女性中全身(systemic)DENND1A.V2 mRNA积累的增加，检测从来自多个正常周期和良好特征的PCOS女性的中午尿样分离的外泌体的mRNA。如材料和方法中所述的，从来自正常周期和PCOS女性的中午尿样中分离和制备尿液外泌体的mRNA。如图4所示，与正常周期女性相比，分离自PCOS的尿液外泌体中的DENND1A.V2 mRNA显著增加，这与PCOS卵泡膜细胞中的qRT-PCR一致[34]。
DENND1A.V2的被迫表达增加正常卵泡膜细胞的类固醇生成。利用表达人DENND1A.V2的腺病毒来测试以下的假设：增加的DENND1A.V2表达将正常卵泡膜细胞转化为雄激素和黄体酮产生增加的PCOS表型。在这些实验中，用0.3、1.0、3.0和10pfu/细胞的空(Null-pAdenoG)或DENND1A.V2表达(hDENND1A.V2-pADenoG)腺病毒感染正常卵泡膜细胞，并在无血清培养基中以用或不用20μM毛喉素的方式进行处理。处理72小时后，对媒介中的DHEA进行定量。与对照腺病毒相比，所有剂量的DENND1A.V2腺病毒进行的感染显著增加毛喉素刺激的DHEA产量(图5A)。在随后的实验中，研究了用3.0pfu对照腺病毒或表达DENND1A.V2的腺病毒感染来自几个个体的正常女性的卵泡膜细胞而产生的针对DHEA(图5B)、17OHP4(图5C)、T(图5D)和P4(图5E)的影响。与对照腺病毒相比，DENND1A.V2腺病毒感染显著增加基底的17OHP4、T和P4积累。此外，与对照腺病毒相比，DENND1A.V2腺病毒感染显著增加毛喉素刺激的DHEA、17OHP4和P4。对于这些实验，Western分析证实在被迫表达后，DENND1A.V2蛋白质增加(数据未显示)[34]。正常卵泡膜细胞的DENND1A.V2被迫表达能将该细胞转化成雄激素和黄体酮生物合成增加的PCOS表型[15，16，34]。
DENND1A.V2的被迫表达增加正常卵泡膜细胞中的CYP17A1和CYP11A1基因表达。为了检测DENND1A.V2表达对CYP17和CYP11A1 mRNA积累的影响，用3pfu DENND1A.V2腺病毒或空(NULL)腺病毒感染第4代正常卵泡膜细胞，并以用或不用20μM毛喉素的方式处理16小时。在处理后，收集RNA，并通过TBP丰度对CYP17和CYP11A1 mRNA丰度进行定量和标准化。与用对照腺病毒进行的感染相比，在毛喉素刺激条件下，进行3pfu/细胞的DENND1A.V2感染后，CYP17A1 mRNA(图6A)和CYP11A1 mRNA(图6B)的积累均显著增加。这些发现也通过以下得到证实：用从Origene(罗克维尔，马里兰州)获得的DENND1A.V2表达质粒(DENND1A.V2/pCMV-XL4)转染正常卵泡膜细胞[34]，以及在DENND1A.V2慢病毒颗粒感染之后(数据未示出)。
为了检测DENND1A.V2对CYP17A1转录的影响，采用磷酸钙法，用含人CYP17A1基因5'-侧翼区的-770/+44(-770CYP17A1/LUC)的pGl3萤光素酶报告基因质粒转染正常卵泡膜细胞[17，22，34]。转染后，用DENND1A.V2腺病毒或对照腺病毒感染细胞1小时，并用存在或缺少20μM毛喉素的无血清培养基处理，其中，毛喉素是一种腺苷酸环化酶的活化剂。在24小时后，测定萤光素酶活性。以一式三份进行转染，并用β-半乳糖苷酶标准化转染效率。图6C显示，与对照腺病毒相比，3pfu/细胞的DENND1A.V2腺病毒感染能使基底和毛喉素刺激的-770CYP17A1/LUC启动子活性均增加[34]。
含赋予PCOS卵泡膜细胞中增加CYP11A1表达的近端CYP11A1启动子的-160/-90bp元件(-160/-90CYP11A1/LUC)的CYP17A1pGl3报告基因构建物，被用于检测DENND1A.V2对卵泡膜细胞中的CYP11A1转录影响。用带有DENND1A.V2/pCMV-XL4或空pCMV-XL4的-160/-90CYP11A1/LUC质粒转染正常卵泡膜细胞。转染48小时后，收集细胞，测定荧光素酶。如图6D所示，与空质粒相比，DENND1A.V2增加毛喉素刺激的-160/-90CYP11A1/LUC启动子活性。总的来说，这些数据表明，由增加的DENND1A.V2表达导致的卵泡膜细胞类固醇生成增加，至少部分是由于CYP17A1和CYP11A1基因的转录激活[34]。
敲减PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2 mRNA减少了CYP17A1和CYP11A1的表达以及雄激素和黄体酮的产生。为了确定敲减内源性DENND1A.V2 mRNA对CYP17A1和CYP11A1 mRNA水平的影响，将沉默DENND1A.V2 shRNA质粒转染到PCOS卵泡膜细胞内，用qRT-PCR评价基底和毛喉素刺激的CYP17A1 mRNA。在这些实验中，用pRSV-Scrambled质粒或特异于DENND1A.V2的质粒(pSV-shRNA1或pRSV-shRNA2)转染第4代PCOS卵泡膜细胞。转染6小时后，以用与不用20μM毛喉素的方式处理细胞，24小时后，收集总RNA，测定CYP17A1、CYP11A1和TBP mRNA丰度。如图7A所示，DENND1A.V2 shRNA1和shRNA2逆转录病毒质粒能显著抑制CYP17A1mRNA在基底和毛喉素刺激下的PCOS卵泡膜细胞中的积累。这两个DENND1A.V2shRNA质粒还能显著抑制毛喉素刺激下的PCOS卵泡膜细胞中的CYP11A1 mRNA(图7B)[34]。对于这些实验，Western和qRT-PCR分析证实，在DENND1A shRNA转染后，DENND1A.V2蛋白质被显著降低[34]。
进行平行研究，以评价特异于DENND1A.V2的沉默shRNA是否会抑制PCOS卵泡膜细胞中的CYP17A1启动子功能(即转录)。用CYP17A1萤光素酶报告基因质粒(-235CYP17A1/LUC)转染PCOS卵泡膜细胞，其中，该质粒包含融合至pGl3中的萤光素酶基因的CYP17A1启动子的-235/+44。在转染混合物中，还加入Scrambled pRV表达载体或编码沉默DENND1A.V2的pRV-shRNA1或pRV-shRNA2质粒。转染6小时后，用PBS洗涤细胞，并用存在或缺少20μM毛喉素的无血清培养基处理。24小时后，测定萤光素酶活性。这些实验的结果表明，与scrambledshRNA相比，DENND1A.V2 shRNA1抑制PCOS卵泡膜细胞中的基底和cAMP依赖性CYP17A1报告基因活性。观察到PCOS卵泡膜细胞中的基底和毛喉素刺激下的-235CYP17A1/LUC启动子调控均增加。如图7C所示，与Scrambled shRNA相比，-235CYP17A1/LUC与沉默DENND1A.V2shRNA1或shRNA2共转染可导致PCOS卵泡膜细胞中的毛喉素依赖性CYP17A1报告基因活性显著下降[34]。
通过shRNA慢病毒颗粒沉默DENND1A.V2表达可抑制PCOS卵泡膜细胞中的类固醇生成。为了评价敲减DENND1A.V2对类固醇生物合成的影响，使用惯用(custom)的Thermo/Dharmacon GIPZ DENND1A.V2 shRNA颗粒。在无血清培养基中，用300,000颗粒/孔的沉默shRNADENND1A.V2慢病毒或对照非沉默慢病毒感染PCOS卵泡膜细胞[34]。6小时后，去除慢病毒混合物，将细胞转移到存在或缺少毛喉素的无血清培养基中处理72小时。用沉默shRNADENND1A.V2慢病毒进行的感染显著抑制毛喉素刺激的17OHP4(图7D)、DHEA生物合成(图7E)和P4(图7F)。虽然在DENND1A.V2慢病毒感染后，基底的类固醇生成呈现控制趋势，但设计的慢病毒感染实验排除基底类固醇浓度的精确评估。
兔多克隆抗DENND1A.V2特异性IgG减少PCOS卵泡膜细胞中的DHEA分泌和CYP17A1mRNA。已知DENND1A与细胞膜和网格蛋白被膜小窝相关，这可能使得DENND1A表位供于可被添加到细胞外的抗体使用。我们制备了针对特异于DENND1A.V2的21个氨基酸肽(QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH)(SEQ ID NO：6)的兔多克隆抗体针(图1C-D)。在正常和PCOS卵泡膜细胞的培养基中加入该DENND1A.V2特异性IgG，以确定它是否可以用来阻断或中和DENND1A.V2功能而因此改变正常和PCOS卵泡膜细胞中的类固醇生物合成。这些实验中，在存在或缺少20μM毛喉素的条件下，用浓度递增的DENND1A.V2同种型特异性IgG或非特异性IgG处理PCOS卵泡膜细胞。如图8A所示，DENND1A.V2 IgG显著抑制毛喉素刺激的DHEA生物合成，其ID50约为0.25μg/mL。与此相反，非特异性IgG对DHEA的生物合成没有影响[34]。
进行随后的实验，以检测0.5μg/mL兔多克隆DENND1A.V2特异性IgG或0.5μg/mL非特异性IgG对以下的影响：在来自各种独立患者的正常和PCOS卵泡膜细胞中以存在或缺少20μM毛喉素的方式处理16小时后的CYP17A1 mRNA(图8B)和CYP11A1 mRNA(图8C)的积累[34]。图8B中的数据表明，在处理16小时后的对照和毛喉素刺激的情况下，0.5μg/mLDENND1A.V2特异性IgG显著抑制PCOS卵泡膜细胞中的CYP17A1 mRNA积累。与此相反，在正常卵泡膜细胞中，DENND1A.V2 IgG对基底或毛喉素刺激的CYP17A1 mRNA没有影响(图8B)。如图8C中所示，DENND1A.V2特异性IgG也显著抑制PCOS卵泡膜细胞中的毛喉素刺激的CYP11A1mRNA积累，而对正常卵泡膜细胞中的CYP11A1 mRNA积累没有影响。
在平行实验中，用0.5μg/mL亲和纯化的兔多克隆DENND1A.V2特异性IgG或0.5μg/mL非特异性IgG处理来自独立患者的正常和PCOS卵泡膜细胞，在处理72小时后，测定基于每个细胞中的基底和毛喉素刺激的缺少DHEA(图8D)、17OHP4(图8E)和P4(图8F)的生物合成。这些实验结果表明，兔多克隆DENND1A.V2特异性IgG显著抑制毛喉素刺激的DHEA(图8D)和17OHP4(图8E)，且相比于对照IgG，在PCOS卵泡膜细胞中的这种抑制达到50％，而不影响正常卵泡膜细胞。
讨论
根据如下的上述事项将会很明显：我们已进行的首次研究来检测来自正常周期和PCOS女性的良好特征性的卵泡膜细胞中的DENND1A表达。对于DENND1AmRNA的剪接变体(DENND1A.V2)增加表达的发现是PCOS卵泡膜细胞的特征，其为寻求对卵泡膜细胞功能方面的这种分子的功能性结果的研究提供了基础[34]。
正常卵泡膜细胞中的DENND1A.V2被迫表达增加CYP17A1和CYP11A1基因表达，并将该细胞转化为雄激素和黄体酮生物合成增加的PCOS表型。与此相反，在PCOS卵泡膜细胞中用沉默shRNA质粒或慢病毒敲减DENND1A.V2能将该细胞恢复至CYP17A1和CYP11A1基因表达以及雄激素和黄体酮生物合成均降低的正常表型。这些观察表明，DENND1A涉及类固醇生成基因转录增加的信号级联放大，其中，类固醇生成基因转录的增加随后会导致雄激素生成增加。
DENND1A.V2是缩短的connecdenn 1，其具有一个网格蛋白结合结构域并被认为能促进内吞作用。在中国汉族中的与PCOS相关的基因座之中[41-43]，几个驻留在或靠近可能用于定义网络的基因，包括FSHR，LHCGR和INSR，它们编码驻留在质膜的受体并通过网格蛋白被膜小窝而被内部化，其中，DENND1A蛋白位于被膜小窝[25，42，44]。DENND1A的DENN结构域的功能是作为Rab-特异性鸟嘌呤核苷酸交换因子[26]。作为另一PCOS GWAS候选物的Ras相关蛋白5B(RAB5B)是Rab-GTP酶，也被认为参与胞吞作用和受体再循环，因此，其可为与DENN结构域相互作用的分子[45,46]。RAB5B信号传导也被报道涉及PI3K、PKB和MAPK/ERK成分[44-47]。因不受理论的束缚，DENND1A.V2的缩短形式能影响卵泡膜和/或颗粒细胞中的胰岛素或LH受体翻转以及敏感性，还能影响PCOS女性中的卵巢功能和类固醇的生物合成。DENND1A也已显示出与脂质(特别是磷酸肌醇-3磷酸盐)和其它内吞作用/核内体蛋白相关[26]，并可能参与胰岛素和LH受体信号传导。可选择地，DENND1A.V2在控制基因表达中可能具有更直接的作用。DENND1A.V2可被易位至细胞核，该过程可通过作为另一GWAS发现的PCOS候选物的RAB5B来促进，在那里DENND1A.V2可能参与CYP17A1和CYP11A1基因表达的转录激活[34]。
使用特异性兔多克隆、以及人和小鼠单克隆的抗DENND1A.V2 IgG抗体，已在本文的实施例中显示出DENND1A.V2表位可用于胞外抗体。观察到的PCOS卵泡膜细胞中的CYP17A1和CYP11A mRNA以及雄激素生物合成的增加可用DENND1A.V2特异性IgG来降低，这说明生物试剂如针对DENND1A.V2的人源化单克隆抗体是用于与PCOS相关的高雄激素血症，以及可能其他胰岛素行为相关的有用的治疗试剂。
这些结果表明，来自DENND1A基因的剪接变体(DENND1A.V2)在控制卵泡膜细胞类固醇生成中具有功能性作用[34]。DENND1A.V2的过表达足以将正常卵泡膜细胞转换成PCOS生化表型，其特征在于升高的CYP17A1和CYP11A1基因表达以及增加的雄激素和黄体酮产生。DENND1A.V2功能的抑制推动PCOS卵泡膜细胞朝在类固醇生成酶基因表达和类固醇生成方面正常的正常表型的发展。DENND1A.V2 mRNA在患有PCOS的女性尿液中增加以及DENND1A.V2特异性IgG能转变PCOS卵泡膜细胞的生化特性而减少类固醇生成这些事实表明DENND1A.V2特异性抗体可用于PCOS的非侵入性检测和PCOS的生物治疗[34]。
实施例2分离自噬菌体展示文库的特异于DENND1A.V2的人源化单克隆性抗体对于治疗PCOS是有用的
材料和方法
噬菌体展示筛选。为了获得特异于DENND1A.V2的功能性人源化单克隆抗体(mAB)，筛选了新制备的噬菌体展示Scl-2文库(Creative Biolabs，纽约)[48-54]。抗体和抗原结合片段的目的是要靶向DENND1A.V2蛋白质C-末端的33个独特氨基酸。DENND1A.V2序列中的33个氨基酸在DENND1A变体1和2之间是独特的，且该氨基酸序列为NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSS SH(SEQ ID NO：5)。为了淘选，利用21个氨基酸序列片段：QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO:6)。先前利用该序列来获得针对DENND1A.V2的功能性兔多克隆抗体(见实施例1)。
用于噬菌体展示的材料
新制备的噬菌体展示Scl-2文库
大肠杆菌TG1宿主菌
M13KO7辅助噬菌体：
引物：
L1：5'-TggAATTgTgAgCggATAACAATT-3'(SEQ ID NO：54)
S6：5'-gTAAATgAATTTTCTgTATgAgg-3'(SEQ ID NO：55)
靶标：CH22、DENND1A.V2
兔抗-M13pAb-HRP
首先，利用针对QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：6)的2个DENND1A变体2肽-蛋白质偶联物[KLH-和BSA-偶联物]，进行噬菌体展示淘选，以选择针对该肽本身的特异性结合剂。在直接包被肽-BSA偶联物后，进行亲和淘选和QC噬菌体ELISA。结果显示，未观察到特异性富集作用。
合成DENND1A.V2特异性肽(QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH；SEQ IDNO：6)的生物素化版，并通过用链霉亲和素预包被板将该生物肽固定化后，用如表2所述的新鲜制备的噬菌体文库进行新淘选。经过三轮筛选，观察到强富集作用。从胰蛋白酶消化洗脱液或竞争洗脱液中获得40个克隆，并进行噬菌体扩增和噬菌体ELISA(表3-4)。
表2针对CH22DENND1A.V2氨基酸序列靶标QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：6)(即生物素-CH22)的人噬菌体淘选过程
富集因子＝输入/产出
表3QC单克隆噬菌体ELISA-1。人M13K07单克隆噬菌体克隆对生物素化的DENND1A.V2氨基酸序列QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：6)(即生物素-CH22)的反应性
M13KO7噬菌体：10(3)cfu/ml
1-A：扩增的第一洗脱液噬菌体
2-A：扩增的第二洗脱液噬菌体
3-A：扩增的第三洗脱液噬菌体
表4QC单克隆噬菌体ELISA-2。人M13K07单克隆噬菌体克隆对生物素化的DENND1A.V2氨基酸序列QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：6)(即生物素-CH22)的反应性
M13KO7：10(10)cfu/ml
使用生物素化的DENND1A.V2肽QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ IDNO：6)作为靶标，确定了两个强结合的scFv(克隆16和79)(表3-4)。scFv噬菌体克隆16和79的序列分析显示，这些克隆的核苷酸和肽序列是相同的(图9A-B)。该scFv的VL和VH被克隆入含有人IgG1的轻链(pIgG1-L)和重链(pIgG1-H)的质粒(图10A-D)。转染后，这些构建在HEK293细胞中表达，并将所得的人重组DENND1A.V2 IgG1进行表达和纯化(图11A-C)。简而言之，将质粒载体转染入293E细胞。在转染96小时后，收集悬浮培养物。产物通过HiTrap rProteinA FF纯化，并用0.2μm过滤器过滤。然后，利用所得人重组DENND1A.V2特异性IgG(V2hmAB)(图11B)进行以下的功能研究：使用产生卵巢雄激素的人卵泡膜细胞，其分离自正常周期女性和患有PCOS的女性(图12A-B和图13A)。
结果
噬菌体展示结果。如表2所示，经三轮筛选后，发现了强富集作用。于是，从胰蛋白酶消化洗脱液或竞争性洗脱液中挑取40个克隆用于进一步QC ELISA检测。来自胰蛋白酶消化洗脱液的前40个克隆进行QC噬菌体ELISA。如表3所示，确定了一个强阳性克隆(即克隆16)和几个弱阳性克隆。来自竞争性洗脱液的第二批40个克隆也进行QC噬菌体ELISA。如表4所示，确定了第二个强阳性克隆(即克隆79)和几个弱阳性克隆。对两个强阳性克隆和几个弱阳性结合克隆进行DNA测序。鉴定为7独特的scFv。两个强阳性克隆(克隆16和79)有着相同的scFv序列(见图9)。
可溶性scFv表达和可溶性scFv ELISA。强阳性scFv基因(相同的克隆16、79)被克隆到可溶性scFv表达载体pCDisplay-2中进行进一步的可溶性scFv表达和可溶性scFvELISA。如表5所示，当含可溶性scFv-AP融合蛋白的大肠杆菌裂解物被直接包被时，表达被成功证实。如表6所示，当通过链霉亲和素预包被板固定生物素化DENND1A.V2肽时，也确认了scFv-AP的阳性结合。
表5直接使用大肠杆菌裂解物对来自噬菌体克隆16和79的可溶性scFv融合蛋白进行ELISA分析
表6使用通过链霉亲和素预包被板固定的DENND1A.V2生物素化肽来进行QC可溶性scFvELISA
由噬菌体展示确认的scFv的VL和VH被克隆到含有人IgG1的轻链(pIgG1-L)和重链(pIgG1-H)的质粒，并进行测序。如图10A-D所示，这些克隆的重链和轻链的VH和VL如同scFv的那些(图9A-9B)。VH和VL的CDR均用带下划线且加括号表示。
重组人DENND1A.V2特异性IgG1功能性抑制PCOS卵泡膜细胞中的DHEA生物合成。进行剂量反应实验，以检测从用生物素化的DENND1A.V2 21个氨基酸肽(QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH)(SEQ ID NO：6)进行的噬菌体展示筛选中获得的重组人IgG1是否能中和增强的DENND1A.V2表达作用和降低PCOS卵泡膜细胞中的类固醇生物合成(图12)。在这些实验中，用浓度递增(.01-6μg/mL)的特异于DENND1A.V2的人重组单克隆IgG1(V2hmAB)或非特异性IgG1处理PCOS卵泡膜细胞，并在缺少(C)和存在20μM毛喉素(F)的条件下处理72小时。如图12A所示，在DHEA生物合成中呈现剂量依赖性降低。与对照IgG1相比，V2hmAB显著降低(*，P<0.01)毛喉素刺激的DHEA生物合成，其ID50约为1.8μg/mL。检测3.0μg/ml和6.0μg/ml非特异性IgG1或V2hmAB对PCOS卵泡膜细胞中生物合成的影响，结果显示，与对照IgG1相比，在用V2hmAB处理后，基底和毛喉素(*，P<0.1)刺激的DHEA生物合成均被抑制(图12B)。在平行的初步研究中，人重组DENND1A.V2 IgG1也抑制基底和毛喉素刺激的CYP17mRNA累积(数据未显示)。
进行随后的实验，以检测最大剂量的人重组DENND1A.V2 IgG1(V2hmAB)(9μg/ml)和非特异性IgG1(9μg/ml)对来自各种个体患者的正常和PCOS卵泡膜细胞中的雄激素生物合成的影响，其中，该细胞在存在(C)和缺少20μM毛喉素的条件下被处理72小时。如图13A所示，最大剂量的V2hmAB IgG1显著(*，P<0.01)抑制PCOS卵泡膜细胞中的毛喉素刺激的DHEA生物合成，而对正常卵泡膜细胞中的DHEA的积累影响极小。
比较兔DENND1A.V2多克隆(图8)和人重组DENND1A.V2 IgG1(图12A-B和13A)对DHEA生物合成的影响，结果表明，与对照IgG相比，针对C-末端DENND1A.V2 21个氨基酸肽所制备的这两种抗体都能降低PCOS卵泡膜细胞中的基底和毛喉素刺激的雄激素生物合成(图13B)。
实施例3特异于DENND1A.V2的小鼠单克隆抗体提供功能性IgG1的CDR序列信息，以构建用于治疗性处理PCOS的人源化单克隆抗体
材料和方法
针对DENND1A肽的小鼠单克隆抗体的制备。使用标准方法来制备针对DENND1A肽QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(SEQ ID NO：6)的小鼠单克隆抗体[55]。用溶于RIBI佐剂中的KLH偶联肽免疫BALB/c小鼠。按照以下方式进行免疫：每次免疫中，在每只小鼠的每个位点以体积为0.05ml的量进行皮下和腹膜内免疫。给予双周3次的免疫，用溶于盐水中的KLH肽进行最终加强免疫。最终加强免疫3天后，用氯胺酮/赛拉嗪麻醉小鼠，在放血后，去除脾和淋巴结。制备免疫细胞的单细胞悬浮液，并与P3X63-Ag8.653骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。通过ELISA，筛选对该肽和BSA-肽具有反应性的来自杂交瘤培养物的上清液，分离阳性培养物以用于扩增和克隆。使产生ELISA中具有反应性抗体的阳性克隆适应于使用Sigma无血清培养基的无血清条件，然后，使用BDBiosciences CELLine设备制备高效价的抗体。接着，使用蛋白A/G柱(Pierce，洛克福特，伊利诺伊州)纯化包含抗体的培养物，并用于各种抗体检测和功能测定中。
小鼠单克隆抗体组的ELISA结合活性。ELISA用于评价所选单克隆抗体的结合特征，其中，该抗体在融合物初筛中呈现阳性。基本方法如下：用在碳酸氢盐结合缓冲液(pH9.6)中的浓度为1μg/ml的各种DENND1A.V2抗原来源(KLH-肽；BSA-肽，游离肽，对照肽和BSA)包被ELISA板的孔，然后，以一式两份的方式，检测杂交瘤细胞培养物上清液的单个稀释液。从板读取机(reader)上确定405nm处的光密度读数，以OD读数的均值±SEM的方式对每种抗原和每个杂交瘤上清液进行绘图。通过限制性稀释克隆一些反应性杂交瘤，同种型特征化，并在ELISA中重新检测。一个通过ELISA检测的小鼠单克隆抗体的结合情况例子如图14所示。若干单克隆抗体被确认为具有DENND1A.V2游离肽(SEQ ID NO：6)以及KLH-与BSA标记肽(包括P1B2、P1C5、P4F1、P5F9和P2F5)的特定反应性。
小鼠DENND1A.V2单克隆抗体的RNA提取和序列分析。通过离心，使ELISA阳性单克隆杂交瘤细胞沉淀，并重新悬浮于TRIzol试剂(Life Technologies)以用于RNA分离。从匀浆中提取总RNA，将所得RNA沉淀物溶解于100μl HyClone HyPure分子生物学级水(ThermoScientific)。用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒合成cDNA，其中，该试剂盒包括用于合成的随机六聚体引物和重组体M-MuLV RT。通过ChoiceTaq DNA聚合酶(DenvilleScientific Inc.)以及IgG1重链的冗余与kappa轻链冗余的引物来扩增所得的cDNA[55][56]。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)来纯化PCR产物。采用已用于PCR扩增中的相同引物，通过Operon直接测序PCR产物。使用DNAMAN软件分析和翻译这些序列，并使用相同的PCR引物进行测序。
小鼠单克隆抗体对雄激素生物合成的功能评价。对来自P1B2和P1C5小鼠单克隆性的克隆的杂交瘤细胞进行进一步亚克隆，并利用来自这些培养物的培养基处理PCOS卵泡膜细胞，以评价它们对如实施例1的材料和方法中所述的PCOS卵泡膜细胞中的卵巢雄激素生物合成的影响。
小鼠DENND1A.V2单克隆抗体的序列分析。从PIB2和P1C5杂交瘤克隆中制备RNA。mAb P1B2的重链和轻链以及P1C5的重链的部分核苷酸和氨基酸序列如图16A-D所示。
结果
小鼠DENND1A.V2单克隆抗体(mAB)ELISA。对所选杂交瘤的小鼠单克隆抗体上清液进行ELISA扫描确定了若干单克隆抗体，其对DENND1A.V2游离肽(SEQ ID NO：6)以及KLH-与BSA标记肽(包括P1B2、P1C5、P4F1、P5F9和P2F5)具有特定反应性(图14)。
小鼠单克隆V2 IgG1对雄激素生物合成的抑制作用。进行实验来研究针对KLH-偶联的DENND1A.V2特异性21个氨基酸的肽(QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH)(SEQ ID NO：6)所制备的小鼠P1B2(mV2.A)和P1C5(mV2.B)DENND1A.V2单克隆抗体是否能类似中和PCOS卵泡膜细胞中的DENND1A.V2并抑制雄激素的生物合成。在这些实验中，用40μL mV2.A和mV2.B小鼠IgG1或者阴性对照小鼠IgG1的组织培养上清液在缺少或存在20μM毛喉素的条件下，处理PCOS卵泡膜细胞72小时。图14中的数据表明，与阴性对照小鼠IgG1相比，DENND1A.V2特异性mV2.A和mV2.B小鼠IgG1均抑制PCOS卵泡膜细胞中的毛喉素刺激的DHEA生物合成(*，P<0.05)。图12-13和15中的数据表明，人和小鼠DENND1A/V2特异性抗体抑制PCOS卵泡膜细胞中的DHEA生物合成。这与使用兔DENND1A.V2特异性多克隆抗体获得的结果(图8)一致。这些数据进一步支持了以下的意图：特异于DENND1A.V2单克隆抗体可被用作PCOS的一个治疗形式。
DENND1A.V2特异性小鼠单克隆抗体P1B2和P1C5的序列。提供小鼠单克隆DENND1A.V2特异性IgG1的DNA和蛋白质序列、P1B2重链(图16A和C；SEQID NO：60和62)、P1B2轻链(图16B和D；SEQ ID NO：61和63)和P1C5重链(图16E-F的重链；SEQ ID NO：64和65)的核苷酸和氨基酸序列。CDR示于括号内。
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虽然本发明描述了其优选的实施方式，但本领域的那些技术人员将认识到，本发明可在所附的权利要求的精神和范围内进行修改。因此，本发明不应局限于上述实施方式，还应包括在本文描述的精神和范围内的所有修改及其等同物。
Claims (28)
1.一种包含抗体或其抗原结合片段的药物组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别DENND1A.V2蛋白质而不特异性识别DENND1A.V1蛋白质。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述抗原结合片段选自于由以下构成的组：Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd片段、Fv片段、scFv片段以及它们的组合。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别存在于以下氨基酸序列中的至少一个表位：如SEQ ID NO：5所示的NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别存在于以下氨基酸序列的至少一个表位：如SEQ ID NO：6所示的QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH。
5.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别至少一个表位，所述表位包含如SEQ ID NO：5所示的NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH序列和/或如SEQ ID NO：6所示的序列QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH中的至少4个连续氨基酸。
6.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别至少一个表位，所述表位存在于下述氨基酸序列中的至少一个：如SEQ ID NO：7至SEQ ID NO：33所示的NTIATPA、TIATPAT、IATPATL、ATPATLH、TPATLHI、PATLHIL、ATLHILQ、TLHILQK、LHILQKS、HILQKSI、ILQKSIT、LQKSITH、QKSITHF、KSITHFA、SITHFAA、ITHFAAK、THFAAKF、HFAAKFP、FAAKFPT、AAKFPTR、AKFPTRG、KFPTRGW、FPTRGWT、PTRGWTS、TRGWTSS、RGWTSSS和GWTSSSH。
7.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：53的残基1-116和残基133-240。
8.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：62和63的互补决定区CDR。
9.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO：65的互补决定区CDR。
10.一种编码抗体或其抗原结合片段的分离的核酸，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别DENND1A.V2蛋白质而不特异性识别DENND1A.V1蛋白质。
11.如权利要求10所述的核酸，其中，所述核酸包含SEQ ID NO：56和/或SEQ IDNO：57所示的序列。
12.如权利要求10所述的核酸，其中，所述核酸包含SEQ ID NO：60和/或SEQ IDNO：61所示的序列。
13.如权利要求10所述的核酸，其中，所述核酸包含SEQ ID NO：64所示的序列。
14.一种用于治疗与DENND1A.V2mRNA和/或蛋白质的表达正相关的疾病的方法，其包括：向需要的个体施用治疗有效量的药物组合物，所述组合物包含抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别DENND1A.V2蛋白质而不特异性识别DENND1A.V1蛋白质。
15.如权利要求14所述的方法，其中，所述疾病是多囊卵巢综合征PCOS。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述疾病是与PCOS相关的II型糖尿病。
17.一种通过细胞内的细胞表面受体来改变信号的方法，所述细胞与对照细胞相比具有增加的DENND1AV.2表达，所述方法包括将所述细胞与抗体或其抗原结合片段进行接触，其中，所述抗体或其抗原结合片段特异性识别DENND1A.V2蛋白质而不特异性识别DENND1A.V1蛋白质。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述细胞选自于由以下构成的组：卵泡膜细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、子宫内膜细胞和颗粒细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其中，使所述细胞与所述抗体或其抗原结合片段进行接触会减少所述细胞中的雄激素和/或黄体酮的生物合成、和/或降低所述细胞中的CYP17A1和/或CYP11A1mRNA和/或蛋白质的基因表达。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述卵泡膜细胞中的雄激素和/或黄体酮的生物合成减少、和/或所述细胞中的CYP17A1和/或CYP11A1mRNA和/或蛋白质的基因表达降低，能减少或防止与高雄激素血症相关的过量雄激素产生和/或排卵停止的症状。
21.权利要求20所述的方法，其中，所述过量雄激素产生的症状包括多毛症。
22.如权利要求18所述的方法，其中，所述抗体或其抗原结合片段减少或防止与PCOS相关的其它表型，所述表型选自于由以下构成的组：异常胰岛素信号传导，在脂肪、骨骼肌和子宫内膜组织中的胰岛素抵抗，颗粒细胞中的异常FSH信号传导，以及它们的组合。
23.一种制品，其包括容器和包含在该容器内的组合物，其中，所述组合物包含特异性识别DENND1A.V2蛋白质而不特异性识别DENND1A.V1蛋白质的抗体；并且所述制品还包括插入物，其指示所述组合物能被用于治疗与DENND1A.V2mRNA和/或蛋白质表达正相关的疾病。
24.如权利要求23所述的制品，其中，所述疾病是PCOS。
25.一种用于诊断个体中的与DENND1A.V2mRNA和/或蛋白质表达正相关的疾病的方法，其包括：将来自所述个体的生物样品与抗体进行接触，其中，所述抗体包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包括：SEQ ID NO：53的残基1-116和残基133-240，或者SEQ ID NO：62、63或65中的至少一个的CDR；以及
将检测到的DENND1A.V2量与参考值进行比较。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述疾病为PCOS。
27.如权利要求25所述的方法，其中，所述生物样品是血液、血清、尿液、血浆或唾液、和/或卵巢、子宫内膜、脂肪组织或骨骼肌的活体组织切片或手术标本。
28.一种用于治疗与DENND1A.V2mRNA和/或蛋白质表达正相关的疾病的方法，其包括：向需要的个体施用治疗有效量的包含RNAi的组合物，其中，所述RNAi组合物降低了DENND1A.V2的表达。
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