KR20110049749A - 양성-센스 단일-사슬 ｒｎａ 바이러스로의 감염을 예방 또는 치료하기 위한 대형 인간 2´,5´-올리고아데닐레이트 합성효소 ｏａｓ3 - Google Patents

양성-센스 단일-사슬 ｒｎａ 바이러스로의 감염을 예방 또는 치료하기 위한 대형 인간 2´,5´-올리고아데닐레이트 합성효소 ｏａｓ3 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스로의 감염을 진단, 예방, 및 치하기 위한, 그리고 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스-관련 질환에 인간 유전적 민감도를 예상하기 위한 대형의 인간 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OAS3)의 용도에 관한 것이다.

Description

양성-센스 단일-사슬 ＲＮＡ 바이러스로의 감염을 예방 또는 치료하기 위한 대형 인간 2´,5´-올리고아데닐레이트 합성효소 ＯＡＳ3{THE LARGE FORM OF HUMAN 2´,5´-OLIGOADENYLATE SYNTHETASE ＯＡＳ3 FOR PREVENTING OR TREATING INFECTION WITH POSITIVE-SENSE SINGLE-STRANDED ＲＮＡ VIRUSES}
본 발명은 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스로의 감염을 예방하거나 또는 이를 치료하기 위한 약제로서의 대형 인간 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OligoAdenylate Synthetase 3: OAS3)에 관한 것이다.
본 발명은 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스로의 감염에 대한 유전적 민감성을 결정하기 위한 마커로서의 대형 인간 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OAS3)에 관한 것이다.
플라비비리대(Flaviviridae) 및 토가비리대(Togaviridae)는 전세계적으로 인간과 동물 건강에 영향을 줄 수 있는 병원균을 포함하는 두 종류의 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스과이다. 이들 바이러스의 예는 플라비바이러스 속(플라비비리대 과)의 뎅기열, 황열(YF), 일본 뇌염(JE), 및 진드기-매개 뇌염(tick-borne encephalitis: TBE) 항원성 복합체의 일원, 알파바이러스 속(토가비리대 과)의 동부 말 뇌염(Eastern Equine Encephalitis: EEE)/베네주엘라 말 뇌염(Venezuelan Equine Encephalitis: VEE), 셈리키 삼림열(Semliki Forest: SF), 및 신드비스(Sindbis: SIN) 군의 일원, 및 C형 간염(HCV) 및 G형 간염(HGV) 바이러스와 같은 헤파시바이러스 속(플라비비리대 과)의 일원들을 포함한다.
뎅기열(Dengue virus, DV; 플라비바이러스 속의 DEN 항원성 복합체)은, 도시화의 극적인 증가가 모기-매개 뎅기열 질병의 증가된 전파를 위한 이상적 조건들을 만들기 때문에 열대 지방의 대부분의 도시 중심부의 풍토병이다. 뎅기열 바이러스의 4가지 항원형(DV-1 내지 DV-4)은 모기 벡터 애데스 애집티(Ae. aegypti)에 의하여 인간에게 전파된다. DV 감염은 뎅기열 충격 신드롬(DSS)과 사망으로 진행할 수 있는 감기-유사 질병(뎅기열, DF)으로부터 뎅기 출혈열(DHF)까지의 다양한 질병을 일으킨다. 현재까지, 뎅기열 질병은 대략 일억 명의 환자를 가지고, 그리고 주로 15세 이하의 어린이에게서, 약 25,000건의 치명적인 케이스를 포함하여, 매년 발생하는 500,000건이 넘는 DHF/DSS을 포함하여, 사람에게서 가장 중요한 아르보비로시스이다. DHF/DSS의 높은 빈도를 갖는 풍토병은 지리적으로 아시아와 남아메리카에 지속적으로 확대되고 있다. 증가된 건강과 경제 영향에도 불구하고 뎅기열 질병의 발병학은 현재 잘 이해되어 있지 않다. 뎅기열 바이러스 감염의 치료를 위하여 유용한 항-뎅기열 백신이나 특정 치료법이 없다.
서부 나일 바이러스(WNV; 플라비바이러스 속의 JE 항원성 복합체)는 모기(큘렉스 종-Culex species) 및 새를 포함하는 천연 전파 사이클에서 순환하고, 말과 사람이 임시 숙주이다. 동물원성 감염증의 WNV는, 1998년 이스라엘에서 높은 신경침입성 균주(WN 바이러스 계통 I의 클레이드 Ia 유래의 변이체 Isr98/NY99)의 출현으로 인하여 북아메리카, 중동, 및 유럽에서 주된 건강 관심분야가 되었다(Ceccaldi et al ., FEMS Microbiol. Lett., 2004, 233, 1-6). WNV는 중추 신경계를 감염시켜 광범위한 동물 종에서 바이러스성 뇌염을 일으킨다. 인간에서, 임상적 감염은 단순한(합병증을 수반하지 않는) 서부 나일 열병으로부터 치명적 수막-뇌염(meningo-encephalitis)까지 심각성이 다양할 수 있다. WNV의 출현은 공중 건강 중요성으로서 바이러스성 뇌염에 대한 관심을 끄는 인간에서의 감염 심각성이 급진적으로 증가하는 것과 관련되었다. 지난 10년 내에, WNV는 서반구와 캐리비안 일대를 거쳐 퍼져나갔다. WNV의 US 출현은 심각한 신경학적 질병(수막뇌염 및 척수성 소아마비-유사 신드롬) 및 수백 건의 관련 사망을 일으킨 수천 명의 환자를 포함하였다. WNV의 모기-매개 전파가 우세한 형태이긴 하지만, 수혈, 장기 기증, 및 태아에서의 태반 통과 전파에 의하여 전달되는 WNV 감염 또한 인지되었다. WNV-관련 질병에 대한 유용한 백신이나 항-바이러스 요법이 없다.
치쿤구니아 바이러스(Chikungunya virus, CHIKV; 알파바이러스의 SF 군)가 아프리카, 동남 아시아, 인도, 및 서태평양에 걸쳐 널리 퍼지고, 수많은 풍토병이 이들 지역에서 보고되었다. 임상적으로, CHIKV에 의한 감염은 열병, 성급하고 강한, 무력화하는, 때로는 지속적인 관절통을 유발한다. 2005-06에는, CHIKV 바이러스가 인도양의 남부, 특히 라 레유니온 섬(프랑스)에 퍼졌고, 이들의 출현이 수십만 명의 환자를 포함하였다. 보다 최근에는 바이러스가 이탈리아 동부에 출현하였고, 여기서 200명 이상의 사람들이 감염되었다.
C형 간염 바이러스(HCV) 감염은 전 세계적으로 일반적이다; 세계 인구의 약 3%가 HCV를 보유하고, 유럽에서만 약 4백만 보균자가 있다고 추측된다. 이들 개체의 20 내지 30%는 간경화 및 간세포암과 같은 장기간 후유증이 진행될 것이다. 리바비린과 함께 PEG화된 인터페론 알파(IFN-α)를 가지고 HCV 감염에 대한 치료가 HCV 바이러스 유전자형 2 또는 3으로 감염된 환자에게 이루어질 수 있고(80%), 반응율은 HCV 바이러스 유전자형 1로 감염된 환자에게서는 훨씬 낮다(42%).
I형 인터페론(IFN-α/β)에 의하여 매개되는 고유한 항바이러스 기작은 잠재적으로 바이러스 복제를 제한하는 숙주 세포 방어의 가장 중요한 경로이다. 사실, IFN-α/β는 항바이러스 상태의 확립에 책임이 있는 IFN-자극 유전자(ISGs)의 유도를 이끄는 특정 신호 변환 경로의 활성을 촉발할 수 있다. 단일 세포에서 RNA 바이러스 복제에 영향을 주는 것으로 여겨지는 ISGs는 RNA-특이적 아데노신 데사미나아제(ADAR), 믹소바이러스 내성 단백질(Mx)과, 이중-사슬 RNA-의존성 단백질 키나아제(PKR), 및 엔도리보뉴클레아제 RNase L에 연결된 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소(2',5'-OAS 또는 OAS) 패밀리이다.
OAS/RNase L 시스템은 확립된 내생성 항바이러스 경로에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 RNA 분해 경로이다. 효소적으로 활성인 OAS의 활성인자 이중-사슬(ds) 바이러스 RNA에 대한 결합은 2'- 내지 5'-링크된 올리고아데닐레이트(2-5A)의 생산을 일으킨다. 잠복성 모노머 RNase L은 2-5A 올리고머에 결합에 의하여 유도되는 동종이합체화를 통하여 효소적으로 활성화된다. 일단 활성화된 RNase L은 바이러스 복제를 억제하여, mRNA와 바이러스 RNA를 포함하여 단일-사슬 RNA 분자를 분해한다(Silverman, J. Virol. 81: 12720, 2007).
인간 OAS는 다음의 순서로 크로모좀 12q24.2 상에서 3개의 가까이 링크된 유전자에 의하여 코드화되는 한 패밀리의 효소이다: 작은(OAS1, p40/46), 중간의(OAS2, p69/71), 그리고 큰(OAS3, p100) OAS 아이소폼(Hovnanian et al., Genomics, 1998, 52, 267-277; Rebouillat, D. and Hovanessian, A.G., Journal of Interferon and Cytokine Research, 1999, 19, 295-308; Rebouillat et al ., Genomics, 2000, 70, 232-240; Justesen et al ., cellular and Molecular Life Sciences, 2000, 57, 1593-1612; Rebouillat; Hovanessian, A.G., Cytokine and Growth Factor Reviews, 2007, 18, 351-361). 각 OAS 유전자는 5개의 번역된 엑손(엑손 A-E)으로 구성된 보존된 OAS 유니트로 이루어진다. OAS1이 하나의 유니트를 가지는 반면, OAS2 및 OAS3는 각각 2개 및 3개의 유니트를 가지며, 이들 세 유전자 모두 활성 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소를 코드한다. 다른 유전자, OASL(OAS-유사)는 OAS-유사 단백질의 단일-유니트를 코드하지만, 이것은 2'-5' 합성효소 활성이 부족하다(Hartmann et al., Nucleic Acids Res., 1998, 26, 4121-4128; Rebouillat et al ., Eur. J. Biochem., 1998; 257, 319-330). 각 크기 분류에서, 일차 전사물의 교대 접합(splicing) 결과로 다수 멤버들이 발생한다. OAS 단백질은 약 350 아미노산의 보존 유니트/도메인(OAS 유니트)을 공유한다; OAS1(p40/p46), OAS2(p69/71) 및 OAS3(p100)은 각각 OAS 유니트의 하나, 둘, 및 세개의 탠덤 카피수를 갖는다. 각 OAS 단백질은 다른 세포 위치에서 축적되고, 활성화되기 위하여 다른 함량의 dsRNA를 요구하고, 그리고 다른 크기의 2-5A 생성물 형성을 촉진한다. OAS1이 사량체로 작용하고 OAS2가 이량체로서만 활성이 있든 아니든, OAS3는 단량체로서만 관찰되었다. 또한, 대형의 인간 OAS는 RNase L 활성에 포함되지 않을 것이다(검토용으로, Rebouillat, D. and Hovanessian, A.G., Journal of Interferon and Cytokine Research, 1999, 19, 295-308).
IFN에 의하여 나타나는 항바이러스 효과에 OAS 패밀리가 연루되는지에 대한 첫번째 직접적인 증거는 세포 내로 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OAS)의 트랜스펙션에 의하여 제공된다. OAS1 또는 OAS2의 과잉발현은 피코르나바이러스 복제에 대한 세포 내성을 유도한다(Hovanessian, A.G., Cytokine and Growth Factor Reviews, 2007, 18, 351-361). 인 비보에서 WNV 감염을 제거하기 위한 OAS1의 중요성은, 인간 OAS1의 이종상동성(orthologous) 유전자, 쥐과 Oas1b이 WNV-유도 뇌염에 대한 마우스의 민감성/내성 표현형에 중요한 역할을 할 수 있다는 발견에 의하여 또한 지지된다(Mashimo, T. et al ., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99, 11311-11316; Lucas et al ., Immunol. 세포. Biol., 2003, 81, 230-236; Kajaste-Rudnitski et al ., Journal of Biological Chemistry, 2006, 281, 46244637; PCT 국제출원 WO 02/081741). OAS 유전자 내의 유전자 마커가 효소 활성에 가장 강력하게 관련되었다는 것이 인간의 OAS 유전자 다형성의 분석으로 증명되었다. OAS1이 바이러스 감염에 대한 숙주 민감성에 영향을 주는 인간 유전자의 우수한 후보자임을 감안한다면(Bonnevie-Nielsen et al ., Am. J. Hum. Genet., 2005, 76, 623-633), OASL 유전자뿐만 아니라 인간 OAS1의 유전자 변형이 바이러스성 뇌염, 1형 DM, HCV 관련 질병 및 다른 바이러스 감염 위험과 연관되었다. HCV 질병을 특별히 강조하면서, HCV 감염의 발생과 연결된 일련의 OAS1 유전형이 보고되었다(PCT 국제출원 WO 03/089003 및 WO 2005/040428).
OAS 패밀리의 항바이러스 활성이 양성-센스 ssRNA 바이러스에 선택적인지 여부는 조사되어야할 중요한 문제이다. OAS1의 전위(ectopic) 발현이 뇌척수염 바이러스(피코르나바이러스) 복제에 대한 저항성을 유도하지만, VSV 바이러스 복제에 대해서는 그렇지 않다는 것이 보고되었다. 그러나, IFN-유도성 RNA-의존적 단백질 키나아제(PKR) 및 믹소바이러스 내성 1(MxA) 유전자와 같은 다른 ISGs와는 반대로, OAS가 IFN-α로 치료된 환자에게서 HCV 제거에 역할을 하지 않는 것으로 여겨진다. OAS, PKR 및 Mx의 전사 수준은 비-인간 영장류 모델에서 DV 감염 후 상향-조절되었다(Sariol et al ., Clinical and Vaccine Immunology, 14, 2007, 756-766). 뎅기열 충격 신드롬과 관련된 유전자 전사 패턴의 분석은, OAS3 유전자 전사체들이 DSS을 갖지 않은 환자보다 DSS을 갖는 뎅기열 환자에서 더 적다는 것을 보여준다(Simmons et al ., J.Infect.Dis., 195:1097, 2007). 그러나, DV 감염의 발병에서 이들 ISGs의 역할은 잘 이해되지 못한 채로 남아있다.
CHIKV은 1형 인터페론(IFN-α/β)의 항바이러스 활성에 매우 민감하다는 것이 보고되었다(Couderc et al ., PloS Pathogens, 2007, 4,e29). 알파바이러스의 경우, IFN-매개 바이러스 성장 억제가 RNase L을 요구하지 않는다는 것을 제안하는 다수의 증거가 있다(Ryman et al., J. Virol., 2005, 79, 1487-1499; 검토용으로, Silverman, J. Virol., 2007, 81, 12720-9). OAS 패밀리와 같은 인간 ISGs의 모든 멤버가 항 알파바이러스 활성에 기여할 수 있는지 여부는 조사되어야 할 중요한 문제이다.
본 발명은 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스로의 감염을 예방하거나 또는 이를 치료하기 위한 약제로서의 대형 인간 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OAS3)를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스로의 감염에 대한 유전적 민감성을 결정하기 위한 마커로서의 대형 인간 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OAS3)를 제공하기 위한 것이다.
처음으로, 본 발명자들은 알파바이러스(CHIKV, SINV, 및 SFV)와 같은 양성-센스 ssRNA 바이러스에 대항하는 확립된 내생성 항바이러스 경로에서 OAS3의 역할을 증명한다. 본 발명자들은 감염된 인간 상피 세포 내부의 바이러스 단백질 합성과 바이러스 RNA 복제를 차단하여, OAS3가 CHIKV 성장의 단계들에서 작용한다는 것을 보여준다. 알파바이러스 감염에 대한 인간의 유전적 민감성에 대한 정보를 거의 입수할 수 없다. C 대신 T로의 치환이 넌센스 돌연변이를 일으키는 코돈 CGA-844의 첫 번째 위치에서(OAS3.R844X), 건강한 백인 개체의 다형성에 대한 OAS3 유전자의 스크리닝이 단일-뉴클레오티드 다형성(SNP)을 확인하였다. OAS3.R844X 위치에서 SNP는 카르복시-말단으로부터 약 20% 부족한, OAS3 단백질의 절단 형(truncated form)을 만드는 것으로 예상된다. 돌연변이체 OAS3의 전위 발현은 전장 OAS3 단백질과 비교하여 낮은 효율의 CHIKV 억제를 나타낸다. OAS3의 유전적 다형성이 그의 항 알파바이러스 활성을 조절할 수 있다는 개념은 치쿤구니아 열병과 같은 알파바이러스-관련 질병의 발병에서 인간 OAS 유전자의 역할을 제시한다.
최초로, 본 발명자들은 OAS3가 DV(간암 세포) 및 WNV(간암 및 상피 세포)로 감염된 인간 세포에서 항 플라비바이러스 활성에 기여한다는 것을 증명한다. DSS 환자와 비-DSS 뎅기열 환자에서 완전한 OAS3 유전자의 조사는 G를 C로 치환하는 것이 Arg으로부터 Ser으로 아미노산 변화를 일으키는 경우 코돈 AGG-381의 3번째 위치에서 SNP rs2285993을 확인하였다. 우리의 유전자 데이타는, 변이체 Ser-381이 뎅기열 타이인 환자에서 DSS 위험에 대한 우세한 방어와 관련된다는 것을 제안한다. 본 발명자들은 여기서 Ser-381을 갖는 OAS3이 인간 간세포에서 DV 성장에 강력한 억제자임을 증명한다.
본 발명자들은 또한 YFV의 약독화된 생백신 균주 17D-204(STAMARIL, Sanofi-Pasteur)가 감염된 인간 상피 및 간암 세포에서 OAS3-매개 항바이러스 경로에 대한 고유의 내성을 가진다는 것을 증명한다. 그러나, IFN-α는 인간 세포에서 YFV의 백신 균주 17D-204에 대항하는 항 바이러스 상태를 확립할 수 있었다.
이들 발견은 CHIKV, WNV 및 DV를 포함하는 주된 의학적 중요성의 양성-센스 ssRNA 바이러스에 대한 OAS3-기초 예방법과 치료법의 개발에 유용하다. 이들은 또한 알파바이러스, 플라비바이러스, 및 주된 의학적 중요성이 있는 다른 양성-센스 ssRNA 바이러스로의 감염에 대한 인간 민감성의 예상을 위한, 그리고 특히 뎅기열, 서부 나일병, 및 치쿤구니아 환자들에게서 여러 형태의 질병의 예상을 위한 새로운 OAS3-기초 분자 도구 개발에 유용하다.
본 발명의 주요부는, 약제로서의 단리된 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3 단백질 또는 상기 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3 단백질을 코드하는 단리된 폴리뉴클레오티드이다.
본 발명은 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스로의 감염을 진단, 예방, 및 치하기 위한, 그리고 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스-관련 질환에 인간 유전적 민감도를 예상하기 위한 대형의 인간 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소(OAS3)의 용도를 제공한다.
- 도 1은 c-myc 항원결정기로 태그된 인간 재조합 OAS3(클론 OAS3C 17.1)의 뉴클레오티드(A) 및 아미노산(B) 서열을 나타낸다. 뉴클레오티드와 아미노산 서열은 각각 SEQ ID NO: 23 및 24에 대응된다. OAS3 mRNA 기준 서열(SEQ ID NO: 27)과 클로닝된 OAS3 cDNA 사이의 변화가 유사한 경우 밑줄이 그어져 있고 비유사한 경우는 굵게 표시된다. 번역 개시 및 정지 코돈은 굵게 표시된다. C_말단 c-myc 항원결정기에 대응되는 부가적 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 밑줄이 그어져 있다. 5' NotI 및 3' EcoRV 제한 부위는 이탤릭체로 표시된다.
- 도 2는 재조합 인간 OAS3를 발현하는 유도 HeLa-Tet-Off/OAS3#C417-1 세포주 조성을 도시한다.
- 도 3은 HeLa 세포에서의 OAS3 검출을 도시한다. (A)에서, HeLa.Tet-Off 세포는 CHIK 바이러스 균주 06-49(CHIKV 06-49)의 세포마다 다른 포커스 형성 단위(AP61FFU)로 감염되었다. 20시간 후-감염(p.i.)에서, 감염된 세포의 상청액에서 생성된 바이러스 입자가 포커스 면역 검사에 의하여 모기 애데스 슈도스쿠텔라리스(Aedes pseudoscutellaris) AP61 세포에서 적정되었다. (B)에서, HeLa.Tet-Off 세포는 세포당 하나의 AP61FFU 감염 다중도(1 MOI)로 CHIKV 투입 5시간 전 1,000 IU/ml 인간 IFN-α로 처리되거나 또는 모의-처리되었다(대조군). 바이러스 후손 생성은 상기한 바와 같이 18h p.i에서 결정되었다. (C)에서, 그래프는 OAS3의 전장 및 절단 형태의 구조를 도시한다. (D)에서, 유도(- Tet) 또는 비유도(+ Tet) Tet-Off/OAS3 세포의 전위 OAS3 발현이 OAS3-특이적 항체를 사용하여 면역 블랏 분석에 의하여 분석되었다. 대조군으로서, HeLa.Tet-Off 세포는 1,000 IU IFN-α(+ IFN)로 처리되거나 또는 모의-처리되었다(모의). β-액틴이 하우스-키핑(보조 관리) 단백질 대조군으로 제공되었다.
- 도 4는 OAS3-발현 HeLa 세포에서의 CHIKV 성장 억제를 도시한다. (A)에서, 세포들이 1 MOI로 CHIKV로 18h 감염되었고, 항-CHIK.E2 MAb 3E4를 사용하여 유동 세포 계수기에 의하여 분석되었다. 5h 전 바이러스 투입된 1,000 IU/ml 인간 IFN-α(+ IFN)로 배양되거나 또는 모의-처리된(대조군) CHIKV-감염 HeLa.Tet-off 세포, 및 테트라사이클린 존재(+ tet) 또는 부재(- tet)에서의 CHIKV-감염 Tet-Off/OAS3 세포, 및 모의-감염된 세포(바이러스 없음)에서의 CHIKV E2 단백질 생성 분석. (B)에서, 세포는 다른 MOI로 CHIKV로 감염되었고, 바이러스 후손 생성이 18 및 24h p.i에서 결정되었다. (C)에서, CHIKV 성장의 억제는 다양한 시간의 p.i에서 관찰되었다. (D)에서, 세포는 1 MOI로 SINV 또는 SFV로 감염되었고, 바이러스 후손 생성이 18h p.i에서 결정되었다.
- 도 5는 OAS3. HeLa/Tet-off의 항바이러스 활성에 대한 WN 바이러스 민감성을 도시하고, 유도된 HeLa.Tet-Off/OAS3#C417-1 세포가 WN 바이러스 균주 IS-98-ST1 세포마다 0.1, 1.0, 10 AP61FFU로 감염되었다. 감염된 세포의 상청액에서 생산된 감염 바이러스 입자는 모기 애데스 슈도스쿠텔라리스 AP61 세포에서 포커스 면역검사에 의하여 48시간 후-감염 시 적정되었다.
- 도 6은 OAS3-발현 세포에서 WN 바이러스 성장의 억제를 도시한다. HeLa/Tet-Off 및 유도 HeLa.Tet-Off/OAS3#C417-1 세포가 WN 바이러스 균주 IS-98-ST1의 세포당 0.1 AP61FFU로 감염되었고, 감염된 세포의 상청액에서 생산된 감염성 바이러스 입자는 모기 애데스 슈도스쿠텔라리스 AP61 세포에서 포커스 면역검사에 의하여 다양한 시간 후-감염(24, 48, 및 72 시간) 시 적정되었다.
- 도 7은 CHIKV 복제를 위한 OAS3 발현의 결과를 도시한다. (A)에서, 면역 블랏 검사는 항-CHIK HMAF(좌측) 또는 항-CHIKV E2 MAb 3E4(우측)을 사용하여 CHIKV(바이러스) 또는 모의-감염된(m.i.) HeLa.Tet-Off/OAS3(OAS3) 세포 및 HeLa.Tet-off 세포(대조군)로부터의 세포 추출물 상에서 실시되었다. β-액틴은 단백질 대조군으로 제공되었다. (B)에서, HeLa.Tet-Off 세포(대조군) 및 1 MOI로 CHIKV로 감염된 HeLa.Tet-Off/OAS3 세포(OAS3)에서 바이러스 RNA 생성의 실시간 RT-PCR 분석이 8h p.i에 실시되었다.
- 도 8은 절단형 OAS3의 항-알파바이러스 활성을 도시한다. HeLa.Tet-off(대조군), HeLa.Tet-Off/OAS3(OAS3) 및 HeLa.Tet-Off/OAS3/delta/1C(OAS3ΔC-term) 세포가 1 MOI로 CHIKV로 감염되었고, 바이러스 후손 생성이 18h p.i에서 결정되었다. 이 값들이 스튜던트 t 검정에 따라 통계적으로 비교되었다(***: P < 0.001).
- 도 9는 절단형 OAS3의 항-플라비바이러스 활성을 도시한다. HeLa.Tet-off(대조군), HeLa.Tet-Off/OAS3(OAS3) 및 HeLa.Tet-Off/OAS3/delta/1C(OAS3ΔC- term) 세포가 1 MOI로 WNV로 감염되었고, 바이러스 후손 생성이 18h p.i에서 결정되었다. 이 값들이 스튜던트 t 검정에 따라 통계적으로 비교되었다(***: P < 0.001).
- 도 10은 I형 IFN 경로에 대한 DV-1 바이러스 민감도를 도시한다. A: DV 감염에 대한 HepG2.Tet-Off 세포주의 민감도. 세포가 증가된 투입량(AP61FFU/세포당)의 DV-1 바이러스 균주 FGA/NA d1d로 감염되었다. 40시간 후-감염에서, 세포는 DV E 당단백질에 반응하는 MAb 4E11을 사용하여 유동 세포 계수기에 의하여 분석되었다. B: I형 IFN 경로에 대한 DV-1 바이러스 민감도. HepG2.Tet-off 세포가 DV 감염(10 MOI) 5시간 전 1,000 IU.mL-1 인간 IFN-α(+IFN)로 예비처리하거나, 처리되지 않았다(모의-처리). 40h p.i.에서, 바이러스 후손 생성이 상기한 바와 같이 결정되었다(Duarte dos Santos et al ., Virology, 2000, 274, 292-).
- 도 11: OAS3-발현 HepG2 세포 내 뎅기열 바이러스 성장의 억제. 2㎍.mL-1 테트라사이클린의 존재(비유도) 또는 부재(유도)에서 어버이(parental) HepG2.Tet-Off 및 HepG2.Tet-Off/OAS3#F8 세포 클론이 다른 감염 다중도로 뎅기열 바이러스 1형 균주 FGA/NA d1d로 감염되었다. 40시간 후-감염에서, 세포는 20분 동안 -20℃에서 메탄올/아세톤으로 고정되었다. 면역형광 검사가 FITC-컨쥬게이트된 항-뎅기열 E mAb 4E1을 사용하여 실시되었다. 핵은 DAPI로 염색되었다. 바이러스 항원에 양성인 HepG2 세포 비율은 삼중 시험으로 결정되었다. 바이러스 후손 생성은 25의 감염 다중도로 결정되었다. 바이러스 적정은 상기한 바와 같이 실시되었다(Duarte dos Santos et al . , Virology, 2000, 274, 292-).
-도 12: OAS3-발현 HepG2 세포는 뎅기열 바이러스 감염에 내성을 보인다. 어버이 HepG2.Tet-Off 및 유도된 HepG2.Tet-Off/OAS3#F8 세포 클론이 뎅기열 바이러스 1형 균주 FGA/NA d1d(Duarte dos Santos et al . , Virology, 2000, 274, 292-)로 30 AP61FFU/세포 감염 다중도로 감염되거나 모의-감염되었다. 40시간 후-감염에서, 면역형광 검사가 도면 부호 11에 기재된 바와 같이 실시되었다.
- 도 13: OAS3-발현 HepG2 세포는 서부 나일 바이러스 감염에 내성을 나타낸다. HepG2.Tet-Off 친세포 클론과 유도된 HepG2.Tet-Off/OAS3#F8 세포 클론이 서부 나일 바이러스 균주 IS-98-ST1(Lucas et al ., Virology J., 2004, 1, 9-)로 1 AP61FFU/세포 감염 다중도로 감염되거나 모의-감염되었다. 40시간 후-감염에서, 세포는 20분 동안 -20℃에서 메탄올/아세톤으로 고정되었다. 면역형광 검사가 cy3-컨쥬게이트 항-서부 나일 E mAb E24를 사용하여 실시되었다. 핵이 DAPI로 염색되었다.
- 도 14는 IFN-α가 인간 상피 HeLa 세포에서 YFV 17D에 대한 항바이러스 상태를 확립할 수 있다는 것을 나타낸다. HeLa 세포는 1 PFU/세포에서 YFV 17D로 감염된 다음, 다양한 시점의 후-감염에서 1,000 IU/mL 인간 IFN-α로 처리되거나, 모의-처리되었다(대조군). 바이러스 후손 생성이 72h 후-감염에서 결정되었다.
- 도 15는 YFV의 17D 생-약독화된 균주가 여러 시점의 후-감염 또는 감염 다중도에도 불구하고 인간 세포에서 OAS3-매개 항바이러스 효과에 대한 예상치 못한 내성을 보인다는 것을 나타낸다. HeLa(대조군) 및 유도된 HeLa.Tet-Off/OAS3(OAS3) 세포가 낮은(패널 A; 1PFU/세포) 또는 높은(패널 B; 10 PFU/cell) 바이러스 투입에서 YFV 균주 17D에 노출되었다.
- 도 16: OAS3-발현 HepG2 세포에서는 황열 백신 17D-204에 대한 억제 없음. 어버이 HepG2.Tet-Off 및 유도된 HepG2.Tet-Off/OAS3#F8 세포 클론이 Vero E6 세포 상에서 일단 성장된 황열 STAMARIL 약독화 생-백신(Sanofi-Pasteur)으로 감염되거나 모의-감염되었다. 40시간 후-감염에서, 세포는 20분 동안 -20℃에서 메탄올/아세톤으로 고정되었다. 면역형광 검사가 항-프렌치 신경조직 친화적 바이러스 HMAF 및 FITC-컨쥬게이트 염소 항-마우스 Ig를 사용하여 실시되었다. 핵이 DAPI로 염색되었다.
- 도 17은 절단된 인간 재조합 OAS3(OAS3 1-843)의 뉴클레오티드(A) 및 아미노산(B) 서열을 나타낸다. 이들 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 25 및 SEQ ID NO: 26에 각각 대응된다. OAS3 mRNA 비교 서열과 클로닝 OAS3 cDNA 단편 사이의 차이는 유사하면 밑줄 그어져 있고, 유사하지 않으면 굵게 표시되어 있다. 번역 개시 및 정지 코돈은 굵게 기재된다. C_말단 c-myc 항원결정기에 대응되는 부가적인 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 밑줄 그어져 있다. 5' NotI 및 3' EcoRV 제한 부위는 이탤릭체로 나타난다.
정의
- "polynucleotide"는 게놈성 DNA 단편, cDNA 단편 또는 RNA 분자를 나타낸다.
- "2'-5'- 올리고아데닐레이트 합성효소 3", " OAS3 ", " OAS 3", "2'-5'- 올리고아데닐레이트 합성효소 3(100 kD )",(2-5')올리고(A) 합성효소 3", " 올리고아데닐레이트 합성효소 p100 ", " p100 ＯＡＳ" 또는 " p100 ＯＡＳ"는 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소 활성을 가지는 포유동물의 OAS3 유전자에 의하여 코드되는 단백질, 또는 변이체가 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소 활성을 가지고, 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스 복제를 억제할 수 있는 경우라면 OAS3 유전자의 다형성에 의하여 생성된 천연 변이체 및 OAS3 유전자/개방형 해독 프레임(ORF) 서열 중 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이(삽입, 결실, 치환)에 의하여 생성된 인공 변이체를 포함하는 유도 변이체를 나타낸다. 바람직하기는, 상기 변이체가 세 개의 OAS 도메인을 포함하는 것이다. OAS3 유전자 및 추론된 OAS3 ORF을 포함하고, 그리고 다양한 포유동물의 아미노산 서열이 서열 데이타베이스에서 입수할 수 있고, 다른 OAS3 유전자/ORF 서열이 당업자에게 공지된 표준 클로닝 및 서열화 기술에 의하여 결정될 수 있다.
- "인간 OAS3 유전자"는 GenBank 서열 수탁번호 NC_000012에서 위치 111860632 내지 111895437에 대응하는 34806 bp 서열이다. 인간 OAS3 유전자는 크로모좀 12(12q24.2) 상에 위치하고, 16개의 엑손: 엑손 1 : 1 내지 264　; 엑손 2 : 3127 내지 3409　; 엑손 3　: 6033 내지 6208　; 엑손 4　: 8300 내지 8538　; 엑손 5　: 9503 내지 9656　; 엑손 6　: 10418 내지 10762　; 엑손 7　: 12250 내지 12532　; 엑손 8　: 22628 내지 22803　; 엑손 9　: 24209 내지 24459　; 엑손 10　: 24870 내지 25014　; 엑손 11　: 25792 내지 25965　; 엑손 12　: 27301 내지 27586　; 엑손 13　: 28975 내지 29150　; 엑손 14　: 29493 내지 29731　; 엑손 15　: 31165 내지 31312　; 엑손 16　: 31519 내지 34806을 포함한다.
- "인간 OAS3 개방형 해독 프레임(ORF)"은 6646bp의 인간 cDNA 서열 GenBank 서열 수탁번호: NM_006187(SEQ ID NO: 27) 상의 위치 88 내지 3351에 대응되는 서열 SEQ ID NO:1이다. cDNA 서열 NM_006187 상의 엑손 1 내지 16의 위치는 각각 다음과 같다: 1 내지 264, 265 내지 547, 548 내지 723, 724 내지 962, 963 내지 1116, 1117 내지 1461, 1462 내지 1744, 1745 내지 1920, 1921 내지 2171, 2172 내지 2316, 2317 내지 2490, 2491 내지 2776, 2777 내지 2952, 2953 내지 3191, 3192 내지 3339, 3340 내지 6627.
- "인간 OAS3 단백질"은 GenBank 수탁번호: NP_006178 또는 SEQ ID NO: 2에 대응되는 1087 아미노산이다; 세 개의 OAS 도메인은 각각 위치 6 내지 343(SEQ ID NO　: 3), 411 내지 742(SEQ ID NO　: 4) 및 750 내지 1084(SEQ ID NO　: 5)에 대응된다.
- "OAS3 활성"은 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소 및 양성-센스 단일 사슬 RNA 바이러스 복제 억제 활성 모두를 나타낸다.
본 발명의 OAS3 단백질의 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소 활성은 형성된 올리고아데닐레이트의 종말점 함량을 결정하는 크로마토그래피 또는 전기영동 방법에 의하여 검사될 수 있다(St Laurent et al ., Cell, 1983, 33, 95-102; Johnston et al ., In : Interferon 3: Mechanisms of Production and Action , 1984, 189-298, Friedman , R.M., Ed , Elsevier , Amsterdam; Justesen et al ., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1980, 77, 4618-4622; Justesen et al ., Nucleic Acids Res., 1980, 8, 3073-3085; Justesen, J. and Kjelgaard, N.O., Anal. Biochem., 1992, 207, 90-93).
- "본 발명의 OAS3 단백질에 의한 양성-센스 ssRNA 바이러스 복제의 억제"는 (세포 게놈에 의하여 코드되지 않은; 예를 들면 재조합 OAS3 단백질) 외인성 OAS3 단백질이 바이러스-감염된 세포에 존재할 때, 바이러스 성장(바이러스 증식)의 부분적 또는 전체적 감소를 의미한다. 이러한 억제는 양성-센스 단일 사슬 RNA 바이러스를 갖는 OAS3 단백질을 발현하는 적절한 재조합 세포주를 감염시킴으로써 정해질 수 있다. 바이러스로 감염된 동일한 형태의 비-재조합 세포는 대조군으로 이용된다. 그 다음, 바이러스-감염된 세포의 상청액에서의 후손 바이러스 생성이 임의의 공지된 바이러스 역가 검사에 의하여 측정될 수 있다. 그 대신, 바이러스 단백질 생성은 바이러스 항원의 면역표지화 또는 웨스턴-블랏에 의하여 분석될 수 있거나, 또는 바이러스 게놈 및 서브게놈 RNAs 생성이 노던-블랏 또는 RT-PCR에 의하여 분석될 수 있다.
- "양성-센스 ssRNA 바이러스"는 유전자 물질로서 양성-센스 단일 사슬 리보핵산(ssRNA)을 가지고, DNA 중간체를 사용하여 복제하지 않는 바이러스를 나타낸다. 양성-센스 ssRNA 바이러스는 바이러스를 분류하는 발티모어 분류 시스템의 그룹 Ⅳ에 속한다.
- 아미노산 서열 및 핵산 서열과 관련하여 "동일성( identity )"은 정렬된 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 사이의 동일성을 극대화하는 서열 정렬을 기준으로 두 서열의 동일성 정도의 척도를 나타내는데, 이는 동일한 잔기 또는 뉴클레오티드의 수, 총 잔기(본 발명의 경우 1087 잔기) 또는 뉴클레오티드(본 발명의 경우 3261 뉴클레오티드)의 수, 및 서열 정렬에서의 존재 및 길이 또는 갭의 상관관계이다. 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 컴퓨터 프로그램이 GCG 서열 분석 패키지(University of Wisconsin, Madison, Wis.)의 일부로 입수할 수 있고, 그리고 예를 들어 디폴트 셋팅과 같이 사용될 수 있는, FASTA 또는 BLAST를 포함하여, 표준 파라미터를 사용하여 서열 동일성을 결정하는데 사용될 수 있다.
SEQ ID NO: 2의 잔기 1 내지 1087과 75% 동일성을 갖는 단백질은, 단백질 서열이 정렬되어 SEQ ID NO: 2 중 잔기 1 내지 1087과 비교될 때, 서열이 (25 x 10.87 = 271)까지의 변화를 포함할 수 있는 단백질이다. 하나의 변화는 SEQ ID NO: 2의 잔기 1 내지 1087과 비교할 때, 하나의 아미노산이 결실, 치환, 또는 삽입되는 것을 의미한다. 예를 들면, SEQ ID NO: 2의 처음 1080 잔기에서 50개의 변화를 가지는 1080 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2와 1080-50/10.87= 94.75%의 동일성을 갖는다. 예를 들어, SEQ ID NO: 2의 잔기 1 내지 1087 중 50개의 변화를 가지는 1090 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2와 1087-50/10.87= 95.4%의 동일성을 갖는다.
- "유사성( similarity )"은 정렬된 아미노산 잔기 사이의 유사성을 극대화하는 서열 정렬을 기준으로 두 아미노산 서열의 유사성 정도의 척도를 나타내는데, 이는 동일하거나 유사한 잔기의 수, 총 잔기(본 발명의 경우 1087 잔기) 수, 및 서열 정렬에서의 존재 및 길이 또는 갭과의 상관관계이다. 다양한 정렬 알고리즘 및/또는 컴퓨터 프로그램이 GCG 서열 분석 패키지(University of Wisconsin, Madison, Wis.)의 일부로 입수할 수 있고, 그리고 예를 들어 디폴트 셋팅과 같이 사용될 수 있는, FASTA 또는 BLAST를 포함하여, 표준 파라미터를 사용하여 서열 유사성을 결정하는데 사용될 수 있다. 유사한 잔기는 공통적인 화학적 특성(크기, 전하(중성, 염기성, 산성), 친수성/소수성)을 갖는 잔기를 의미한다.
- "개체( individual )"는 포유동물 및 다른 척추동물(예: 조류, 어류, 및 파충류)을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "포유동물" 및 "포유동물의"라는 용어는 유아에게 젖을 먹이고, 살아있는 유아를 낳거나(진수류(eutharian) 또는 태반류 동물), 알을 낳는(후수류(metatharian) 또는 비태반류 동물), 단공류(monotremes), 유대류(marsupial), 및 태반류(placental) 동물을 포함하는 모든 척추동물을 의미한다. 포유동물 종의 예는 인간 및 다른 영장류(예: 원숭이, 침팬지), 설치류(예:랫트, 마우스, 기니 피그) 및 예를 들어 소, 돼지, 및 말과 같은 다른 동물을 포함한다.
- "돌연변이"는 폴리뉴클레오티드(cDNA, 유전자) 또는 폴리펩티드 서열에서 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드/아미노산의 치환, 결실, 삽입을 의미한다. 상기 돌연변이는 유전자 또는 그의 조절 서열의 코딩 서열에 영향을 줄 수 있다. 또한, 코드되는 mRNA의 구조/안정성 또는 게놈 서열의 구조에도 영향을 줄 수 있다.
본 발명은 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 변형을 포함하는 변성 OAS3 단백질을 포함한다: OAS3 아미노산 서열 중 하나 또는 그 이상의 아미노산의 돌연변이(삽입, 결실, 치환), 아미노산 융합 모이어티의 부가, 비-천연 아미노산(D-아미노산 또는 비-아미노산 유사체)에 의한 아미노산 잔기의 치환, 펩티드 결합의 변화, 환화(사이클화), 측쇄(지질, 올리고- 또는 폴리사카라이드)에 화학적 기의 부가, 및 적절한 운반체와의 결합. 당업계에 공지된 과정에 의하여 도입되는 이들 변형은 2',5'-올리고아데닐레이트 합성효소 및 양성-센스 단일 사슬 RNA 바이러스 복제 활성의 억제에 대하여 여전히 활성이 있는 변성된 OAS3 단백질을 생성한다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3(OAS3)은 인간 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 OAS3 단백질은 SEQ ID NO: 2의 잔기 1 내지 1087에 대하여 적어도 70%의 아미노산 서열 동일성 또는 적어도 80%의 아미노산 서열 유사성, 바람직하기는 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성 또는 적어도 90%의 아미노산 서열 유사성을 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 OAS3 단백질은 SEQ ID NO: 2의 381 위치에 세린을 포함하는 것이다. 바람직하기는, 상기 OAS3 단백질은 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 7로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 이를 포함하는 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 OAS3 폴리뉴클레오티드가 앞서 정의된 단백질을 코드하는 것이고, 더 바람직하기는 단백질 SEQ ID NO: 7을 코드하는 단백질 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 6을 코드하는 SEQ ID NO: 1로 이루어지는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 이를 포함하는 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드가 발현 벡터에 삽입되는 것이다.
벡터는 링크된 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 본 발명에 사용될 수 있는 벡터는 염색체의, 비-염색체의, 반-합성의 또는 합성의 핵산으로 이루어질 수 있는 벡터, 플라즈미드, RNA 벡터, 또는 선형이나 환형의 DNA 또는 RNA 분자를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 벡터는 자율적 복제(에피좀성 벡터) 및/또는 링크된 핵산의 발현(발현 벡터)이 가능한 것이다. 다수의 적절한 벡터가 당업자에게 공지되어 있고, 상업적으로 유용하다.
바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파르보바이러스(예: 아데노-관련 바이러스 또는 AAVs), 코로나바이러스, 오르소-믹소바이러스(예: 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스(예: 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라-믹소바이러스(예: 홍역 및 센다이 바이러스)와 같은 음성 사슬 RNA 바이러스, 피코르나바이러스 및 알파바이러스와 같은 양성 사슬 RNA 바이러스, 및 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(예: 단순 헤르페스 바이러스 1형 및 2형, 엡스타인-바 바이러스, 사이토메갈로바이러스) 및 폭스바이러스(예: 우두, 계두, 카나리아 폭스)를 포함하는 이중-사슬 DNA 바이러스를 포함한다. 다른 바이러스는 예를 들면, 노르워크(Norwalk) 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파포바바이러스, 헤파드나바이러스 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 조류 백혈병 육종, 포유동물 C-형, B-형 바이러스, D형 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티-바이러스, 스푸마바이러스를 포함한다(Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
바람직하기는 상기 벡터가 발현 벡터인 것으로, 여기서 본 발명의 OAS3 단백질을 코드하는 서열은 상기 단백질의 생산이나 합성을 허용하는 적절한 전사 및 번역 조절 요소의 조절 하에 배치된다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 카세트에 포함된다. 더 바람직하기는, 상기 벡터가 복제 기원, 상기 코딩 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터, 리보좀-결합 부위, RNA-스플라이싱 부위(게놈 DNA가 사용될 때), 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 부위를 포함한다. 이는 또한 인핸서를 포함할 수 있다. 프로모터의 선택은 폴리펩티드가 발현되는 세포에 의존할 것이다. 적절한 프로모터는 조직 특이성 그리고/또는 유도 프로모터를 포함한다. 유도 프로모터의 예는 증가된 수준의 중금속에 의하여 유도되는 진핵생물 메탈로티오닌 프로모터, 증가된 온도에 의하여 유도되는 열 충격 프로모터이다. 조직 특이성 프로모터의 예는 골격근 크레아틴 키나아제, 전립선-특이성 항원(PSA), 안티트립신 프로테아제, 인간 계면활성제(SP) A 및 B 단백질, 및 b-카제인이다. 벡터는 선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 예를 들면: 진핵세포 배양을 위한 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제, 히스티디놀 디하이드로게나아제, 디하이드로폴레이트 환원효소, 하이그로-마이신 포스포트랜스퍼라아제, 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아데, 아데노신 디아미나아제, 글루타민 합성효소, 및 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트란스퍼라아제; 사카로미세스 세레비시애(S. cerevisiae)에서의 TRP1, URA3 및 LEU2; 대장균(E. coli)에서의 테트라사이클린, 리팜피신, 또는 암피실린 내성.
벡터의 선택은 이의 용도(안정성 또는 일과성 발현)에 그리고/또는 숙주 세포에 의존한다; 바이러스 벡터 및 "네이키드" 핵산 벡터가 포유동물 세포(인간 및 동물)에서의 발현을 위하여 바람직한 벡터이다. 용도는, 무엇보다도, 관심의 서열이 미리 삽입된, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 AAVs와 같은 바이러스 벡터로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 주요부는 상기한 바와 같은, 바람직하게는 발현 벡터에 삽입된, 하나 이상의 OAS3 단백질 또는 하나 이상의 OAS3 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 허용가능한 부형제, 운반체, 첨가제 및/또는 면역증강제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물이다.
당업자에게 공지된 임의의 적절한 운반체가 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있고, 운반체 형태는 투여 방식에 따라 달라질 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구적 투여를 위해서는, 운반체가 물, 염수 완충액, 락토오스, 만니톨, 글루타메이트, 지방 또는 왁스를 포함하는 것이 바람직하고, 주입가능한 약제학적 조성물은 바람직하기는 등장액(약 300-320 mosmole)인 것이다. 경구적 투여를 위하여, 상기한 임의의 운반체, 또는 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈쿰, 셀룰로오스, 글루코오스, 슈크로오스, 및 마그네슘 카보네이트와 같은 고형 운반체가 사용될 수 있다. 또한, 생분해성 마이크로스피어(예: 폴리락틱 갈락타이드)는 본 발명의 약제학적 조성물을 위한 운반체로 사용될 수 있다. 적절한 생분해성 마이크로스피어가 예를 들면, 미국특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 개시되어 있다. 첨가제는 항응고제, 항산화제, 염료, 향미 증진제, 또는 진정, 응집 또는 분리제 중에서, 그리고 일반적으로 제약 산업에서 통상적으로 사용되는 임의의 부형제 중에서 선택될 수 있다. 임의의 다양한 면역증진제가 면역 반응을 증진시키기 위하여 본 발명의 조성물에 사용될 수 있다.
약제학적 조성물은 경구 투여에 적합한 형태일 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 경구 투여용 정제, 일반적인 캡슐, 젤라틴 캡슐, 또는 시럽 형태이다. 이러한 젤라틴 캡슐, 일반적인 캡슐, 및 정제 형태는 애쥬번트 또는 전분과 같은 바인더, 검 및 젤라틴, 칼슘 포스페이트와 같은 애쥬번트, 옥수수전분 또는 알젠산과 같은 분해제, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 감미제 또는 풍미제와 같은 약리학적 제제에 통상적으로 사용되는 부형제를 포함할 수 있다. 용액이나 현탁액은 약리학적으로 상용성있는 용매 첨가에 의하여 수성 또는 비수성 매질에서 제조될 수 있다. 이는 글리콜, 폴리글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리글리콜 에테르, DMSO 및 에탄올을 포함한다.
OAS3 단백질 또는 OAS3 폴리뉴클레오티드(단리되거나 또는 벡터에 삽입된)는 단독으로 또는 적어도 적당한 부형제 및/또는 운반체와 함께, 특정 세포 형태에 적합한, 당업계에 공지된 임의의 편리한 수단에 의하여, 인 비트로, 엑스 비보, 또는 인 비보에서 세포 내로 도입된다. 예를 들면, OAS3 단백질/폴리뉴클레오티드는 유기체에서 상기 서열에 대한 방어를 제공하거나 또는 이들이 숙주-세포막을 통과할 수 있게 하는 성분과 연결될 수 있다. OAS3 단백질은 리포좀, 폴리에틸렌이민(PEI), 및/또는 막 이동 펩티드와 연결되는 것이 유리할 수 있다(Bonetta, The Scientist, 2002, 16, 38; Ford et al., Gene Ther., 2001, 8, 1-4; Wadia and Dowdy, Curr. Opin. Biotechnol., 2002, 13, 52-56; Langel, U. In Handbook of cell penetrating peptides (2nd Ed.), 2006, Lavoisier, FRANCE); 후자의 경우, OAS3 단백질의 서열은 막 이동 펩티드(융합 단백질)의 서열과 융합된다. 폴리뉴클레오티드 코딩 OAS3(단리되거나 벡터에 삽입된)가 다양한 방법(예: 주입, 직접 섭취, 발사체 포격, 리포좀, 전기천공)에 의하여 세포에 도입될 수 있다. OAS3 단백질은 상기한 적절한 발현 벡터를 사용하여 세포 내로 안정적으로 또는 일과적으로 발현될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, OAS3 단백질/폴리뉴클레오티드는 실질적으로 비-면역원성, 즉 면역학적 부작용을 거의 또는 전혀 일으키지 않는 것이다. 이 종류의 유해한 면역반응을 줄이거나 제거하기 위한 다양한 방법이 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, OAS3 단백질은 실질적으로 N-포밀 메티오닌이 없는 것이다. 원하지 않는 면역 반응을 피하기 위한 다른 방법은 (바람직하기는 500 내지 20,000 달톤의 평균 분자량(MW)의) 폴리에틸렌 글리콜("PEG") 또는 폴리프로필렌 글리콜("PPG")에 단백질/폴리뉴클레오티드를 컨쥬게이트하는 것이다.
본 발명의 다른 주요부는 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스로의 감염을 예방하거나 치료하기 위한 상기한 OAS3 단백질을 코드하는 OAS3 단백질 또는 폴리뉴클레오티드이다.
보다 바람직한 구체예에 따르면, 상기 바이러스는 알파바이러스 (Alphavirus) 속인 것이다. 보다 바람직하기는, 치쿤구니아(CHIK), 신드비스 (Sindbis: SIN), 셈리키 삼림열(Semliki Forest: SF), 동부 말 뇌염(Eastern Equine Encephalitis: EEE), 서부 말 뇌염(Western Equine Encephalitis: WEE), 베네주엘라 말 뇌염(Venezuelan Equine Encephalitis: VEE), 롯스 리버(Ross River: RR), 오'니옹 니옹(O'Nyong Nyong: ONN) 및 바르마 삼림열(Barma Forest: BF) 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
보다 더 바람직한 구체예에 따르면, 상기 바이러스는 플라비바이러스(Flavivirus) 속인 것이다. 보다 바람직하기는, 상기 바이러스가 뎅기열, 일본 뇌염, 키아사눌 삼림열병(Kyasanur Forest Disease), 머레이 계곡 뇌염(Murray Valley Encephalitis), 세인트 루이스 뇌염, 진드기-매개 뇌염, 서부 나일, 황열, 및 옴스크 출혈열(Omsk hemorrhagic fever: OHF) 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
다른 보다 바람직한 구체예에 따르면, 상기 바이러스는 헤파시바이러스(Hepacivirus) 속인 것이다. 보다 바람직하기는, 상기 바이러스가 C형 간염 바이러스인 것이다.
또한, 본 발명의 주요부는 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 동시에, 분리되어, 연속적으로 사용하기 위한 복합 제제로서, 상기한 바와 같이 바람직하기는 발현 벡터에 삽입된, 적어도 OAS3 단백질 또는 OAS3 폴리뉴클레오티드와 이 제1의 성분과 다른 제2의 성분을 함유하는 제품으로서, 상기 제2의 성분이 항바이러스성, 항염증성, 및 면역조절성 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 주요부는 또한 임의의 수단에 의하여, 상기한 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 감염의 예방이나 치료가 필요한 개체에서 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법이다.
일반적으로, 조성물은 피부나 직장을 통하여, 비경구적 주입(예: 피부내, 근육내, 정맥내, 또는 피하), 비강적으로(예: 흡인 또는 분무), 경구적으로, 설하로, 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물에 존재하는 OAS3(단백질/폴리펩티드)의 함량은 치료적으로 유효한 함량이다. OAS3(단백질/폴리펩티드)의 치료적으로 유효한 함량은 조성물이 투여되는 개체에서 지나치게 부정적인 효과를 유발하는 일 없이 OAS3 단백질이 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스 복제를 억제하는 역할을 실행하는데 필요한 함량이다. 사용될 OAS3(단백질/폴리펩티드)와 투여될 조성물의 정확한 함량은 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스 종 및 치료될 개체종(인간, 동물), 투여 방식, 투여 빈도, 및 조성물 내 다른 성분과 같은 요인에 따라 달라질 것이다.
바람직하기는, 조성물이 OAS3(단백질/폴리펩티드) 약 10㎍ 내지 10㎎, 더 바람직하기는 약 100㎍ 내지 1㎎을 포함하는 것이다. "약"이란, OAS3의 상기한 양(㎍ 또는 ㎎) 값이 이러한 양을 평가하는데 사용되는 방법의 오차의 마진에 따라 일정한 범위 내에서 변할 수 있다는 의미이다.
예를 들어, 본 발명의 조성물을 경구 투여하는 동안, 치료되는 개체는 연속 3일 동안 매일 OAS3(단백질/폴리펩티드) 약 10㎍ 내지 10㎎의 1회 투여량 계획으로 투여받을 수 있다. 이 치료는 일주일 후 한 번 반복될 수 있다.
피하 주사와 같은 비경구적 투여에서, 치료되는 개체는 OAS3(단백질/폴리펩티드) 약 10㎍ 내지 10㎎, 더 바람직하기는 약 100㎍ 내지 1㎎의 1회 투여량으로 투여받을 수 있다. 이 치료는 일주일 후 한 번 반복될 수 있다.
본 발명의 주요부는 또한 상기 개체로부터 얻어진 핵산 샘플에서 OAS3 유전자의 다형성을 검출하는 것을 포함하는, 상기한 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스로의 감염에 대한 개체의 민감성을 평가하기 위한 인 비트로 방법이다.
핵산 샘플은 게놈 DNA, 총 mRNA 또는 cDNA일 수 있다.
다형성은, 예를 들면 In Current Protocols in Human Genetics , 2008, John Wiley & Sons , Inc에 기재된 핵산 서열에서의 돌연변이를 검출할 수 있는 당업계에서 공지된 임의의 방법에 의하여 검출된다. 유전자형 검사의 예는 특별한 제한없이 다음을 포함한다: RAPD, RFLP, AFLP, 서열 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화, SnapShot PCR, 리가아제 검출 반응, PCR 및 Maldi-TOF, 파이로서열화(Pyrosequencing). 이 검사는 표 2 및 3의 OAS3 특이적 프라이머, 특히 프라이머 SEQ ID NO: 11, 12, 62 내지 86, 및 118 내지 142를 사용할 수 있다.
상기 방법의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스는 치쿤구니아 바이러스와 같은 알파바이러스 또는 뎅기열 바이러스와 같은 플라비바이러스이다.
상기 방법의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 다형성은 Arg844 코돈이 정지 코돈(R844X)으로 돌연변이되는 것이다; 백인종에게서 검출된 상기 다형성은 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스 감염, 특히 치쿤구니아 바이러스 감염에 증가된 민감성과 관련된다. R844X 돌연변이는 한 쌍의 프라이머(SEQ ID NO: 11 및 SEQ ID NO: 12)를 사용하는 PCR-RFLP, 이어지는 BglII로 183bp PCR 생성물의 소화에 의하여 검출될 수 있다; 115bp와 68bp의 두 단편의 존재는 OAS3.R844X 돌연변이의 존재를 나타낸다.
상기 방법의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 상기 다형성은 코돈 381의 세 번째 위치에서의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)이다. 바람직하기는 상기 SNP가 Arg에서 Ser으로 변한 코돈 AGG-381의 G에서 C로의 치환인 것이다(R381S). 유전자 데이타는 변이체 Ser-381이 뎅기열 환자에서 DSS의 위험에 대응하는 우세한 방어와 관련된다(표 6). 이 SNP는 상기한 바와 같은 임의의 적절한 유전자형 검사에 의하여 검출될 수 있다. 예를 들면, 이 검사는 표 3에 나타낸 OAS3 엑손 6에 특이적인 한 쌍의 PCR 프라이머(SEQ ID NO: 70 및 126)와 같은 한 쌍의 OAS3 특이적 프라이머로 증폭된 게놈 DNA의 직접 서열화를 포함할 수 있다.
본 발명의 주요부는 또한 서열 SEQ ID NO: 7 또는 SEQ ID NO: 30으로 이루어지거나 이를 포함하는 단리된 OAS3 단백질이다.
본 발명의 주요부는 또한 서열 SEQ ID NO: 9로 이루어지거나 이를 포함하는 단리된 OAS3 단백질 단편이다; SEQ ID NO: 7의 1 내지 843 잔기를 포함하는 이러한 OAS3 단편은 OAS3의 첫 번째 및 두 번째 OAS 도메인을 포함하지만 대부분의 세 번째(C-말단) OAS 도메인이 부족하다.
본 발명의 주요부는 또한 다음과 같다:
- SEQ ID NO: 7의 OAS3 단백질을 코드하는 서열 SEQ ID NO: 6로 이루어지거나 이를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드,
- SEQ ID NO: 9의 OAS3 단백질 단편을 코드하는 서열 SEQ ID NO: 8로 이루어지거나 이를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드,
- OAS3 단백질 변이체 SEQ ID NO: 30을 코드하는 서열 SEQ ID NO: 28 또는 29로 이루어지거나 이를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 주요부는 또한 재조합 벡터, 바람직하기는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28 및 SEQ ID NO: 29로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터이다.
본 발명의 주요부는 또한 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 28 및 SEQ ID NO: 29로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열로 이루어지거나 이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의하여 형질 주입(transfection) 또는 형질 전환(transformation)된 숙주이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 기탁 번호 I-3927로 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)에 2008년 2월 26일 기탁된 HeLa-Tet-Off/OAS3#C417-1로 명명된 재조합 인간 OAS3를 발현하는 HeLa-Tet-Off 세포주이다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 기탁 번호 I-3968로 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)에 2008년 4월 17일 기탁된 HeLa-Tet-Off/OAS3/delta/1C로 명명된 절단 재조합 인간 OAS3를 발현하는 HeLa-Tet-Off 세포주이다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 기탁 번호 I-4158로 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)에 2009년 5월 15일 기탁된 HeLa-Tet-Off/OAS3#F8로 명명된 재조합 인간 OAS3를 발현하는 HepG2-Tet-Off 세포주이다.
다양한 바이러스로 감염될 수 있는 HeLa 또는 HepG2 세포에서 유래한 이들 세포주는 OAS3 매개 항 바이러스 활성에 대한 바이러스의 민감성을 분석하는 데 유용하다.
본 발명의 주요부는 또한 상기한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-인간 형질전환 동물이다.
본 발명의 주요부는 또한 상기한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환 식물이다.
본 발명의 OAS3 단백질/폴리뉴클레오티드는 공지된 재조합 DNA 및 유전 공학 기술을 사용하여 제조된다. 예를 들면, OAS3 ORF를 포함하는 서열이 특정 프라이머로의 폴리머라아제 사슬 반응에 의하여 DNA 주형으로부터 증폭된다. 그 다음 PCR 단편은 적절한 제한 부위를 사용하여 발현 벡터에 클로닝된다. OAS3 단백질이 OAS3 단백질의 발현에 적합한 조건 하에서 발현 벡터에 의하여 변화된 숙주 세포 또는 형질전환 동물/식물에서 발현되고, OAS3 단백질은 숙주 세포 배양액으로부터 또는 형질전환 동물/식물로부터 회수된다.
달리 기재되지 않는 한, 본 발명의 실시는, 당업계의 기술 내에 있는, 통상적인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 형질전환 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 잘 설명되어 있다. 예를 들면, Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition,(Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis(M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization(B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized cells And Enzymes(IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning(1984); the series, Methods In ENZYMOLOGY(J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York), specifically, Vols.154 and 155(Wu et al. eds.) and Vol. 185, "Gene Expression Technology"(D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV(D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); 및 Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) 참조. Current Protocols in Human Genetics(John Wiley & Sons, Inc, 2008)의 경우 특히 제12장 "Vectors For Gene Therapy" 및 제13장 "Delivery Systems for Gene Therapy" 참조.
실시예
실시예 1 : HeLaTet - Off / OAS3 세포주의 확립 및 평가
1) 재료 및 방법
a) 세포 배양
HeLa.Tet-Off 세포주를 BD BIOSCIENCES CLONTECH에서 구입하였다. HeLa.Tet-Off 세포를, 10% 열-불활화된 송아지 태아 혈청(FCS), 4 mM L-글루타민, 100 UI/ml 페니실린, 10 ㎍/ml 스트렙토마이신, 및 200 ㎍.mL-1 G418(INVITROGEN)이 보충된DMEM(INVITROGEN)에서, 37℃로 5% CO2 내에 유지하였다.
HeLa.Tet-Off/OAS3 세포주(CNCM I-3927)를 DMEM, 10% FCS, 4 mM L-글루타민, 100 UI/ml 페니실린, 10 ㎍/ml 스트렙토마이신, 200 ㎍.mL-1 G418, 100 ㎍.mL-1 하이그로마이신 B(BD BIOSCIENCES CLONTECH), 및 2 ㎍.mL-1 테트라사이클린(SIGMA-ALDRICH) 내에 유지하였다. 이들 세포를 단층으로 성장시켰다; 예상되는 세포 밀도는 80% 내지 100%이다; 개체군 이배수 시간은 약 2일이다. 이들 세포를 트립신화에 의하여 수확한다; 이를 매주 1/10 서브-배양한다. 이들 세포는 제한된 수명을 가진다(15 내지 20 계대). 이들 세포를 20% FCS, 10% DMSO, 4 mM 글루타민, 100 UI/ml 페니실린, 10 ㎍/ml 스트렙토마이신, 200 ㎍.mL-1 G418, 100 ㎍.mL-1 하이그로마이신 B, 및 2 ㎍.mL-1 테트라사이클린이 보충된 DMEM에서 냉동하였다.
HeLa.Tet-Off/OAS3/delta/1C(OAS3ΔC- term) 세포주(CNCM I-3968)를 DMEM, 10% FCS, 20 mM L-글루타민, 10,000 UI/ml 페니실린, 10 ㎍/ml 스트렙토마이신, 200 ㎍.mL-1 G418, 100 ㎍.mL-1 하이그로마이신 B(BD BIOSCIENCES CLONTECH), 및 10 ㎍.mL-1 테트라사이클린(SIGMA-ALDRICH) 내에 유지하였다. 이들 세포를 단층으로 성장시켰다; 예상되는 세포 밀도는 90%이다; 개체군 이배수 시간은 약 2일이다. 이들 세포를 트립신화에 의하여 수확한다; 이를 매주 1/10 서브-배양한다. 이들 세포는 제한된 수명을 가진다(25 계대). 이들 세포를 20% FCS, 10% DMSO, 4 mM 글루타민, 10,000 UI/ml 페니실린, 10 ㎍/ml 스트렙토마이신, 200 ㎍.mL-1 G418, 100 ㎍.mL-1 하이그로마이신 B, 및 10 ㎍.mL-1 테트라사이클린이 보충된 DMEM에서 냉동하였다.
b) OAS3 단백질 발현 HeLa . Tet - Off 세포주의 확립
PCR4-TOPO 벡터(INVITROGEN)에서 별도로 클로닝되는 인간 OAS3의 두 개의 중첩 cDNA 단편이 전장 OAS3 단백질(aa 1 내지 1,087; SEQ ID NO: 24 및 도 1) 또는 절단형 OAS3ΔC- term 또는 OAS3[1-843](aa 1 내지 843; SEQ ID NO: 26 및 도 3C, 9 및 17)
이 연구에 사용된 비교 서열인 OAS3 서열(GenBank 기탁 번호 NM-006187; SEQ ID NO: 27) 및 OAS3 cDNA(도 1) 사이의 뉴클레오티드 및 아미노산 차이가 표 1에 나열된다.
표 1: OAS3 mRNA 비교 서열과 클로닝된 OAS3 cDNA 사이의 뉴클레오티드 및 아미노산 차이
OAS3 mRNA
상의 위치 (NM_006187
또는 SEQ ID NO: 27)		 OAS3 단백질 상의 위치 (NP_006178
또는 SEQ ID NO: 2)		 NM _006187 (6646 bp ) 클로닝된 OAS3
cDNA(3264 bp ) 		OAS3 -Δ Cterm
(2532 bp )
NT
(SEQ ID
NO: 27)		 AA
(SEQ ID NO: 2)		 NT
(SEQ ID
NO: 6)		 AA
(SEQ ID
NO: 7)		 NT
(SEQ ID
NO: 8)		 AA
(SEQ ID
NO: 9)
140 18 G Arg A Lys A Lys
204 39 C Ala T Ala T Ala
2617 844 C Arg C Arg T 정지
2681 865 G Trp C Ser 　 　
3303 1072 A Gly G Gly 　 　
* 번역에서의 차이는 회색으로 강조되어 있다.
OAS3 서열을 PCR로 변성시켜, 부가적인 10-잔기 서열 EQKLISKEDL(SEQ ID NO: 10), 이어지는 OAS3에 대한 프라이머 커플 pTet-OAS3-univ1 및 pTet-OAS3-rev2 및 OAS3[1-843]에 대한 프라이머 커플 pTet-OAS3-univ1bis 및 pTet-OAS3-rev2bis을 갖는 정지-코돈에 의하여 3 개방형 해독 프레임 단부 상에 접근되게 하였다(표 2).
표 2: 프라이머 서열 ( SEQ ID NO : 11 내지 22)
프라이머 뉴클레오티드 서열(5'→3')
OAS3.R844X-F gtggtgttcctcagctgctt
OAS3.R844X-R catcgtctgggatgtcagtg
pTet-OAS3-univ1 attaatgcggccgcaacgaaaccagaaatccgaaggcc
pTet-OAS3-rev2 aactaactatag tcaaaggtcctccttggagatgagcttctgttc
cacagcagccttcactggccatggctggatggg
pTet-OAS3-univ-1bis attaatgcggccgcatggacttgtacagcaccccggccgctgcg
pTet-OAS3-rev-3bis aactaactatag tcaaaggtcctccttggagatgagcttctgttcgatct
cggagatgatctcggcccgccgcttgttgcc
OAS3-For cggacggtgctggggctcgtg
OAS3-Rev cttgtcttcgagtagaggcttctc
Chik/E2/9018/+ caccgccgcaactaccg
Chik/E2/9235/- gattggtgaccgcggca
GAPDH-For gggagccaaaaggg
GAPDH-Rev ggggacacggaagg
효소 인지 부위는 밑줄 그어져 있다. 정지 코돈에 상보적인 서열은 굵게 표시된다. OAS3 서열(SEQ ID NO: 23 및 25)은 하류 및 상류 단부에서 각각 NotI 및 EcoRV 제한 효소 부위에 인접한다. PCR 산물은 NotI 및 EcoRV로 소화된 다음 pTRE2hyg 발현 벡터(BD BIOSCIENCES CLONTECH)의 독특한 부위 NotI 및 EcoRV로 삽입되어 pTRE2hyg-OAS3(도 1) 및 pTRE2hyg/OAS3CΔC- term(OAS3 1-843)을 제조하였다. 이 배열에서, OAS3 삽입은 Tet-Off 발현 시스템의 조절 하에 있다. Tet-Off 시스템은 억제인자 테트라사이클린(Tet)을 철수시켜 외부 유전자 발현의 유도를 가능하게 한다. HeLa.Tet-Off 세포(BD BIOSCIENCES CLONTECH)를 제조자의 추천 공정에 따라 형질주입 시약 Fugene 6(ROCHE)를 사용하여 pTRE2hyg-OAS3 또는 pTRE2hyg/OAS3CΔC- term으로 형질주입시켰다. Tet-Off 발현 시스템이 배양 배지로 2㎍/ml의 Tet를 첨가하여 억제되었다. 형질주입된 세포를 억제자 G418과 하이그로마이신을 함유하는 성장 배지 상에서 선택한 다음 10㎍.mL-1의 억제인자 테트라사이클린(Tet) 존재 하에서 희석을 제한하여 단일 세포로부터 클로닝하였다. Tet 철수를 위하여, 세포 단층을 트립신화하고, 유전자 독성약 만을 보충한 DMEM/10% FBS로 대체하기 전, 세포를 비-보충 DMEM으로 최소 5번 이상 세정하였다. 비유도 세포(+Tet)에서의 재조합 OAS3 mRNA 생성 수준에 대한 유도된 세포(-Tet)에서의 생성 수준이 프라이머 OAS3-For 및 OAS3-Rev 커플을 사용하여 RT-PCR 분석에 의하여 결정되었다(표 2). 이 실험에 기초하여, 유도성 HeLa.Tet-Off/OAS3#C417-1 및 HeLa.Tet-Off/OAS3/delta/1C(OAS3ΔC- term) 클론이 선택되었다. HeLa.Tet-Off/OAS3#C417-1 세포주를 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)에 기탁 번호 I-3927로 2008년 2월 26일 기탁하였다. HeLa-Tet-Off/OAS3/delta/1C 세포주를 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)에 기탁 번호 I-3968로 2008년 4월 17일 기탁하였다. 양쪽 HeLa.Tet-Off/OAS3 세포주를 2 ㎍.mL-1 Tet의 존재 하에서 억제 조건 하에 유지하였다.
c) 바이러스
모기 애데스 슈도스쿠텔라리스(AP61) 세포 단층 상의 임상적 단리체 치쿤구니아 균주 06-49(CHIKV 06-49; Schuffenecker et al ., PLoS Medicine 3, 2006, e263)의 생성 및 포커스 면역검출 검사에 의한 바이러스 적정(Despres et al., Virology, 1993, 196, 209-219)을 이전에 기재된 바와 같이 실시되었다(Brehin et al ., Virology, 2008, 371, 185-195). 감염도 역가는 AP61 세포 상에서 포커스 형성 단위(FFU)로 표현되었다. 항바이러스 효과를 검사하기 위하여, 인간 IFN-α(BIOSOURCE)를 1,000 IU.mL-1로 배양 매질에 직접 첨가하였다.
d) 면역 블랏 검사
세포성 단백질을 이전에 기재된 바와 같이(Brehin et al ., Virology, 2008, 371, 185-195) 면역 블랏 검사하였다. 바이러스 단백질 발현을 항-CHIKV HMAF 또는 항-CHIK.E2 MAb 3E4을 사용하여 검출하였다(Brehin et al ., Virology, 2008, 371, 185-195). OAS3 단백질 발현을 항-OAS3 N-term(Santa-Cruz) 또는 C-term(ABGENT) 항체를 사용하여 검출하였다.
e) 유동 세포 계수기 분석
세포를 분리한 다음 PBS 중 3.2% 파라포름알데히드로 고정하였다. 고정된 세포를 침투시키고, 항-CHIKV HMAF로 염색하고, 이전에 기재된 바와 같이 유동 세포 계수기로 분석하였다(Brehin et al ., Virology, 2008, 371, 185-195).
2) 결과
첫째, CHIKV 감염에 대한 HeLa.Tet-Off 친세포주의 민감성을 평가하였다(도 3a). 1의 감염 다중도(MOI)로 감염된 이들 세포의 CHIKV 복제의 분석은, 후손 바이러스의 생성이 18h p.i.에서 ~ 7.0 로그 FFU.mL-1에 도달된다는 것을 보여준다. CHIKV E2 당단백질에 반응하는 MAb 3E4를 사용하는 유동 세포 계수기 분석에 의하여(Brehin et al ., Virology, 2008, 371, 185-195), 약 50%의 CHIKV-감염된 HeLa.Tet-Off 세포가 바이러스 항원에 대해 양성이었다. 그 다음, HeLa.Tet-Off 세포에서 항바이러스 상태를 확립하는 IFN-α 활성을 조사하였다. CHIK 노출 5시간 전 1,000 IU.mL-1 인간 IFN-α로의 HeLa.Tet-Off 세포의 예비처리(1 MOI)는 18h p.i에서의 바이러스 역가의 약 1.5 로그 감소를 나타내었다(도 3b). 따라서, IFN-의존적 항바이러스 경로가 HeLa.Tet-Off 세포에서 기능하고, 세포 수준에서 CHIKV에 대항하는 방어를 제공한다. 그러나, CHIKV-감염된 세포는 5h p.i. 일회성 바이러스 복제에서 감염된 HeLa.Tet-Off 세포 내에서 IFN-α에 대한 완전한 저항성을 확립한다는 것을 보여준다.
Tet-Off 발현 시스템의 조절 하에서 OAS3 단백질 발현을 상향 조절하는 안정한 HeLa.Tet-Off/OAS3#C417-1 세포 클론이 대형 OAS의 항바이러스 활성을 평가하기 위하여 선택되었다. 재조합 OAS3 단백질은 3개의 잠재적 활성 촉매 부위를 포함하는 3개의 인접 OAS 유니트(도메인 I, II, 및 III)로 구성된다(도 3c). 재조합 OAS3 단백질의 발현이 인간 OAS3 단백질의 C-말단 영역에 대응하여 유도된 폴리클론성 면역 혈청으로 세포 용해물의 면역 블랏에 의하여 분석되었다(도 3d). 양성 대조군으로 5시간 동안 1,000 IU.mL-1의 IFN-α와 함께 배양된 세포들이 제공되었다. IFN-α 처리시, 내생성 OAS3 분자의 생성이 HeLa.Tet-Off 세포에서 검출된 반면, OAS3의 기초적 발현은 휴지 세포에서는 관찰되지 않았다. 따라서, OAS3 유전자 발현이 IFN-α/β에 의하여 활발하게 상향-조절될 수 있다. 재조합 OAS3 단백질의 기본 수준이 비유도 HeLa.Tet-Off/OAS3 세포(2 ㎍.mL-1 Tet)에서 관찰되어 차단(shut-off)이 불완전하다는 것을 나타낸다(도 3d). 배양 매질로부터 24시간에 억제인자 Tet를 제거할 때, 비유도 세포에서 발견된 것과 비교하여 재조합 OAS3의 생성 수준에서 현저한 증가가 있었다.
실시예 2 : CHIKV 에 대한 OAS3 의 항바이러스 효과
1) 재료 및 방법
실험 과정은 실시예 1에 기재된 바와 같다.
2) 결과
인간 상피 세포에서 CHIKV 성장에 대한 OAS3 단백질의 효과를 조사하기 위하여, HeLa.Tet-Off/OAS3 세포를 1 MOI로 CHIKV.06-49로 18시간 감염시켰다. MAb 3E4를 사용하여 유동 세포 계수기에 의하여 결정된 바와 같이, 비유도 HeLa.Tet-Off/OAS3 및 HeLa.Tet-Off 세포가 CHIKV 감염에 대해 유사한 민감도를 보였다(도 4a). 바이러스 노출 24시간 전 HeLa.Tet-Off/OAS3 세포의 유도는 CHIKV-감염된 세포의 적어도 20% 이상의 감소를 나타내었다. 양성 대조군으로서, IFN-α 처리는 감염된 HeLa.Tet-Off 세포의 비율을 75% 감소시켰다. 따라서, CHIKV는 인간 상피 세포에서 OAS3의 전위 발현에 민감하다.
HeLa.Tet-Off/OAS3 세포가 CHIKV 성장을 억제하는 효율을 더 평가하기 위하여, 유도된 세포들을 증가된 CHIKV-06.49 투여에 노출시켰다(도 4b). 18h p.i.에서, 재조합 OAS3 단백질 발현은 시험된 MOI에 상관없이 후손 바이러스 생성을 1.5 내지 2.0 로그 감소시켰다. 24h p.i.에서, 시험된 더 낮은 MOI로 바이러스 역가에 약 3.0 로그 감소가 있었다. 따라서, OAS3 발현은 인간 섬유 아세포에서 CHIKV의 세포-대-세포 전파를 억제할 수 있다. 적절한 MOI로, 바이러스 후손은 여전히 적어도 2.0 로그 감소하였다. 10 MOI로, 바이러스 성장은 약 0.5 로그 정도만 감소하였는데, 이는 감염이 높은 바이러스 투입에서 감염이 실행될 때, CHIKV가 OAS3의 항바이러스 활성을 회피하는 능력을 가진다는 것을 제시한다.
운동학 연구는 CHIKV의 OAS3-매개 억제가 바이러스 수명 사이클 동안 유효하다는 것을 보여준다(도 4c). 12h p.i.에서, HeLa.Tet-Off 세포와 비교하여 HeLa.Tet-Off/OAS3 세포로부터 회수된 바이러스 역가에 2.0 로그 감소가 있었다. OAS3 단백질 발현의 유도는 24h p.i에서 여전히 1.5 로그 이상 후손 바이러스 생성을 감소시킬 수 있었다.
세포 용해시 배양 배지로 방출되므로 막 강도의 척도가 되는 세포질 효소인, 젖산 탈수소효소(LDH)의 측정은, 감염된 친세포와 비교하여 첫 번째 24h 감염 내에 감염된 HeLa/Tet-Off/OAS3 세포의 생활성을 현저히 손실시키지 않는다는 것을 보여준다. 따라서, CHIKV 감염에 대한 내성은 세포 자멸 유도를 통한 바이러스-감염 세포의 감소보다는 오히려 OAS3의 항바이러스 활성에 직접 관련되었다.
실시예 3 : 인간 OAS3 발현 HeLa . Tet - Off 재조합 세포주에서의 다른 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스에 대한 OAS3 의 항바이러스 활성
1) 재료 및 방법
실험 과정은 실시예 1에 기재된 바와 같다. 또한, 바이러스 생성 및 적정은 하기한 바와 같이 실행되었다.
바이러스
모기 애데스 슈도스쿠텔라리스(AP61) 세포 단층 상에서 낮은 계대배양의 서부 나일 바이러스(WNV) IS-98-ST1 균주(GenBank 기탁 번호 AF 481864)의 생성 및 포커스 면역검출 검사에 의한 바이러스 적정(Despres et al ., Virology, 1993, 196, 209-219)이 이전에 기재된 바와 같이 실행되었다(Brehin et al ., Virology, 2008, 371, 185-195; 국제 출원 WO 02/081741). 감염도 역가는 AP61 세포 상에서 포커스 형성 단위로 발현되었다. 신드비스 바이러스 균주 AR339(SINV AR339) 및 셈리키 삼림열 바이러스 균주 SF 64(SFV 64)를 아프리카 녹색 원숭이 신장(VERO) 세포주에서 증식시키고, 감염도 역가를 VERO 세포 상에서 플라크 형성 단위(PFU)로 표시하였다. 항바이러스 효과를 검사하기 위하여, 인간 IFN-α(BIOSOURCE)를 1,000 IU.mL-1로 배양 매질에 직접 첨가하였다.
2) 결과
인간 상피 세포에서 SINV 균주 AR339, SFV 균주 SF 64 및 WNV 균주 IS-98-ST1의 성장을 억제하는 대형 OAS의 활성을 조사하였다(도 4d, 5 및 6). HeLa.Tet-off 및 유도된 HeLa.Tet-Off/OAS3 세포를 1 MOI로 알파바이러스로 감염시켰다. OAS3 단백질 발현에 응하여, 18h p.i에서 SINV와 SFV 사이의 후손 바이러스 생성에서 비슷한 억제 정도(~ 2 로그)가 있었다(도 4d). HeLa.Tet-off 및 유도된 HeLa.Tet-Off/OAS3 세포를 0.1, 1 또는 10 MOI로 플라비바이러스(WNV)로 48시간 감염시켰다(도 5 및 6). 바이러스 역가 측정에 기초하여, WN 바이러스 복제를 효율적으로 억제함으로써 인간 상피 세포가 OAS3 발현에 반응한다는 것이 나타난다. 0.1 MOI로, HeLa.Tet-Off 세포와 비교하여 HeLa.Tet-Off/OAS3로부터 회수된 바이러스 역가에서 1.5 로그 감소가 있었다(도 6). OAS3 단백질 발현의 유도로 72h 후-감염에서 후손 바이러스 생성이 적어도 1.0 로그 감소할 수 있었다. 따라서, OAS3-발현 HeLa 세포는 친세포와 비교하여 WN 바이러스 감염에 더 낮은 민감도를 보인다. 결론적으로, 이 데이타는 OAS3가 인간 세포 내에서 알파바이러스 및 플라비바이러스와 같은 RNA 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 가진다는 것을 보여준다.
실시예 4: OAS3 -매개 CHIKV 억제의 기작
1) 재료 및 방법
실험 과정은 실시예 1에 기재된 바와 같다. 또한, 정량적 RT-PCR은 하기한 바와 같이 실행되었다.
정량적 RT - PCR
이전에 기재된 바와 같이(Kajaste-Rudnistki et al., J. Biol. Chem., 2006, 281, 4624-4637), 본질적으로 SYBR® Green PCR을 사용하여 바이러스 RNA 축적의 실시간 RT-PCR 분석을 ABI Prism 7700 서열 검출로 실시하였다.
CHIKV E2 유전자용 프라이머는 Chik/E2/9018/+ 및 Chik/E2/9235/-이다(표 2). GAPDH mRNA을 각 샘플의 표준화용 내생성 서열 대조군으로 사용하였다. 프라이머 GAPDH-For 및 GAPDH-Rev이 표 2에 나열되어 있다. 바이러스 RNA 카피수의 정량을 위하여, 이전에 기재된 바와 같이(Vazeille et al., PLoS One, 2007, 2(11): e1168) 인 비트로에서 E2의 N-말단 영역을 코드화하는 CHIK RNA 전사체를 표준 곡선을 만들기 위하여 실시하였다.
2) 결과
OAS3의 항바이러스 활성의 분자적 기준을 해결하기 위한 노력으로, CHIKV 성장의 억제가 구조적 바이러스 단백질 축적의 부족에 기인한 것인지 여부를 결정하였다. 전체 단백질을 18h 시점 후-감염에서 Hela.Tet-off 및 유도된 HeLa.Tet-Off/OAS3 세포로부터 추출하였고, 캡시드 단백질(C), 외피 당단백질 pE2(E2의 전구체), E2, 및 E1이 항-CHIKV HMAF를 사용하여 면역 블랏에 의하여 검출된 반면, 외피 당단백질 pE2(E2의 전구체) 및 E2가 항-CHIKV E2 MAb 3E4를 사용하여 면역 블랏에 의하여 특이적으로 검출되었다. 도 7a에 나타난 바와 같이, OAS3 단백질 발현에 반응하는 바이러스 구조 단백질의 배경 수준이 있었다. 따라서, OAS3-발현 HeLa 세포를 효율적으로 감염시키는 CHIKV의 불활성은 바이러스 단백질 합성의 심한 감소와 관련된다.
바이러스 단백질 합성의 비효율성이 바이러스 RNA의 축적의 부족에 기인하는지 여부를 결정하였다. 총 RNA를 8h 시점 후-감염에서 Hela.Tet-off 및 유도 HeLa.Tet-Off/OAS3 세포로부터 추출하고, 게놈 및 서브 게놈 바이러스 RNAs의 생성을 CHIKV E2 유전자를 기준으로 디자인된 프라이머를 가지고 RT-PCR 검사를 사용하여 분석하였다. 실-시간 RT-PCR 분석에 의하여 결정된 바와 같이, 친세포에서 발견된 것과 비교하여 OAS3-발현 세포로부터 회수된 바이러스 RNA 수준이 2 로그 감소하였다(도 7b). 따라서, OAS3 발현이 감염된 세포 내의 바이러스 RNA 축적을 방해한다. 이들 결과에 기초하여, OAS3 발현이 감염된 세포 내의 알파바이러스 복제에 영향을 준다고 결론지을 수 있다.
실시예 5 : 건강한 개체에서 OAS3 유전자 다형성의 OAS3 항바이러스 효과에 대한 영향
1) 재료 및 방법
실험 과정은 실시예 1에 기재된 바와 같다. 또한, OAS3 다형성의 유전자형이 하기한 바와 같이 검사되었다.
유전자형( Genotyping )
표 2에 기재된 한 쌍의 프라이머 OAS3.R844X-F(SEQ ID NO: 11) 및 OAS3.R844X-R(SEQ ID NO: 12)를 사용하여 PCR-RFLP 검사에 의하여 SNP OAS3.R844X의 유전자형을 검사하였다. 183 bp-길이 PCR 산물을 Bgl II로 소화시켰고, 115와 68 bp의 두 단편의 검출은 OAS3.R844X 존재를 나타내었다.
2) 결과
OAS3 유전자가 다형성에 대하여 선별되었다. 48명의 건강한 백인 개체에서 총 16개의 엑손, 측면 인트론 및 OAS3 유전자의 2kb 5'을 재-서열화하여, C 대신 T를 치환하여 논-센스 돌연변이(OAS3.R844X)를 생성하는 코돈 CGA-844의 첫 번째 위치에서 단일-뉴클레오티드 다형성(SNP)을 확인하였다(표 1). 이 SNP를 180명의 건강한 백인 개체에서 추가로 선별하여, 0.5%의 대립 유전자 빈도(allele frequency)를 제공하는 두 이형접합체(heterozygote)를 동정하였다. OAS3.R844X는 아마 카르복시 말단으로부터 OAS3 단백질의 약 20%를 절단하기 때문에(도 3c), OAS3-1 내지 OAS3-843 서열을 함유하는 안정한 HeLa.Tet-off/OAS3ΔC- term 세포 클론이 생성되었다. OAS3ΔC- term은 OAS3의 제3의 도메인의 활성 촉매 부위를 한정하는 3가 원소를 구성하는 D889 잔기가 부족하다는 것을 주목하는 것은 흥미롭다(Sarkar et al ., 1999; Rambouillat et al., 2000). CHIKV 및 WNV 성장을 억제하는 돌연변이 OAS3의 활성을 평가하기 위하여, HeLa.Tet-Off/OAS3가 유도되고, HeLa.Tet-off/OAS3ΔC- term 세포를 1 MOI로 CHIKV-06-49 또는 서부 나일 바이러스(WNV) IS-98-ST1 균주로 감염시켰다. 도 8 및 9에 도시된 바와 같이, OAS3ΔC- term-발현 세포는 CHIKV 및 WNV 감염에 내성을 보여, OAS-1 내지 OAS3-843 서열이 여전히 방어를 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 바이러스 성장의 분석은, OAS3ΔC- term의 전위 발현이 전장 OAS3와 비교하여 CHIKV 및 WNV 억제에 더 낮은 효율을 나타낸다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 코돈 CGA-844에서의 SNP가 항바이러스 활성에 영향을 가질 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 6 : 인간 OAS3 를 발현하는 Hep . G2 . Tet - Off 세포주에서 DV 및 WNV 에 대한 OAS3의 항바이러스 활성
1) 재료 및 방법
a) 세포 배양
HepG2.Tet-Off 세포주를 CLONTECH(# 632106)로부터 구입하였다. HepG2.Tet-Off 세포를 10% 열-불활화된 송아지 태아 혈청(FCS), 4 mM L-글루타민, 100 UI/ml 페니실린 G 나트륨, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 설페이트(GIBCO, # 15140-122), 0.1 mM 비-필수 아미노산, 및 100 ㎍.mL-1 G418(GIBCO, # 10131-019)이 보충된 DMEM(GIBCO, # 41965)에서, 37℃로 5% CO2 내에 유지하였다.
HepG2.Tet-Off/OAS3#F8 세포주(CNCM I-4158)를 DMEM, 10% FCS, 4 mM L-글루타민, 100 UI/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 100 ㎍.mL-1 G418, 100 ㎍.mL-1 하이그로마이신 B(CLONTECH, # 631309), 및 2 ㎍.mL-1 테트라사이클린(SIGMA-ALDRICH, # T-7660)에서 유지하였다.
b) OAS3 단백질 발현 HepG2 . Tet - Off 세포주의 확립
전장 인간 OAS3 단백질(SEQ ID NO: 24)를 발현하는 유도성 HepG2.Tet-Off/OAS3#F8 클론을 유도성 HeLa.Tet-Off/OAS3#C417-1에 대하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 선택하였다. HepG2.Tet-Off/OAS3#F8 세포주는 기탁 번호 I-4158로 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)에 2009년 5월 15일 기탁되었다.
이 세포주를 2 ㎍.mL-1 Tet의 존재의 억제 조건 하에서 유지하였다.
c) 바이러스
모기 애데스 슈도스쿠텔라리스(AP61) 세포 단층 상에서 낮은 계대의 서부 나일 바이러스(WNV) IS-98-ST1 균주(GenBank 기탁 번호 AF 481864; Lucas et al. , Virology J., 2004, 1, 9-)의 생성 및 포커스 면역검출 검사에 의한 바이러스 적정(Despres et al ., Virology, 1993, 196, 209-219)이 이전에 기재된 바와 같이 실행되었다(Brehin et al ., Virology, 2008, 371, 185-195). DV1 균주 FGA/NA d1d의 생성 및 바이러스 적정이 이전에 기재된 바와 같이 실행되었다(Duarte dos Santos et al . , Virology, 2000, 274, 292-). 감염도 역가를 AP61 세포 상에서 포커스 형성 단위(FFU)로 표현하였다. 항바이러스 효과를 검사하기 위하여, 인간 IFN-α(BIOSOURCE)를 1,000 IU.mL-1로 배양 매질에 직접 첨가하였다.
d) 면역형광 검사
바이러스-감염된 세포를 20분 동안 -20℃에서 메탄올/아세톤으로 고정하였다. 면역형광 검사는 FITC-컨쥬게이트 항-뎅기열 E mAb 4E1 또는 cy3-컨쥬게이트 항-WNV.E MAb E24를 사용하여 실시되었다. 핵은 DAPI로 염색되었다.
2) 결과
첫째, DV 감염에 대한 HepG2.Tet-Off 친세포주의 민감도를 평가하였다(도 10a). 세포를 DV-1 바이러스 균주 FGA/NA d1d의 세포마다 다른 포커스 형성 단위(AP61FFU)로 감염시켰다. 40h 후-감염에서, 세포를 DV E 당단백질에 반응성인 MAb 4E11를 사용하여 유동 세포 계수기에 의하여 분석하였다. 세포당 30 AP61FFU의 DV-1 바이러스 투입으로, 약 50%의 HepG2.Tet-Off 세포를 뎅기열 E 당단백질에 대한 양성 신호에 의하여 입증되는 바와 같이 DV-1 바이러스로 감염시켰다.
그 다음, HepG2.Tet-Off 세포에서 항바이러스 상태를 확립하는 IFN-α의 활성이 조사되었다. DV 감염(10 MOI) 5시간 전 1,000 IU.mL-1 인간 IFN-α로 HepG2.Tet-off 세포를 예비처리하면 40h p.i.에서 바이러스 역가가 0.7 로그 감소하였다(도 10b). 따라서, IFN-의존적 항바이러스 경로는 HepG2.Tet-Off 세포에서 기능하고, 세포 수준에서 DV에 대한 방어를 제공한다.
Hep.G2 세포에서 DV 성장에 대한 OAS3 단백질의 효과를 조사하기 위하여, 유도(-Tet) 및 비유도(+Tet) HepG2.Tet-Off/OAS3 세포 및 HepG2.Tet-Off 친세포를 DV-1 바이러스 균주 FGA/NA d1d의 투입을 증가시켜 감염시켰다. 40h p.i.에서, 항-뎅기열 E mAb를 사용하여 면역형광 검사를 실시하고, 바이러스 항원에 양성인 HepG2 세포의 비율을 결정하였다(도 11 및 12). 후손 바이러스 생성을 25의 감염 다중도로 결정하였다(도 11). 재조합 OAS3 단백질 발현은 DV-감염 세포를 적어도 75% 이상(도 11 및 12), 그리고 후손 바이러스 생성을 2 로그 감소시켰다(도 11).
따라서, OAS3-발현 HepG2 세포는 DV 감염에 내성을 나타낸다.
Hep.G2 세포의 WNV 성장에 대한 OAS3 단백질의 효과가 면역형광 검사에 의하여 또한 분석되었다. 어버이 HepG2.Tet-Off 및 유도 HepG2.Tet-Off/OAS3#F8 세포 클론을 감염 다중도 1 AP61FFU/세포에서 서부 나일 바이러스 균주 IS-98-ST1로 감염시키거나 모의-감염시켰다. 40h 후-감염에서, 바이러스 항원(WNV E 당단백질)을 cy3-컨쥬게이트 mAb E24를 사용하여 면역형광에 의하여 검출하였다. 결과(도 13)는 HeLa 세포(실시예 3)에서 얻어진 것을 확인하였고, OAS3-발현 인간 세포가 WNV 감염에 대한 내성을 보인다는 것을 나타낸다.
실시예 7 : 황열 바이러스의 약독화 17D-204 생-백신 균주는 인간 세포에서 대형의 인간 2',5'- 올리고아데닐레이트 합성효소( OAS3 )에 의하여 매개된 항바이 러스 효과에 대하여 놀라운 내성을 보인다.
1) 재료 및 방법
황열 바이러스(YFV) 약독화 백신 균주(STAMARIL®, AVENTIS-PASTEUR)를 아프리카 녹색 원숭이 신장(VERO) 세포주에서 증식시키고, 감염도 역가를 VERO 세포 상에서 플라크 형성 단위(PFU)로 표시하였다. 항바이러스 효과를 검사하기 위하여, 인간 IFN-α(BIOSOURCE)를 1,000 IU.mL-1로 배양 매질에 직접 첨가하였다. 항-프렌치 신경조직 친화적 바이러스 HMAF 및 FITC-컨쥬게이트 염소 항-마우스 Ig를 사용하여, 면역형광 검사를 실시예 6에 기재된 바와 같이 실시하였다.
2) 결과
실시예 2, 3, 4 및 6은, IFN-α/β에 의하여 매개되는 OAS3-의존적 항바이러스 활성이 인간 세포에서 치쿤구니아 바이러스와 같은 알파바이러스 및 서부 나일 및 뎅기열 바이러스와 같은 플라비바이러스에 대한 주된 인간 세포 방어 전략을 나타낸다는 첫 번째 증거를 제공한다.
OAS3가 황열 바이러스(YFV)에 대한 항바이러스 활성을 나타내는지 여부를 조사하였다. 이를 위하여, YFV의 약독화된 17D-204 생백신 균주(STAMARIL, Aventis-Pasteur)를 아프리카 녹색 원숭이 신장(VERO) 세포주에서 두 번 증식시키고, 감염도 역가를 VERO 세포 상에서 플라크 형성 단위(PFU)로 표시하였다. HeLa 세포를 1 PFU/세포에서 YFV 17D로 감염시킨 다음, 다양한 시점의 후-감염에서 1,000 IU/ml 인간 IFN-α로 처리하거나, 모의-처리(대조군)하였다. 바이러스 후손 생성을 72h 후-감염에서 결정하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, IFN-α는 인간 상피 HeLa 세포에서 YFV 17D에 대한 항바이러스 상태를 확립할 수 있다. 바이러스 성장을 억제하는 OAS3의 활성을 평가하기 위하여, HeLa(대조군) 및 유도 HeLa.Tet-Off/OAS3(OAS3) 세포를 낮은(1PFU/세포; 도 15A) 또는 높은(10 PFU/세포; 도 15B) 바이러스 투입으로 YFV 균주 17D에 노출시켰다. 양쪽 세포 개체군 사이에 YFV 복제에 명확한 차이는 없었다(도 15). 운동학 연구는 17D가 후-감염의 시점이나 감염 다중도에 상관없이 인간 세포에서 OAS3-매개 항바이러스 효과에 대한 내성이 있다는 것을 보여준다.
OAS3 매개 항바이러스 효과에 대한 YFV 17D의 내성은 YFV 17D로 감염된 어버이 HepG2.Tet-Off 및 HepG2.Tet-Off/OAS3#F8 세포 클론에서 면역형광 검사에 의하여 확인되었다(도 16).
YFN의 약독화 생 균주가 OAS3의 항 플라비바이러스 활성에 대한 예기치 못한 내성을 보인다는 관찰은 플라비바이러스의 약독화 기작을 설명하기 위한 새로운 장을 연다.
실시예 8: OAS3 의 비-유사성 변이체가 뎅기열 충격 신드롬의 병인과 관련된다.
1) 재료 및 방법
a) 환자 및 대조군
3년의 기간(2000년 6월-2003) 동안 징후에 의하여 뎅기열 바이러스(DV)가 감염된 750명의 환자(남성:여성 비 = 0.99)를 태국, 방콕의 2 병원, 라마티보디(Ramathibodi: '라마'로 약칭하기도 함) 병원 및 마히돌 대학의 시리라즈(Siriraj) 병원, 태국의 콘-캔 주의 한 병원으로부터 연구에 등록시켰다. 환자들의 연령은 평균이 9.6살인 1 내지 25살 범위였다. 고열, 심각한 두통, 안와후 통증, 근육통, 관절통, 구토와 발진을 포함하는 임상 특징에 기초하여 뎅기열 바이러스 감염이 의심되는 환자를 임상적 관찰 및 치료를 위하여 위 병원에 입원시켰다. 뎅기열 바이러스 감염의 증상은 후 급성 및/또는 회복기 혈청에서 상응하는 IgG 및 IgM 효소-연결된 면역흡수 검사 적정에 의하여 나중에 확인되었다. DF(뎅기열) 및 DHF(뎅기 출혈열)의 다른 증상을 혈액 농축이나 늑막 삼출로 나타난 증가된 혈관 투과성에 대한 증거의 부재(DF) 또는 존재(DHF) 기준으로 확립하였다. 특이적으로, DHF의 증상은 다음 4가지 특징 모두에 기초하여 이루어졌다: 1) 2-7일간 지속되는 높은 지속적인 열, 2) 양성 지혈대 시험, 붉은 반점, 자반병 또는 토혈과 같은 출혈 경향, 3) 혈소판 감소증(혈소판 수 < 100,000/㎕) 및 4) 혈액 농축(20% 이상의 혈소판 증가)이나 늑막 삼출로 나타나는 증가된 혈관 투과성으로 인한 혈장 누출의 증거. 명확하지 않은 임상 증상으로 인하여 DF나 DHF로 분류될 수 없는 일부 뎅기열 환자를 미상의 DF/DHF 상태로 분류하였다. DHF의 심각성은 WHO 기준에 따라 4 등급으로 분류하였다. 등급 Ⅲ과 Ⅳ는 심한 충격으로, 특징적으로 증가된 심장 이완기 혈압을 갖는 맥압이 좁은 DHF였다. 이차 감염은 뎅기열-특이적 IgM/IgG 비 < 1.8로 정의되었다. 연구의 목적과 프로젝트 프로토콜이 환자와 이들의 부모나 친척에게 주의 깊게 설명되었다. 정보에 입각한 동의를 모든 개체로부터 개별적으로 얻었다. 프로토콜은 각 병원의 윤리 위원회에서 승인받았다.
대조군들은 라마티보디 병원으로부터 296명의 혈액 기증자와 시리라즈 병원으로부터 216명의 혈액 기증자, 및 콘-캔 주로부터 184명의 인종 일치된 건강한 대조군으로 이루어진다(남성:여성 비=1). 양 케이스와 대조군은 태국의 방콕 및 중심부로부터 나왔다. EDTA 상에 전체 혈액 샘플을 환자 및 대조군으로부터 수집하고, DNA를 표준 페놀/클로로포름 추출 방법을 사용하여 추출하였다.
2004-2006년 동안, 본 발명자들은 같은 임상 및 바이러스 증상 기준을 사용하여 라마티보디 및 콘-캔 병원으로부터 254명의 환자(남성:여성 비=1.07)를 등록하였다.
b) 다형성 동정 및 유전자형
개별 DNA 샘플에서, PCR 증폭된 게놈 DNA의 직접적인 서열화에 의하여 다형성을 동정하였다(24명의 뎅기열 환자와 32명의 타이인 대조군). OASs 엑손, 인트론 및 5' 및 3' 영역의 일부의 서열화를 위하여 사용된 프라이머를 표 3에 나타내었다.
표 3: OAS3 서열화 프라이머 ( SEQ ID NO : 31 내지 142)
유전자/엑손 전방 프라이머 서열 역 프라이머 서열 PCR 산물 크기
OAS1/pro1 CCAGGAGTTCGAGACCAGAC TGCAGGGACAGTCACAGAAC 546
OAS1/pro1 GGTGAGGCATAGGGGATTTT ATAGGAGGTGGGGCTTGACt 409
OAS1/pro3 CCTTGAACCCAGGAAGTTGA CCTTTGTCCTTTAGCCAGCA 498
OAS1/pro4 CTTTTTGCAGTGGGCATGTA TGTCAATGGCATGGTTGATT 503
OAS1/exon1 TTTGCAAAAGGAAAGTGCAA GAAACCACCATCCCAGAAGA 503
OAS1/exon2 AGCATCCATTTTCCCATCTG CCCACCCTGCTTTAGAGAGA 604
OAS1/exon3 GGATCAGGAATGGACCTCAA GGCTCCTCTCTCCACCTCTT 499
OAS1/exon4 AATGAATGAGCCTGGATTCG TACAATGATGGGCAACAGGA 493
OAS1/exon5 GAGCCCTTCCTCATGTTCTG ATAAATGGCCTTTGGCAAGA 396
OAS1/exon6-1 AGCTGGGGCTTGTTAGTCCT TGGAATGAAGTGAGGCTGTG 502
OAS1/exon6-2 GCTCCTCAGTGAGCTGGTGT TCCATGAGGACAGGGATTTT 508
OAS1/exon6-3 CGGCCATGTCATTGTTTTTAT ACTGCCAGAGTGGAGATGCT 560
OAS2/pro1 AAAGCACAGGCTTTGGAGTC TGAGCCCAGGTACCCAGATA 600
OAS2/pro2 TTGGGGGAGCTCAGTCTTTA CTGACTTGCTCAGGGACACA 583
OAS2/pro3 TTTCTGGCTCACACACTTGG AGCAGGGAAACCAAAACTGA 602
OAS2/pro4 CGATGTGCTCAAGGACAGAC CCATTTCCCATTGCTCTCAG 480
OAS2/exon1 CCTCCCATCCTACCATTCAC GTCACACAGCTCTGGAGCAA 394
OAS2/exon2 ATGAGCATCCCAATCAGGTC GAGAGCGAGTCCAGGGTAGA 597
OAS2/exon3 TGACCGATTAAGCAAGAGTCG TGTTGCACTTTACTGGATGTCA 379
OAS2/exon4 TAAGAGAGGTCCCTGCTCCA GGACCTCCCCTCTTTCAGAC 595
OAS2/exon5 GAGGGGCTTGATGTCGTAGA CTCTGCCAACACCCTGATTT 511
OAS2/exon6 TTGTGTGCCACTCCAAACTC TAACTCCTGGCTTCCCTTCC 500
OAS2/exon7 CAGAACTTGGCCTTGGAAAC CCCATGCTTGGAAAAGAGAA 594
OAS2/exon8 GGAGATGCTCCCTGTGTCTT GGGTTAGTGATGGGAACGTC 499
OAS2/exon9 TCCAAGCTGCAGAGTGTGAG GCCCCTGCTAGGTTTTATCC 532
OAS2/exon10-1 CGCGGCCTCTAGAAAGTTAC GGTTGTCACTGGGAGAGGAG 593
OAS2/exon10-2 AGGCAGGTAACCCCAGATTC GCACAAGAGAGCCTCCAAAC 606
OAS2/exon10-3 TGGTTCTCTCCACCAGGTTC GGATGGATCCTAGCTCCACA 496
OAS2/exon11-1 GTAGGGAAGAGGTGGCCAAG GACTGGAAGGAAAAAGGAGGA 600
OAS2/exon11-2 GTCTTGCCTTGCTGAACTCC AAGGCTAAAGCCCAAGGAAA 484
OAS2/exon11-3 CCAGCCAACCCTTTCATTAG CACATGCTTGGTCTTTCTGG 450
OAS3/pro1 TATTGACCCTTCTGCGTTCC GCACACCTGAGCTCTCTTCC 607
OAS3/pro2 GGAGAGAGGACCTGGGAGTT CGACCATGGTGTAGGTGCTA 602
OAS3/pro3 CCAGCCAGACAACTTTCCAG TCGGATTTCTGGTTTCGTTT 609
OAS3/exon1 AAGTGGGTGTCAGGTCCAAG TGTCAAGCGGGCTTAAGAGT 615
OAS3/exon2 ACAGTCTCTCCCCAGCACAC CCCAGGTCAAACAGCAAGTT 490
OAS3/exon3 AAAGCTCCAGGCTCTCTTCC TGCACAAGGGACATAAACAGA 481
OAS3/exon4 GGCTGAAGCTACCAGTGAGG CTAATGTGCATCTGGGCTGA 580
OAS3/exon5 TCGAGGCTCAGAGAGGGTAA GCCTCCCAATGTGTTGAGAT 451
OAS3/exon6 GGCACCTTTTTCAACTCTGC CCAGCAAATCATCCTTCCTG 654
OAS3/exon7 CATGCAGTCGACCTTTGTCA TCAATGCTTGGTCAAGTAGGAG 545
OAS3/exon8 CCACTGTGCAGTTACTGGATG AAGCAAAGGAGGGGAGATGT 508
OAS3/exon9 CTAGGCAAAAGCCACGTCTG GGAAGCAGAGTGAGGAGTGG 606
OAS3/exon10 CCCAATAGCTTTCCAACCAA GCTGGGACGTAGCAATCTGT 500
OAS3/exon11 CCTCAGAACCTACCCACCAG GGACATATCTGGGCCCTCTC 494
OAS3/exon12 TGACTTGTCCAAGGTCACACA AAAGGGGCCCTCTTCTTTAG 566
OAS3/exon13 ATCCCAGACCACCCTTAGGA CTCCACCAACCCAGGATCT 407
OAS3/exon14 AAAGTTTTGGGGTTGCTTTG ATTGACCGTTTGTCCCTCAG 490
OAS3/exon15 TCTAGCCCCTGCAAAGTGTT ATGGGAAAATGGAAGCACAG 395
OAS3/exon16-1 ATCTGTGGTGCCAAAGGAAG GCAGGAGGAAAGATGTGAGC 591
OAS3/exon16-2 CCTCCCATGGCTTACACACT CATAGCATGCATGTCCCAAC 599
OAS3/exon16-3 CAGGAGAGCATGCCCATATT GAGAGCCTCCTGGATGGAC 259
OAS3/exon16-4 GAGATTCTGCATCCCCACAG TAGACCCACTCCCTCATCCA 609
OAS3/exon16-5 CTCTGGCTGCAGAGGAGTCT GCCCTGAGCTCTTGGATATG 597
OAS3/exon16-6 AACGCTAAGGGCACCTTCTT GGGTGTTTTTAGGGTGACCA 603
OAS3/exon16-7 CACCCTGGTGTTGGCATATT AGAAGGGTGAGAGCTTTATGG 634
서열화 결과를 Genalys 소프트웨어에 의하여 분석하였다(Takahashi et al ., J. Bioinform. Comput Biol., 2003, 1, 253-265). OAS3-R381S은 추천된 프로토콜로 ABI Prism 7000 서열 검출 시스템을 사용하는 TaqMan 검사에 의하여 유전자형을 조사하였다. OAS3 서열의 보다 더 일반적인 변이체의 코돈 381은 아르기닌에 대응되는 AGG이다. rs2285933으로 명명된 다형 OAS3-R381S은 아르기닌으로부터 세린으로 아미노산을 변화시키는 OAS3의 코돈 381의 세 번째 뉴클레오티드에서의 G를 C로 치환(AGG에서 AGC로)한 것이다. OAS3-(R381 and S381) mRNA의 두 변이체, ORF 및 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 28, 29, 30(R381) 및 SEQ ID NO: 27, 1 및 2(S381)에 각각 대응된다.
c) 통계학적 분석
본 발명자들은 Haploview 프로그램으로 수행되는 피어슨 카이자승 검정에 의하여 대립인자 계수를 사용하여 관련 연구를 실행하였다(Barrett et al ., Bioinformatics, 2005, 21, 263-265). 이 프로그램은 실험적 P 값을 얻기 위하여 순열 검정(permutation test)를 실행할 수 있게 한다. 본 발명자들은 STATA 버젼 9를 사용하여 시험된 유전자 모델에 따라 유전자형 결과를 코딩하는 로지스틱 회귀 분석을 실행하였다.
2) 결과
2000-2003년 동안, 본 발명자들은 방콕 내 두 병원(Siriraj, SI 및 Ramathibodi, RA)으로부터 580명과 태국 북-동부, 콘-캔 주(KK)의 다른 병원으로부터 170명의 뎅기열 환자를 모집하였다. 일반적인 개체의 유전자 빈도를 나타내기 위하여 방콕 내 같은 병원에서 512명의 혈액 기증자와 태국의 북동부 지방으로부터 184명의 건강한 지원자로부터의 DNA 샘플을 수집하였다. 이들 환자와 대조군의 일부에 대한 유전자 연구가 이전에 보고된 바 있다(Sakuntabhai et al ., Nature Genetics, 2005, 37, 507-513). 바이러스 진단은 혈청학적 시험에 의하여 확인되었고, 환자들은 WHO 기준에 따라 4그룹으로 분류되었다: DF(혈장 누출 증거가 없음), 및 DHF1(혈장 누출 증거 있음), DHF2(자발적 출혈 있음) 및 DSS(충격 있음)(표 4).
표 4: 연구된 개체에서의 질병 심각도
2001-2003 2004-2006
병원 병원
임상 진단 시리라즈 라마티보디 콘캔 총합 라마티보디 콘캔 총합
DF 115 62 49 226 29 70 99
DHF1 36 60 41 137 23 21 44
DHF2 78 97 48 223 33 29 62
DSS 43 46 24 113 15 20 35
미분류 7 36 8 51 1 13 14
총합 279 301 170 750 101 153 254
WHO 기준에 따라 DF 또는 DHF를 갖는 것으로 분류될 수 없는 51명의 환자가 있었다(미분류; UC). 각 심각도 카테고리 내의 환자 비율이 병원마다 유의적으로 달랐다(P =1.5 x 10-8). 이는 병원 형태 차이(KK는 이차 진료 및 SI와 RA는 의과 대학)와 포함 기준(KK에서는 3일 미만의 열 및 SI와 RA에서는 의심되는 뎅기열 증세)의 차이를 반영한다.
충격에 대한 한계 유의 수준만으로(DSS 대 나머지, P = 0.038), 뎅기열 감염에 대한 우세한 IgM 반응을 갖는 환자와 비교하여 우세한 IgG 반응을 갖는 환자(각각 P = 1.1 x 10-7 및 P = 7.6 x 10-5)의 혈장 누출(DHF1/DHF2/DSS versus DF)과 자발성 출혈(DHF2/DSS versus DF/UC/DHF1)의 매우 현저하게 증가된 위험이 있었다.
표 5: 질병 심각도와 면역 반응

임상 진단		 면역 반응
IgM 우세 IgG 우세
DF 51 162
% 53.7 27.1
DHF1 15 121
% 15.8 20.2
DHF2 19 199
% 20 33.3
DSS 8 99
% 8.4 16.6
미분류 2 17
% 2.1 2.8
총합 95 598
이들 발견은 DV에 대한 IgG 반응을 나타내는 개체들이 이들 질병의 보다 더 심각한 형태가 될 경향이 있다는 의견과 일치한다.
태그된 다형성의 선별을 위하여, 방콕 내 2 병원으로부터 환자들의 혈장 누출 위험(DHF1/DHF2/DSS 대 DF), 자발성 출혈 위험(DHF2/DSS 대 DF/UC/DHF1), 충격 위험(DSS 대 비-충격 DV 환자)에 대한 대립 인자 수를 사용하여 관련성에 대한 시험을 실시하였다(표 6).
표 6: 뎅기열 환자에서 OAS3 - R381S 의 관련성 연구
Figure pct00001
*MAF: 평균 대립 인자 빈도(Mean Allele Frequency)
표 6에 나타난 바와 같이, 어떠한 다형성도 질병 위험과 관련성의 증거를 보이지 않았다. 그러나, OAS3의 한 비-유사적 다형성은 질병의 심각도에 따라 매우 현저하게 다른 대립 인자 수 분배를 가졌다. 이 변이체(OAS3-R381S: rs2285933)는 OAS3의 코돈 381의 3번째 뉴클레오티드의 G가 C로 치환되어 아미노산이 아르기닌에서 세린으로 변화된 것이다. 양쪽 병원에서 이 다형성의 C 대립 인자는 DSS에서 보다 DF, DHF1 및 DHF2에서 더 빈도가 높았다. 2 병원 사이의 각 환자군과 대조군 사이의 대립 인자 빈도는 유의적인 차이가 없었다. 결합 분석에서, C 대립 인자는 일반 개체에서는 14%, DF에서는 20%, DHF1 및 DHF2에서는 15-16%, DSS에서는 7%의 빈도를 가졌다. DSS와 비-충격 DV 증상 사이의 차이는 매우 유의적이었다(P = 7.10-4). 본 발명자들은 10,000번의 변환을 실행하여, 실험적 P값 0.0032를 얻었다.
유전 방식
OAS3 - R381S의 유전 방식을 발견하기 위하여, 3가지 다른 유전 방식에 기초하여 모델들의 가능성을 비교하였다: DSS의 위험에 대한 로지스틱 회귀를 사용하여 C 대립 인자의 부가, 우성 및 열성. C 대립 인자의 열성 모델이 현저한 연관성을 보이지 않는 반면, C 대립 인자의 우성 모델(< 10-5 P < 10-5, OR = 0.30 95CI = 0.17-0.53) 및 부가 모델(17.93, P < 10-5)에서는 매우 높은 수준이 얻어졌다. 로그 가능도 비 검정에서, 우성 모델은 부가 모델보다 훨씬 더 적합하였다(P = 0.04). 따라서, 나머지의 분석에서는 우성 모델이 사용되었다.
제3의 코호(cohort)트에서의 복제
동일한 유행병 동안(2001-2003) 3번째 병원(KK)의 환자에게 OAS3 -R381S 의 복제 연구를 실시하였다. C 대립 인자는 이전의 결과(C 대립 인자 빈도에서는 8% 대 17% 및 CG+GG 빈도에서는 17% 대 32%)와 유사한 충격없이, DV 환자와 비교하여 DSS 군에서 낮은 빈도를 나타내었다. 비록, 이 차이는 소수의 환자로 인하여 통계적으로 유의적이지는 않지만, 3 병원의 모든 환자를 합하면 높은 유의적 관련성이 얻어졌다(C 대립 인자의 우성 모델에서 OR = 0.48, 95 CI = 0.31-0.75, P= 7 x 10-4).
OAS3 및 면역 반응 형태
OAS3-R381S의 효과가 바이러스의 면역 반응 형태에 의존하는지 여부를 추가로 조사하였다. 우세한 IgM 면역 반응을 갖는 환자에서 DSS와 다형성에는 유의적인 관련성이 없었다. 그러나, 유의적인 그리고 거의 유의적인 관련성은 각 병원에서의 우세한 IgG 반응을 갖는 환자에게서 얻어져 합해졌다(Chi2 = 19.41, OR = 0.27 95 CI = 0.14-0.53, P < 10-5)(표 7).
표 7: IgM and IgG 면역 반응에서의 OAS3 - R381S
　
 IgM 반응 IgG 반응
수 빈도(%)
P 		수 빈도(%)
P
병원 및 군 GG CG+CC GG CG+CC GG CG + CC GG CG + CC
시리라즈
비-충격 DENV 28 14 66.7 33.3 126 59 68.1 31.9
DSS 2 0 100 0 1 35 3 92.1 7.9 0.002
라마
Non-충격 DV 33 16 67.3 32.7 128 53 70.7 29.3
DSS 3 2 60 40 1 33 5 86.8 13.2 0.044
콘-캔
Non-충격 DV 17 4 80.9 19.1 81 41 66.4 33.6
DSS 0 1 0 100 0.23 20 3 87 13 0.052
2004-2006 유행병 동안의 환자의 연관성 연구
2004-2006 동안, 이전의 2 병원(RA 및 KK, 표 4)에서 환자를 추가로 얻었다. OAS3 - R381S의 연관성 연구가 모든 연구된 가설과 유의적인 연관성을 드러내지는 않았지만, 이들 환자를 원래의 케이스/대조군 연구에 추가하였을 때 유의적인 연관성이 남아 있었다(OR = 0.48, 95 CI = 0.31-0.75, P= 7 x 10-4). 이 결과는 본 발명자들이 2 기간 사이의 결과의 불일치를 조사하도록 자극하였다.
뎅기열 질환의 심각성에 기여할 수 있는 하나의 인자는 바이러스 인자이다. 본 발명자들은, 471명의 환자로부터 얻어진 데이타를 가지고 있는 시리라즈 병원과 콘-캔 병원으로부터의 환자 데이타를 사용하여 2001-2006년 동안 DV-4 혈청형의 발병율을 조사하였다(표 8).
표 8: 뎅기열 바이러스 혈청형
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
DV1과 DV2 혈청형이 2001-2003년에 우세했던 반면, 2004에는 DV1이 감소되었고 2004년에 DV4 유행병이 시작된 다음 2006년까지 우세하였다(표 8A). DV2 혈청형이 다른 DV 혈청형보다 더 심각한 케이스를 가지면서, 뎅기열 질환의 심각성은 바이러스의 다른 혈청형 사이에서 현저하게 차이가 났다(P = 0.012, 표 8B). 놀랍게도, DV2 및 DV4가 우세한 IgG를 보이면서, 바이러스의 혈청형은 면역 반응 형태에 따라 현저하게 차이가 났다(피셔 정확도 P < 10-4, 표 8C). 이들 결과는 공중 보건국(Ministry of Public Health)의 데이타와 유사하였다. 본 발명자들은 OAS3 - R381S 효과가 어떤 바이러스 혈청형에 특이적일 수 있다고 가설을 세웠다. 본 발명자들은 DV2에서만 DSS에 대한 OAS3-R381S의 유의적으로 우세한 방어적인 효과를 발견하였다(OR = 0.24, 95 CI = 0.08-0.74, P = 0.0045, 표 9).
표 9: OAS3 - R381S 및 뎅기열 혈청형
　 수 빈도(%) P
GG CG + CC GG CG + CC 　
혈청형 1
비-충격DV 125 57 68.7 31.3
DSS 21 6 77.8 22.2 0.32
혈청형 2
비-충격 DV 82 42 66.1 33.9
DSS 32 4 88.9 11.1 0.0045
혈청형 4
비-충격 DV 49 21 70 30
DSS 6 2 75 25 0.77
DF/DHF/DSS 환자와 대조군에서 OAS 유전자의 체계적 선별에 기초하여, 뎅기열 바이러스 감염을 갖는 환자에서 OAS3 유전자의 다형성 및 충격 위험(DSS)과 질병의 심각도 사이의 연관성을 확인하였다. 변이체(OAS3 - R381S : rs2285933)는 아르기닌을 세린으로 아미노산을 변화시키는 OAS3의 코돈 381의 3번째 뉴클레오티드에서 G가 C로 치환된 것이다. C 변이체는, 0.13:0.32의 빈도 비율로, 비-충격 뎅기열 질환과 비교하여 DSS에 대한 우세한 방어와 연관된다(OR = 0.48, 95 CI = 0.31-0.75, P= 7 x 10-4). 또한, 유의적인 연관성은 오로지 우세한 IgG 반응을 갖는 환자(OR = 0.46, 95 CI = 0.28-0.74, P = 8 x 10-4)와 DV 혈청형 2에 의하여 감염된 환자(OR = 0.24, 95 CI = 0.08-0.74, P = 0.0045)에서만 발견되었다.
이들 결과는 비-유사적 다형인 OAS3-R381S의 기능적 역할을 지지하고, 뎅기열 발병에서의 OAS3의 역할과 OAS3 변이체와 바이러스의 혈청형 사이의 상관 관계를 증명한다.
이러한 발견으로 DV 감염된 환자에게서의 질병 심각도의 예상 및 OAS3에 기초한 뎅기열 바이러스 및 주요 의학적 중요성을 갖는 다른 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스에 의한 감염에 대한 예방 및 치료의 개발을 위한 중요한 결론을 내릴 수 있다.
Collection Nationale de Cultures de Microorganismes CNCM03927 20080226 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes CNCM03968 20080417 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes CNCM04158 20090515
SEQUENCE LISTING <110> INSTITUT PASTEUR BREHIN, Anne-Claire SAKUNTABHAI, Anavaj DESPRES, Philippe CASADEMONT Isabelle JULIER C?ile CHUANSUMRIT Ampaiwan MALASIT Prida PAULOUS Sylvie <120> THE LARGE FORM OF HUMAN 2',5'-OLIGOADENYLATE SYNTHETASE OAS3 FOR PREVENTING OR TREATING INFECTION WITH POSITIVE-SENSE SINGLE-STRANDED RNA VIRUSES <130> 226EP158 <160> 142 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3264 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(3264) <400> 1 atg gac ttg tac agc acc ccg gcc gct gcg ctg gac agg ttc gtg gcc 48 Met Asp Leu Tyr Ser Thr Pro Ala Ala Ala Leu Asp Arg Phe Val Ala 1 5 10 15 aga agg ctg cag ccg cgg aag gag ttc gta gag aag gcg cgg cgc gct 96 Arg Arg Leu Gln Pro Arg Lys Glu Phe Val Glu Lys Ala Arg Arg Ala 20 25 30 ctg ggc gcc ctg gcc gct gcc ctg agg gag cgc ggg ggc cgc ctc ggt 144 Leu Gly Ala Leu Ala Ala Ala Leu Arg Glu Arg Gly Gly Arg Leu Gly 35 40 45 gct gct gcc ccg cgg gtg ctg aaa act gtc aag gga ggc tcc tcg ggc 192 Ala Ala Ala Pro Arg Val Leu Lys Thr Val Lys Gly Gly Ser Ser Gly 50 55 60 cgg ggc aca gct ctc aag ggt ggc tgt gat tct gaa ctt gtc atc ttc 240 Arg Gly Thr Ala Leu Lys Gly Gly Cys Asp Ser Glu Leu Val Ile Phe 65 70 75 80 ctc gac tgc ttc aag agc tat gtg gac cag agg gcc cgc cgt gca gag 288 Leu Asp Cys Phe Lys Ser Tyr Val Asp Gln Arg Ala Arg Arg Ala Glu 85 90 95 atc ctc agt gag atg cgg gca tcg ctg gaa tcc tgg tgg cag aac cca 336 Ile Leu Ser Glu Met Arg Ala Ser Leu Glu Ser Trp Trp Gln Asn Pro 100 105 110 gtc cct ggt ctg aga ctc acg ttt cct gag cag agc gtg cct ggg gcc 384 Val Pro Gly Leu Arg Leu Thr Phe Pro Glu Gln Ser Val Pro Gly Ala 115 120 125 ctg cag ttc cgc ctg aca tcc gta gat ctt gag gac tgg atg gat gtt 432 Leu Gln Phe Arg Leu Thr Ser Val Asp Leu Glu Asp Trp Met Asp Val 130 135 140 agc ctg gtg cct gcc ttc aat gtc ctg ggt cag gcc ggc tcc ggc gtc 480 Ser Leu Val Pro Ala Phe Asn Val Leu Gly Gln Ala Gly Ser Gly Val 145 150 155 160 aaa ccc aag cca caa gtc tac tct acc ctc ctc aac agt ggc tgc caa 528 Lys Pro Lys Pro Gln Val Tyr Ser Thr Leu Leu Asn Ser Gly Cys Gln 165 170 175 ggg ggc gag cat gcg gcc tgc ttc aca gag ctg cgg agg aac ttt gtg 576 Gly Gly Glu His Ala Ala Cys Phe Thr Glu Leu Arg Arg Asn Phe Val 180 185 190 aac att cgc cca gcc aag ttg aag aac cta atc ttg ctg gtg aag cac 624 Asn Ile Arg Pro Ala Lys Leu Lys Asn Leu Ile Leu Leu Val Lys His 195 200 205 tgg tac cac cag gtg tgc cta cag ggg ttg tgg aag gag acg ctg ccc 672 Trp Tyr His Gln Val Cys Leu Gln Gly Leu Trp Lys Glu Thr Leu Pro 210 215 220 ccg gtc tat gcc ctg gaa ttg ctg acc atc ttc gcc tgg gag cag ggc 720 Pro Val Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Ile Phe Ala Trp Glu Gln Gly 225 230 235 240 tgt aag aag gat gct ttc agc cta gcc gaa ggc ctc cga act gtc ctg 768 Cys Lys Lys Asp Ala Phe Ser Leu Ala Glu Gly Leu Arg Thr Val Leu 245 250 255 ggc ctg atc caa cag cat cag cac ctg tgt gtt ttc tgg act gtc aac 816 Gly Leu Ile Gln Gln His Gln His Leu Cys Val Phe Trp Thr Val Asn 260 265 270 tat ggc ttc gag gac cct gca gtt ggg cag ttc ttg cag cgg cag ctt 864 Tyr Gly Phe Glu Asp Pro Ala Val Gly Gln Phe Leu Gln Arg Gln Leu 275 280 285 aag aga ccc agg cct gtg atc ctg gac cca gct gac ccc aca tgg gac 912 Lys Arg Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro Thr Trp Asp 290 295 300 ctg ggg aat ggg gca gcc tgg cac tgg gat ttg cta gcc cag gag gca 960 Leu Gly Asn Gly Ala Ala Trp His Trp Asp Leu Leu Ala Gln Glu Ala 305 310 315 320 gca tcc tgc tat gac cac cca tgc ttt ctg agg ggg atg ggg gac cca 1008 Ala Ser Cys Tyr Asp His Pro Cys Phe Leu Arg Gly Met Gly Asp Pro 325 330 335 gtg cag tct tgg aag ggg ccg ggc ctt cca cgt gct gga tgc tca ggt 1056 Val Gln Ser Trp Lys Gly Pro Gly Leu Pro Arg Ala Gly Cys Ser Gly 340 345 350 ttg ggc cac ccc atc cag cta gac cct aac cag aag acc cct gaa aac 1104 Leu Gly His Pro Ile Gln Leu Asp Pro Asn Gln Lys Thr Pro Glu Asn 355 360 365 agc aag agc ctc aat gct gtg tac cca aga gca ggg agc aaa cct ccc 1152 Ser Lys Ser Leu Asn Ala Val Tyr Pro Arg Ala Gly Ser Lys Pro Pro 370 375 380 tca tgc cca gct cct ggc ccc act ggg gca gcc agc atc gtc ccc tct 1200 Ser Cys Pro Ala Pro Gly Pro Thr Gly Ala Ala Ser Ile Val Pro Ser 385 390 395 400 gtg ccg gga atg gcc ttg gac ctg tct cag atc ccc acc aag gag ctg 1248 Val Pro Gly Met Ala Leu Asp Leu Ser Gln Ile Pro Thr Lys Glu Leu 405 410 415 gac cgc ttc atc cag gac cac ctg aag ccg agc ccc cag ttc cag gag 1296 Asp Arg Phe Ile Gln Asp His Leu Lys Pro Ser Pro Gln Phe Gln Glu 420 425 430 cag gtg aaa aag gcc atc gac atc atc ttg cgc tgc ctc cat gag aac 1344 Gln Val Lys Lys Ala Ile Asp Ile Ile Leu Arg Cys Leu His Glu Asn 435 440 445 tgt gtt cac aag gcc tca aga gtc agt aaa ggg ggc tca ttt ggc cgg 1392 Cys Val His Lys Ala Ser Arg Val Ser Lys Gly Gly Ser Phe Gly Arg 450 455 460 ggc aca gac cta agg gat ggc tgt gat gtt gaa ctc atc atc ttc ctc 1440 Gly Thr Asp Leu Arg Asp Gly Cys Asp Val Glu Leu Ile Ile Phe Leu 465 470 475 480 aac tgc ttc acg gac tac aag gac cag ggg ccc cgc cgc gca gag atc 1488 Asn Cys Phe Thr Asp Tyr Lys Asp Gln Gly Pro Arg Arg Ala Glu Ile 485 490 495 ctt gat gag atg cga gcg cag cta gaa tcc tgg tgg cag gac cag gtg 1536 Leu Asp Glu Met Arg Ala Gln Leu Glu Ser Trp Trp Gln Asp Gln Val 500 505 510 ccc agc ctg agc ctt cag ttt cct gag cag aat gtg cct gag gct ctg 1584 Pro Ser Leu Ser Leu Gln Phe Pro Glu Gln Asn Val Pro Glu Ala Leu 515 520 525 cag ttc cag ctg gtg tcc aca gcc ctg aag agc tgg acg gat gtt agc 1632 Gln Phe Gln Leu Val Ser Thr Ala Leu Lys Ser Trp Thr Asp Val Ser 530 535 540 ctg ctg cct gcc ttc gat gct gtg ggg cag ctc agt tct ggc acc aaa 1680 Leu Leu Pro Ala Phe Asp Ala Val Gly Gln Leu Ser Ser Gly Thr Lys 545 550 555 560 cca aat ccc cag gtc tac tcg agg ctc ctc acc agt ggc tgc cag gag 1728 Pro Asn Pro Gln Val Tyr Ser Arg Leu Leu Thr Ser Gly Cys Gln Glu 565 570 575 ggc gag cat aag gcc tgc ttc gca gag ctg cgg agg aac ttc atg aac 1776 Gly Glu His Lys Ala Cys Phe Ala Glu Leu Arg Arg Asn Phe Met Asn 580 585 590 att cgc cct gtc aag ctg aag aac ctg att ctg ctg gtg aag cac tgg 1824 Ile Arg Pro Val Lys Leu Lys Asn Leu Ile Leu Leu Val Lys His Trp 595 600 605 tac cgc cag gtt gcg gct 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Gly Asn Leu Gly His Asn Ala Arg 1040 1045 1050 tgg gac ctg ctg gcc aag gaa gct gca gcc tgc aca tct gcc ctg 3204 Trp Asp Leu Leu Ala Lys Glu Ala Ala Ala Cys Thr Ser Ala Leu 1055 1060 1065 tgc tgc atg gga cgg aat ggc atc ccc atc cag cca tgg cca gtg 3249 Cys Cys Met Gly Arg Asn Gly Ile Pro Ile Gln Pro Trp Pro Val 1070 1075 1080 aag gct gct gtg tga 3264 Lys Ala Ala Val 1085 <210> 2 <211> 1087 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Asp Leu Tyr Ser Thr Pro Ala Ala Ala Leu Asp Arg Phe Val Ala 1 5 10 15 Arg Arg Leu Gln Pro Arg Lys Glu Phe Val Glu Lys Ala Arg Arg Ala 20 25 30 Leu Gly Ala Leu Ala Ala Ala Leu Arg Glu Arg Gly Gly Arg Leu Gly 35 40 45 Ala Ala Ala Pro Arg Val Leu Lys Thr Val Lys Gly Gly Ser Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Thr Ala Leu Lys Gly Gly Cys Asp Ser Glu Leu Val Ile Phe 65 70 75 80 Leu Asp Cys Phe Lys Ser Tyr Val Asp Gln Arg Ala Arg Arg Ala Glu 85 90 95 Ile Leu Ser Glu Met Arg Ala Ser Leu Glu Ser Trp Trp Gln Asn Pro 100 105 110 Val Pro Gly Leu Arg Leu Thr Phe Pro Glu Gln Ser Val Pro Gly Ala 115 120 125 Leu Gln Phe Arg Leu Thr Ser Val Asp Leu Glu Asp Trp Met Asp Val 130 135 140 Ser Leu Val Pro Ala Phe Asn Val Leu Gly Gln Ala Gly Ser Gly Val 145 150 155 160 Lys Pro Lys Pro Gln Val Tyr Ser Thr Leu Leu Asn Ser Gly Cys Gln 165 170 175 Gly Gly Glu His Ala Ala Cys Phe Thr Glu Leu Arg Arg Asn Phe Val 180 185 190 Asn Ile Arg Pro Ala Lys Leu Lys Asn Leu Ile Leu Leu Val Lys His 195 200 205 Trp Tyr His Gln Val Cys Leu Gln Gly Leu Trp Lys Glu Thr Leu Pro 210 215 220 Pro Val Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Ile Phe Ala Trp Glu Gln Gly 225 230 235 240 Cys Lys Lys Asp Ala Phe Ser Leu Ala Glu Gly Leu Arg Thr Val Leu 245 250 255 Gly Leu Ile Gln Gln His Gln His Leu Cys Val Phe Trp Thr Val Asn 260 265 270 Tyr Gly Phe Glu Asp Pro Ala Val Gly Gln Phe Leu Gln Arg Gln Leu 275 280 285 Lys Arg Pro Arg Pro Val Ile Leu Asp Pro Ala Asp Pro Thr Trp Asp 290 295 300 Leu Gly Asn Gly Ala Ala Trp His Trp Asp Leu Leu Ala Gln Glu Ala 305 310 315 320 Ala Ser Cys Tyr Asp His Pro Cys Phe Leu Arg Gly Met 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ctgccacaga cacagacaga gggagttggg acatgcatgc 4140 tatggggacc ctcttgttgg acacctaatt ggatgcctct tcatgagagg cctccttttc 4200 ttcacctttt atgctgcact cctcccctag tttacacatc ttgatgctgt ggctcagttt 4260 gccttcctga atttttattg ggtccctgtt ttctctccta acatgctgag attctgcatc 4320 cccacagcct aaactgagcc agtggccaaa caaccgtgct cagcctgttt ctctctgccc 4380 tctagagcaa ggcccaccag gtccatccag gaggctctcc tgacctcaag tccaacaaca 4440 gtgtccacac tagtcaaggt tcagcccaga aaacagaaag cactctagga atcttaggca 4500 gaaagggatt ttatctaaat cactggaaag gctggaggag cagaaggcag aggccaccac 4560 tggactattg gtttcaatat tagaccactg tagccgaatc agaggccaga gagcagccac 4620 tgctactgct aatgccacca ctacccctgc catcactgcc ccacatggac aaaactggag 4680 tcgagaccta ggttagattc ctgcaaccac aaacatccat cagggatggc cagctgccag 4740 agctgcggga agacggatcc cacctccctt tcttagcaga atctaaatta cagccagacc 4800 tctggctgca gaggagtctg agacatgtat gattgaatgg gtgccaagtg ccagggggcg 4860 gagtccccag cagatgcatc ctggccatct gttgcgtgga tgagggagtg ggtctatctc 4920 agaggaagga acaggaaaca 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Leu Lys Ser Trp Thr Asp Val Ser 530 535 540 ctg ctg cct gcc ttc gat gct gtg ggg cag ctc agt tct ggc acc aaa 1680 Leu Leu Pro Ala Phe Asp Ala Val Gly Gln Leu Ser Ser Gly Thr Lys 545 550 555 560 cca aat ccc cag gtc tac tcg agg ctc ctc acc agt ggc tgc cag gag 1728 Pro Asn Pro Gln Val Tyr Ser Arg Leu Leu Thr Ser Gly Cys Gln Glu 565 570 575 ggc gag cat aag gcc tgc ttc gca gag ctg cgg agg aac ttc atg aac 1776 Gly Glu His Lys Ala Cys Phe Ala Glu Leu Arg Arg Asn Phe Met Asn 580 585 590 att cgc cct gtc aag ctg aag aac ctg att ctg ctg gtg aag cac tgg 1824 Ile Arg Pro Val Lys Leu Lys Asn Leu Ile Leu Leu Val Lys His Trp 595 600 605 tac cgc cag gtt gcg gct cag aac aaa gga aaa gga cca gcc cct gcc 1872 Tyr Arg Gln Val Ala Ala Gln Asn Lys Gly Lys Gly Pro Ala Pro Ala 610 615 620 tct ctg ccc cca gcc tat gcc ctg gag ctc ctc acc atc ttt gcc tgg 1920 Ser Leu Pro Pro Ala Tyr Ala Leu Glu Leu Leu Thr Ile Phe Ala Trp 625 630 635 640 gag cag ggc tgc agg cag gat tgt ttc aac atg gcc caa ggc ttc cgg 1968 Glu Gln Gly Cys Arg Gln Asp Cys Phe Asn Met Ala Gln Gly Phe Arg 645 650 655 acg gtg ctg ggg ctc gtg caa cag cat cag cag ctc tgt gtc tac tgg 2016 Thr Val Leu Gly Leu Val Gln Gln His Gln Gln Leu Cys Val Tyr Trp 660 665 670 acg gtc aac tat agc act gag gac cca gcc atg aga atg cac ctt ctt 2064 Thr Val Asn Tyr Ser Thr Glu Asp Pro Ala Met Arg Met His Leu Leu 675 680 685 ggc cag ctt cga aaa ccc aga ccc ctg gtc ctg gac ccc gct gat ccc 2112 Gly Gln Leu Arg Lys Pro Arg Pro Leu Val Leu Asp Pro Ala Asp Pro 690 695 700 acc tgg aac gtg ggc cac ggt agc tgg gag ctg ttg gcc cag gaa gca 2160 Thr Trp Asn Val Gly His Gly Ser Trp Glu Leu Leu Ala Gln Glu Ala 705 710 715 720 gca gcg ctg ggg atg cag gcc tgc ttt ctg agt aga gac ggg aca tct 2208 Ala Ala Leu Gly Met Gln Ala Cys Phe Leu Ser Arg Asp Gly Thr Ser 725 730 735 gtg cag ccc tgg gat gtg atg cca gcc ctc ctt tac caa acc cca gct 2256 Val Gln Pro Trp Asp Val Met Pro Ala Leu Leu Tyr Gln Thr Pro Ala 740 745 750 ggg gac ctt gac aag ttc atc agt gaa ttt ctc cag ccc aac cgc cag 2304 Gly Asp Leu Asp Lys Phe Ile Ser Glu Phe Leu Gln Pro Asn Arg Gln 755 760 765 ttc ctg gcc cag gtg aac aag gcc gtt gat acc atc tgt tca ttt ttg 2352 Phe Leu Ala Gln Val Asn Lys Ala Val Asp Thr Ile Cys Ser Phe Leu 770 775 780 aag gaa aac tgc ttc cgg aat tct ccc atc aaa gtg atc aag gtg gtc 2400 Lys Glu Asn Cys Phe Arg Asn Ser Pro Ile Lys Val Ile Lys Val Val 785 790 795 800 aag ggt ggc tct tca gcc aaa ggc aca gct ctg cga ggc cgc tca gat 2448 Lys Gly Gly Ser Ser Ala Lys Gly Thr Ala Leu Arg Gly Arg Ser Asp 805 810 815 gcc gac ctc gtg gtg ttc ctc agc tgc ttc agc cag ttc act gag cag 2496 Ala Asp Leu Val Val Phe Leu Ser Cys Phe Ser Gln Phe Thr Glu Gln 820 825 830 ggc aac aag cgg gcc gag atc atc tcc gag atc cga gcc cag ctg gag 2544 Gly Asn Lys Arg Ala Glu Ile Ile Ser Glu Ile Arg Ala Gln Leu Glu 835 840 845 gca tgt caa cag gag cgg cag ttc gag gtc aag ttt gaa gtc tcc aaa 2592 Ala Cys Gln Gln Glu Arg Gln Phe Glu Val Lys Phe Glu Val Ser Lys 850 855 860 tgg gag aat ccc cgc gtg ctg agc ttc tca ctg aca tcc cag acg atg 2640 Trp Glu Asn Pro Arg Val Leu Ser Phe Ser Leu Thr Ser Gln Thr Met 865 870 875 880 ctg gac cag agt gtg gac ttt gat gtg ctg cca gcc ttt gac gcc cta 2688 Leu Asp Gln Ser Val Asp Phe Asp Val Leu Pro Ala Phe Asp Ala Leu 885 890 895 ggc cag ctg gtc tct ggc tcc agg ccc agc tct caa gtc tac gtc gac 2736 Gly Gln Leu Val Ser Gly Ser Arg Pro Ser Ser Gln Val Tyr Val Asp 900 905 910 ctc atc cac agc tac agc aat gcg ggc gag tac tcc acc tgc ttc aca 2784 Leu Ile His Ser Tyr Ser Asn Ala Gly Glu Tyr Ser Thr Cys Phe Thr 915 920 925 gag cta caa cgg gac ttc atc atc tct cgc cct acc aag ctg aag agc 2832 Glu Leu Gln Arg Asp Phe Ile Ile Ser Arg Pro Thr Lys Leu Lys Ser 930 935 940 ctg atc cgg ctg gtg aag cac tgg tac cag cag tgt acc aag atc tcc 2880 Leu Ile Arg Leu Val Lys His Trp Tyr Gln Gln Cys Thr Lys Ile Ser 945 950 955 960 aag ggg aga ggc tcc cta ccc cca cag cac ggg ctg gaa ctc ctg act 2928 Lys Gly Arg Gly Ser Leu Pro Pro Gln His Gly Leu Glu Leu Leu Thr 965 970 975 gtg tat gcc tgg gag cag ggc ggg aag gac tcc cag ttc aac atg gct 2976 Val Tyr Ala Trp Glu Gln Gly Gly Lys Asp Ser Gln Phe Asn Met Ala 980 985 990 gag ggc ttc cgc acg gtc ctg gag ctg gtc acc cag tac cgc cag ctc 3024 Glu Gly Phe Arg Thr Val Leu Glu Leu Val Thr Gln Tyr Arg Gln Leu 995 1000 1005 tgt atc tac tgg acc atc aac tac aac gcc aag gac aag act gtt 3069 Cys Ile Tyr Trp Thr Ile Asn Tyr Asn Ala Lys Asp Lys Thr Val 1010 1015 1020 gga gac ttc ctg aaa cag cag ctt cag aag ccc agg cct atc atc 3114 Gly Asp Phe Leu Lys Gln Gln Leu Gln Lys Pro Arg Pro Ile Ile 1025 1030 1035 ctg gat ccg gct gac ccg aca ggc aac ctg ggc cac aat gcc cgc 3159 Leu Asp Pro Ala Asp Pro Thr Gly Asn Leu Gly His Asn Ala Arg 1040 1045 1050 tgg gac ctg ctg gcc aag gaa gct gca gcc tgc aca tct gcc ctg 3204 Trp Asp Leu Leu Ala Lys Glu Ala Ala Ala Cys Thr Ser Ala Leu 1055 1060 1065 tgc tgc atg gga cgg aat ggc atc ccc atc cag cca tgg cca gtg 3249 Cys Cys Met Gly Arg Asn Gly Ile Pro Ile Gln Pro Trp Pro Val 1070 1075 1080 aag gct gct gtg tga 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Gln Gln Leu Gln Lys Pro Arg Pro Ile Ile 1025 1030 1035 Leu Asp Pro Ala Asp Pro Thr Gly Asn Leu Gly His Asn Ala Arg 1040 1045 1050 Trp Asp Leu Leu Ala Lys Glu Ala Ala Ala Cys Thr Ser Ala Leu 1055 1060 1065 Cys Cys Met Gly Arg Asn Gly Ile Pro Ile Gln Pro Trp Pro Val 1070 1075 1080 Lys Ala Ala Val 1085 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/pro1 F-primer <400> 31 ccaggagttc gagaccagac 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/pro1 F-primer <400> 32 ggtgaggcat aggggatttt 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/pro3 F-primer <400> 33 ccttgaaccc aggaagttga 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/pro4 F-primer <400> 34 ctttttgcag tgggcatgta 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon1 F-primer <400> 35 tttgcaaaag gaaagtgcaa 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon2 F-primer <400> 36 agcatccatt ttcccatctg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon3 F-primer <400> 37 ggatcaggaa tggacctcaa 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon4 F-primer <400> 38 aatgaatgag cctggattcg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon5 F-primer <400> 39 gagcccttcc tcatgttctg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon6-1 F-primer <400> 40 agctggggct tgttagtcct 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon6-2 F-primer <400> 41 gctcctcagt gagctggtgt 20 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon6-3 F-primer <400> 42 cggccatgtc attgttttta t 21 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/pro1 F-primer <400> 43 aaagcacagg ctttggagtc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/pro2 F-primer <400> 44 ttgggggagc tcagtcttta 20 <210> 45 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OAS2/exon11-3 F-primer <400> 61 ccagccaacc ctttcattag 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/pro1 F-primer <400> 62 tattgaccct tctgcgttcc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/pro2 F-primer <400> 63 ggagagagga cctgggagtt 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/pro3 F-primer <400> 64 ccagccagac aactttccag 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon1 F-primer <400> 65 aagtgggtgt caggtccaag 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon2 F-primer <400> 66 acagtctctc cccagcacac 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon3 F-primer <400> 67 aaagctccag gctctcttcc 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon4 F-primer <400> 68 ggctgaagct accagtgagg 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon5 F-primer <400> 69 tcgaggctca gagagggtaa 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon6 F-primer <400> 70 ggcacctttt tcaactctgc 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon7 F-primer <400> 71 catgcagtcg acctttgtca 20 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon8 F-primer <400> 72 ccactgtgca gttactggat g 21 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon9 F-primer <400> 73 ctaggcaaaa gccacgtctg 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon10 F-primer <400> 74 cccaatagct ttccaaccaa 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon11 F-primer <400> 75 cctcagaacc tacccaccag 20 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon12 F-primer <400> 76 tgacttgtcc aaggtcacac a 21 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon13 F-primer <400> 77 atcccagacc acccttagga 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon14 f-primer <400> 78 aaagttttgg ggttgctttg 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon15 F-primer <400> 79 tctagcccct gcaaagtgtt 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-1 F-primer <400> 80 atctgtggtg ccaaaggaag 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-2 F-primer <400> 81 cctcccatgg cttacacact 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-3 F-primer <400> 82 caggagagca tgcccatatt 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-4 F-primer <400> 83 gagattctgc atccccacag 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-5 F-primer <400> 84 ctctggctgc agaggagtct 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-6 F-primer <400> 85 aacgctaagg gcaccttctt 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-7 F-primer <400> 86 caccctggtg ttggcatatt 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/pro1 R-primer <400> 87 tgcagggaca gtcacagaac 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/pro1 R-primer <400> 88 ataggaggtg gggcttgact 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/pro3 R-primer <400> 89 cctttgtcct ttagccagca 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/pro4 R-primer <400> 90 tgtcaatggc atggttgatt 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon1 R-primer <400> 91 gaaaccacca tcccagaaga 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon2 R-primer <400> 92 cccaccctgc tttagagaga 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon3 R-primer <400> 93 ggctcctctc tccacctctt 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon4 R-primer <400> 94 tacaatgatg ggcaacagga 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon5 R-primer <400> 95 ataaatggcc tttggcaaga 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon6-1 R-primer <400> 96 tggaatgaag tgaggctgtg 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon6-2 R-primer <400> 97 tccatgagga cagggatttt 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS1/exon6-3 R-primer <400> 98 actgccagag tggagatgct 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/pro1 R-primer <400> 99 tgagcccagg tacccagata 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/pro2 R-primer <400> 100 ctgacttgct cagggacaca 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/pro3 R-primer <400> 101 agcagggaaa ccaaaactga 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/pro4 R-primer <400> 102 ccatttccca ttgctctcag 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon1 R-primer <400> 103 gtcacacagc tctggagcaa 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon2 R-primer <400> 104 gagagcgagt ccagggtaga 20 <210> 105 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon3 R-primer <400> 105 tgttgcactt tactggatgt ca 22 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon4 R-primer <400> 106 ggacctcccc tctttcagac 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon5 R-primer <400> 107 ctctgccaac accctgattt 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon6 R-primer <400> 108 taactcctgg cttcccttcc 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon7 R-primer <400> 109 cccatgcttg gaaaagagaa 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon8 R-primer <400> 110 gggttagtga tgggaacgtc 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon9 R-primer <400> 111 gcccctgcta ggttttatcc 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon10-1 R-primer <400> 112 ggttgtcact gggagaggag 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon10-2 R-primer <400> 113 gcacaagaga gcctccaaac 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon10-3 R-primer <400> 114 ggatggatcc tagctccaca 20 <210> 115 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon11-1 R-primer <400> 115 gactggaagg aaaaaggagg a 21 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon11-2 R-primer <400> 116 aaggctaaag cccaaggaaa 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS2/exon11-3 R-primer <400> 117 cacatgcttg gtctttctgg 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/pro1 R-primer <400> 118 gcacacctga gctctcttcc 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/pro2 R-primer <400> 119 cgaccatggt gtaggtgcta 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/pro3 R-primer <400> 120 tcggatttct ggtttcgttt 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon1 R-primer <400> 121 tgtcaagcgg gcttaagagt 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon2 R-primer <400> 122 cccaggtcaa acagcaagtt 20 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon3 R-primer <400> 123 tgcacaaggg acataaacag a 21 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon4 R-primer <400> 124 ctaatgtgca tctgggctga 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon5 R-primer <400> 125 gcctcccaat gtgttgagat 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon6 R-primer <400> 126 ccagcaaatc atccttcctg 20 <210> 127 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon7 R-primer <400> 127 tcaatgcttg gtcaagtagg ag 22 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon8 R-primer <400> 128 aagcaaagga ggggagatgt 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon9 R-primer <400> 129 ggaagcagag tgaggagtgg 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon10 R-primer <400> 130 gctgggacgt agcaatctgt 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon11 R-primer <400> 131 ggacatatct gggccctctc 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon12 R-primer <400> 132 aaaggggccc tcttctttag 20 <210> 133 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon13 R-primer <400> 133 ctccaccaac ccaggatct 19 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon14 R-primer <400> 134 attgaccgtt tgtccctcag 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon15 R-primer <400> 135 atgggaaaat ggaagcacag 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-1 R-primer <400> 136 gcaggaggaa agatgtgagc 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-2 R-primer <400> 137 catagcatgc atgtcccaac 20 <210> 138 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-3 R-primer <400> 138 gagagcctcc tggatggac 19 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-4 R-primer <400> 139 tagacccact ccctcatcca 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-5 R-primer <400> 140 gccctgagct cttggatatg 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-6 R-primer <400> 141 gggtgttttt agggtgacca 20 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> OAS3/exon16-7 R-primer <400> 142 agaagggtga gagctttatg g 21

Claims (28)

  1. 약제로서의 단리된 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3 단백질 또는 상기 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3 단백질을 코드하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 인간 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3의 서열을 갖는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 2의 잔기 1 내지 1087에 대하여 적어도 70% 아미노산 서열 동일성 또는 80% 아미노산 서열 유사성을 가지는, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 2의 381 부위에 세린(Serine)을 포함하는, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 단백질은 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 7로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 제3항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 기재된 단백질을 코드하는 것인, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 6으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것인, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항, 제2항, 제6항, 및 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 벡터 내에 삽입되는 것인, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드.
  9. 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스 감염을 예방 또는 치료하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 기재된 단리된 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3 단백질 또는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 알파바이러스 속(Alphavirus genus)의 바이러스로의 감염을 치료하기 위한 것인, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 바이러스는 치쿤구니아(Chikungunya) 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 동부 말 뇌염(Eastern Equine Encephalitis) 바이러스, 서부 말 뇌염(Western Equine Encephalitis) 바이러스, 베네주엘라 말 뇌염(Venezuelan Equine Encephalitis) 바이러스, 롯스 리버(Ross River) 바이러스, 셈리키 삼림열(Semliki Forest) 바이러스, 바르마 삼림열(Barma Forest) 바이러스, 및 오'니옹 니옹(O'Nyong Nyong) 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제9항에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리뉴클레오티드가 플라비바이러스 속(Flavivirus genus)의 바이러스로의 감염을 치료하기 위한 것인, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 바이러스는 뎅기열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 키아사눌 삼림열병(Kyasanur Forest disease) 바이러스, 머레이 계곡 뇌염(Murray Valley Encephalitis) 바이러스, 세인트 루이스 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 서부 나일 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 및 옴스크 출혈열(Omsk hemorrhagic fever) 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드.
  14. 제9항에 있어서, C형 간염 바이러스 감염을 치료하기 위한 것인, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 기재된 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 동시에, 분리하여, 또는 연속적으로 사용하기 위한 복합 제제로서, 적어도 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 따른 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3의 제1 성분, 및 상기 제1 성분과 다른 제2 성분을 함유하는 제품으로서, 상기 제2 성분은 항바이러스약, 항염증약, 및 면역조절약으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제품.
  16. 개체로부터 얻어진 핵산 샘플에서 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3 유전자의 다형성을 검출하는 단계를 포함하는, 제9항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 따른 양성-센스 단일-사슬 RNA 바이러스 감염에 대한 상기 개체의 민감성을 평가하기 위한 인 비트로 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 검출은 SEQ ID NO: 11, 12, 62 내지 86 및 118 내지 142로 이루어진 군으로부터 선택되는 OAS3 특이적 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 다형성은 Arg844 코돈의 정지 코돈(R844X)으로의 돌연변이 및 아르기닌 381 코돈의 세린 코돈(R381S)으로의 변경으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 R844X 돌연변이는 다음을 포함하는 PCR-RFLP 검사에 의하여 검출되는 것인 방법:
    a) 한 쌍의 프라이머 SEQ ID NO: 11 및 12를 사용하는 PCR에 의한 183bp 산물의 증폭, 및
    b) BglII 엔도뉴클레아제로 PCR 산물의 소화, 여기서 115 bp 및 68 bp의 두 단편의 존재는 R844X 돌연변이의 존재를 나타냄.
  20. 제18항에 있어서, S381 변이체는 뎅기열 바이러스 감염 환자에서 뎅기열 충격 신드롬의 위험에 대한 우세한 방어와 관련되는 것인 방법.
  21. SEQ ID NO: 7 및 SEQ ID NO: 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단리된 OAS3 단백질.
  22. 서열 SEQ ID NO: 9로 이루어진 단리된 OAS3 단백질 단편.
  23. OAS3 단백질 SEQ ID NO: 7을 코드하는 서열 SEQ ID NO: 6, OAS3 단백질 SEQ ID NO: 30을 코드하는 서열 SEQ ID NO: 28 또는 29, 및 OAS3 단백질 단편 SEQ ID NO: 9를 코드하는 서열 SEQ ID NO: 8로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  24. 제23항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 벡터.
  25. 제23항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열 또는 제24항에 따른 재조합 벡터로 형질 주입 또는 형질 전환된 숙주 세포.
  26. 제25항에 있어서, 기탁 번호 I-3927로 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)에 2008년 2월 26일 기탁되고, HeLa-Tet-Off/OAS3#C417-1로 명명된, 재조합 인간 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3를 발현하는 HeLa-Tet-Off 세포주인 숙주 세포.
  27. 제25항에 있어서, 기탁 번호 I-3968로 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)에 2008년 4월 17일 기탁되고, HeLa-Tet-Off/OAS3/delta/1C로 명명된, 절단 재조합 인간 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3를 발현하는 HeLa-Tet-Off 세포주인 숙주 세포.
  28. 제25항에 있어서, 기탁 번호 I-4158로 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes(25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15)에 2009년 5월 15일 기탁되고, HepG2-Tet-Off/OAS3#F8로 명명된, 재조합 인간 2'-5'-올리고아데닐레이트 합성효소 3를 발현하는 HepG2-Tet-Off 세포주인 숙주 세포.
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