JP2017501979A - Dennd1a変異体2と相関する障害の予防及び/又は治療のための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
PCOSなどのDENND1A.V2関連障害を治療するための医薬組成物及び方法を提供する。特に、DENND1A.V2に特異的なヒト化マウスモノクローナル抗体、及びそれを使用するための方法を提供する。
Description
本出願は2013年11月19日付け米国仮出願第61/906,078号及び2014年8月28日付け米国仮出願第62/042,852号に関連し、それぞれの開示は参照により本明細書に援用される。
本発明は概括的には、限定するものではないが、多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)などの、DENND1A.V2(1A変異体2を含むDENN/MADDドメイン)mRNA及び/又はタンパク質の発現と相関する障害に関するものであり、より詳細にいうと、これらの障害を予防及び/又は治療するための組成物及び方法に関する。
多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)は、最も一般的な内分泌疾患の1つであり、世界的に見て生殖可能年齢の女性の5〜7%が罹患している[1]。それは高アンドロゲン血症/アンドロゲン過剰症、無排卵症、不妊症、及び左右対称卵巣腫大に埋め込まれた複数の小さな皮質下卵胞「嚢胞」からなる特徴的な卵巣形態に関連している[2〜5]。血中テストステロンレベルの上昇は主に卵巣によるアンドロゲン生成増加に起因し、PCOSの女性の典型的な内分泌表現型である。PCOSの診断基準については議論の余地があるが、他の原因では解明されていない高アンドロゲン血症/アンドロゲン過剰症及び無排卵症はその障害の特質であり、重要な要素として全ての「見解一致」診断スキームに包含されている[6〜10]。卵巣莢膜細胞はPCOSの女性における過剰なアンドロゲン生合成の主要な原因であるとの見解で一致している[11〜13]。新たに単離した莢膜組織、又は正常女性及びPCOS女性由来の莢膜細胞培養の研究によって、PCOS莢膜は正常に排卵する女性の莢膜組織又は細胞より多くの量のアンドロゲンを分泌することが実証されている[12、14〜19]。PCOS莢膜細胞中の莢膜アンドロゲン生合成増加は、アンドロゲン生合成、シトクロムP450 17アルファヒドロキシラーゼ(CYP17A1遺伝子にコードされている)及びシトクロムP450コレステロール側鎖切断部位(CYP11A1遺伝子にコードされている)に関与する主要酵素の発現増加に起因する[15〜17、20]。
正常周期の女性及びPCOSの女性の卵巣由来の個々の大きさが同じ卵胞から単離した莢膜細胞を増殖させる条件が整えば、継代したPCOS莢膜細胞は正常な莢膜細胞と比較してアンドロゲン及びプロゲステロンのレベルを上昇させる能力を保持するという第1の証拠が与えられる[15、16、21]。PCOS莢膜細胞中のアンドロゲン及びプロゲステロン生合成のこの増大は、CYP17A1及びCYP11A1遺伝子転写の増加ならびにRNAの安定性に部分的に起因している[17、20、22]。マイクロアレイ分析及び定量的PCRによって複数の個体から得た正常及びPCOS莢膜細胞の分子特徴化によって、正常細胞及びPCOS細胞が特有の分子署名を有していることも確立された[16、23、24]。これらの知見は、屈性刺激に応答してアンドロゲンの過剰分泌を促進するPCOS莢膜における内因性異常の概念と一致している。莢膜細胞培養系によって、PCOSの女性における遺伝子異常の根底にある生化学的及び分子メカニズムを特定するための固有の構築基盤が与えられる。
本開示では、代替的にスプライシングしたトランケート型のDENND1AであるDENND1A.V2[25、26]は正常莢膜細胞とPCOS莢膜細胞とで示差的に発現することを実証するデータが示されている。当該データは、PCOS莢膜細胞によって増加したCYP17A1及びCYP11A1遺伝子発現ならびに増大したアンドロゲン及びプロゲスチン生合成の病態生理学的状態にDENND1A.V2が寄与していることを実証している[17、20、22]。更に本明細書に提示されたデータは、shRNA又は抗体ベースの手法を利用してDENND1A.V2を標的にすれば、PCOS莢膜細胞によって顕著になったCYP17A1及びCYP11A1遺伝子発現やアンドロゲン生成増加が抑制可能になることを実証している。したがって、PCOSの特質であるアンドロゲン発現の増加を阻害することは、PCOS患者、ならびにDENND1A.V2発現に確実に関連している他の傷害を持つ個人にも予防及び/又は治療効果があるであろう。
本発明の1態様には、予防及び/又は治療の利点が達成されるように効果的量のDENND1A.V2標的薬剤を含む組成物を、それを必要とする被験者に投与する工程が含まれる。標的薬剤の例には、抗体もしくは抗原結合断片及びRNAi、shRNA又は他のヌクレオチド含有組成物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、DENND1A.V2発現と確実に相関している障害であればいかなる障害でも、被験者は治療を必要とする。いくつかの実施形態では、障害は、基準値に相対して増加したDENND1A.V2と相関している。更なる実施形態では、個人はPCOSのリスクを有しているか、PCOSに罹患している疑いがあるか、又はPCOSと診断されている。
本発明の他の態様は、DENND1A.V2タンパク質を特異的に認識するとともに、DENND1A.V1(DENN/MADDドメインを含む1A変異体1)タンパク質を特異的に認識しない抗体又はその抗原結合断片から成る医薬組成物に関する。抗原結合断片の例としてはFab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fd断片、Fv断片、scFv断片及びこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、明瞭なDENND1A.V2のC末端アミノ酸配列:NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号5)に存在する少なくとも1つのエピトープを特異的に認識する。
本発明の他の特徴及び利点は以下の発明の説明に記載され、部分的にその説明から明らかになり、あるいは本発明の実施によって知る場合もある。本発明は、特にこの明細書及び特許請求の範囲で指摘した組成物及び方法によって実現し、達成されるであろう。
本発明の実施形態は抗体又はその抗原結合断片から成る医薬組成物に関するものであり、当該抗体又はその抗原結合断片はDENND1A.V2タンパク質を特異的に認識するとともに、DENND1A.V1タンパク質を特異的に認識しない。本発明の更なる実施形態は、DENND1A.V2のmRNA及び/又はタンパク質の発現と確実に相関している障害の予防及び/又は治療のための方法に関するものであり、当該方法は、抗体又はその抗原結合断片から成る医薬組成物を治療有効量で、それが必要な被験者に投与する工程を含み、ここでは抗体又はその抗原結合断片はDENND1A.V2タンパク質を特異的に認識するとともに、DENND1A.V1タンパク質を特異的に認識しない。
DENND1A.V2のcDNA配列は:
である。
である。
DENND1A.V2のアミノ酸配列は:
である。
である。
DENND1A.V1のcDNA配列は:
である。
である。
DENND1A.V1アミノ酸配列は:
である。
である。
本明細書で提示した各cDNA配列に関し、本発明はcDNAと同等のmRNAを包含し、このことは各TがUに置換されている各cDNA配列が本発明に包含されていることを意味する。
一態様では、本開示は1つ以上の単離した、更に/又は、組み換え技術もしくは合成(例えば化学合成)を行った結合パートナーを含み、これはDENND1A.V2タンパク質を特異的に認識するが、DENND1A.V1タンパク質は特異的に認識しない。
このような結合パートナーには、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fd断片、Fv断片、scFv断片、アプタマー、二重特異性抗体及びこれらの組み合わせなどのDENND1A.V2タンパク質の固有のC末端に特異的に結合可能な抗体及びその抗原結合断片が挙げられる。単鎖Fv又は「scFv」抗体断片は抗体のVH及びVLドメインから成り、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、FvポリペプチドはVH及びVLドメインの間にポリペプチドリンカーを更に含み、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。抗体及びその抗原結合断片はDENND1A.V2タンパク質の固有の33アミノ酸C末端にある1つ以上のエピトープを対象としている。DENND1A変異体1と2との間に固有に存在する33アミノ酸DENND1A.V2配列は:NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号5)である。
本開示はこの固有のDENND1A.V2のC末端アミノ酸配列の断片に対する抗体を作製する実演を包含する。この点で、以下の固有な21アミノ酸配列断片:QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)を標的とするDENND1A.V2ポリクローナル抗体(ウサギ)を作製した。この配列は、配列が適切に抗原性を有し、他のタンパク質に非特異的な交差反応性がある抗体を生成する可能性が無いと予測する分析に基づいて選択した。
本開示では、DENND1A.V2タンパク質の21アミノ酸C末端を標的とする抗体はPCOS莢膜細胞におけるアンドロゲン生合成ならびにCYP17及びCYP11A1mRNAを有意に減少させることが実証されている(例えば、図8A〜Bを参照)。
本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、少量存在する自然発生的突然変異を除き、集団を構成する個々の抗体は同一である。モノクローナル抗体は単一の抗原部位に対して高度に特異的である。更に、様々な決定基(エピトープ)に対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体標本とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基を対象としている。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成することができるという点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得る抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体生成を必要とするものであると解釈すべきではない。
抗体の調製のための抗体及び方法は、当技術分野において周知である。抗体生成法、及び抗原へ実質上特異的に結合するため生成された抗体のスクリーニングの詳細は標準的な参照文献に記載されており、例えばE.Harlow及びD.Lane著、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988年;F.Breitling及びS.Dubel著、Recombinant Antibodies、John Wiley&Sons社、ニューヨーク、1999年;H.Zola著、Monoclonal Antibodies;Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives、Basics:From Background to Bench、BIOS Scientific Publishers、2000年;ならびにB.K.C.Lo著、Antibody Engineering:Methods and Protocols、Methods in Molecular Biology、Humana Press、2003年が挙げられる。
例示的な1手法では、モノクローナル抗体はDENND1A.V2のC末端に位置するポリペプチドNTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号5)、又はその任意の免疫原性断片を使用する標準的な手法によって作製可能である。1実施形態では、配列QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)から成る配列番号5の21アミノ酸配列セグメントに対して、又は配列番号6内の1つ以上の決定基に対してモノクローナル抗体を作製する。
本開示の抗体は、NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号5)配列又はQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)に存在する立体構造エピトープ(単数又は複数)及び/又は直鎖エピトープ(単数又は複数)のうちいずれかを認識することが可能である。
実施形態では、抗体及び抗原結合断片は、33アミノ酸配列以内の任意の位置で開始及び終了する33アミノ酸DENND1A.V2のC末端配列の少なくとも約4個の連続したアミノ酸中に存在する少なくとも1つのエピトープを特異的に認識する。実施形態では、エピトープは、33アミノ酸DENND1A.V2のC末端配列(配列番号5)中に存在する少なくとも約4、5、6又は7個の連続アミノ酸を有する。エピトープは、例えば約12アミノ酸以下の長めの配列(例えば8、9、10、11又は12アミノ酸)で定義することも可能である。従ってエピトープは、33アミノ酸DENND1A.V2のC末端配列の任意の約12アミノ酸までのセグメント、もしくはそれ以上に長いセグメントを含むか、又はそれのみから構成することが可能である。実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、33アミノ酸DENND1A.V2のC末端配列の以下に示す例示的なセグメント:NTIATPA(配列番号:7);TIATPAT(配列番号:8);IATPATL(配列番号:9);ATPATLH(配列番号:10); TPATLHI(配列番号:11);PATLHIL(配列番号:12);ATLHILQ(配列番号:13);TLHILQK(配列番号:14);LHILQKS(配列番号:15);HILQKSI(配列番号:16);ILQKSIT(配列番号:17); LQKSITH(配列番号:18);QKSITHF(配列番号:19);KSITHFA(配列番号:20);SITHFAA(配列番号:21);ITHFAAK(配列番号:22);THFAAKF(配列番号:23);HFAAKFP(配列番号:24);FAAKFPT(配列番号:25);AAKFPTR(配列番号:26);AKFPTRG(配列番号:27);KFPTRGW(配列番号:28);FPTRGWT(配列番号:29);PTRGWTS(配列番号:30);TRGWTSS(配列番号:31);RGWTSSS(配列番号:32);GWTSSSH(配列番号:33)及びこれらの組み合わせ:のうちのいずれかに一部又は全体が存在するエピトープに特異的である。実施形態では、本開示の抗体は、21アミノ酸配列:QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)(例えば、上記で開示した7アミノ酸配列の群に含まれるか、又はそれらを含む約4、5、6、7、8、9、10、11又は12連続アミノ酸から成るセグメント)のうちの少なくとも約4つの連続したアミノ酸に存在するエピトープを特異的に認識する。例えば、配列番号7から開始して、以下の4つの連続したアミノ酸: NTIA(配列番号:66)、TIAT(配列番号:67)、IATP(配列番号68)及びATPA(配列番号69)は、抗体に認識されるエピトープから構成されてもよい。また、これらのエピトープは比較的長い配列の一部であってもよい。例えば、配列番号66から開始して、配列XXNTIAX(配列番号70)は、抗体に認識されるエピトープから構成されてもよく、ここではXは、本明細書に記載されているように任意のアミノ酸である。実施形態では、抗体は、配列番号5に一部又は全体が存在する配列に対して少なくとも約65、70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%の配列同一性を有するエピトープを認識する。本開示は、上記アミノ酸セグメントの少なくとも1つを認識する少なくとも1つのパラトープ、又は上記セグメントの少なくとも1つを認識する少なくとも2つのパラトープを有する構造(例えば、本明細書に記載された抗体又はその断片などの結合分子)を含む。
本発明の抗体又は抗原結合断片は、標的エピトープが他のエピトープに5%以下の結合を示す場合に、好ましくは、例えば酵素結合免疫吸着検定法で測定したときに他のエピトープに測定可能な結合を示さない場合に、標的エピトープを特異的に認識又は結合する。抗体又は抗原結合断片は、標的エピトープが他のエピトープに5%を超える結合を示す場合、標的エピトープを特異的に認識又は結合することはない。非特異的に結合する抗体又は抗原結合断片は依然として選択的に結合することも可能であり、例えば抗体は標的エピトープに結合し、更にいくつかの他のエピトープへの非特異的な結合を示す場合もある。
抗体は、化学的ペプチド合成などの当技術分野で公知の様々な方法によって製造してもよい。1つの手法では、モノクローナル抗体を作製するために、本明細書に記載されたDENND1A.V2のC末端ポリペプチドをマウスなどの実験動物に導入し、数週間に及ぶ期間、続けて投与する。通常、脾細胞をマウス脾臓から単離し、単離されたB細胞を取得し、電気融合などの任意の好適な手法によって不死化された骨髄腫細胞と融合する。骨髄腫細胞はヒポキサンチン‐グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)遺伝子を十分持っていないことが特徴的であり、その結果としてHAT培地(ヒポキサンチン‐アミノプテリン‐チミジン培地)に対して感受性を持つ。融合物は通常、10〜14日などの期間、HAT培地に曝露し、この間、アミノプテリンなどの化合物を使用してヌクレオチド合成を阻害する。その結果として、非融合細胞は死滅し、不死化して抗体を生成するB細胞‐骨髄腫ハイブリッド(ハイブリドーマ)は生存する。細胞を希釈し、例えばマルチウェルプレートの1つ1つのウェルで単一のハイブリドーマを単離する。その後、ハイブリドーマをスクリーニングし、DENND1A.V2のC末端を特異的に認識し、それによってDENND1A.V1タンパク質とは交差反応しない抗体を生成するハイブリドーマを同定する。適切なハイブリドーマを単離すると、分泌された免疫グロブリン(Ig)をコードするDNAを配列することが可能になるので、Igのアミノ酸配列を決定することができる。ハイブリドーマによって作製した抗体の合成版を作製するために、又は本明細書で更に説明する抗原結合部分を作製するために、Ig重鎖及び軽鎖の相補性決定領域(CDR)を決定し、使用することが可能である。あるいは、抗体を生成する細胞をクローニングし、モノクローナル抗体の継続的な供給源を提供する同一の娘クローンを生成することが可能である。大量の抗血清が必要な場合、比較的大型の動物、例えばヤギ又はヒツジを抗体産生用宿主種として使用してもよい。
非ヒト哺乳動物由来のハイブリドーマによって生成された抗体はいかなる抗体でも修飾してキメラ型又は部分的もしくは完全なヒト化形態にすることが可能であり;本開示はこのような修飾体も包含している。一般に、非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体由来の最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は基本的に、レシピエントの超可変領域由来の残基を、所望の抗体特異性、親和性及び性能を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域由来の残基(「ドナー」抗体とも称する)で置換しているヒト免疫グロブリン(「レシピエント」抗体とも称する)である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基に置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能を更に改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は少なくとも1つ、通常2つの可変ドメインの全てを実質的に含むことが知られており、ここでは超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンに対応し、FRの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列の領域である。ヒト化抗体は場合によって、免疫グロブリン定常領域(Fc)、通常ヒト免疫グロブリンの領域の少なくとも一部を含むことも可能である。詳細については、Jonesら、[27];Riechmannら、[28];及びPresta、[29]を参照されたい。
非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術分野で周知である。本開示に従って生成された抗体のヒト化は基本的に、ヒト抗体の対応する配列にマウスCDR配列を置き換えることによってWinter及び共同研究者の方法に従って行うことが可能である(Jonesら[27];Riechmannら、[28]、及びVerhoeyenら、[30])。
別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載した抗体の抗原結合領域断片又は可変領域断片を含む。好適な抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv断片が挙げられる。抗体断片を生成するために様々な技術が開発されている。従来、これらの断片は無傷の抗体のタンパク質分解性消化を介して誘導されていた。しかし、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接生成することが可能である。以下に説明するように、例えば抗体断片は抗体ファージライブラリーから単離することが可能である。あるいは、Fab’‐SH断片を細菌発現系から直接回収し、化学的に結合し、F(ab’)2断片を形成することが可能である。
1実施形態では、抗原結合領域を有するタンパク質のライブラリをスクリーニングし、本開示に従った治療目的のために修飾できる候補を同定することが可能である。例えば、ファージディスプレイ又は他の抗体ライブラリは、本明細書に記載のDENND1A.V2のC末端ポリペプチドに対してスクリーニングすることが可能であり、DENND1A.V2のC末端特異的結合タンパク質を同定することが可能である。当業者に公知の技術によって、ファージDNA又は抗原結合領域をコードする任意の他のDNAにコードされる軽鎖及び重鎖のCDR配列を決定することが可能である。その後、上述の様にCDR配列を発現ベクターにクローニングし、上記のDENND1A.V2のC末端特異的抗体、又はそのDENND1A.V2のC末端特異的断片を生成することが可能である。従って、実施形態では、上記のDENND1A.V2のC末端特異的抗体、又はそのDENND1A.V2のC末端特異的断片は、ライブラリ内のポリペプチドとは区別されている。1実施形態では、DENND1A.V2のC末端特異的抗体、又はそのDENND1A.V2のC末端特異的断片は、必ずしも限定するものではないがバクテリオファージ被覆タンパク質(単数又は複数)などのファージ/ファージミドタンパク質は含まない。本明細書では、非限定的な例としてラクダのナノボディなどの抗体又は抗原結合断片を生成するための新たな手法が考えられている。
本発明はまた、抗DENND1A.V2抗体をコードする単離核酸、前記核酸を含むベクター及び宿主細胞、ならびに抗体生成のための組換え技術を提供する。単離した核酸は異種プロモーターに操作可能に結合することも可能である。本発明は更に、本明細書に開示したタンパク質/ポリペプチド配列と少なくとも約65、70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%配列相同性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子配列(遺伝子)を含む単離核酸分子及びその補体を提供する。コード化ヌクレオチド配列の例が提供されているが、遺伝子コードが重複しているので他のヌクレオチド配列も同一のタンパク質/ポリペプチドをコードする可能性があることは当業者に認識されている。抗体の組換え体を生成するため、抗体をコードする核酸を単離し、更なるクローニング(例えばDNAの増幅)又は発現のための複製可能なベクターに挿入する。モノクローナル抗体をコードするDNAは従来の手技によって(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって)容易に単離し、配列決定される。例えばpIgG1‐H及びPIgG1‐L等、多くのベクターが当技術分野で利用可能であり、公知である。ベクター成分は一般的に以下の1種以上:シグナル配列、複製起点、1つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター及び転写終結配列:を含むがこれらに限定されるものではない。
ハイブリドーマ細胞はこのようなDNAの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されればDNAは発現ベクターに挿入することも可能であり、その後、抗体タンパク質を他に生成しない大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトし、組換え宿主細胞内にモノクローナル抗体を合成する。発現ベクターの例としては、CMV又はβ‐アクチン作動型プラスミド(すなわち、pcDNA、pCM6、pDRIVE‐β‐act等)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書に記載の抗DENND1A.V2抗体のアミノ酸配列修飾(単数又は複数)を検討する。例えば、抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望ましい場合もある。抗DENNDlA.V2抗体のアミノ酸配列変異体は、抗DENNDlA.V2抗体核酸に適当なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成によって調製する。このような修飾には、例えば抗DENNDlA.V2抗体のアミノ酸配列内の残基における欠失、及び/又は挿入、及び/又は置換が挙げられる。置換は保存的又は非保存的であってもよい。最終構築物を得るために欠失、挿入及び置換を任意に組み合わせ、所望の特徴を有する最終構築物がもたらされる。グリコシル化部位の数又は位置の変化など、アミノ酸を変化させれば、抗DENNDlA.V2抗体の翻訳後プロセシングも変化し得る。一般に、このような変異体のアミノ酸配列は、それらが由来する配列に対して、又は断片ではその配列の連続部分に対して、少なくとも約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一である。
変異誘発の好ましい場所である抗DENNDlA.V2抗体の特定の残基又は領域を同定する有用な方法は「アラニンスキャニング変異誘発」と称する。ここでは、残基、又は標的残基の群を同定し(例えば、Arg、Asp、His、Lys及びGluなどの荷電残基)を同定し、中性又は負の電荷を帯びたアミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)で置換し、アミノ酸とDENND1A抗原との相互作用に影響を与える。その後、置換部位上に、又はその部位に対して更なる変異体又は他の変異体を導入することによって、置換に対する機能的感受性を実証するこれらのアミノ酸位置を改良する。従って、アミノ酸配列変異を導入するための部位は予め決定するが、変異自体の性質は予め決定する必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を分析するためにアラニンスキャニング又はランダム変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現した抗DENNDlA.V2抗体変異体を、所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列の挿入には、1残基〜100残基以上のポリペプチドの長さのアミノ及び/又はカルボキシル末端融合、ならびに単一又は複数アミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、N末端メチオニルを有する抗DENNDlA.V2抗体が挙げられる。抗DENNDlA.V2抗体分子の他の挿入変異には、抗体の血清半減期を増加させる酵素又はポリペプチドに対する抗DENNDlA.V2抗体のN又はC末端への融合が挙げられる。
別のタイプの変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基で置換した抗DENNDlA.V2抗体分子中に少なくとも1つのアミノ酸残基を有する。置換変異誘発について最も関心ある部位には超可変領域が挙げられるが、FR変化も考えられる。
抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、(a)例えばシート形態又はらせん形態のような置換領域のポリペプチド骨格の構造、(b)標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、又は(c)側鎖の量、の維持に対するその効果に有意差を示す置換を選択することによって達成される。
抗DENNDlA.V2抗体の適切な形態の維持に関与しないシステイン残基であればいかなる残基も通常、セリンと置換し、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止することがあり得る。例えば、配列番号58のVH内の2つのシステインは以下のようにセリンと置換することが可能である:EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSSAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSIIGTDGDDTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYSAKAEASFDYWGQGTLVTVSS(配列番号:71)。逆に、ジスルフィド結合(単数又は複数)を形成することが可能な残基を抗体に付加し、(抗体がFv断片などの抗体断片である場合は特に)その安定性を改善することがあり得る。
特に好ましいタイプの置換変異体としては、親抗体(例えばヒト化又はヒト抗体)の1つ以上の超可変領域残基の置換​​が挙げられる。一般的に、更なる開発のために選択されて得られた変異体(単数又は複数)は、それらが生成される親抗体と比較して改善された生物学的特性を有している。このような置換変異体を生成するための利便性のある方法には、ファージディスプレイを利用する親和性成熟が含まれる。すなわち、いくつかの超可変領域部位(例えば6〜7部位)を変異させ、各部位で全ての可能なアミノ酸置換を生じさせる。ファージディスプレイ変異体はその後、生物学的活性(例えば、結合親和性、細胞機能に対する適当な効果)についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するため、アラニンスキャニング変異誘発を行い、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することが可能となる。あるいは、又はそれに加えて、抗体とヒトDENND1A.V2との間の接触点を同定するために抗原‐抗体複合体の結晶構造を分析することが有益である場合もある。このような接触残基及び隣接残基が本明細書で詳述する技術に従った置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルを本明細書に記載したスクリーニングに供し、1つ以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体を更なる開発のために選択することも可能である。別のタイプ抗体のアミノ酸変異体は、グリコシル化可能な1つ以上の残基の欠失を意味する「改変」によって、典型的にグリコシル化される1つ以上の残基もしくはグリコシル化に感受性の無い残基の置換によって、及び/又はグリコシル化部位である1つ以上のアミノ酸の添加によって、抗体の元のグリコシル化パターンを改変する。例えば、N結合型グリコシル化モチーフは、以下のように配列番号58のVHに添加することが可能である:
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSSAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSIIGTDGDDTNYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYSAKAEASFDYWGQGTLVTVSS(配列番号:72)。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSSAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSIIGTDGDDTNYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYSAKAEASFDYWGQGTLVTVSS(配列番号:72)。
本発明の実施形態は、DENND1A.V2関連障害の治療に関する。用語「治療」は、治療的処置及び予防又は防止的手段の両方を意味する。治療を必要とする対象には、障害をすでに持つ被験体、障害が予防されるべき被験体も含まれる。従って本明細書で治療対象となる哺乳動物は、障害を有すると診断されている場合、あるいは障害に対してその素因又は感受性を有している(例えば遺伝的素因)場合があり得る。
治療目的の用語「哺乳動物」は、ヒト、ならびにイヌ、ウマ、ネコ、ウシ等の飼育動物及び家畜、動物園の動物、競技動物又はペットを含む哺乳動物に分類される全ての動物を意味する。当該哺乳動物はヒトであることが好ましい。
いくつかの実施形態では、本発明の抗体及び/又は抗原結合断片は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、安定剤等の成分を含むことが可能な医薬製剤の形態で提供される。抗体及び/又は抗原結合断片はDENND1A.V2のmRNA又はタンパク質の発現と相関する障害を治療するために他の薬物又は療法と組み合わせてもよい。例えば、ホルモン療法と組み合わせるPCOSの治療にDENND1A.V2に対するモノクローナル抗体を投与してもよい。
PCOS、PCOSに関連するII型糖尿病、ならびに過剰なステロイド生合成を招くDENND1A.V2の発現の直接的結果である女性及び男性の他の障害は、DENND1A.V2のmRNA又はタンパク質の発現と確実に相関している疾患又は障害の例である。罹患する組織には:卵巣、血管平滑筋、骨格筋、脂肪組織及び子宮内膜が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
用語「治療有効量」は、被検体における疾患又は障害を治療するのに有効とする薬剤又は医薬組成物の量を意味する。PCOS又は他のDENND1A.V2関連障害の場合、治療的有効量の抗体は、その障害に関連する1つ以上の症状をある程度は低減及び/又は予防することも可能である。例えば、本明細書の記載どおりに治療した被験者から得た生体試料(例えば血液試料)中の測定可能なテストステロン(総テストステロン及び遊離テストステロン)、アンドロステンジオン及びデヒドロエピアンドロステロン硫酸塩(DHEAS)の量は、例えば少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80又は90%以上減少させることが可能であり;及び/あるいは他の症状を改善することも可能であり、例えば、排卵周期は回復し、複数の卵胞嚢胞が消失するなど卵巣の形態は正常化し、高インスリン血症及びインスリン抵抗性が軽減し得る。
更なる実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は任意の好適な手段で投与してもよく、当該手段には皮下、非経口、膣内、腹腔内、肺内及び鼻腔内投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。非経口注射には、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、リンパ内又は皮下投与が挙げられる。また、モノクローナル抗体及び/又はその抗原結合断片は、例えば減量しながらパルス注入によって投与してもよい。経口投与の方法も検討されている。徐放製剤はペグ化などの修飾と併用して、医薬組成物の半減期を延長してもよい。
疾患の予防又は治療では、抗体の適切な用量は、治療する疾患の種類、疾患の重症度及び経過、抗体投与が予防目的であるか治療目的であるか、又はその両方であるか、治療歴、患者の既往歴及び抗体への反応性、ならびに主治医の裁量に依存する。抗体は一度で、又は一連の処置に渡って適切に患者に投与する。疾患の種類及び重症度によって、例えば1回以上の分割投与又は連続的注入のいずれかで、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば0.1〜20mg/kg)の抗体が患者に対する初回の投与量の候補である。典型的な1日用量は、上述の要因に依存して約1μg/kg〜100mg/kg以上の範囲である。数日以上にわたる反復投与では、症状に依存して、疾患症状の目的の抑制が生じるまで治療を続ける。抗体の好ましい用量は約0.5mg/kg〜約10mg/kgの範囲である。従って、約0.5mg/kg、2mg/kg、4mg/kg又は10mg/kg(又はこれらの任意の組み合わせ)のうちの1つ以上の用量を患者に投与してもよい。このような用量は例えば、毎週又は3週間毎に間欠的に投与してもよい。初回の高めの負荷投与量の後は、低用量を1回、又はそれ以上投与する。投与計画の例としては、約4mg/kgの初回負荷投与量の後、毎週約2mg/kgの抗DENND1A.V2抗体量を維持する。しかし他の投薬計画も有用である。この治療の進行は従来の技術及び検定によって容易に観察される。患者への抗体タンパク質投与の他に、本出願は遺伝子治療による抗体投与も検討している。抗体をコードする核酸のこのような投与は「治療的有効量の抗体を投与する」という表現に包含されている。
本発明の実施形態は、抗体及びその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドから成る発現ベクター、細胞が前記発現ベクターを含んで抗体又はその抗原結合断片を発現するインビトロ細胞培養、ならびに抗体及びその抗原結合断片を作製するためのこのような発現ベクター及び細胞培養を利用する方法を包含する。他の実施形態は、DENND1A.V2の発現と確実に相関している障害を治療するためのRNAi、shRNA又は他のヌクレオチドを含有する組成物を包含する。
核酸(場合によってはベクター内に含有されている)を患者の細胞に送達するために、インビボ及びエクスビボの2つの主要な手法がある。インビボ送達では、核酸は患者に、例えば血流に、又は抗体を必要とする部位に直接注射する。エクスビボ治療では、患者の細胞を取り出し、前記単離した細胞に核酸を導入し、修飾した細胞を患者に直接投与するか、又は例えば多孔性膜内にカプセル封入して患者に再移植する。生細胞への核酸の導入に利用可能な技術は多様に存在する。核酸をインビトロで培養細胞に移入するか、又はインビボで目的の宿主細胞に移入するかによって技術は多様に変化する。インビトロでの核酸の哺乳動物細胞への移入に適した技術には、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE‐デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等が挙げられる。遺伝子のエクスビボ送達のために一般的に使用されるベクターはレトロウイルスである。
インビボの核酸移入技術の例には、ウイルスベクター(アデノウイルス、単純ヘルペスI型ウイルス、又はアデノ随伴ウイルスなど)でのトランスフェクション、及び脂質ベース系(遺伝子の脂質媒介移入の有用な脂質は例えばDOTMA、DOPE及びDC‐Choiである)が挙げられる。いくつかの状況では、標的細胞を標的とする薬剤、例えば標的細胞の細胞表面膜タンパク質、標的細胞上の受容体のリガンド等に特異的な抗体などと共に核酸源を提供することが望ましい。リポソームを使用する場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を使用して;例えば特定の細胞タイプに指向性を持つキャプシドタンパク質又はその断片、周期中に内部移行するタンパク質の抗体、及び細胞内局在を標的として細胞内半減期を促進するタンパク質;を標的にし、ならびに/あるいはこれらの取り込みを容易にすることが可能となる。
いくつかの実施形態では、標的細胞は莢膜細胞であり、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片を莢膜細胞に接触させると、莢膜細胞内のアンドロゲン及び/又はプロゲステロン生合成が減少し、ならびに/あるいは細胞内でCYP17A1及び/又はCYP11A1遺伝子発現、ならびにCYP17及びCYP11A1のmRNA及び/又はタンパク質が減少する。これらの減少によって、CYP17A1及び/又はCYP11A1遺伝子調節ならびにCYP17及び/又はCYP11A1のmRNA及び/又はタンパク質の過剰発現;例えば過剰アンドロゲン生成に関連する症状が軽減又は予防される。軽減又は解消される可能性のある過剰アンドロゲン生成の症状の例としては:高アンドロゲン血症に伴う無排卵、多毛症、卵巣形態、不妊が挙げられるが、これらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体又は抗原結合断片は、PCOSに伴う他の表現型、例えば、異常なインスリンシグナル伝達、脂肪、骨格筋及び子宮内膜組織におけるインスリン抵抗性、顆粒膜細胞内の異常なFSHシグナル伝達、及びこれらの複合的症状を抑制又は予防する。
本発明の実施形態はまた、対照細胞と比較してDENND1A.V2発現が増加している細胞内で細胞表面受容体によってシグナル伝達を変化させる方法も提供する。当該方法は、このような細胞を本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片に接触させる工程を含み、この工程では、抗体又は抗原結合断片はDENND1A.V2タンパク質を特異的に認識するとともに、DENND1A.V1タンパク質を特異的に認識しない。
本明細書に記載した障害の治療に有用な材料を含む製造物品も提供する。本製造物品は、容器、及び容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器としては例えば、ボトル、バイアル、注射器等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成できる。容器は症状の治療に効果的な組成物を保持し、滅菌アクセスポート(例えば、容器は静脈注射用液バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有するバイアルであってもよい)を備えてもよい。組成物中の少なくとも1種の活性剤は、本明細書に記載の抗DENND1A.V2抗体又は抗体断片である。ラベル又は添付文書は、適応症を治療するために組成物を使用することを指示し、組成物を使用するための指針を提供する場合もある。
抗DENND1A.V2抗体は、DENND1A.V2タンパク質の診断アッセイ、例えば特定の細胞、組織又は血清中のその発現の検出に有用である。本発明の態様は、被験者のDENND1A.V2のmRNA及び/又はタンパク質の発現と確実に相関する障害を診断する方法を提供するものであり、当該方法は、前記被験者から得た生体試料を、配列番号53、58、59、62、63又は65のアミノ酸配列を含む1種以上の抗体に接触させる工程、及び検出したDENND1A.V2の量を基準陰性対照と比較する工程を含む。障害はPCOSであってもよい。基準値は、罹患していない健康かつ正常な患者から得た試料から取得してもよい。測定値が正常基準値より高い場合、被験者は罹患していると判断し、また測定値が正常基準値と同等か又はそれより低い場合、被験者は罹患していないと判断することが可能である。特定の実施形態では、基準と比較して、試料中のDENND1A変異体2のmRNAでは少なくとも1.5倍、DENND1A変異体2のタンパク質では2〜3倍統計学的に有意な増加が測定されることは、PCOSの診断又はPCOS診断の支援となる。特定の実施形態では、基準に対するその増加は少なくとも2.0、3.0又は4.0倍であり、この数値は包括的なものであり、小数点第1位までのこれらの間にある数値も含まれる。基準値は、既に疾患又は障害と診断された患者から得た陽性対照の数値であってもよい。この場合、測定値が陽性基準値と同等か又はそれより高いと、被験者は罹患していると判断することが可能である。測定値が、例えば少なくとも統計的に有意な1.5倍の減少と、低い場合、被験者は罹患していないと結論付けることが可能である。いくつかの実施形態では、診断には陽性及び陰性両方の基準値を使用している。被験者が罹患していると判断されれば、本明細書に記載の治療工程又は方法を継続することが可能である。
生体試料の例としては、尿、血液、血漿、血清及び唾液が挙げられるがこれらに限定されるものではない。いくつかの実施形態では、生体試料は、卵巣、子宮内膜、脂肪組織又は骨格筋の生検あるいは外科的標本である。診断用途では、通常、抗体は検出可能な部分で標識する。多数の標識が利用可能であり、当技術分野で公知である(例えば、様々な蛍光又は比色タグ)。本発明の別の実施形態では、抗DENND1A.V2抗体は標識する必要がなく、その存在はDENND1A.V2抗体に結合する標識抗体を用いて検出することが可能である。本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接及び間接的サンドイッチアッセイならびに免疫沈降アッセイなどの任意の公知のアッセイ法で使用することが可能である。
DENND1A変異体2のmRNAが検出されれば、このことは当該技術分野で公知の様々な技術によって達成される可能性もある。DENND1A変異体2のmRNAの存否を判定するか、又はそれを定量するのに適した技術には;DENND1A変異体2のmRNAに対するプローブもしくはプライマーのハイブリダイゼーション、又は、種々のチップ技術を利用するポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドアレイ、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。したがって、様々な実施形態では、DENND1A変異体2のmRNA又はそのDNA等価物に対するプローブは固体支持体上に配列及び/又は固定することが可能である。
DENND1A変異体2のmRNAは直接的に試験してもよく、あるいは例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)や定量的リアルタイム(qRT‐PCR)PCR分析などのリアルタイム(RT)PCR、又は他のインビトロ増幅法の利用によってインビトロで酵素的に増幅してもよい。増幅反応では、プライマーは、DENND1A変異体2のmRNAにハイブリダイズし、DENND1A変異体2との複合体を形成するように設計し、核酸増幅生成物(すなわちアンプリコン)を得るために使用することが可能である。本発明の方法の様々な実施形態を実行するために当業者は、好適なプライマーを設計し、増幅及び/又はハイブリダイゼーション反応を実行する方法を理解するであろう。一般的に、プライマーは増幅反応に有用であるよう十分な長さを有する必要があり、また一般的に、長さが少なくとも12塩基であるプライマーはこのような目的に適していると考えられる;しかし、8塩基もの短いプライマーも反応条件によっては使用することが可能である。DENND1A変異体2のRNAを検出するために使用するプライマー/プローブは、リアルタイム(RT)‐PCRなどの反応で使用するためのリポーター色素形態の蛍光体及び/又は消光部分などの1種以上の検出可能標識と共役させるなど、修飾部分を含むことが可能であり、このことはRNAから増幅したDNAの定量を可能にし、定量は経時的に増幅と同時に行うことが可能となる。1実施形態において、増幅反応にはDENND1A変異体2のmRNAに特異的な少なくとも1つのポリヌクレオチドプローブが用いられ、当該プローブでは一方の末端ヌクレオチドは蛍光タグを含むように修飾され、他方の末端ヌクレオチドは蛍光タグから蛍光を消す部分を含むように修飾されている。例えばqRT‐PCRにおける使用ではこのようなプローブは、2つのRT‐PCRプライマーがハイブリダイズする配列の間に存在してその配列に重ならないDENND1A変異体2部分又はその相補体に特異的に結合するよう設計可能である。この設計を利用し、増幅中にポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を介してプローブが分解されるまで蛍光タグからのシグナルを消光させ、この時点で、蛍光ヌクレオチドを消光部分から分離し、そのシグナルは検出可能となる。
必要であれば、DENND1A変異体2のmRNA及び/又はタンパク質の測定値を基準値と比較することが可能である。個体から得られた変異体2のmRNA及び/又はタンパク質レベルと比較できる基準値が好適な基準値となり得る。この例としては、PCOSなどの診断が求められる特定の状態にない個体から得られる試料が挙げられるが、これに限定されるものではない。このような基準値には、対応対象(例えば、年齢、性別又は他の人口統計について対応させている)、標準化曲線(単数又は複数)、及び/又は質量、モル濃度、濃度等の、試料から得たDENND1A変異体2の定性又は定量的測定値の実験データを標準化するために使用する公知のRNA又はタンパク質インプット量などの実験的に設計された対照値が挙げられる。基準レベルはまた、グラフ上の面積として図示してもよい。特定の実施形態では、試料中の変異体2のmRNA及び/又はタンパク質が基準を上回る量で測定されたということは、PCOSと診断されたということであり、言い換えれば医師によるPCOSの診断を支援したことになる。特定の実施形態では、基準はPCOS莢膜細胞と比較する正常莢膜細胞である。別の実施形態では、基準はPCOSに罹患していない個人から得たエキソソームを含む試料である。
本発明の例示的な実施形態を更に詳細に説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、当然ながら多様に変更可能であることは理解すべきである。また、本発明の範囲は添付の請求項でのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は特定の実施形態のみを説明することを目的とし、限定することを意図していないことも理解すべきである。
数値の範囲が提供されている場合、特段明確に指示の無い限り、前記範囲の上限及び下限の間にあって下限の単位の10分の1までの各介在数値、及び他の所定の数値又はその所定の範囲の中にある介在数値は本発明に包含されることは理解されているものとする。所定の範囲で限界値が特異的に除外されることを仮定して、これらの比較的狭い範囲の上限及び下限はそれぞれ更に狭い範囲に納めることも可能であり、また本発明に包含もされる。所定の範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、これらの包含される限界値の一方又は両方を排除する範囲もまた本発明に包含される。
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料も本発明の実施又は試験において使用することが可能であるが、代表的な例示的方法及び材料を以下に記載する。
各個別の刊行物又は特許が具体的かつ個別に参照により援用されていることが示すように、本明細書で引用した全ての刊行物及び特許は参照により本明細書に援用され、また、刊行物が引用されている事柄に関する方法及び/又は材料を開示及び説明するために参照により本明細書に援用される。あらゆる刊行物の引用は出願日前にそれが開示されていることを示すためであり、先行発明によるこのような刊行物に本発明が先行する権利はないという承認であると解釈すべきではない。更に、示された刊行物の日付は、実際の公開日とは異なっており、個別に確認する必要がある場合もある。
なお、本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されているように、単数形は、「a」、「an」及び「the」は、文脈上特段の指示が無い限り、複数の対象を含むことを留意されたい。更に、特許請求の範囲は任意の要素を除外するように起草してもよいことを留意されたい。このように、この記述は、請求項の要素の詳述又は「消極的な」限定の使用に関連する「単に」、「のみ」等の排他的用語を使用するための事前説明として役立つように意図している。
本開示を読めば当業者に明らかな通り、本明細書に記載及び説明された個々の実施形態の各々はそれぞれの成分及び特徴を有し、これらは、本発明の範囲又は精神から逸脱することなく、任意の他のいくつかの実施形態の特長から容易に分離するか、又はそれらと組み合わせることが可能である。引用された方法はどれも、引用されたイベントの順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実施することが可能である。
以下の実施例によって本発明を更に説明する。しかしこれらの実施例及び図面はいかなる場合でも、本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
実施例1.PCOS莢膜表現型を生成するDENND1A.V2発現
材料及び方法
実施例1.PCOS莢膜表現型を生成するDENND1A.V2発現
材料及び方法
正常及びPCOS莢膜細胞。ペンシルベニア州立大学医学部の治験審査委員会に承認されたプロトコルの下でインフォームドコンセントを行った後、子宮摘出術を受けた女性の卵胞からヒト内莢膜組織を得た。先行文献に記載の通り[31]、個々の卵胞を卵巣支質から切除し、0.05%のコラゲナーゼI、0.05%のコラゲナーゼIA及び0.01%のデオキシリボヌクレアーゼと共に、10%ウシ胎児血清(FBS)を含む培地中に分散させた。正常及びPCOS被験者の比較的小さい卵胞由来莢膜細胞を比較できるように、単離した卵胞の中から直径3〜5mmのものをサイズ選択した。莢膜細胞は、先行文献に記載された増殖培地(5%のFBS、5%のウマ血清(HS)、2%のUltroSer G(商標)、20nMのインスリン、20nMのセレン、1μMのビタミンE及び抗生物質を含む、ダルベッコイーグル培地(DME)とHams F‐12培地との1:1混合物)を使用しているフィブロネクチンを被覆した皿上で培養した。血清及び成長因子は以下の供給源:FBS及びDME/F12(Irvine Scientific(登録商標)、Irvine社、カリフォルニア州);ウマ血清(Life Technologies社、Grand Island、ニューヨーク州);UltroSer G(商標)(Reactifs IBF社、Villeneuve‐la‐Garenne、フランス)から取得し;他の化合物はSigma(登録商標)(セントルイス、ミズーリ州)から入手した。酸化的損傷を防止するため、酸素分圧を低下させ(5%のO2、90%のN2及び5%のCO2)、酸化防止剤(ビタミンE及びセレン)を補って細胞を培養した。
これらの研究で使用された莢膜細胞培養物は先行技術で記載され、機能的に特徴付けされている[15、17、32]。PCOS莢膜と正常莢膜との比較実験は、適合した年齢の被験者の適合したサイズの卵胞から単離した第4継代(31〜38細胞数倍加)莢膜細胞を使用して行った。上記の培地中、第2継代細胞の凍結ストックから増殖させた第4継代細胞を使用すると、同一の患者集団から複数の実験が行えるようになった。全ての研究で、少なくとも5人の独立した正常患者及び5人の独立したPCOS患者から得た莢膜細胞培養物を試験した。全ての正常及びPCOS細胞の継代条件及び分割比は同一であった。
PCOS及び正常卵巣組織は38〜40歳の年齢が適合した女性から得た。PCOSの診断はNIHコンセンサスガイドライン[10]に従って行った。これには高アンドロゲン血症、乏排卵症、多嚢胞性卵巣が含まれており、21‐ヒドロキシラーゼ欠損症、クッシング症候群及び高プロラクチン血症は含まれていない。先行技術で記載しているように[15、33]、試験したPCOS莢膜細胞標本は全て、年間6回未満の月経の女性、及び血清中総テストステロン又は生物学上利用可能なテストステロンレベルが上昇している女性の卵巣から得た。PCOS卵巣の各々には直径10mm未満の複数の皮質下卵胞が含まれていた。対照(正常)莢膜細胞標本は、正常な月経履歴として21〜35日の月経周期を有し、高アンドロゲン症の臨床兆候の無い生殖可能な女性の卵巣から取得した。PCOS被験者も正常被験者も手術時にホルモン剤を投与されていなかった。手術の適応症は機能障害性子宮出血、子宮内膜癌及び/又は骨盤痛であった。
ウエスタンブロット分析。第4継代の正常及びPCOS莢膜細胞を半コンフルエント状態になるまで培養し、無血清培地に移し、フォルスコリン存在下及び非存在下で24時間置いた。処置後に莢膜細胞を、1mMのオルトバナジウム酸ナトリウム、0.1mMのフッ化フェニルメチルスルホニル、1mMのジチオスレイトール、0.2mMのベンズアミジン、1μMのミクロシスチン、1μg/mlのロイペプチン及び1μg/mlのペプスタチンAを含む氷冷した改変RIPA緩衝液(30mMのトリス、150mMのNaCl、50mMのNaF、0.5mMのEDTA、0.5%のデオキシコール酸、1.0%のノニデットP‐40、0.1%のSDS)に回収した。タンパク質濃度は、BCAタンパク質アッセイ(Pierce社、ロックフォード、イリノイ州、米国)を用いて測定した。10%のSDS‐PAGEで全細胞溶解物(35μg/In)を分離し、PVDF膜に移し、先行技術で記載しているように[32][34]、ウエスタン分析を実施した。
DENND1A.V2の免疫組織化学的局在。DENND1Aの免疫組織化学的分析は、DENND1A.V2に特異的であることが見出されたSigma社のDENND1A抗体を使用し、Ventana Discovery XT Stainer(Ventana Medical Systems社、トゥーソン、アリゾナ州)によって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織の厚さ4〜5μmの切片上で実施した。染色プロトコルは簡単に、1:300希釈した一次抗体中での30分間のインキュベーション、その後のVentana OmniMap DAB抗ウサギ検出キット(Ventana Medical Systems社、トゥーソン、アリゾナ州)での検出及び可視化から構成されている。副腎皮質のFFPE試料を陽性組織対照として使用した[34]。DENND1A.V2免疫組織化学のカラー画像は、McAllisterらによって公開されている[34]。
定量的DENND1A.V1、DENND1A.V2、CYP17A1及びCYP11A1の1工程超高速qRT‐PCR。DENND1A.V1及びV2、CYP17A1ならびにCYP11A1のmRNA量の定量は、50〜100ngの総RNA/チューブ及び200nMの終濃度のフォワード及びリバースプライマーならびに100nMのプローブを使用し、Single Step Brilliant(商標)III Ultra Fast qRT‐PCR Reagents(Agilent社)によって測定した。使用した特定のプライマー及びプローブ配列は以下に詳細に提供する。「ZEN」部分は、例示的なの位置にあるプローブとして示されているが、必要であればプローブ内の他の位置に配置することも可能である。遺伝子特異的な1工程PCRは、Mx3000pThermocyclerシステム(ストラタジーン社)で、この装置の取扱説明書に従って、各mRNA試料及び一連の希釈物について二重に実施した。莢膜RNAテンプレートの任意の数値は各連続的希釈物(すなわち、1000、300、100、30、10、3、1、0.3、0.1ng)に割り当て、Ct値(y軸=Ct、x軸=数値、対数スケール)に対してプロットし、標準曲線を作成した。標準曲線の傾き及びy切片に基づいて、各未知数値を任意の数値に割り当てた。各反応の標準化にTBP値を使用するために、TATAボックス結合タンパク質(TBP)に対して同じプロセスを実施した。各未知数値の平均目標値を、各未知数値の平均TBP値で割り、各試料の目標の基準値を求めた[34]。
プライマー及びプローブのセット
DENND1A変異体2に特異的なmRNAプライマー及びプローブのセット[25]は、3’UTR、フォワードプライマー(5’GGGCTGACTTCGGAGTGTGT3’)(配列番号34)、リバースプライマー(5’GGGCTGACTTCGGAGTGTGT3’)(配列番号35)、プローブ(5’/56‐FAM/CCAAAGAGC/ZEN/CGGTGTCTGATAATCCCA/3iA3AbkFQ/‐3’)(配列番号36)に特異的である。
第2の確認用DENND1A変異体2に特異的なmRNAプライマー及びプローブのセットは、33aa3’CDSフォワードプライマー(5’TCCACATGTTGTTAAGAGACCAAAG3’)(配列番号37)、リバースプライマー(5’CCGCAAAATGGGTAATGCTT3’)(配列番号38)、プローブ(5’/56‐FAM/AGCCCTGAG/ZEN/CAAAACACCATTGCAA/3iA3AbkFQ/‐3’)(配列番号39)に特異的である。
DENND1A変異体1に特異的なmRNAプライマー及びプローブのセット、フォワードプライマー(5’GGATTCATTTCCATAAACCAAGTTAAAG3’)(配列番号40)、リバースプライマー(5’CACAATTTCCTGCGTGTCTCA3’)(配列番号41)、プローブ(5’/56‐FAM/ATGGCCCGA/ZENCCATTTAAGAAAACAACCA/#IA3BkFQ/‐3)(配列番号42)
CYP17のmRNAプライマー及びプローブのセット、フォワードプライマー(5’‐GGCCTCAAATGGCAACTCTAGA‐3’)(配列番号43)、リバースプライマー(5’‐CTTCTGATCGCCATCCTTGAA‐3’)(配列番号44)、プローブ(5’6‐FAM‐TCGCGTCCAACAACCGTAA GGGTATC‐3’BHQ‐1)(配列番号45)
CYP11A1のmRNAプライマー及びプローブのセット、フォワードプライマー(5’GAGGGAGACGGGCACACA‐3’)(配列番号46)、リバースプライマー(5’‐TGACATAAACCGACTCCACGTT‐3’)(配列番号47)、プローブ(5’6‐FAM‐TCCACCTTCACCATGTCCAGAATTTCCA‐3’BHQ‐1)(配列番号48)
TATAボックス結合タンパク質(TBP)mRNAプライマー及びプローブのセット、標準化のための各cDNA試料についてTBPも測定した。フォワードプライマー(5’‐CACGGCACTGATTTTCAGTTC‐3’)(配列番号49)、リバースプライマー(5’‐TCTTGCTGCCAGTCTGGACT‐3’)(配列番号50)、プローブ(5’JOE‐TGTGCACAGGAGCCAAGAGTGAAGA‐3’BHQ‐1)(配列番号51)。
DENND1A変異体2に特異的なmRNAプライマー及びプローブのセット[25]は、3’UTR、フォワードプライマー(5’GGGCTGACTTCGGAGTGTGT3’)(配列番号34)、リバースプライマー(5’GGGCTGACTTCGGAGTGTGT3’)(配列番号35)、プローブ(5’/56‐FAM/CCAAAGAGC/ZEN/CGGTGTCTGATAATCCCA/3iA3AbkFQ/‐3’)(配列番号36)に特異的である。
第2の確認用DENND1A変異体2に特異的なmRNAプライマー及びプローブのセットは、33aa3’CDSフォワードプライマー(5’TCCACATGTTGTTAAGAGACCAAAG3’)(配列番号37)、リバースプライマー(5’CCGCAAAATGGGTAATGCTT3’)(配列番号38)、プローブ(5’/56‐FAM/AGCCCTGAG/ZEN/CAAAACACCATTGCAA/3iA3AbkFQ/‐3’)(配列番号39)に特異的である。
DENND1A変異体1に特異的なmRNAプライマー及びプローブのセット、フォワードプライマー(5’GGATTCATTTCCATAAACCAAGTTAAAG3’)(配列番号40)、リバースプライマー(5’CACAATTTCCTGCGTGTCTCA3’)(配列番号41)、プローブ(5’/56‐FAM/ATGGCCCGA/ZENCCATTTAAGAAAACAACCA/#IA3BkFQ/‐3)(配列番号42)
CYP17のmRNAプライマー及びプローブのセット、フォワードプライマー(5’‐GGCCTCAAATGGCAACTCTAGA‐3’)(配列番号43)、リバースプライマー(5’‐CTTCTGATCGCCATCCTTGAA‐3’)(配列番号44)、プローブ(5’6‐FAM‐TCGCGTCCAACAACCGTAA GGGTATC‐3’BHQ‐1)(配列番号45)
CYP11A1のmRNAプライマー及びプローブのセット、フォワードプライマー(5’GAGGGAGACGGGCACACA‐3’)(配列番号46)、リバースプライマー(5’‐TGACATAAACCGACTCCACGTT‐3’)(配列番号47)、プローブ(5’6‐FAM‐TCCACCTTCACCATGTCCAGAATTTCCA‐3’BHQ‐1)(配列番号48)
TATAボックス結合タンパク質(TBP)mRNAプライマー及びプローブのセット、標準化のための各cDNA試料についてTBPも測定した。フォワードプライマー(5’‐CACGGCACTGATTTTCAGTTC‐3’)(配列番号49)、リバースプライマー(5’‐TCTTGCTGCCAGTCTGGACT‐3’)(配列番号50)、プローブ(5’JOE‐TGTGCACAGGAGCCAAGAGTGAAGA‐3’BHQ‐1)(配列番号51)。
ステロイド生合成の定量。 デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)、17‐ヒドロキシプロゲステロン(17OHP4)、テストステロン(T)及びプロゲステロン(P4)のELISAは、有機溶媒抽出せずに、DRG International社(スプリングフィールド、ニュージャージー州)製のキットを使用してメーカープロトコルに記載されているように実施し、細胞数によって標準化した。
エキソソームRNA抽出及び精製。ペンシルベニア州立大学医学部の治験審査委員会に承認されたプロトコルの下でインフォームドコンセントを行った後、正常及びPCOS莢膜細胞について上述した同一の臨床基準を利用して正常女性及びPCOSの女性から日中の尿試料を得た。尿試料を回収し、処置まで4℃で静置した後、15mLチューブに分注し、Sorvall Super T21 Table Top Centrifugeのスイングバケット中、300g、4℃で10分間遠心分離し、微粒子状物質を除去した。その後、上清を2000g、4℃で10分間連続的に遠心分離し、細胞残屑を取り除き、上清を17×100mm培養チューブに移し、フロア型Beckman Coulter Avanti(登録商標)J‐E遠心分離機を使用して12,000g、4℃で30分間遠心分離した。この最終的な透明上清を−80℃で凍結し、Norgen(登録商標)(Thorold社、カナダ)製の「尿エキソソームRNA単離キット」の改変プロトコルを利用して抽出する。得られたRNAは、Nano‐dropを用いて定量化する。その後、DENND1A.V2のmRNAはqRT‐PCRで定量し、5SのmRNA量を用いて標準化した[34]。
複製欠損アデノウイルス感染。これらの研究のため、DENND1A.V2アデノウイルス(hDENNDlA.V2‐pADenoG)をApplied Biological Materials社(バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州)から入手し、これはDENND1A.V2をコードするpCMV6‐XL4プラスミドからDENND1A.V2をOrigene社(ロックビル、メリーランド州)製のpADenoGにクローニングすることによって構築した[34]。対照としての空のNULL非発現アデノウイルス(pAdenoG Null)もApplied Biological Materials社(バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州)から入手した[35〜37]。これらの組換えアデノウイルスを繁殖し、HEK293Tの単層細胞内で増殖させ、Virabind(商標)Adenovirus Miniprep Kit(Cell Biolabs社、サンディエゴ、カリフォルニア州)を用いて精製し、QuickTiter Adenovirus Titer Elisa Kit(Cell Biolabs社、サンディエゴ、カリフォルニア州)で滴定した。DENND1A.V2及び対照としての空のNULL非発現アデノウイルス(pAdenoG Null)の両方を用いて、先行技術の記載の通りに正常莢膜細胞を感染させた[34][38]。アデノウイルス感染には、第4継代莢膜細胞を75%コンフルエントの状態まで培養する工程、リン酸緩衝生理食塩水で細胞をすすぐ工程、及び通常の治療量の50%の無血清培地中で60分間、細胞上にアデノウイルスを層形成させる工程が含まれる。次いで、示したように、処置する場合としない場合において細胞を無血清培地中で培養した。
正常及びPCOS莢膜細胞の一過性トランスフェクション。正常周期女性及びPCOSの女性から単離したヒト莢膜細胞を先行技術の記載の通りにトランスフェクトした[17、22、39]。トランスフェクションの1時間前に、20mmol/LのHEPES及び2%の熱不活性化ウシ血清(Atlanta Biologicals社、アトランタ、ジョージア州)を含むDME高グルコース培地に細胞を移し、37℃で3%CO2及び95%周囲空気のインキュベーターに移した。リン酸カルシウム沈殿物には2μg/ディッシュのルシフェラーゼプラスミド、及び0.1μg/ディッシュのβ‐ガラクトシダーゼpSVβ‐gal(Promega社、マディソン、ウィスコンシン州)の発現ベクターが含まれ、各30mmウェルに供されている。トランスフェクション後、細胞を15​​%グリセロール/HBSSで、続いてPBSですすぎ、ビヒクル又は10μMのフォルスコリンを含むトランスフェクション培地で48時間処理した。細胞を、トリプシンを用いて回収し、ペレット化し、リポーター溶解緩衝液(Promega社)に再懸濁した。ルシフェラーゼ活性はSirius Luminometer(Zylux社、オークリッジ、テネシー州)で、Luciferase Assay System(Promega社)によって測定した。β‐ガラクトシダーゼ活性は化学発光アッセイGalacto‐Light Plus(商標)(Tropix、ベッドフォード、マサチューセッツ州)で測定し、トランスフェクション効率の標準化のために利用した。本実施例の文脈において特に断らない限り、4人以上の個々の正常対照患者及び4人以上の個々のPCOS患者から単離した莢膜細胞にトランスフェクションを3重に行った。
統計的分析。データを提示し、3重に実施した平均値±SEMとして本実施例に記載している。個々の患者からqRT‐PCR、ステロイド及びトランスフェクション分析の結果を収集し、Prism5.0c(GraphPad Software社、サンディエゴ、カリフォルニア州)を使用してANOVAを実施した。複数の比較のため、Boniferri法によってP値を求め、このとき有意差はANOVAにより示した[34]。
DNA抽出。個々の正常周期の女性(n=6)及びPCOS女性(n=6)から単離して増殖させた莢膜細胞培養物からDNAを抽出した。凍結莢膜細胞培養プレートを−80℃から戻し、1Mのトリス‐HCl pH8.0(Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州)を0.10μL、0.5MのEDTA pH8.0(Promega社、マディソン、ウィスコンシン州)を0.10μL、10%SDS(Fisher Biotech社、フェアローン、ニュージャージー州)を0.02μL、5MのNaCl(Promega社、マディソン、ウィスコンシン州)を0.04μL、10mg/mLのプロテイナーゼK(Life Technologies(商標)社、カールスバッド、カリフォルニア州)を0.01μL、及び水を0.82mL含む1mLの溶菌液を各プレートに添加した[34]。溶液中、プレートから細胞を掻き取り回収した。細胞を含む溶菌液を1.5mLのマイクロ遠心チューブに移し、これをチューブローテーター中、55℃で一晩インキュベートした。試料を12,000rpm、室温で5分間遠心分離した。約400μLの試料を、500μLのイソプロピルアルコールを含む1.5mLマイクロ遠心チューブに移し、数回上下転倒した後、DNAを沈殿させた。DNAを70%エタノールで2回洗浄し、1XのTris‐EDTA pH7.4(Fisher BiorReagents社、フェアローン、ニュージャージー州)を400μL含むマイクロ遠心チューブに移した。チューブをチューブローテーター中、55℃で2時間インキュベートし、DNAを溶液に溶解した[34]。
全エキソーム配列決定。DNA試料は、BGI Americas社(ケンブリッジ、マサチューセッツ州)と共同のIllumina HiSeq 2000シーケンシングを備えたAgilent SureSelect 51Mキャプチャーキットを用いて、100Xカバレッジで1億リード数の全エキソーム配列決定に供した。
エキソーム配列分析。読み取られた配列はBGIの参照ゲノム(ヒトhg19)に整合させた[34]。変異体呼び出し及びデータ作成のまとめはBGIに従って行った。データの視覚化及び呼び出された変異体の同定はIGV(Integrative Genomic Viewer)ソフトウェアを用いて行った[40]。更に分析するため、正常及びPCOS莢膜細胞試料から、マイナーアレルに関する支持体数が15未満(独自にマッピングした塩基の数)である変異体のみを選択した。DENND1AにおけるSNPを同定し、それらのマイナーアレル出現頻度を計算した。データを表1に示す[34]。
表1は、個々の正常周期女性(n=6)及びPCOSの女性(n=6)から抽出したDNAの全エキソーム配列分析によって同定したDENND1A変異体を示す:表には、以前にdbSNPでリストされ、同定されたSNPのrs識別番号に付随した変異体、染色体の位置、遺伝子変異体の位置/機能、ヒト参照ゲノムHg19の参照アレルがリストされている。本発明者らの試料一式(6つの正常試料、6つのPCOS試料)におけるSNPのマイナーアレル出現頻度を計算し、存在する場合は、欧州‐米国人口におけるアレル出現頻度と比較した[34]。
表1:個々の正常周期女性及びPCOS女性から抽出したDNAの全エキソーム配列分析によって同定したDENND1A変異体
表1:個々の正常周期女性及びPCOS女性から抽出したDNAの全エキソーム配列分析によって同定したDENND1A変異体
エキソームのデータ比較。 本発明者らのウエスタン分析によって同定されたDENND1A変異体のマイナーアレル出現頻度は、オンラインデータベース ― Exome 6500を用いて、集団におけるこれら変異体のアレル出現頻度と比較した[34]。本研究の莢膜細胞試料は西欧系の患者から抽出したので、欧州‐米国人口における出現頻度と比較した[34]。
結果
結果
DENND1A.V2タンパク質発現はPCOS莢膜細胞で増加する。DENND1Aの代替的にスプライシングされた形態が正常及びPCOS莢膜細胞で示差的に発現されているか否かを調べるため[34]、半コンフルエント状態になるまで培養し、無血清培地に移し、20μMのフォルスコリンの存在下及び非存在下で24時間処理した正常及びPCOS女性由来単離莢膜細胞から得た全細胞抽出物についてウエスタンブロット分析を行った。中間N末端DENND1A抗体(Sigma)を利用し、本発明者らはDENND1A.V1に対応する約112kDのバンド、及びDENND1A.V2に対応する62kDのバンドを予測した。図1Aに示すように、代表的なウエスタンブロット分析から、正常莢膜細胞と比較して、基本条件及びフォルスコリン刺激条件の両方の条件下で処理したPCOS莢膜細胞における62kDのDENND1A.V2の増加が実証された。しかし、112kDのDENND1A.V1はPCOS莢膜細胞内では有意に増加しなかった。図1Bでは、それぞれ5人の正常及びPCOS被検者から単離した莢膜細胞から回収した全細胞溶解物の累積的分析から、対照条件及びフォルスコリン刺激条件下の両方の正常莢膜細胞と比較して、DENND1A.V2タンパク質はPCOS莢膜細胞内で増加することが実証された(*、P<0.01)。フォルスコリン処理は正常又はPCOS莢膜細胞におけるDENND1A.V2タンパク質蓄積に影響を与えるとは思われなかった。対照的に、正常及びPCOSの莢膜細胞におけるDENND1A.V1の累積的分析から、正常細胞においてフォルスコリン処理によってDENND1A.V1タンパク質レベルが増加(*、P<0.01)したことが分かった(図1C)。また、フォルスコリン刺激PCOS莢膜細胞において、DENND1A.V1は正常細胞と比較して有意に減少した。対照条件及びフォルスコリン刺激条件下の両方のPCOS莢膜細胞でDENND1A.V2/V1タンパク質の比率が減少(**、P<0.01)した(図1D)[34]。N末端に特異的なAbcam社の抗体を用いて実施したウエスタン分析で同様の結果が得られ、DENND1Aウエスタンデータのペプチド内配列に対するSigma社の抗体を定量し、正常及びPCOS莢膜細胞において有意差がなく、フォルスコリン処理で調節もされない総mTORによって標準化した。アクチン及びGAPDHは、莢膜細胞内でフォルスコリンによって調節され、正常及びPCOS細胞内で示差的に発現するので、ウエスタンを標準化するために利用できない。
ウエスタン分析はまた、DENND1A.V2に特異的な21アミノ酸ペプチド(QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH)(配列番号6)に対して生成されたウサギポリクローナル抗体の効果を評価するためにも行った。正常及びPCOS女性から単離し、増殖させ、無血清培地中、20μmのフォルスコリンの存在下及び非存在下で24時間処理した莢膜細胞から得た全細胞抽出物を使用してウエスタンブロット分析を行った。図1Eに示すように、代表的なウエスタンブロット分析から、基本条件及びフォルスコリン刺激条件の両方の条件下で処理したPCOS莢膜細胞における62kDのDENND1A.V2の増加が実証された。これらの実験では、タンパク質負荷を総mTORによって標準化した。これらのデータは、N末端DENND1A抗体を用いた図1Aに示した並行したウエスタンブロット分析と一致している。図1Fに示すように、代表的なウエスタンブロット分析から、基本条件及びフォルスコリン刺激条件の両方の条件下で処理したPCOS莢膜細胞における62kDのDENND1A.V2の増加が実証された。図1Fでは、それぞれ4人の正常患者及びPCOS患者から単離した莢膜細胞から採取した全細胞溶解物の累積的分析から、DENND1A.V2タンパク質は対照条件及びフォルスコリン刺激条件の両方の条件下の正常莢膜細胞と比較してPCOS莢膜細胞で優位に増加していることが実証された(*、P<0.01)。フォルスコリン処理が正常又はPCOS莢膜細胞中のDENND1A.V2タンパク質蓄積に影響を与えるとは思われなかった。
DENND1A.V2免疫組織化学染色は卵巣莢膜区分内で増強する。卵巣中のDENND1A.V2の局在を更に検討するため、正常周期及びPCOS患者集団から得た卵巣組織のパラフィン包埋ブロックならびにDENND1A.V2に特異的な抗体を利用した[34]。図2Aに示すように、免疫染色は卵巣の莢膜区分内で際立ち(4X)、正常卵巣内の莢膜細胞と比較してPCOS莢膜中で増加した(10X)。図2Bでは、PCOS莢膜細胞及び顆粒細胞におけるDENND1A.V2染色を示す(40X)。図2Bに示すように(100X、雑誌「Oil」)、主にPCOS莢膜核、細胞質及び細胞膜で染色される[34]。
DENND1A.V2のmRNA量は、正常莢膜細胞と比較してPCOS莢膜細胞で増加し、PCOS莢膜細胞によって増加したアンドロゲン生成と相関する。DENND1A.V2のmRNA量は、20μMのフォルスコリンの存在下及び非存在下で処理した6人の正常患者及び6人のPCOS患者から単離した莢膜細胞において検討し(図3A)、QRT‐PCR分析で定量し、TATAボックス結合タンパク質(TBP)mRNAを用いて標準化した。DENND1A.V2のmRNAは、正常細胞と比較して、基本条件下及びフォルスコリン刺激条件下でPCOS莢膜細胞において有意に増加した。フォルスコリン刺激に応答したDENND1A.V2のmRNA蓄積の有意な増加はなかった。DENND1A.V2のmRNAがアンドロゲン生合成の増加に関連しているか否かを検討するため、本発明者らは、同一条件下で、適合した6つの正常莢膜細胞標本及び6つのPCOS莢膜細胞標本中のDHEA蓄積を調査した。図3Bに示すように、DHEA合成が低度である正常莢膜細胞はDENND1A.V2のmRNAを減少させ、一方で、PCOS莢膜細胞内の基準条件及びフォルスコリン刺激条件下DHEA生成の増加はDENND1A.V2のmRNA量増加と関連している[34]。
尿エキソソームDENND1A.V2のmRNAはPCOS女性で増加する。エキソソームは、血液や尿中に流れ込む核酸豊富な小型の小胞であり、個別化医療及び臨床診断で使用するためのRNAの安定した供給源を提供する。そこで、PCOS莢膜細胞内に増加したDENND1A.V2が、PCOS女性におけるDENND1A.V2のmRNA全身蓄積の増加を反映しているか否かを検討するため、複数の正常周期女性、及び良好に特徴化されたPCOS女性由来の日中尿試料から単離したエキソソームmRNAを調査した。「材料及び方法」に記載のように、正常周期女性及びPCOS女性の日中の尿サンプルから尿エキソソームmRNAを単離し、調製した。図4に示すように、PCOS莢膜細胞でのqRT‐PCRと同様、DENND1A.V2のmRNAは、正常周期女性と比較してPCOSから単離した尿エキソソーム中で有意に増加する[34]。
DENND1A.V2の強制的発現は、正常莢膜細胞のステロイド生成を増加させる。ヒトDENND1A.V2を発現するアデノウイルスを用いて、DENND1A.V2の発現増加によって正常莢膜細胞はアンドロゲン及びプロゲステロン生成増加のPCOS表現型に変換されるという仮説を検証した。これらの実験では、正常莢膜細胞を、0.3、1.0、3.0及び10pfu/細胞の空のアデノウイルス(Null‐pAdenoG)又はDENND1A.V2発現アデノウイルス(hDENND1A.V2‐pADenoG)に感染させ、無血清培地中で20μMのフォルスコリンの存在下又は非存在下で処理した。治療の72時間後、培地中のDHEAを定量した。DENND1A.V2アデノウイルス感染は全ての用量で、対照アデノウイルスと比較してフォルスコリン刺激DHEA生成を有意に増加させた(図5A)。その後の実験では、数人の個々の正常女性のから得た莢膜細胞を3.0pfuの対照アデノウイルス又はDENND1A.V2を発現するアデノウイルスに感染させ、それによるDHEA(図5B)、17OHP4(図5C)、T(図5D)及びP4(図5E)への効果を調べた。DENND1A.V2アデノウイルス感染は、対照アデノウイルスと比較して、基本条件の17OHP4、T、及びP4蓄積を有意に増加させた。また、DENND1A.V2アデノウイルス感染は、対照アデノウイルスと比較してフォルスコリン刺激したDHEA、17OHP4、及びP4を有意に増加させた。これらの実験では、ウエスタン分析によって、DENND1A.V2タンパク質は強制的発現後に増加することが確認された(データは示していない)[34]。従って、通常の莢膜細胞におけるDENND1A.V2の強制的発現によって、細胞はアンドロゲン及びプロゲスチン生合成が増加するPCOS表現型に変換された[15、16、34]。
DENND1A.V2の強制的発現は、正常莢膜細胞内のCYP17A1及びCYP11A1遺伝子発現を増加させる。CYP17及びCYP11A1のmRNA蓄積に対するDENND1A.V2発現の効果を検討するため、第4継代正常莢膜細胞の培養物を、3pfuのDENND1A.V2アデノウイルス又はNullアデノウイルスに感染させ、20μMのフォルスコリンの存在下又は非存在下で16時間処理した。処理後、RNAを回収し、CYP17及びCYP11A1のmRNA量を定量し、TBP量によって標準化した。フォルスコリン刺激条件下での3pfu/細胞のDENND1A.V2感染後、対照アデノウイルスでの感染と比較してCYP17A1のmRNA(図6A)及びCYP11A1のmRNA(図6B)の両方で蓄積が有意に増加した。これらの知見はまた、Origene社(ロックビル、メリーランド州)から入手したDENND1A.V2発現プラスミド(DENND1A.V2/pCMV‐XL4)による正常莢膜細胞のトランスフェクション[34]、ならびにその後のDENND1A.V2レンチウイルス粒子感染を利用して確認した(データは示していない)。
CYP17A1転写に対するDENND1A.V2の効果を検討するため、リン酸カルシウム法によって正常莢膜細胞を、ヒトCYP17A1遺伝子の5’隣接領域の−770/+44を含むpGl3ルシフェラーゼリポータープラスミド(−770 CYP17A1/LUC)でトランスフェクトした[17、22、34]。トランスフェクション後、DENND1A.V2アデノウイルス又は対照アデノウイルスで細胞を1時間かけて感染させ、無血清培地中、20μMフォルスコリンの存在下及び非存在下でアデニル酸シクラーゼの活性化剤で処理した。24時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。トランスフェクションは3重に行い、β‐ガラクトシダーゼによってトランスフェクション効率について標準化した。図6Cから、3pfu/細胞のDENND1A.V2アデノウイルス感染は、対照アデノウイルスと比較して、基本条件及びフォルスコリン刺激条件両方の−770CYP17A1/LUCプロモーター活性を増加させることが分かる[34]。
PCOS莢膜細胞においてCYP11A1発現を増加させる近位CYP11A1プロモーターの−160/−90bp要素を含むCYP11A1のpGl3リポーター構築物(−160/−90 CYP11A1/LUC)を用いて、莢膜細胞におけるCYP11A1転写に対するDENND1A.V2の効果を調査した。DENND1A.V2/pCMV‐XL4の存在下、又はpCMV‐XL4の非存在下において、正常莢膜細胞を−160/−90のCYP11A1/LUCプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後に細胞を回収し、ルシフェラーゼを測定した。図6Dに示すように、DENND1A.V2は、空のプラスミドと比較して、フォルスコリンで刺激した−160/−90 CYP11A1/LUCプロモーター活性を増加させた。これらのデータから、DENND1A.V2発現増大に起因する莢膜細胞ステロイド生成の増加は、CYP17A1及びCYP11A1遺伝子の転写活性化に少なくとも部分的に起因していることが示唆されている[34]。
PCOS莢膜細胞におけるDENND1A.V2のmRNAのノックダウンはCYP17A1及びCYP11A1発現、ならびにアンドロゲン及びプロゲステロン生成を減少させる。CYP17A1及びCYP11A1のmRNAレベルに対する内因性DENND1A.V2のmRNAのノックダウン効果を測定するため、サイレンシングDENND1A.V2shRNAプラスミドをPCOS莢膜細胞にトランスフェクトし、基準条件下及びフォルスコリン刺激条件下のCYP17A1のmRNAをqRT‐PCRによって評価した。これらの実験では、第4継代PCOS莢膜細胞をpRSV‐スクランブルプラスミド又はDENND1A.V2特異的プラスミド(pSV‐shRNA1又はpRSV‐shRNA2)でトランスフェクトした。 トランスフェクションから6時間後、20 μMのフォルスコリンの存在下及び非存在下で細胞を処理し、その24時間後、全RNAを回収し、CYP17A1、CYP11A1及びTBPのmRNA量を測定した。図7Aに示すように、DENND1A.V2のshRNA1及びshRNA2レトロウイルスプラスミドによって、PCOS莢膜細胞における基本条件及びフォルスコリン刺激条件の両方の条件下にあるCYP17A1のmRNA蓄積が有意に阻害された。また、両DENND1A.V2shRNAプラスミドは、PCOS莢膜細胞におけるフォルスコリンで刺激したCYP11A1のmRNA(図7B)も有意に阻害した[34]。これらの実験では、ウエスタン及びqRT‐PCR分析から、DENND1A.V2タンパク質はDENND1AのshRNAトランスフェクション後に有意に減少することが確認された[34]。
DENND1A.V2に特異的なサイレンシングshRNAはPCOS莢膜細胞でCYP17A1プロモーター機能(すなわち転写)を阻害するか否かを評価するため、並行した研究を行った。pGL3中のルシフェラーゼ遺伝子に融合した−235/+44のCYP17A1プロモーターを含むCYP17A1ルシフェラーゼリポータープラスミド(−235のCYP17A1/LUC)でPCOS莢膜細胞をトランスフェクトした。サイレンシングDENND1A.V2のpRV‐shRNA1又はpRV‐shRNA2をコードするスクランブルpRV発現ベクター又はプラスミドもトランスフェクション混合物に添加した。トランスフェクションから6時間後、細胞をPBSですすぎ、20μMのフォルスコリンの存在下及び非存在下、無血清培地中で処理した。24時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。これらの実験の結果から、DENND1A.V2のshRNA1のトランスフェクションは、スクランブルshRNAと比較して、PCOS莢膜細胞内で基本条件及びcAMP依存条件下のCUP17A1リポーター活性を阻害することが示された。PCOS莢膜細胞において基本条件及びフォルスコリン刺激条件下の−235のCYP17A1/LUCプロモーター制御の増加が観察された。図7Cに示すように、−235CYP17A1/LUCとサイレンシングDENND1A.V2shRNA1又はshRNA2とを同時トランスフェクションすることによって、スクランブルshRNAと比較して、PCOS莢膜細胞内のフォルスコリン依存CYP17A1リポーター活性が有意に減少した[34]。
shRNAレンチウイルス粒子によるDENND1A.V2発現のサイレンシングはPCOS莢膜細胞ステロイド生成を阻害する。ステロイド生合成に対するDENND1A.V2のノックダウンの効果を評価するため、Thermo/Dharmacon社製GIPZの特注DENND1A.V2shRNA粒子を利用した。無血清培地中、300,000粒子/ウェルのサイレンシングshRNA DENND1A.V2レンチウイルス又は対照非サイレンシングレンチウイルスでPCOS莢膜細胞を感染させた[34]。6時間後、レンチウイルス混合物を除去し、細胞をフォルスコリン存在下又は非存在下の無血清培地に移し、72時間置いた。サイレンシングshRNA DENND1A.V2のレンチウイルスによる感染によって、フォルスコリン刺激17OHP4(図7D)、DHEA生合成(図7E)及びP4(図7F)が有意に阻害された。DENND1A.V2レンチウイルス感染後の基本条件でのステロイド生成は阻害される傾向にあったが、レンチウイルス感染実験の計画では、基本条件でのステロイド濃度の正確な評価は除外されていた。
ウサギポリクローナル抗DENND1A.V2特異的IgGはPCOS莢膜細胞におけるDHEA分泌及びCYP17A1のmRNAを減少させる。DENND1Aが、細胞外部に付加した抗体に利用できるDENND1Aエピトープを潜在的に形成する細胞膜及びクラスリン被覆ピットに関連していることは公知である。本発明者らは、DENND1A.V2に特異的な21アミノ酸ペプチド(QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH)(配列番号6)に対するウサギポリクローナル抗体を生成した(図1C〜D)。このDENND1A.V2特異的IgGを正常及びPCOS莢膜細胞の培地に添加し、当該IgGを使用してDENND1A.V2機能を遮断又は中和し、それによって正常及びPCOS莢膜細胞内のステロイド生合成を改変できるか否かを判定した。これらの実験では、20μMのフォルスコリンの存在下又は非存在下で、PCOS莢膜細胞を高濃度のDENND1A.V2アイソフォーム特異的IgG又は非特異的IgGで処理した。図8Aに示すように、DENND1A.V2のIgGは、約0.25μg/mLのID50でフォルスコリン刺激下DHEA生合成を有意に阻害する。これとは対照的に、非特異的IgGはDHEA生合成に影響を及ぼさなかった[34]。
様々な個々の患者から得た正常及びPCOS莢膜細胞において、20μMのフォルスコリン存在下及び非存在下での16時間の処理後に、CYP17A1のmRNA(図8B)及びCYP11A1のmRNA(図8C)蓄積に対する0.5μg/mLのウサギポリクローナルDENND1A.V2特異的IgG又は0.5μg/mLの非特異的IgGの効果を検討するため、その後の実験を行った[34]。図8Bのデータから、16時間の処理後、対照条件及びフォルスコリン刺激条件下で、0.5μg/mLのDENND1A.V2特異的IgGはPCOS莢膜細胞内のCYP17A1のmRNA蓄積を有意に阻害することが実証されている。対照的に、正常莢膜細胞では、DENND1A.V2のIgGは基本条件下又はフォルスコリン刺激条件下のCYP17A1のmRNAには影響を及ぼさなかった(図8B)。図8Cに示すように、DENND1A.V2特異的IgGは、PCOS莢膜細胞内のフォルスコリン刺激下CYP11A1のmRNA蓄積も有意に阻害する一方で、正常莢膜細胞内のCYP11A1のmRNA蓄積に対しては影響を及ぼさなかった。
並行した実験では、個々の患者から得た正常及びPCOS莢膜細胞を、0.5μg/mLの親和性精製したウサギポリクローナルDENND1A.V2特異的IgG又は0.5μg/mLの非特異的IgGで処理し、72時間の処理後、基本条件及びフォルスコリン刺激条件下DHEA(図8D)、17OHP4(図8E)及びP4(図8F)の生合成を、1細胞当りで測定した。これらの実験結果から、ウサギポリクローナルDENND1A.V2特異的IgGは、正常莢膜細胞に影響を及ぼすことなく、PCOS莢膜細胞内フォルスコリン刺激DHEA(図8D)及び17OHP4(図8E)を、対照IgGと比較して50%有意に阻害することが示された。
考察
考察
以上から、正常周期女性及びPCOS女性から得て十分に特徴化した莢膜細胞においてDENND1A発現を検討するための最初の研究が本発明者らによって実施されたことは明らかである。DENND1AのmRNAのスプライス変異体であるDENND1A.V2の発現増加はPCOS莢膜細胞の特徴であるという発見から、莢膜細胞機能に関するこの分子の機能的因果関係に関する研究を追及するための基盤がもたらされた[34]。
正常莢膜細胞におけるDENND1A.V2の強制発現はCYP17A1及びCYP11A1遺伝子発現を増加し、細胞を、増強したアンドロゲン及びプロゲスチン生合成のPCOS表現型に変換する。対照的に、PCOS莢膜細胞内のサイレンシングshRNAプラスミド又はレンチウイルスによるDENND1A.V2のノックダウンによって、細胞は、減少したCYP17A1及びCYP11A1遺伝子発現ならびにアンドロゲン及びプロゲスチン生合成の正常表現型に戻る。これらの観察から、DENND1Aはステロイド生成遺伝子の転写を増強させた後にアンドロゲン生成が増加するシグナル伝達カスケードに関与していることが示唆される。
DENND1A.V2は、クラスリン結合ドメインを有してエンドサイトーシスを促進すると考えられるトランケート型connecdenn1である。漢民族のPCOSに関連する遺伝子座のうち[41〜43]、いくつかの遺伝子座はネットワークを定義する可能性のある遺伝子の中に、又はその近傍に位置し、これらには、原形質膜上にある受容体をコードしてクラスリン被覆ピットに内在化されたFSHR、LHCGR及びINSRが挙げられ、ここではDENND1Aタンパク質が配置されている[25、42、44]。DENND1AのDENNドメインはRab特異的グアニンヌクレオチド交換因子として機能する[26]。他のPCOS GWAS候補、Ras関連タンパク質5B(RAB5B)はRab‐GTPアーゼであり、また、エンドサイト―シスや受容体再生に関与していると考えられており、従って、DENNドメインと相互作用する分子であり得る[45、46]。RAB5Bシグナル伝達はまた、PI3K、PKB及びMAPK/ERK成分が関与しているという報告もある[44〜47]。理論に束縛されることなく、トランケート型DENND1A.V2は莢膜及び/又は顆粒膜細胞におけるインスリン又はLH‐受容体代謝回転及び感受性に影響を与え、更に、PCOS女性の卵巣機能及びステロイド生合成に影響を与えることが可能である。DENND1Aはまた、脂質、特にホスホイノシトール‐3‐リン酸、及び他のエンドサイトーシス/エンドソームタンパク質[26]に関連していることが分かっており、インスリン及びLH受容体シグナル伝達に関与している可能性がある。あるいは、DENND1A.V2は、遺伝子発現制御において、より直接的な役割を担っている可能性がある。DENND1A.V2は核に転座することも可能であり、別のGWASとしてRAB5Bによって簡略化し得るプロセスにより、CYP17A1及びCYP11A1遺伝子発現の転写活性化に関与する可能性のあるPCOS候補が発見された[34]。
特異的ウサギポリクローナル、ヒト及びマウスモノクローナル抗DENND1A.V2のIgGを使用し、DENND1A.V2エピトープは細胞外抗体に利用可能であることが本明細書の実施例に示している。PCOS莢膜細胞におけるCYP17A1及びCYP11AのmRNAの増強ならびにアンドロゲン生合成はDENND1A.V2特異的IgGによって低減できるという観察から、DENND1A.V2に対するヒト化モノクローナル抗体などの生物学的薬剤は、PCOSに関連する高アンドロゲン血症、及びインスリン作用に関連する可能性のある他の表現型に有用な治療剤であることが示されている。
これらの知見から、DENND1A遺伝子由来のスプライス変異体(DENND1A.V2)は莢膜細胞ステロイド生成の制御において機能的役割を担っていることが実証されている[34]。DENND1A.V2の過剰発現は、正常莢膜細胞を、CYP17A1及びCYP11A1遺伝子発現の増加ならびにアンドロゲン及びプロゲスチン生成の増強を特徴とするPCOS生化学的表現型に変換するのに十分な量である。DENND1A.V2機能を抑制すると、PCOS莢膜細胞がステロイド生成酵素遺伝子発現及びステロイド生成に関して正常表現型になるよう促進される。PCOSの女性の尿中でDENND1A.V2のmRNAが増加し、DENND1A.V2特異的IgGはPCOS莢膜細胞の生化学的特徴を変換してステロイド生成を減少させるという事実から、PCOSの非侵襲性検出及びPCOSの生物学的療法に対するDENND1A.V2特異的抗体の有用性が示されている[34]。
実施例2.ファージディスプレイライブラリから単離したDENND1A.V2に特異的なヒト化モノクローナル抗体はPCOSの治療に有用である。
材料及び方法
実施例2.ファージディスプレイライブラリから単離したDENND1A.V2に特異的なヒト化モノクローナル抗体はPCOSの治療に有用である。
材料及び方法
ファージディスプレイスクリーニング。DENND1A.V2に特異的な機能的ヒト化mABを得るために、新たに作製されたファージディスプレイScl‐2ライブラリ(Creative Biolabs社、ニューヨーク)をスクリーニングした[48〜54]。抗体及び抗原結合断片はDENND1A.V2タンパク質の固有の33アミノ酸C末端を標的にするよう意図されている。DENND1A変異体1と2との間で固有の33アミノ酸DENND1A.V2配列は:NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号5)である。パニングには、固有の21アミノ酸配列セグメント:QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)を利用した。これは、DENND1A.V2に対する機能的ウサギポリクローナル抗体を得るために以前に使用した配列である(実施例1参照)。
ファージディスプレイに使用した材料
新たに調整したファージディスプレイScl‐2ライブラリ
大腸菌TG1宿主株
M13KO7ヘルパーファージ
プライマー:
L1:5’‐TggAATTgTgAgCggATAACAATT‐3’(配列番号54)
S6:5’‐gTAAATgAATTTTCTgTATgAgg‐3’(配列番号55)
標的:CH22 DENND1A.V2
ウサギ抗M13pAb‐HRP
ファージディスプレイに使用した材料
新たに調整したファージディスプレイScl‐2ライブラリ
大腸菌TG1宿主株
M13KO7ヘルパーファージ
プライマー:
L1:5’‐TggAATTgTgAgCggATAACAATT‐3’(配列番号54)
S6:5’‐gTAAATgAATTTTCTgTATgAgg‐3’(配列番号55)
標的:CH22 DENND1A.V2
ウサギ抗M13pAb‐HRP
初めに、QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)との2種のDENND1A変異体2ペプチド‐タンパク質複合体[KLH‐及びBSA‐複合体]を利用し、ファージディスプレイパニングを行い、ペプチド自体に特異的なバインダーを選択した。ペプチド‐BSA複合体を直接被覆した後、親和性パニング及びQCファージELISAを行った。結果から、非特異的な濃縮効果は認められないことが分かった。
DENND1A.V2特異的ペプチドのビオチン化形態(QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH;配列番号6)を合成し、ストレプトアビジンで事前に被覆したプレートで生物ペプチドを固定することによって表2に記載の通り新規に作成されたファージライブラリを利用し、新たなパニングを実施した。3回目のスクリーニング後に強力な濃縮効果が観察された。トリプシン消化溶出液又は競合溶出液のいずれかから40個のクローンを選択し、ファージ増幅及びファージELISAに供した(表3〜4)。
表2.CH22 DENND1A.V2アミノ酸配列標的QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)(すなわちビオチン‐CH22)のためのヒトファージパニングプロセス
表3.QCモノクローナルファージELISA‐1。ビオチン化DENND1A.V2アミノ酸配列QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)(すなわちビオチン‐CH22)に対するヒトM13KO7モノクローナルファージクローンの反応性
M13KO7ファージ:10(3)cfu/ml
表4.QCモノクローナルファージELISA‐2。ビオチン化DENND1A.V2アミノ酸配列QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)(すなわちビオチン‐CH22)に対するヒトM13KO7モノクローナルファージクローンの反応性
表2.CH22 DENND1A.V2アミノ酸配列標的QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)(すなわちビオチン‐CH22)のためのヒトファージパニングプロセス
M13KO7ファージ:10(3)cfu/ml
標的としてビオチン化DENND1A.V2ペプチドQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)を使用し、2種の強力な結合scFv(クローン16及び79)を同定した(表3〜4)。scFvファージクローン16及び79の配列分析から、これらのクローンのヌクレオチド及びペプチド配列が同一であることが分かった(図9A〜B)。IgG1のヒト軽鎖(pIgG1‐L)及び重鎖(pIgG1‐H)を含むプラスミドにこのscFvのVL及びVHをクローニングした(図10A〜D)。トランスフェクションの後、これらの構築物はHEK293細胞で発現し、得られたヒト組換えDENND1A.V2のIgG1を発現させ、精製した(図11A〜C)。要するに、プラスミドベクターを293E細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから96時間後に懸濁液培養物を回収した。HiTrap rProteinA FFによって生成物を精製し、0.2μm濾紙を使用して濾過した。その後、得られたヒト組換えDENND1A.V2特異的IgG(V2 hmAB)(図11B)を利用し、正常周期の女性及びPCOSの女性から単離した卵巣アンドロゲン生成ヒト莢膜細胞を用いて機能試験を実施した(図12A〜B及び図13A)。
結果
結果
ファージディスプレイの結果。表2に示されるように、強力な濃縮効果は3回目のスクリーニング後に見られた。それに応じて、更なるQC ELISAアッセイのために、トリプシン消化溶出液又は競合溶出液のいずれかから40個のクローンを選択した。トリプシン消化溶出液から得た第1の40個のクローンをQCファージELISAに供した。表3に示すように、1つの強力な陽性クローン、クローン16を、いくつかの弱い陽性クローンと共に同定した。競合溶出液から得た第2の40個のクローンもQCファージELISAに供した。表4に示すように、第2の強力な陽性クローン、クローン79を、いくつかの弱い陽性クローンと共に同定した。前記2つの強力な陽性クローン及びいくつかの弱い陽性結合クローンでDNA配列決定を行った。7つの固有のscFvを同定した。2つの強力な陽性クローン(クローン16及び79)は、同一のscFv配列を有していた(図9参照)。
可溶性scFv発現及び可溶性scFvのELISA。更なる可溶性scFv発現及び可溶性scFvのELISAのため、強力な陽性scFv遺伝子(クローン16及び79と同一)を可溶性scFv発現ベクターpCDisplay‐2にクローニングした。表5に示すように、可溶性scFv‐AP融合タンパク質を含む大腸菌溶解物を直接被覆したところ、発現が良好に確認された。表6に示すように、ストレプトアビジンを事前に被覆したプレートを介し、ビオチン化DENND1A.V2ペプチドを固定したところ、scFv‐APの陽性結合も確認された。
表5.大腸菌溶解物を直接使用する、ファージクローン16及び79からの可溶性scFv融合タンパク質のELISA分析
表6.ストレプトアビジンを事前に被覆したプレートを介した固定化DENND1A.V2ビオチン化ペプチドを使用するQC可溶性scFvのELISA
表5.大腸菌溶解物を直接使用する、ファージクローン16及び79からの可溶性scFv融合タンパク質のELISA分析
ファージディスプレイから同定したscFvのVL及びVHをIgG1のヒト軽鎖(pIgG1‐L)及び重鎖(pIgG1‐H)を含むプラスミドにクローニングし、配列決定した。図10A〜Dに示すように、これらのクローンの重鎖及び軽鎖のVH及びVLはscFvのものと同一であった(図9A〜9B)。VH及びVL両方のCDRは下線及び括弧で示している。
組換えヒトDENND1A.V2特異的IgG1はPCOS莢膜細胞におけるDHEA生合成を機能的に阻害する。ビオチン化DENND1A.V2の21アミノ酸ペプチド(QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH)(配列番号6)によるファージディスプレイスクリーニングから得た組換えヒトIgG1は、DENND1A.V2発現の効果を中和し、PCOS莢膜細胞におけるステロイド生合成を減少させることが可能であるか否かを検討するため、用量応答実験を行なった(図12)。これらの実験では、PCOS莢膜細胞はフォルスコリン非存在下(C)及び20μMのフォルスコリン存在下(F)で、DENND1A.V2(V2hmAB)に特異的なヒト組換えモノクローナルIgG1又は非特異的IgG1を高濃度(0.01〜6μg/mL)で72時間処理された。図12Aに示すように、DHE​​A生合成には用量依存的減少があった。対照IgG1と比較して、V2hmABはフォルスコリン刺激下DHEA生合成を約1.8μg/mLのID50で有意に減少させた(*、P<0.01)。PCOS莢膜細胞生合成に対する3.0μg/ml及び6.0μg/mlの非特異的IgG1又はV2hmABの効果の試験によって、基本条件及びフォルスコリン刺激下(*、P<0.1)DHEA生合成はV2hmABの治療後、対照IgG1と比較して阻害されることが分かった(図12B)。並行した予備研究では、ヒト組換えDENND1A.V2のIgG1も基本条件及びフォルスコリン刺激条件下CYP17mRNA蓄積を阻害した(データは示していない)。
フォルスコリン非存在下(C)及び20μMのフォルスコリン存在下で72時間処理した多様な個々の患者由来の正常及びPCOS莢膜細胞における、アンドロゲン生合成に対する最大量のヒト組換えDENND1A.V2のIgG1(V2hmAB)(9μg/ml)及び非特異的IgG1(9μg/ml)の効果を調査するため、引き続き実験を行なった。図13Aに示すように、最大量のV2hmABのIgG1は、PCOS莢膜細胞内でフォルスコリン刺激下DHEA生合成を有意に(*、P<0.01)阻害した一方で、正常莢膜細胞内ではDHEA蓄積に対する影響は非常に少なかった。
DHEA生合成に対するウサギDENND1A.V2ポリクローナル(図8)及びヒト組換えDENND1A.V2のIgG1(図12A〜B及び13A)の効果の比較によって、C末端DENND1A.V2の21アミノ酸ペプチドに対して生成された両抗体は、対照IgGと比較してPCOS莢膜細胞における基本条件及びフォルスコリン刺激条件下アンドロゲン生合成を減少させることが実証された(図13B)。
実施例3.DENND1A.V2に特異的なマウスモノクローナル抗体はPCOSの治療処置のためヒト化モノクローナルを構築する機能的IgG1のCDR配列情報を提供する。
材料及び方法
実施例3.DENND1A.V2に特異的なマウスモノクローナル抗体はPCOSの治療処置のためヒト化モノクローナルを構築する機能的IgG1のCDR配列情報を提供する。
材料及び方法
DENND1Aペプチドに対するマウスモノクローナル抗体生成。標準的手順によって、DENND1AペプチドQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)に対するマウスモノクローナル抗体を調製した[55]。BALB/cマウスを、RIBIアジュバント中のKLH結合ペプチドを用いて免疫化した。免疫化は、1回の免疫化につきマウス1体当たり1箇所に0.05mlを皮下及び腹腔内の両方に行った。免疫化は隔週で3回行い、最後の追加免疫は、生理食塩水中のKLHペプチドとして与えた。最終追加免疫から3日後、マウスをケタミン/キシラジンで麻酔し、全採血後、脾臓及びリンパ節を切除した。免疫細胞の単一細胞懸濁液を調製し、P3X63‐Ag8.653骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマを生成した。当該ペプチド及びBSAペプチドへの反応性についてハイブリドーマ培養物の上清をELISAでスクリーニングし、陽性培養物を増殖及びクローニングするために単離した。ELISAで反応性抗体を生成する陽性クローンは、Sigma社の無血清培地を使用した無血清条件に適合させ、次いでBD Biosciences社のCELLine装置を使用して高力価抗体を生成した。その後、抗体を含有する培養物をプロテインA/Gカラム(Pierce社、ロックフォード、イリノイ州)を用いて精製し、種々の抗体の検出及び機能アッセイに使用した。
マウスモノクローナル抗体パネルのELISA結合活性。 融合物の一次スクリーニングで陽性と見られた選択モノクローナル抗体の結合特性を評価するためにELISAを実施した。基本的な方法としては、重炭酸塩結合緩衝液(pH9.6)中の種々のDENND1A.V2抗原供給源(KLHペプチド;BSAペプチド、遊離ペプチド、対照ペプチド及びBSA)1ug/mlでELISAプレートウェルを被覆し、その後、ハイブリドーマ細胞培養液上清の単一希釈物を二重に試験する。405nmでの光学密度の読み取りをプレートリーダーから確立し、各抗原及び各ハイブリドーマ上清についてOD読み取り値の平均±SEMをプロットした。限界希釈法によって数種の反応性ハイブリドーマをクローニングし、アイソタイプによって特徴化し、ELISAで再試験した。ELISAによるマウスモノクローナル抗体の結合プロファイルの例は図14に示す。いくつかのモノクローナル抗体は、DENND1A.V2遊離ペプチド(配列番号6)、ならびにP1B2、P1C5、P4F1、P5F9及びP2F5などのKLH及びBSA標識化ペプチドに特異的に反応性を示すことが特定された。
マウスDENND1A.V2モノクローナル抗体のRNA抽出及び配列分析。ELISA陽性モノクローナルハイブリドーマ細胞を遠心分離によってペレット化し、TRIzol試薬(Life Technologies社)中に再懸濁し、RNAを単離した。全RNAを破砕物から抽出し、得られたRNAペレットを100μlのHyClone HyPure Molecular Biology Grade Water(Thermo Scientific社)に溶解した。合成に使用するランダム6量体プライマー及び組換えM‐MuLV RTの両方を備えるRevertAid First Strand cDNA合成キットを用いてcDNAを合成した。得られたcDNAは、ChoiceTaq DNA Polymerase(Denville Scientific社)ならびにIgG1重鎖還元体及びカッパ軽鎖還元体プライマーによって増幅した[55][56]。PCR生成物をQIAquick PCR精製キット(Qiagen社)を用いて精製した。PCR増幅に使用したものと同じプライマーを用い、PCR生成物をオペロンによって直接、配列決定した。配列を分析し、DNAMANソフトウェアを使用して翻訳し、同じPCRプライマーを用いて配列決定した。
アンドロゲン生合成に対するマウスモノクローナル抗体の機能評価。P1B2及びP1C5マウスモノクローナルクローン由来のハイブリドーマ細胞を更にサブクローニングし、これらの培養物から得た培地を利用し、実施例1「材料及び方法」の記載の通りにPCOS莢膜細胞を処理し、PCOS莢膜細胞内の卵巣アンドロゲン生合成に対するその効果を評価した。
マウスDENND1A.V2モノクローナル抗体の配列分析。P1B2及びP1C5ハイブリドーマクローンからRNAを調製した。mAB P1B2の重鎖及び軽鎖ならびにP1C5の重鎖の部分的なヌクレオチド及びアミノ酸配列を図16A〜Dに示す。
結果
結果
マウスDENND1A.V2mABのELISA。選択したハイブリドーマのためにマウスモノクローナル抗体の上清をELISAスキャンすることによって、DENND1A.V2遊離ペプチド(配列番号6)、ならびにP1B2、P1C5、P4F1、P5F9及びP2F5などのKLH及びBSA標識化ペプチドに特異的に反応性を示すいくつかのモノクローナル抗体が同定された(図14)。
アンドロゲン生合成に対するマウスモノクローナルV2のIgG1の阻害効果。KLH共役DENND1A.V2特異的21アミノ酸ペプチド(QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH)(配列番号6)に対して生成されたマウスP1B2(mV2.A)及びP1C5(mV2.B)DENND1A.V2モノクローナル抗体は同様にPCOS莢膜細胞内のDENND1A.V2を中和し、アンドロゲン生合成を抑制するか否かを調査するため、複数の実験を実施した。これらの実験では、20μMのフォルスコリン存在下及び非存在下、mV2.A及びmV2.BマウスIgG1、又は陰性対照マウスIgG1のいずれかの40μLの組織培養上清でPCOS莢膜細胞を72時間処理した。図14のデータから、DENND1A.V2特異的mV2.A及びmV2.Bの両方のマウスIgG1は、陰性対照マウスIgG1と比較して、PCOS莢膜細胞内フォルスコリン刺激下DHEA生合成を阻害することが実証されている(*、P<0.05)。図12〜13及び15のデータから、ヒト及びマウスの両方のDENND1A/V2特異的抗体は、PCOS莢膜細胞内のDHEA生合成を抑制することが実証されている。これは、ウサギDENND1A.V2特異的ポリクローナル抗体を用いて得られた結果と一致している(図8)。これらのデータは更に、DENND1A.V2に特異的なモノクローナル抗体はPCOSの治療法として使用可能であるという考えを支持している。
DENND1A.V2特異的マウスモノクローナル抗体P1B2及びP1C5の配列。マウスモノクローナルDENND1A.V2特異的IgG1のDNA及びタンパク質の両配列、P1B2重鎖(図16A及びC;配列番号60及び62)、P1B2軽鎖(図16B及びD;配列番号61及び63 )、及びP1C5重鎖(図16E〜F;配列番号64及び65)のヌクレオチド及びアミノ酸配列が提供されている。CDRは括弧で示している。
(参考文献)
本発明はその好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明は添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内で改変可能に実施できることは当業者であれば認識しているものとする。従って、本発明は、上述した実施形態に限定されるべきではなく、本明細書に提供される説明の精神及び範囲内でその改変及び等価物全てを更に包含することが好ましい。
(参考文献)
本発明はその好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明は添付の特許請求の範囲の精神及び範囲内で改変可能に実施できることは当業者であれば認識しているものとする。従って、本発明は、上述した実施形態に限定されるべきではなく、本明細書に提供される説明の精神及び範囲内でその改変及び等価物全てを更に包含することが好ましい。
(図面の用語の対応訳)
[図1A]
(1)正常
[図1B]
(1)DENND1A.V2タンパク質(相対飽和度)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図1C]
(1)DENND1A.V1タンパク質(相対飽和度)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図1D]
(1)DENND1A.V2/V1比率(相対飽和度)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図1E]
(1)正常
[図1F]
(1)DENND1A.V2タンパク質(相対飽和度)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図2A、2B]
(1)DENND1A.V2免疫組織化学
(2)莢膜
(3)正常卵胞
(4)PCOS卵胞
(5)顆粒膜
(6)莢膜細胞核
(7)核
[図3A]
(1)DENND1A.V2 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図3B]
(1)DENND1A.V2 mRNA (相対量)
(2)正常 C
(3)正常 F
[図4]
(1)尿エキソソームDENND1A.V2 mRNA (相対量)
(2)正常
[図5A]
(1)細胞
[図5B]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図5C]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図5D]
(1)テストステロン
(2)細胞
(3)対照
(4)フォルスコリン
[図5E]
(1)プロゲステロン
(2)細胞
(3)対照
(4)フォルスコリン
[図6A]
(1)CYP17 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図6B]
(1)CYP11A1 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図6C]
(1)−770 CYP17A1 LUC (相対的ルシフェラーゼ量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図6D]
(1)−160/−90 CYP11A1 LUC (相対的ルシフェラーゼ量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図7A]
(1)CYP17 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)スクランブル
[図7B]
(1)CYP11A1 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)スクランブル
[図7C]
(1)−235 CYP17A1 LUC (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)スクランブル
[図7D]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図7E]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図7F]
(1)プロゲステロン
(2)細胞
(3)対照
(4)フォルスコリン
[図8A]
(1)細胞
(2)抗体(μg)
[図8B]
(1)CYP17 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図8C]
(1)CYP11A1 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図8D]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図8E]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図8F]
(1)プロゲステロン
(2)細胞
(3)対照
(4)フォルスコリン
(5)正常
[図9A]
(1)scFV DNA VH‐リンカー‐VL
[図9B]
(1)scFv タンパク質 VH‐リンカー‐VL、CDRはボックスで囲まれている
[図10A]
(1)ヒト組換えDENND1.V2のIgG1における重鎖のDNA配列
[図10B]
(1)ヒト組換えDENND1.V2のIgG1における軽鎖のDNA配列
[図10C]
(1)ヒト組換えDENND1.V2のIgG1における重鎖のタンパク質配列
VH‐[CDRは下線及び括弧で示している]
[図10D]
(1)組換えDENND1.V2のIgG1における軽鎖のタンパク質配列
VL‐[CDRは下線及び括弧で示している]
[図11A]
(1)プロジェクトID:ファージディスプレイスクリーニング DENND1A.V2のIgG1
(2)生成物タイプ:IgG1
(3)ラベルID
(4)体積
(5)濃度
(6)総量
(7)生成法:プラスミドベクターを293E細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから96時間後に懸濁培養物を回収した。生成物をHiTrap rProteinA FFにより生成し、0.2μm濾紙で濾過した。
濃度測定:BCA法
算出濃度 126μg/mL
総量:1008μg 調合緩衝液:0.1Mのグリシン‐HCl、0.05MのTris、pH7.4
[図11B]
(1)還元SDS‐PAGE
(2)レーン1:DENND1A.V2のIgG1
(3)レーン2:マーカー
[図11C]
(1)ELISA結果
(2)項目
(3)培地
(4)被覆:Bio‐CH‐22
(5)2次抗体:HRP‐ヤギ抗ヒトIgG1
[図12A]
(1)細胞
(2)抗体(μg/mL)
[図12B]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図13A]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図13B]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)ポリクローナル
(5)組換え
[図14]
(1)マウスmAb ELISA
(2)OD(平均±SEM)405nm
(3)マウスモノクローナルAb
(4)V2‐ペプチド
(5)L2‐ペプチド
(6)V2‐BSA‐ペプチド
(7)V2‐KLH‐ペプチド
[図15]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)対照
[図16A]
(1)P1B2マウスmABのDNA重鎖配列
[図16B]
(1)P1B2マウスmABのDNA軽鎖配列
[図16C]
(1)P1B2マウスmABの重鎖タンパク質配列
VH‐[CDRは下線及び括弧で示している]
[図16D]
(1)P1B2マウスmABの軽鎖タンパク質配列
VL‐[CDRは下線及び括弧で示している]
[図16E]
(1)P1C5マウスmABのDNA重鎖配列
[図16F]
(1)P1C5mABの重鎖タンパク質配列
VH‐[CDRは下線及び括弧で示している]
(表1−表6の用語の対応訳)
[表1]
Gene : 遺伝子
Location : 配置
Position : 位置
Function : 機能
Ref Allele : 参照アレル
#Samples with SNP : SNPの試料数
Calculated minor allele freq : 計算したマイナーアレル出現頻度
Normal : 正常
Synonymous coding : 同義コーディング
ABSENT : 無し
Intron : イントロン
[表2]
Round : 各回数
Conditions : 条件
Input : インプット量
Output : アウトプット量
Enriching factor : 濃縮倍数
Target protein : 100ug/ml Biotin-CH22 標的タンパク質:100ug/mlのビオチン‐CH22
Washing : 0.1% Tween20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.1%Tween20を含むPBST、10倍
Elution : Trypsin digestion 溶出:トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Target protein : 60ug/ml Biotin-CH22 標的タンパク質:60ug/mlのビオチン‐CH22
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.2%Tween20を含むPBST、10倍
Elution : Trypsin digestion 溶出:トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Target protein : No coating 標的タンパク質:被覆なし
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.2%Tween20を含むPBST、10倍
Elution : Trypsin digestion 溶出:トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Target protein : 40ug/ml Biotin-CH22 標的タンパク質:40ug/mlのビオチン‐CH22
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.2%Tween20を含むPBST、10倍
Elution : Trypsin digestion 溶出:トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Target protein : No coating 標的タンパク質:被覆なし
Washing : 0.2% Tweenβ20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.2%Tweenβ20を含むPBST、10倍
Elution : Trypsin digestion 溶出:トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Target protein : 40ug/ml Biotin-CH22 標的タンパク質:40ug/mlのビオチン‐CH22
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.2%Tween20を含むPBST、10倍
Elution : Competitive digestion 溶出:競合消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Target protein : No coating 標的タンパク質:被覆なし
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.2%Tween20を含むPBST、10倍
Elution : Competitive digestion 溶出:競合消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Enriching factor = input/output : 濃縮倍率=インプット量/アウトプット量
[表3]
Clones : クローン
Coating : Biotin-CH22 被覆:ビオチン‐CH22
No coating : 被覆なし
1‐A:1回目の溶出液の増幅ファージ
2‐A:2回目の溶出液の増幅ファージ
3‐A:3回目の溶出液の増幅ファージ
[表4]
Clones : クローン
Coating : Biotin-CH22 被覆:ビオチン‐CH22
No coating : 被覆なし
[表5]
Clones : クローン
[表6]
Clones : クローン
Temp. : 温度
Coating : Biotin-CH22 被覆:/ビオチン‐CH22
No coating : 被覆なし
[図1A]
(1)正常
[図1B]
(1)DENND1A.V2タンパク質(相対飽和度)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図1C]
(1)DENND1A.V1タンパク質(相対飽和度)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図1D]
(1)DENND1A.V2/V1比率(相対飽和度)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図1E]
(1)正常
[図1F]
(1)DENND1A.V2タンパク質(相対飽和度)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図2A、2B]
(1)DENND1A.V2免疫組織化学
(2)莢膜
(3)正常卵胞
(4)PCOS卵胞
(5)顆粒膜
(6)莢膜細胞核
(7)核
[図3A]
(1)DENND1A.V2 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図3B]
(1)DENND1A.V2 mRNA (相対量)
(2)正常 C
(3)正常 F
[図4]
(1)尿エキソソームDENND1A.V2 mRNA (相対量)
(2)正常
[図5A]
(1)細胞
[図5B]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図5C]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図5D]
(1)テストステロン
(2)細胞
(3)対照
(4)フォルスコリン
[図5E]
(1)プロゲステロン
(2)細胞
(3)対照
(4)フォルスコリン
[図6A]
(1)CYP17 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図6B]
(1)CYP11A1 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図6C]
(1)−770 CYP17A1 LUC (相対的ルシフェラーゼ量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図6D]
(1)−160/−90 CYP11A1 LUC (相対的ルシフェラーゼ量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図7A]
(1)CYP17 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)スクランブル
[図7B]
(1)CYP11A1 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)スクランブル
[図7C]
(1)−235 CYP17A1 LUC (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)スクランブル
[図7D]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図7E]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図7F]
(1)プロゲステロン
(2)細胞
(3)対照
(4)フォルスコリン
[図8A]
(1)細胞
(2)抗体(μg)
[図8B]
(1)CYP17 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図8C]
(1)CYP11A1 mRNA (相対量)
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図8D]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図8E]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図8F]
(1)プロゲステロン
(2)細胞
(3)対照
(4)フォルスコリン
(5)正常
[図9A]
(1)scFV DNA VH‐リンカー‐VL
[図9B]
(1)scFv タンパク質 VH‐リンカー‐VL、CDRはボックスで囲まれている
[図10A]
(1)ヒト組換えDENND1.V2のIgG1における重鎖のDNA配列
[図10B]
(1)ヒト組換えDENND1.V2のIgG1における軽鎖のDNA配列
[図10C]
(1)ヒト組換えDENND1.V2のIgG1における重鎖のタンパク質配列
VH‐[CDRは下線及び括弧で示している]
[図10D]
(1)組換えDENND1.V2のIgG1における軽鎖のタンパク質配列
VL‐[CDRは下線及び括弧で示している]
[図11A]
(1)プロジェクトID:ファージディスプレイスクリーニング DENND1A.V2のIgG1
(2)生成物タイプ:IgG1
(3)ラベルID
(4)体積
(5)濃度
(6)総量
(7)生成法:プラスミドベクターを293E細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションから96時間後に懸濁培養物を回収した。生成物をHiTrap rProteinA FFにより生成し、0.2μm濾紙で濾過した。
濃度測定:BCA法
算出濃度 126μg/mL
総量:1008μg 調合緩衝液:0.1Mのグリシン‐HCl、0.05MのTris、pH7.4
[図11B]
(1)還元SDS‐PAGE
(2)レーン1:DENND1A.V2のIgG1
(3)レーン2:マーカー
[図11C]
(1)ELISA結果
(2)項目
(3)培地
(4)被覆:Bio‐CH‐22
(5)2次抗体:HRP‐ヤギ抗ヒトIgG1
[図12A]
(1)細胞
(2)抗体(μg/mL)
[図12B]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
[図13A]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)正常
[図13B]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)ポリクローナル
(5)組換え
[図14]
(1)マウスmAb ELISA
(2)OD(平均±SEM)405nm
(3)マウスモノクローナルAb
(4)V2‐ペプチド
(5)L2‐ペプチド
(6)V2‐BSA‐ペプチド
(7)V2‐KLH‐ペプチド
[図15]
(1)細胞
(2)対照
(3)フォルスコリン
(4)対照
[図16A]
(1)P1B2マウスmABのDNA重鎖配列
[図16B]
(1)P1B2マウスmABのDNA軽鎖配列
[図16C]
(1)P1B2マウスmABの重鎖タンパク質配列
VH‐[CDRは下線及び括弧で示している]
[図16D]
(1)P1B2マウスmABの軽鎖タンパク質配列
VL‐[CDRは下線及び括弧で示している]
[図16E]
(1)P1C5マウスmABのDNA重鎖配列
[図16F]
(1)P1C5mABの重鎖タンパク質配列
VH‐[CDRは下線及び括弧で示している]
(表1−表6の用語の対応訳)
[表1]
Gene : 遺伝子
Location : 配置
Position : 位置
Function : 機能
Ref Allele : 参照アレル
#Samples with SNP : SNPの試料数
Calculated minor allele freq : 計算したマイナーアレル出現頻度
Normal : 正常
Synonymous coding : 同義コーディング
ABSENT : 無し
Intron : イントロン
[表2]
Round : 各回数
Conditions : 条件
Input : インプット量
Output : アウトプット量
Enriching factor : 濃縮倍数
Target protein : 100ug/ml Biotin-CH22 標的タンパク質:100ug/mlのビオチン‐CH22
Washing : 0.1% Tween20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.1%Tween20を含むPBST、10倍
Elution : Trypsin digestion 溶出:トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Target protein : 60ug/ml Biotin-CH22 標的タンパク質:60ug/mlのビオチン‐CH22
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.2%Tween20を含むPBST、10倍
Elution : Trypsin digestion 溶出:トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Target protein : No coating 標的タンパク質:被覆なし
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.2%Tween20を含むPBST、10倍
Elution : Trypsin digestion 溶出:トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Target protein : 40ug/ml Biotin-CH22 標的タンパク質:40ug/mlのビオチン‐CH22
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.2%Tween20を含むPBST、10倍
Elution : Trypsin digestion 溶出:トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Target protein : No coating 標的タンパク質:被覆なし
Washing : 0.2% Tweenβ20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.2%Tweenβ20を含むPBST、10倍
Elution : Trypsin digestion 溶出:トリプシン消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Target protein : 40ug/ml Biotin-CH22 標的タンパク質:40ug/mlのビオチン‐CH22
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.2%Tween20を含むPBST、10倍
Elution : Competitive digestion 溶出:競合消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Target protein : No coating 標的タンパク質:被覆なし
Washing : 0.2% Tween20 PBST, 10 times 洗浄剤:0.2%Tween20を含むPBST、10倍
Elution : Competitive digestion 溶出:競合消化
Pre counter select : 2%M-PBS 事前カウンターセレクション:2%MのPBS
Enriching factor = input/output : 濃縮倍率=インプット量/アウトプット量
[表3]
Clones : クローン
Coating : Biotin-CH22 被覆:ビオチン‐CH22
No coating : 被覆なし
1‐A:1回目の溶出液の増幅ファージ
2‐A:2回目の溶出液の増幅ファージ
3‐A:3回目の溶出液の増幅ファージ
[表4]
Clones : クローン
Coating : Biotin-CH22 被覆:ビオチン‐CH22
No coating : 被覆なし
[表5]
Clones : クローン
[表6]
Clones : クローン
Temp. : 温度
Coating : Biotin-CH22 被覆:/ビオチン‐CH22
No coating : 被覆なし
Claims (28)
- 抗体又はその抗原結合断片から成る医薬組成物であって、前記抗体又はその抗原結合断片がDENND1A.V2タンパク質を特異的に認識するとともに、DENND1A.V1タンパク質を特異的に認識しないことを特徴とする医薬組成物。
- 前記抗原結合断片がFab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fd断片、Fv断片、scFv断片及びこれらの組み合わせから成る群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体又はその抗原結合断片がアミノ酸配列:NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号5)に存在する少なくとも1つのエピトープを特異的に認識することを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体又はその抗原結合断片がアミノ酸配列:QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)に存在する少なくとも1つのエピトープを特異的に認識することを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が、配列NTIATPATLHILQKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号5)及び/又は配列QKSITHFAAKFPTRGWTSSSH(配列番号6)内の少なくとも4つの連続アミノ酸から成る少なくとも1つのエピトープを特異的に認識することを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が以下のアミノ酸配列:NTIATPA;TIATPAT;IATPATL;ATPATLH;TPATLHI;PATLHIL;ATLHILQ;TLHILQK;LHILQKS;HILQKSI;ILQKSIT;LQKSITH;QKSITHF;KSITHFA;SITHFAA;ITHFAAK;THFAAKF;HFAAKFP;FAAKFPT;AAKFPTR;AKFPTRG;KFPTRGW;FPTRGWT;PTRGWTS;TRGWTSS;RGWTSSS;及びGWTSSSH(配列番号7〜配列番号33)の少なくとも1つに存在する少なくとも1つのエピトープを特異的に認識することを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が配列番号53の残基1〜116及び133〜240から成るアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が配列番号62及び63の相補性決定領域(CDR)から成るアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が配列番号65のCDRから成るアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の医薬組成物。
- 抗体又はその抗原結合断片をコードする単離核酸であって、前記抗体又はその抗原結合断片がDENND1A.V2タンパク質を特異的に認識するとともに、DENND1A.V1タンパク質を特異的に認識しないことを特徴とする核酸。
- 前記核酸が配列番号56及び/又は配列番号57で示される配列から成ることを特徴とする請求項10に記載の核酸。
- 前記核酸が配列番号60及び/又は配列番号61で示される配列から成ることを特徴とする請求項10に記載の核酸。
- 前記核酸が配列番号64で示される配列から成ることを特徴とする請求項10に記載の核酸。
- DENND1A.V2のmRNA及び/又はタンパク質の発現と確実に相関する障害を治療するための方法であって、前記方法は抗体又はその抗原結合断片から成る医薬組成物を治療有効量で、それが必要な被験者に投与する工程を含み、前記抗体又はその抗原結合断片がDENND1A.V2タンパク質を特異的に認識するとともに、DENND1A.V1タンパク質を特異的に認識しないことを特徴とする方法。
- 前記障害が多嚢胞性卵巣症候群(PCOS)であることを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記障害がPCOSに伴うII型糖尿病であることを特徴とする請求項15に記載の方法。
- 細胞の細胞表面受容体が、対照細胞と比較してDENND1A.V2発現を増加させることによってシグナル伝達を変更する方法であって、前記方法は前記細胞と抗体又はその抗原結合断片とを接触させる工程を含み、前記抗体又はその抗原結合断片がDENND1A.V2タンパク質を特異的に認識するとともに、DENND1A.V1タンパク質を特異的に認識しないことを特徴とする方法。
- 前記細胞が莢膜細胞、脂肪細胞、骨格筋細胞、子宮内膜細胞及び顆粒膜細胞から成る群から選択されることを特徴とする請求項17に記載の方法。
- 前記細胞と前記抗体又はその抗原結合断片との接触が、前記細胞におけるアンドロゲン及び/又はプロゲステロン生合成を減少させ、ならびに/あるいは、前記細胞におけるCYP17A1及び/又はCYP11A1mRNA及び/又はタンパク質の遺伝子発現を減少させることを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 莢膜細胞におけるアンドロゲン及び/又はプロゲステロン生合成の前記減少、ならびに/あるいは前記細胞におけるCYP17A1及び/又はCYP11A1mRNA及び/又はタンパク質の遺伝子発現の前記減少が、高アンドロゲン血症に伴う過剰アンドロゲン生成及び/又は無排卵症の症状を抑制あるいは防止することを特徴とする請求項19に記載の方法。
- 過剰アンドロゲン生成の前記症状に多毛症が含まれることを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 前記抗体又はその抗原結合断片が異常なインスリンシグナル伝達、脂肪や骨格筋及び子宮内膜組織におけるインスリン抵抗性、顆粒膜細胞内の異常なFSHシグナル伝達、およびこれらの複合的症状から成る群から選択されるPCOSを伴う他の表現型を抑制又は予防することを特徴とする請求項18に記載の方法。
- 容器及び容器内の組成物から成る製造物品であって、前記組成物が、DENND1A.V2タンパク質を特異的に認識するとともに、DENND1A.V1タンパク質を特異的に認識しない抗体から成り、更に、DENND1A.V2mRNA及び/又はタンパク質の発現と確実に相関する障害を治療するために前記組成物が使用可能であることを指示する添付文書を備えることを特徴とする製造物品。
- 前記障害がPCOSであることを特徴とする請求項23に記載の製造物品。
- 被験者のDENND1A.V2mRNA及び/又はタンパク質の発現と確実に相関する障害を診断する方法であって、
配列番号53の残基1〜166及び133〜240又は配列番号62、63又は65のうちの少なくとも1つのCDRから成るアミノ酸配列を含む抗体に、前記被験者の生体試料を接触させる工程;ならびに
検出したDENND1A.V2量を基準値と比較する工程
を含む方法。 - 前記障害がPCOSであることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- 前記生体試料が血液、血清、尿、血漿もしくは唾液であり、及び/あるいは卵巣、子宮内膜、脂肪組織もしくは骨格筋の生検又は外科的標本であることを特徴とする請求項25に記載の方法。
- DENND1A.V2mRNA及び/又はタンパク質の発現と確実に相関する障害を治療する方法であって、
RNAiを含有する組成物を治療有効量で、それが必要な被験者に投与する工程を含み、前記RNAi組成物がDENND1A.V2の発現を減少させることを特徴とする方法。
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