JP7017012B2 - B型肝炎ウイルス由来ポリペプチド及びその抗ウイルス用途 - Google Patents
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Description
参照例.統計分析
対照群と試験群との統計的比較は、一元分散分析(one-way ANOVA)を使用して分析した。統計的有意性p値は、次のように設定された。p<0.05(*)、p<0.01(**)または <0.001(***)。全ての実験は、独立して3回反復した。
本実験例においては、HBV重合酵素由来ペプチドが、抗HIV-1効果を有するか否かということを確認するものである。具体的には、遺伝子型C2感染を有した慢性患者のB型肝炎ウイルスにおいて、preS1開始部位の15、18及び21個のヌクレオチド欠失が、ウイルスの増殖を調節し、疾病進行に寄与し、本実験例において、それぞれ15、18及び21個のヌクレオチド欠失された配列に相応する重合酵素地域から、3種類のペプチド候補物質を選別した。そして、それらペプチドを、Poly5(GRLVF、配列番号1)、Poly6(GRLVFQ、配列番号2)またはPoly7(GRLVFQT、配列番号3)を命名し(図1A))、各ペプチドは、9-フルオレニルメチルオキシカルボルニル(Fmoc)基盤の固体相方法で、Peptron Inc.で合成され、実施例で使用された全てのペプチドの純度、高性能液体クロマトグラフィによって測定されたように、95%以上であった。前記3個のポリペプチドの抗HIV-1効果を評価するために、細胞基盤抗ウイルス効果を分析した。MT-4細胞(4×105細胞数)に、HIV-1(4×105CCID50)を1時間感染させた。前記MT-4細胞は、NIH/AIDSResearch and Reference Reagent Programから提供された。HIV-1は、293FT細胞に、単一バイシストロニックRNAから、Nefと強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)を共発現するpBR_HIV-1_M_NL4-3_IRES_eGFPベクター(DS441)を、Lipofectamine 2000試薬(Life Technologies)を使用し、48時間形質感染させた後、ウイルス前駆体であるHIV-1を含む上澄み液を収去し、ウイルス力価をp24 ELISA(ABI)で測定した。感染性HIV-1を増幅させるために、MT-4細胞に、ウイルス前駆体であるHIV-1を、多数感染濃度(MOI)である0.5の濃度で72時間感染させた。その後、収集した上澄み液を遠心分離及び濾過した後、感染性ウイルスの力価を測定するために、p24 ELISAを使用し、使用直前まで-70℃で保管した。
本実験例においては、Poly6の効果を調査する前、非特異的に細胞毒性により、Poly6がHIV-1増殖に影響を及ぼす可能性を排除するために、細胞に対するPoly6の毒性効果を測定した。具体的には、MT-4細胞を、1×104細胞数になるようにし、Poly6を濃度別に処理し、5日間培養し、MTT分析キット(Promega)を使用し、細胞毒性いかんを測定した。HIV-1感染により、細胞毒性によって細胞死滅が発生する場合、Poly6による抗細胞毒性効果を分析するために、MT-4細胞(1×104細胞数)にHIV-1(1×104CCID50)を感染させ、5日間培養後、細胞生存能を分析した。それと共に、上澄み液においてHIV-1力価を評価するために、p24 ELISAを遂行した。その結果、Poly6は、5日間、25μM濃度までMT-4細胞に、有意な細胞毒性を起こさなかった(図2A))。293FT細胞からHIV-1を生成するために、pBR_HIV-1_M_NL4-3_IRES_eGFPベクターを形質感染させ、MT-4細胞における、Poly6による抗HIV-1活性を、p24 ELISAで評価した。HIV-1増殖は、Poly6により、濃度によって阻害され、平均50%抑制濃度(IC50)は、約0.2664μMであった(図2B))。また、HIV-1LTRの活性によるGFP発現もPoly6によって濃度によって漸次的に減少された(図2C)。HIV-1が感染されたMT-4細胞は、ウイルス増殖により、細胞自滅信号伝達経路が活性化され、細胞が破壊される。従って、AZT処理後、MT-4細胞は、AZTによる抗ウイルス効果のために、窮極的に細胞保護効果を示したということが分かった。AZTと同様に、HIV-1に感染されたMT-4細胞に対するPoly6の細胞変性抑制効果を分析した結果、図2でのように、AZT(図2D))及びPoly6(図2E))において、濃度により、有意な細胞保護効果を確認した。5μM濃度のPoly6は、HIV-1によって誘導される細胞死滅から、細胞を約100%健康に維持するのに十分であった。Poly6の抗HIV-1効果による細胞保護能の増大により、細胞の上澄み液におけるウイルスp24の量は、相対的に、HIV-1の抑制によって減少した(図2E)。すなわち、そのような実験結果を総合すれば、本実験例においては、Poly6がHIV-1の増殖を抑制し、細胞変性を抑制することにより、MT-4細胞の生存能を保護する中枢的な役割を行っているということが分かった。
本実験例においては、ex-vivoでPoly6の抗HIV-1効果を確認するために行われた。具体的には、ヒト末梢血液単核細胞(PBMCs)にHIV-1を感染させた。Biocoll(BIOCHROME)を使用し、ヒト末梢血液単核細胞(PBMC)を分離し、10% FBSと1μg/mlフィトヘマグルチニン(PHA、Sigma-Aldrich)、IL-2(100U/ml、PEPROTECH)が添加されたRPMI1640培地で3日間培養した。PHA-刺激PBMC細胞を、0.1の多数感染濃度(MOI:multiplicity of infection)でHIV-1に感染させ、試薬を処理した後、5日間培養した。PBMCsにおけるウイルス力価を決定するために、細胞からウイルスRNAを分離し、記述されたように、RT-qPCRによって分析した。GFP発現は、蛍光顕微鏡で観察し、GFP抗体を使用し、ウェスタンブロット分析を行った。
本実験例においては、HIV-1DNAの宿主遺伝体内挿入を分析するために、2つの長い末端反復配列(2-LTR)と、Alu PCRが遂行された。具体的には、2-LTR PCRは、細胞質において、挿入されずに残って発生する円形ウイルスDNAの検出に使用され、Alu PCRは、挿入されたウイルスDNAの増幅のために遂行された。48時間の試薬処理後、QIAamp MinElute Virus Spin Kit(QIAGEN)を使用し、HIV-1に感染されたMT-4細胞からウイルスDNAを抽出した。2-LTR PCR分析のためのプライマー及び探針として、2-LTRF(MH535)、AACTAGGGAACCCACTGCTTAAG(正方向、配列番号8)、2-LTRR(MH536)、TTCACAGATCAAGGATATCTTGTC(逆方向、配列番号9)、及び2-LTRの探針として、FAM-ACACTACTTGAAGCACTCAA-TAMRA(配列番号10)が使用され、Alu-1F、TCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGG(正方向、配列番号11)、Alu-1R、CCCTAGTTAGCCAGAGAGCTCCCA(逆方向、配列番号12)及び2次Alu PCRフォワードプライマー、Alu-2F、ACAGCCTCCTAGCATTTCGT(正方向、配列番号13)、Alu-2R、AGCGGAAAGTCCCTTGTAGA(逆方向、配列番号14)、及びAlu PCRの探針として、FAM-AGCATGGGATGGAGGACCCG-TAMRA(配列番号15)が使用された。
本実験例は、Poly6によるHIV-1挿入酵素抑制に係わるTOAデータを証明するために遂行された。具体的には、Alu PCR及び2-LTR PCRを使用し、HIV-1に感染されたMT-4細胞において、挿入酵素リング形成を検出した。HIV-1cDNAが細胞内核に入ったとき、挿入が起こらなければ、それは、自ら複製し、2-LTRリングを形成すると知られている。挿入酵素抑制剤であるラルテグラビルと異なり、2-LTRリングのレベルは、Poly6によって上昇し、HIV-1が感染されたMT-4細胞においては、挿入されたcDNAの数が顕著に減少した(図5A))。該結果は、Poly6が、挿入酵素の統合過程を遮断することにより、HIV-1増殖を抑制するものであることを示す。ウイルスの細胞内挿入段階において、p300のような細胞内因子により、挿入酵素がアセチル化される過程は、すでに知られており、Poly6作用による統合抑制活性に係わる根本的なメカニズムを確認するために、まず、免疫ブロッティングにより、Poly6が感染されていないMT-4細胞と、HIV-1に感染されたMT-4細胞とにおいて、p300タンパク質発現がいかなる影響を受けるかということを調査した結果、感染されていないMT-4細胞において、Poly6が、DMSO、AZTまたはラルテグラビルより、さらに効率的にp300発現を低減させるということを発見した(図5B))。次に、低減されたp300が、挿入酵素による免疫沈澱後、ウイルス挿入酵素アセチル化に対する抑制効果を起こすことができるか否かということを確認するために、抗体は、DMSO、AZT、ラルテグラビルまたはPoly6に処理された感染されたMT-4細胞の細胞に適用した。次に、アセチル化されたリシン(Cell Signaling)に特異的な抗体を使用し、免疫ブロッティングを行った。その結果、Poly6とラルテグラビルとが挿入酵素のアセチル化を抑制しているということを確認することができた(図5C)。
実験例1.抗HBV効果を示すHBV重合酵素由来ペプチドの確認、及び細胞生存力の分析
本実験例においては、抗HBV効果を示すHBV重合酵素由来ペプチドを確認し、その処理時、細胞生存力を分析するものである。前述のPoly5(GRLVF、配列番号1)、Poly6(GRLVFQ、配列番号2)またはPoly7(GRLVFQT、配列番号3、図1A))の3個候補ペプチドによる抗ウイルス効果を評価するために、HepG2.2.15(ヒト由来肝臓癌細胞であるHepG2細胞とHBVとが永久に挿入されている)やpHBV-1.2X-WT(wild type)(Genotype C)が一時的に形質感染されたHepG2細胞に(製造社のプロトコルにより、Lipofectamine 2000試薬(Life Technologies)を使用する)、PBS(0.5%)、エンテカビル(ETV、Sigma-Aldrich、30nM)、または3個の候補(10μM)を2日間処理した後、定量的PCR及びELISAを実施し、ビリオン複製及び肝炎表面抗原(HBsAg)を確認した。このとき、各ペプチドは、基盤固体相方法でPeptron Inc.で合成され、各ペプチドの純度は、高速液体クロマトグラフィによって測定されたように、95%以上であった。また、TaqMan probe hybridization PCRのための定量的リアルタイムPCR及びプローブ用オリゴヌクレオチドを下記表1に示した。
慢性HBV感染は、急性感染とは異なり、肝硬化及び肝細胞癌のような深刻な肝疾患を誘発すると知られている。従って、慢性感染を克服する抗HBVに対する薬物を開発することが重要である。しかし、HBVゲノムが宿主染色体に挿入されているために、ヒトの肝及び血清から、ウイルスの完全な除去が困難であるという問題で残っている。従って、本実験例においては、Poly6による抗ウイルス効果を評価するために、HBVを持続的に発現するHepG2.2.15永久細胞株にPoly6を処理した。また、HepG2細胞を6ウェルプレートに接種した後、HepG2細胞を、pHBV-1.2X-WTで一時的に形質感染させた。pHBV-1.2X-WTを有するHepG2細胞またはHepG2-2.15細胞を、24時間または48時間、PBS(0.5%)、ETV(30nM)またはPoly6(10μM)で処理し、上澄み液及びペレットを使用し、多様な分析を行った。分泌されたHBsAg及びHBeAgを、培養上澄み液から測定するために提供された実験方法により、HBsAg(BIOKIT)及びHBeAg(AccuDiag)のELISAを遂行した。8-ヒドロキシ-2’-デオキシグアノシン(8-OHdG)活性の検出のために、8-OHdG分析キット(OxiSelect Oxidative DNA Damage ELISA kit、Cell Biolabs)及びELISAを、製造プロトコルによって遂行した。
本実験例においては、ヌクレオカプシド発現分析、ミトコンドリア活性酸素測定、及び第1型インターフェロンに係わる実験を介して、細胞における、Poly6の抗ウイルスメカニズムを確認した。
マウスモデル(in vivo)において、Poly6効果を確認するために、本実験例を遂行した。まず、形質転換されたマウスモデルを構築するために、HBV W4P突然変異を発現するトレンスジェニックマウスをマクロジェン(Macrogen)で生成させ、マウスをランダムに相互培養し、マクロジェンで病菌がない状態に維持させた。実験動物は、特定病源菌がない実験動物センターに保管された。簡潔に述べれば、PMSG(7.5IU)とhCGは、過排卵のために、5~8週間、C57BL/6Nメスマウスに、48時間ごとの間隔(5IU)で腹腔内注射された。注射後、それらメスマウスを、C57BL/6Nオスマウスと交配させた。翌日、処女プラグがあるメスマウスを犠牲にし、受精された胚芽を収穫し、HBV W4P完全ゲノムを、遺伝子変形マウス生産のための標準マイクロ注入手続き(Macrogen)を使用し、1つの細胞胚芽に共同微細注入させた。微細注入器を利用し、精子髄核に、微細注入のためのHBV DNA(4ng/μl)を直接注射した後、微細注入された胚芽を、1時間ないし2時間37℃で培養した。14個から16個の注入された1細胞段階の胚芽を外科的方法でICP(pseudopregnant recipient mice)の卵管に移植した。F0が生まれた後、移植遺伝子(transgene)の存在に係わる尾カットサンプルを使用してテストした遺伝型分析(genotyping)を行い、フェノール抽出方法を介した遺伝体DNA(genomic DNA)PCRスクリーニングをPCR分析で確認した。
核において、HBV重合酵素の活性を抑制し、リン酸化形態に転換させるメカニズムを介して、現在HBV抗ウイルス剤として商用されているエンテカビルと、第I型インターフェロン(IFN-I)とを増加させると確認されたPoly6と併用処理による抗HBV効果と、第1型インターフェロン増加相乗効果とを確認した。HepG2-2.15細胞で、6ウェル培養プレート上において、5x105細胞/ウェルで24時間培養し、PBS、ETV、Poly6の単独処理、または2つの物質を併用して処理した。48時間細胞を培養した後、上澄み液を収集し、ELISA、qPCR、LDH assayを進めた。
本発明は以下の態様を含む。
<1> 配列番号1、配列番号2及び配列番号3からなる群から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
<2> 前記ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列からなる、<1>に記載のポリペプチド。
<3> 前記ポリペプチドは、B型肝炎ウイルス(HBV)重合酵素に由来するものである、<1>に記載のポリペプチド。
<4> 前記ポリペプチドは、抗ウイルス活性を有するものである、<1>に記載のポリペプチド。
<5> <1>に記載のポリペプチドを含む抗ウイルス用薬学的組成物。
<6> 前記ウイルスは、アデノウイルス、天然痘ウイルス、小児麻痺ウイルス、はしかウイルス、重症熱性血小板減少症侯群ウイルス、インフルエンザウイルス、C型肝炎ウイルス(hepatitis C virus)、ヒト免疫欠乏ウイルス-1(HIV-1)及びB型肝炎ウイルス(HBV)からなる群から選択される少なくとも一つである、<5>に記載の薬学的組成物。
<7> 前記ポリペプチドは、抗ウイルス活性を有し、前記ウイルスは、ヒト免疫欠乏ウイルス-1(HIV-1)及びB型肝炎ウイルス(HBV)からなる群から選択される少なくとも一つである、<5>に記載の薬学的組成物。
<8> 抗ウイルス剤をさらに含む、<5>に記載の薬学的組成物。
<9> 前記抗ウイルス剤は、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、アンプレナビル、アバカビル、アンサマイシン、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリン、ファムシクロビル、ヒペリシン、インジナビル、ラミブジン、ロブカビル、ネルフィナビル、ネビラピン、ノバフェロン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、チプラナビル、ビラゾール、リバビリン、ザルシタビン、ジドブジン、マラビロク、ラルテグラビル、エルビテグラビル、ジダノシン、テノホビル、エムトリシタビン、ロピナビル、アタザナビル、エンフビルチド、クレブジン、エンテカビル及びアデホビルからなる群から選択される少なくとも一つである、<8>に記載の薬学的組成物。
<10> 前記抗ウイルス剤は、エンテカビルである、<8>に記載の薬学的組成物。
<11> 前記ポリペプチドは、ウイルスの増殖を抑制するものである、<5>に記載の薬学的組成物。
<12> 前記ポリペプチドは、HIV-1挿入酵素のアセチル化を阻害し、前記酵素の活性を抑制するものである、<5>に記載の薬学的組成物。
<13> 前記ポリペプチドは、細胞内ミトコンドリアの活性酸素を増加させるものである、<5>に記載の薬学的組成物。
<14> 前記ポリペプチドは、第I型インターフェロン(IFN-I)の発現を増大させるものである、<5>に記載の薬学的組成物。
<15> 前記ポリペプチドは、HBVのHBcAgまたはヌクレオカプシドの合成を抑制するものである、<5>に記載の薬学的組成物。
<16> <1>に記載のポリペプチドを含む後天性免疫欠乏症(AIDS)の予防用または治療用薬学的組成物。
<17> 前記後天性免疫欠乏症はHIV-1感染から発病されるものである、<16>に記載の薬学的組成物。
<18> <1>に記載のポリペプチドを含む肝疾患の予防用または治療用薬学的組成物。
<19> 前記肝疾患は、肝炎、肝硬変症及び肝臓癌からなる群から選択される少なくとも一つである、<18>に記載の薬学的組成物。
<20> 前記肝疾患は、B型肝炎である、<18>に記載の薬学的組成物。
<21> 前記肝疾患はHBV感染から発病されるものである、<18>に記載の薬学的組成物。
<22> <1>に記載のポリペプチドを含む抗ウイルス用健康機能食品。
<23> <5>に記載の薬学的組成物を個体に投与する工程を含む、ウイルス感染症及びそれと関連した症状を予防または治療する方法。
Claims (19)
- 配列番号1、配列番号2及び配列番号3からなる群から選択されるいずれか1つのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸配列からなる、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、B型肝炎ウイルス(HBV)重合酵素に由来するものである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドは、抗ウイルス活性を有するものである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドを含む抗ウイルス用薬学的組成物。
- 前記ウイルスは、アデノウイルス、天然痘ウイルス、小児麻痺ウイルス、はしかウイルス、重症熱性血小板減少症侯群ウイルス、インフルエンザウイルス、C型肝炎ウイルス(hepatitis C virus)、ヒト免疫欠乏ウイルス-1(HIV-1)及びB型肝炎ウイルス(HBV)からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項5に記載の薬学的組成物。
- 抗ウイルス剤をさらに含む、請求項5に記載の薬学的組成物。
- 前記抗ウイルス剤は、アシクロビル、ファムシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、アンプレナビル、アバカビル、アンサマイシン、シドフォビル、ダルナビル、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリン、ファムシクロビル、ヒペリシン、インジナビル、ラミブジン、ロブカビル、ネルフィナビル、ネビラピン、ノバフェロン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、チプラナビル、ビラゾール、リバビリン、ザルシタビン、ジドブジン、マラビロク、ラルテグラビル、エルビテグラビル、ジダノシン、テノホビル、エムトリシタビン、ロピナビル、アタザナビル、エンフビルチド、クレブジン、エンテカビル及びアデホビルからなる群から選択される少なくとも一つである、請求項7に記載の薬学的組成物。
- 前記ポリペプチドは、ウイルスの増殖を抑制するものである、請求項5に記載の薬学的組成物。
- 前記ポリペプチドは、HIV-1挿入酵素のアセチル化を阻害し、前記酵素の活性を抑制するものである、請求項5に記載の薬学的組成物。
- 前記ポリペプチドは、細胞内ミトコンドリアの活性酸素を増加させるものである、請求項5に記載の薬学的組成物。
- 前記ポリペプチドは、第I型インターフェロン(IFN-I)の発現を増大させるものである、請求項5に記載の薬学的組成物。
- 前記ポリペプチドは、HBVのHBcAgまたはヌクレオカプシドの合成を抑制するものである、請求項5に記載の薬学的組成物。
- 請求項1に記載のポリペプチドを含む後天性免疫欠乏症(AIDS)の予防用または治療用薬学的組成物。
- 前記後天性免疫欠乏症はHIV-1感染から発病されるものである、請求項14に記載の薬学的組成物。
- 請求項1に記載のポリペプチドを含む肝疾患の予防用または治療用薬学的組成物。
- 前記肝疾患は、肝炎、肝硬変症及び肝臓癌からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項16に記載の薬学的組成物。
- 前記肝疾患はHBV感染から発病されるものである、請求項16に記載の薬学的組成物。
- 請求項1に記載のポリペプチドを含む抗ウイルス用健康機能食品。
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