CN102124101A - 用于预防或治疗正义单链rna病毒感染的大形式的人2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶oas3 - Google Patents

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Abstract

大形式的人2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶(OAS3)在诊断、预防和治疗正义单链RNA病毒感染中以及在预测人对正义单链RNA病毒相关疾病的遗传易感性中的用途。

Description

用于预防或治疗正义单链RNA病毒感染的大形式的人2’,5’-寡聚腺苷酸合成酶OAS3
本发明涉及作为药物用于预防或治疗正义单链RNA病毒(positive-sense single-stranded RNA virus)感染的大形式的人2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶(2’，5’-OligoAdenylate Synthetase，OAS3)。
本发明还涉及作为标志物用于确定对正义单链RNA病毒感染之遗传易感性的大形式的人2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶(OAS3)。
黄病毒科(Flavivirida)和披膜病毒科(Togaviridae)是两个正义单链(single-stranded，ss)RNA病毒科，其包括在世界范围内可影响人和动物健康的病原体。这些病毒的实例包括黄病毒属(Flavivirus)(黄病毒科)的登革病、黄热病(YF)、日本脑炎(JE)和蜱媒脑炎(tick-borne encephalitis，TBE)抗原性复合物的成员；甲病毒属(Alphavirus)(披膜病毒科)的东方型马脑炎(EEE)病毒/委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒、Semliki森林(SF)病毒和辛德毕斯(Sindbis，SIN)病毒的成员；以及丙型肝炎病毒属(Hepacivirus)(黄病毒科)的成员，如丙型肝炎病毒(HCV)和G型肝炎病毒(HGV)。
登革病毒(DV；黄病毒属的DEN抗原性复合物)是热带地区大多数城市中心的地方性病毒，这是由于城市化步伐的加快为蚊媒登革病的加速传播提供了理想的条件。登革病毒的4种血清型(DV-1至DV-4)通过蚊载体埃及伊蚊(Ae.aegypti)传播到人。DV感染导致一系列疾病，从流感样疾病(登革热，DF)到登革出血热(DHF)，其可发展为登革休克综合征(DSS)乃至死亡。迄今，登革病是人类中最重要的虫媒病毒病，估计每年有1亿病例和超过500,000例DHF/DSS发生，其中包括约25,000个死亡病例(主要为年龄低于15岁的儿童)。高DHF/DSS发病率的流行病继续在亚洲和南美洲地理性蔓延。尽管对健康和经济的影响越来越大，但是目前对登革病的致病机理却了解甚少。尚没有可用的抗登革疫苗或治疗登革病毒感染的特异性疗法。
西尼罗病毒(WNV；黄病毒属的JE抗原性复合物)在包括蚊(库蚊(Culex)种)和鸟类的天然传播圈中循环，而马和人是其偶然宿主。由于1998年在以色列出现了高度神经侵袭性毒株(来自WN病毒谱系I的Ia进化支的Isr98/NY99变种)(Ceccaldi等，FEMS Microbiol.Lett.，2004，233，1-6)，因此动物源性的WNV在北美、中东和欧洲成为主要的健康问题。WNV感染中枢神经系统并在多个动物物种中导致病毒性脑炎。在人中，临床感染的严重程度可从无并发症的西尼罗热到致命的脑膜脑炎。已将WNV的出现与人感染严重性的显著升高联系起来，这使病毒性脑炎作为公共健康问题受到人们的关注。在过去的10年中，WNV已传播到西半球和加勒比海地区。美国的WNV爆发已牵涉到数千患者，引起了严重的神经性疾病(脑膜脑炎和脊髓灰质炎样综合征)，并导致了数百例的相关死亡。尽管WNV的蚊媒传播为主要模式，然而也认识到通过输血、器官捐献以及跨胎盘传播到胎儿的WNV感染。对于WNV相关疾病尚没有可用的疫苗或抗病毒疗法。
基孔肯雅病毒(Chikungunya virus，CHIKV；甲病毒属的SF组)在非洲、东南亚、印度和西太平洋地区广泛传播，且在这些地区已有多次流行的报道。临床上，CHIKV感染导致发热、发疹以及强烈的、使人丧失劳动能力的并且有时持久的关节痛。在2005-06年，CHIK病毒已传播到南印度洋南部地区，特别是留尼旺岛(La Réunion)(法国)(此处的爆发波及了成百上千的患者)。最近，该病毒在意大利东部出现，感染了超过200个人。
丙型肝炎病毒(HCV)是世界范围内很常见的，据估计全世界约3％的人口携带HCV，且仅在欧洲就有约4百万携带者。20～30％的这些个体会发生肝硬化及其长期后遗症(如肝细胞癌)。用PEG化干扰素α(IFN-α)与病毒唑联合治疗HCV感染可在感染了HCV病毒基因型2或3的患者中实现持久的应答(80％)，但是在感染了HCV病毒基因型1的患者中应答率低得多(42％)。
由I型干扰素(IFN-α/β)介导的先天抗病毒机制可能是宿主细胞防御限制病毒复制的最重要途径。事实上，IFN-α/β能够触发导致诱导IFN刺激基因(IFN-stimulated gene，ISG)之特定信号转导途径的激活，所述IFN刺激基因负责建立抗病毒状态。认为在单个细胞中影响RNA病毒复制的ISG包括RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)、粘病毒抵抗蛋白(Mx)家族的蛋白、双链RNA依赖性蛋白激酶(PKR)以及与内切核糖核酸酶RNase L相关的2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶(2’，5’-OAS或OAS)家族。
OAS/RNase L系统是已知在已建立的内源抗病毒途径中起重要作用的RNA衰减途径。具有酶活性的OAS与激活物双链(ds)病毒RNA的结合产生2’-5’连接的寡聚腺苷酸(2-5A)。通过与2-5A寡聚物结合所诱导的同二聚化，无活性的单体RNase L被酶促激活。一经激活，RNase L就降解单链RNA分子(包括mRNA和病毒RNA)，从而抑制病毒复制(Silverman，J.Virol.81：12720，2007)。
人OAS是由染色体12q24.2上3个紧密相连的基因编码的酶家族，其次序如下：小片段(OAS1，p40/46)、中片段(OAS2，p69/71)和大片段(OAS3，p100)OAS同工型(Hovnanian等，Genomics，1998，52，267-277；Rebouillat，D.和Hovanessian，A.G.，Journal of Interferon and Cytokine Research，1999，19，295-308；Rebouillat等，Genomics，2000，70，232-240；Justesen等，Cellular and Molecular Life Sciences，2000，57，1593-1612；Rebouillat；Hovanessian，A.G.，Cytokine and Growth Factor Reviews，2007，18，351-361)。每个OAS基因由包含5个翻译外显子(外显子A-E)的保守OAS单元所组成。OAS1具有一个单元，而OAS2和OAS3分别有两个和三个单元，并且所有这3个基因编码活性的2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶。另一基因OASL(OAS样)编码单个单元的OAS样蛋白，然而其缺乏2’-5’合成酶活性(Hartmann等，Nucleic Acids Res.，1998，26，4121-4128；Rebouillat等，Eur.J.Biochem.，1998；257，319-330)。在每个大小类型中，原始转录物经可变剪接而产生多个成员。OAS蛋白共有由约350个氨基酸组成的保守单元/结构域(OAS单元)；OAS1(p40/p46)、OAS2(p69/71)和OAS3(p100)分别含有一个、两个和三个OAS单元串联拷贝。每种OAS蛋白在细胞中的不同位置聚集，需要不同量的dsRNA来激活，且催化不同大小的2-5A产物形成。OAS1以四聚体发挥作用，OAS2只在二聚体时有活性，而OAS3只作为单体被观察到。此外，推测大形式的人OAS不参与RNase L活化(综述可见，Rebouillat，D.和Hovanessian，A.G.，Journal of Interferon and Cytokine Research，1999，19，295-308)。
通过用2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶(OAS)cDNA转染细胞，提供了OAS家族参与IFN所显示的抗病毒作用的第一个直接证据。OAS1或OAS2的过表达导致细胞对小核糖核酸病毒复制的抗性(Hovanessian，A.G.，Cytokine and Growth Factor Reviews，2007，18，351-361)。以下发现也支持了OAS1体内清除WNV感染的重要性：鼠Oas1b(人OAS1的直系同源基因)可在小鼠对WNV诱导之脑炎的易感性/抗性表型中起关键作用(Mashimo，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99，11311-11316；Lucas等，Immunol.Cell.Biol.，2003，81，230-236；Kajaste-Rudnitski等，Journal of Biological Chemistry，2006，281，46244637；国际PCT申请WO 02/081741)。对人中OAS遗传多态性的分析表明OAS基因中的遗传标志物与酶活性的关联最大。考虑到OAS1是影响宿主对病毒感染之易感性的极佳候选人类基因(Bonnevie-Nielsen等，Am.J.Hum.Genet.，2005，76，623-633)，人OAS1以及OASL基因的遗传改变与病毒性脑炎、1型DM、HCV相关疾病和其它病毒感染的风险相关。特别强调一下HCV疾病，已报道了一系列OAS1基因型与HCV感染的结局有关(国际PCT申请WO 03/089003和WO 2005/040428)。
OAS家族的抗病毒活性是否对正义ssRNA病毒具有选择性是仍待研究的重要问题。据报道，OAS1的异位表达导致对脑心肌炎病毒(小核糖核酸病毒)复制的抗性，但对VSV病毒复制则无抗性。然而，认为OAS在用IFN-α治疗的患者的HCV清除中无作用，而这与另一些ISG(如IFN可诱导的RNA依赖性蛋白激酶(PKR)和粘病毒抵抗蛋白1(MxA)基因)不同。在非人灵长类动物模型中，DV感染后OAS、PKR和Mx的转录水平均上调(Sariol等，Clinical and Vaccine Immunology，14，2007，756-766)。对登革休克综合征相关的基因转录模式的分析显示，与非DSS患者相比，OAS3基因转录物在DSS登革病患者中的丰度较低(Simmons等，J.Infect.Dis.，195：1097，2007)。然而，对这些ISG在DV感染致病机理中的作用仍了解甚少。
据报道，CHIKV对I型干扰素(IFN-α/β)的抗病毒活性作用具有高度敏感性(Couderc等，PloS Pathogens，2007，4，e29)。在甲病毒的情形中，一系列证据表明IFN介导的病毒生长抑制不需要RNase L(Ryman等，J.Virol.，2005，79，1487-1499；综述见，Silverman，J.Virol.，2007，81，12720-9)。人ISG的任何成员(如OAS家族)是否可表现抗甲病毒活性是仍待研究的重要问题。
本发明人首次证实OAS3在针对正义ssRNA病毒(如甲病毒(CHIKV、SINV和SFV))的公认内源抗病毒途径中有作用。他们显示，OAS3通过在被感染的人上皮细胞中阻止病毒蛋白质合成和病毒RNA复制而对CHIKV生长阶段起作用。针对甲病毒感染的人遗传易感性，几乎没有可用的信息。在健康的白种人个体中筛查OAS3基因的多态性，在密码子CGA-844的第一位鉴定出单核苷酸多态性(SNP)，其中用T替换C得到无义突变(OAS3.R844X)。预计该OAS3.R844X位置的SNP将产生OAS3蛋白的截短形式，在羧基端缺失约20％。与全长的OAS3蛋白相比，OAS3突变体的异位表达对CHIKV的抑制效力降低。OAS3的遗传多态性可控制其抗甲病毒活性的观点表明，人OAS基因在甲病毒相关疾病(如基孔肯雅热)的致病机理中起作用。
本发明人首次证实OAS3在感染了DV(肝癌细胞)和WNV(肝癌和上皮细胞)的人细胞中表现出抗黄病毒活性。在DSS患者和非DSS登革患者中检查完整的OAS3基因鉴定出在密码子AGG-381的第三位具有SNP rs2285993，其中用C替换G使氨基酸从精氨酸变为丝氨酸。我们的遗传学数据表明，在泰国登革患者中Ser-381变体与对DSS风险的显性保护作用有关。本发明人在本文中证明具有Ser-381的OAS3是人肝细胞中DV生长的强效抑制物。
本发明人还证实YFV的减毒活疫苗株17D-204(STAMARIL，Sanofi-Pasteur)在被感染的人上皮和肝癌细胞中对OAS3介导的抗病毒途径具有固有的抗性。然而，在人细胞中IFN-α能建立针对YFV的17D-204疫苗株的抗病毒状态。
这些发现可用于开发针对有重大医学意义的正义ssRNA病毒(包括CHIKV、WNV和DV)的基于OAS3的预防和治疗。它们还可用于开发预测人对以下病毒感染易感性的基于OAS3的新型分子工具，所述病毒包括甲病毒、黄病毒和其它具有重大医学意义的正义ssRNA病毒，特别是预测登革、西尼罗和基孔肯雅患者的严重疾病形式。
本发明的一个主题是用作药物的分离的2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶3蛋白或分离的编码所述2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶3蛋白的多核苷酸。
定义
-“多核苷酸”是指基因组DNA片段、cDNA片段或RNA分子。
-“2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶3”、“OAS3”、“OAS 3”、“2’，5’-寡聚腺苷 酸合成酶3(100kD)”、“(2-5’)-寡聚(A)合成酶3”、“寡聚腺苷酸合成酶 p100”、“p100OAS”或“p100OAS”是指由哺乳动物OAS3基因编码的蛋白质，其具有2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶活性，并且指衍生的变体，包括由OAS3基因中多态性导致的天然变体以及由OAS3基因/开放读码框(ORF)序列中一个或多个核苷酸的突变(插入、缺失、替换)导致的人工变体，只要所述变体具有2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶活性并能够抑制正义单链RNA病毒复制即可。优选地，所述变体含3个OAS结构域。可在序列数据库中获得多种哺乳动物的OAS3基因和推导出的OAS3 ORF以及氨基酸序列，其它OAS3基因/ORF序列可经本领域技术人员已知的标准克隆和测序技术来确定。
-“人OAS3基因”是对应于GenBank序列登记号NC_000012的111860632至111895437位的34806bp的序列。人OAS3基因位于12号染色体上(12q24.2)，并包括16个外显子：外显子1：1至264位；外显子2：3127至3409位；外显子3：6033至6208位；外显子4：8300至8538位；外显子5：9503至9656位；外显子6：10418至10762位；外显子7：12250至12532位；外显子8：22628至22803位；外显子9：24209至24459位；外显子10：24870至25014位；外显子11：25792至25965位；外显子12：27301至27586位；外显子13：28975至29150位；外显子14：29493至29731位；外显子15：31165至31312位；外显子16：31519至34806位。
-“人OAS3开放读码框(ORF)”是序列SEQ ID NO：1，其对应于6646bp的人cDNA序列(GenBank登记号：NM_006187(SEQ ID NO：27))的88至3351位。在cDNA序列NM_006187上外显子1至16的位置分别为：1至264位，265至547位，548至723位，724至962位，963至1116位，1117至1461位，1462至1744位，1745至1920位，1921至2171位，2172至2316位，2317至2490位，2491至2776位，2777至2952位，2953至3191位，3192至3339位，3340至6627位。
-“人OAS3蛋白”是对应于GenBank登记号NP_006178或SEQ ID NO：2的1087个氨基酸的序列；其3个OAS结构域分别对应于6至343位(SEQ ID NO：3)、411至742位(SEQ ID NO：4)和750至1084位(SEQ ID NO：5)。
-“OAS3活性”是指2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶活性以及正义单链RNA病毒复制抑制活性。
本发明OAS3蛋白的2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶活性可利用层析或电泳方法通过确定所形成的寡聚腺苷酸的终点量来测定(St Laurent等，Cell，1983，33，95-102；Johnston等，In：Interferon 3：Mechanisms of Production and Action，1984，189-298，Friedman，R.M.，Ed，Elsevier，Amsterdam；Justesen等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1980，77，4618-4622；Justesen等，Nucleic Acids Res.，1980，8，3073-3085；Justesen，J.和Kjelgaard，N.O.，Anal.Biochem.，1992，207，90-93)。
-“本发明的OAS3蛋白对正义ssRNA病毒复制的抑制”是指当外源OAS3蛋白(不是由所述细胞基因组编码，例如重组OAS3蛋白)存在于被病毒感染细胞中时，病毒生长(病毒增殖)的部分或完全降低。该抑制可通过用正义单链RNA病毒感染表达OAS3蛋白的合适重组细胞系来测定。使用经病毒感染的同一类型的非重组细胞作为对照。然后，可通过已知的任何病毒滴度测定来检测经病毒感染细胞的上清液中病毒后代的产生。或者，可通过病毒抗原的Western印迹或免疫标记来分析病毒蛋白的产生，或者通过Northern印迹或RT-PCR来分析病毒基因组或亚基因组RNA的产生。
-“正义ssRNA病毒”是指以正义单链核糖核酸(ssRNA)作为遗传物质并且不用DNA中间体进行复制的病毒。正义ssRNA病毒属于病毒分类的巴尔的摩分类系统中的组IV。
-与氨基酸序列和核酸序列有关的“同一性”是指基于序列比对(其尽可能增大所比对氨基酸残基或核苷酸的同一性)对两个序列同一性程度的测量，其是一致残基或核苷酸数、总残基(在本发明中为1087个残基)或核苷酸(在本发明中为3261个核苷酸)数以及序列比对中空位的存在和长度的函数。已有多种比对算法和/或计算机程序采用标准参数来确定序列同一性，包括FASTA或BLAST(其为GCG序列分析软件包的一部分(威斯康星大学，Madison，Wis.))，并可采用如默认设置。
与SEQ ID NO：2的1至1087位残基有75％同一性的蛋白质是：当将该蛋白序列与SEQ ID NO：2的1至1087位残基进行比对并比较时，该蛋白质的序列可包含至多(25×10.87＝271)个变化。一个变化是指与SEQID NO：2的1至1087位残基比较时，一个氨基酸的缺失、替换或插入。例如，与SEQ ID NO：2的前1080个残基相比具有50个变化的含1080个氨基酸的序列，与SEQ ID NO：2的同一性为1080-50/10.87＝94.75％。例如，与SEQ ID NO：2的1至1087位残基相比具有50个变化的含1090个氨基酸的序列，与SEQ ID NO：2的同一性为1087-50/10.87＝95.4％。
-“相似性”是指基于序列比对(其尽可能增大所比对氨基酸残基的相似性)对两个氨基酸序列的相似性程度的测量，其是一致或相似的残基数、总残基数(在本发明中为1087个残基)以及序列比对中空位的存在和长度的函数。已有多种比对算法和/或计算机程序采用标准参数来确定序列相似性，包括FASTA或BLAST(其为GCG序列分析软件包的一部分(威斯康星大学，Madison，Wis.))，并可采用如默认设置。相似的残基是指具有相当的化学性质(大小、电荷(中性、碱性、酸性)、亲水性/疏水性)的残基。
-“个体”包括哺乳动物，以及其它脊椎动物(如，鸟类、鱼类和爬行动物)。本文所用术语“哺乳动物”是指哺乳其子代并且生出活的幼体(真兽亚纲(eutharian)或胎盘类哺乳动物)或产卵(后兽亚纲(metatharian)或非胎盘类哺乳动物)的任何脊椎动物，包括单孔类动物、有袋类动物和胎盘类动物。哺乳动物物种的实例包括人和其它灵长类动物(例如，猴和黑猩猩)、啮齿类动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠)和其它动物(例如牛、猪和马)。
-“突变”意指在多核苷酸(cDNA、基因)或多肽序列中一个或多个核苷酸/氨基酸的替换、缺失、插入。所述突变可影响基因的编码序列或其调控序列。它还可影响基因组序列的结构或所编码mRNA的结构/稳定性。
本发明涵盖经修饰的OAS3蛋白，其包含选自以下的一个或多个修饰：OAS3氨基酸序列中一个或多个氨基酸的突变(插入、缺失、替换)、氨基酸融合部分的添加、用非天然的氨基酸(D-氨基酸或非氨基酸类似物)替换氨基酸残基、对肽键的修饰、环化、向侧链加入化学基团(脂质、寡糖或多糖)以及与适当载体偶联。通过本领域熟知的方法引入的这些修饰得到仍具有2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶活性以及对正义单链RNA病毒复制具有抑制活性的经修饰OAS3蛋白。
根据本发明的一个优选实施方案，所述2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶3(OAS3)是人2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶3。
根据本发明另一优选实施方案，所述OAS3蛋白与SEQ ID NO：2的1至1087位残基具有至少70％氨基酸序列同一性或80％氨基酸序列相似性，优选地具有至少80％氨基酸序列同一性或90％氨基酸序列相似性。
根据本发明的一个更优选的实施方案，所述OAS3蛋白在SEQ ID NO：2的第381位包含丝氨酸。优选地，所述OAS3蛋白包含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7的氨基酸序列或由其组成。
根据本发明的另一优选实施方案，所述OAS3多核苷酸编码上述蛋白质，更优选地其包含选自以下的核苷酸序列或由其组成：编码蛋白质SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1以及编码蛋白质SEQ ID NO：7的SEQ ID NO：6。
根据本发明的另一优选实施方案，所述多核苷酸被插入表达载体中。
载体是指能够转运连接其上的另一核酸的核酸分子。本发明中可用的载体包括但不限于：病毒载体、质粒、RNA载体或者线性或环状DNA或RNA分子，其可由染色体的、非染色体的、半合成的或合成的核酸组成。优选的载体能进行自主复制(附加型载体)和/或能表达与其连接的核酸(表达载体)。大量的合适载体已为本领域技术人员所知并可购得。
病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒或AAV)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病毒和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹病毒和仙台病毒)、正链RNA病毒(如细小核糖核酸病毒和甲病毒)以及双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如，1型和2型单纯疱疹病毒、EB病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如牛痘、禽痘和金丝雀痘))。其它病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白细胞组织增生肉瘤病毒、哺乳动物C型病毒、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、泡沫病毒(Coffin，J.M.，Retroviridae：The viruses and their replication，Fundamental Virology，第三版，B.N.Fields等编，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。
优选地，所述载体为表达载体，其中编码本发明OAS3蛋白的序列置于适当的转录和翻译控制元件的控制下，以允许产生或合成所述蛋白质。因此，所述多核苷酸包含在表达盒中。更具体地，所述载体包含复制起点、与所述编码多核苷酸有效连接的启动子、核糖体结合位点、RNA剪接位点(当采用基因组DNA时)、多聚腺苷酸化位点和转录终止位点。其还可包含增强子。启动子的选择将取决于多肽所表达的细胞。合适的启动子包括组织特异性启动子和/或可诱导的启动子。可诱导启动子的实例包括：重金属水平升高诱导的真核金属硫蛋白启动子、温度升高诱导的热休克启动子。组织特异性启动子的实例包括骨骼肌肌酸激酶、前列腺特异性抗原(PSA)、α-抗胰蛋白酶、人表面活性剂(SP)A和B蛋白以及β-酪蛋白。载体可包含选择标记，例如：用于真核细胞培养的新霉素磷酸转移酶、组胺醇脱氢酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素磷酸转移酶、单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶、腺苷脱氨酶、谷氨酰胺合成酶和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶；用于酿酒酵母(S.cerevisiae)的TRP1，URA3和LEU2；用于大肠杆菌(E.coli)中的四环素、利福平或氨苄青霉素抗性。
载体的选择取决于它们的用途(稳定表达或瞬时表达)或/和宿主细胞；病毒载体和“裸”核酸载体为哺乳动物细胞(人和动物)中表达的优选载体。可采用病毒载体(如腺病毒、逆转录病毒、慢病毒和AAV)等，其中预先将目的序列插入所述载体中。
本发明的主题还包括药物组合物，其特征为包含至少一种OAS3蛋白或一种OAS3多核苷酸(优选地插入到上述表达载体中)，以及至少一种可用载体、运载体(carrier)、添加剂和/或免疫刺激剂。
可将本领域普通技术人员已知的任何合适的运载体用于本发明的药用组合物中，运载体的类型取决于施用模式。对于肠胃外施用(如皮下注射)，运载体优选地包含水、盐水缓冲液、乳糖、甘露醇、谷氨酸盐，脂肪或蜡，注射用药物组合物优选为等渗溶液(约300-320毫渗透摩尔)。对于口服施用，可采用任何上述运载体或固体运载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁。还可用生物可降解的微球(例如，polylactic galactide)作为本发明药物组合物的运载体。已公开了合适的生物可降解微球，如美国专利4,897,268和5,075,109中的微球体。添加剂可选自抗凝集剂、抗氧化剂、染料、增味剂或者光滑、聚集或分离剂，以及一般来讲在制药工业中常规采用的任何赋形剂。在本发明的组合物中可采用多种免疫刺激剂中的任意种来增强免疫应答。
所述药物组合物可采用适于口服施用的形式。例如，所述组合物采用口服施用的以下形式：片剂、普通胶囊剂、明胶胶囊剂或糖浆剂。这些明胶胶囊剂、普通胶囊剂和片剂形式可包含药物制剂中常规采用的赋形剂，如辅药或粘合剂(如淀粉、树胶或明胶)、辅药(如磷酸钙)、崩解剂(如玉米淀粉或海藻酸)、润滑剂(如硬脂酸镁)、甜味剂或调味剂。可通过在水性介质或非水性介质中加入药理学相容性溶剂来制备溶液和悬液。这些包括乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、聚乙二醇醚、DMSO和乙醇。
通过本领域技术人员熟知的适用于特定细胞类型的任何便捷手段，将OAS3蛋白或OAS3多核苷酸(分离的或插入载体中的)在体外、离体或体内引入细胞中，可单独引入或与至少一种适当的载体和/或运载体一起引入。例如，OAS3蛋白/多核苷酸可与以下物质结合，所述物质能在机体中对所述序列提供保护或能使其穿过宿主细胞膜。OAS3可有利地与脂质体、聚乙烯亚胺(PEI)和/或膜转位肽相结合(Bonetta，The Scientist，2002，16，38；Ford等，Gene Ther.，2001，8，1-4；Wadia和Dowdy，Curr.Opin.Biotechnol.，2002，13，52-56；Langel，U.In Handbook of cell penetrating peptides(第二版)，2006，Lavoisier；法国)；在后一情形中，OAS3蛋白序列与膜转位肽的序列融合(融合蛋白)。编码OAS3的多核苷酸(分离的或插入载体中的)可通过多种方法引入到细胞中(例如，注射、直接摄取、射弹攻击、脂质体、电穿孔)。可使用上述合适的表达载体将OAS3蛋白稳定或瞬时地表达在细胞中。
在本发明的一个实施方案中，OAS3蛋白/多核苷酸基本无免疫原性，即不引起或基本不引起不良免疫应答。可依照本发明采用多种改善或消除此种有害免疫反应的方法。在一个优选的实施方案中，OAS3蛋白基本不含N-甲酰甲硫氨酸。避免不期望的免疫反应的另一种方法是将蛋白质/多核苷酸与聚乙二醇(“PEG”)或聚丙二醇(“PPG”)(优选的平均分子量(MW)为500至20,000道尔顿)缀合。
本发明的另一主题是上述OAS3蛋白或编码所述OAS3蛋白的多核苷酸，其用于预防或治疗正义单链RNA病毒的感染。
根据一个更优选的实施方案，所述病毒属于甲病毒属。更优选地，其选自：基孔肯雅(CHIK)病毒、辛德毕斯(SIN)病毒、Semliki森林(SF)病毒、东方型马脑炎(EEE)病毒、西方型马脑炎(WEE)病毒、委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒、罗斯河(RR)病毒、奥-奈氏(ONN)病毒和Barma森林(BF)病毒。
根据另一更优选的实施方案，所述病毒属于黄病毒属。更优选地，所述病毒选自：登革病毒、日本脑炎病毒、Kyasanur森林病病毒、墨莱溪谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、蜱媒脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病病毒和鄂木斯克出血热(OHF)病毒。
根据另一优选的实施方案，所述病毒属于丙型肝炎病毒属。更优选地，所述病毒为丙型肝炎病毒。
本发明的主题还包括至少含有上述OAS3蛋白或OAS3多核苷酸(优选地插入表达载体中)的产品，以及与前一产品不同的第二产品，所述第二产品选自：抗病毒、抗炎和免疫调节药物，其可作为联合制剂同时、分开或依次用于预防或治疗正义单链RNA病毒感染。
本发明的主题还包括在有此需要的个体中预防或治疗正义单链RNA病毒感染的方法，所述方法包括以任何方式向所述个体施用上述组合物的步骤。
一般来讲，所述组合物可通过以下方式施用：肠胃外注射(例如，真皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如，通过吸入或喷雾)、口服、舌下或局部(通过皮肤或通过直肠)。
本发明组合物中存在的OAS3(蛋白质/多肽)的量为治疗有效量。OAS3(蛋白质/多肽)的治疗有效量为OAS3蛋白实现其抑制正义单链RNA病毒复制的作用而不在施用该组合物的对象中导致过度副作用的必要量。所用OAS3(蛋白质/多肽)和待施用组合物的准确量将根据如下因素而不同：正义单链RNA病毒物种、接受治疗的个体物种(人、动物)、施用方式、施用频率以及该组合物中的其它成分。
优选地，所述组合物包含约10μg至约10mg(更优选约100μg至约1mg)的OAS3(蛋白质/多肽)。“约”是指OAS3所述量(μg或mg)的值可在特定范围内变化，这取决于评估该量所使用的方法的误差限度。
例如，当口服施用本发明的组合物时，待治疗的个体可以连续3天每天接受约10μg至约10mg OAS3(蛋白质/多肽)的单剂量。该治疗可在一周后重复1次。
对于肠胃外施用(例如皮下注射)，待治疗的个体可接受约10μg至约10mg(更优选约100μg至约1mg)OAS3(蛋白质/多肽)的单剂量。可在一周后重复该治疗1次。
本发明的主题还包括在体外评估个体对以上定义的正义单链RNA病毒之易感性的方法，其包括：检测从所述个体获得的核酸样品中OAS3基因的多态性。
所述核酸样品可以是基因组DNA、总mRNA或cDNA。
多态性可用本领域已知的可检测核酸序列中突变的任何方法来检测，例如在Current Protocols in Human Genetics，2008，John Wiley & Sons，Inc.中所表述地。基因分型测定的实例包括但不限于：RAPD、RFLP、AFLP、序列特异性寡核苷酸杂交、SnapShot PCR、连接酶检测反应、PCR和Maldi-TOF、焦磷酸测序。这些测定可使用表II和III中的OAS3特异性引物，特别是引物SEQ ID NO：11、12、62至86以及118至142。
根据所述方法的一个优选实施方案，所述正义单链RNA病毒为甲病毒(如基孔肯雅病毒)或黄病毒(如登革病毒)。
根据所述方法的另一优选实施方案，所述多态性为Arg844密码子突变为终止密码子(R844X)；在白种人群中检测到的所述多态性与对正义单链RNA病毒感染(特别是基孔肯雅病毒感染)的易感性提高相关。R844X突变可如下检出：使用引物对(SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12)进行PCR-RFLP，之后用BglII消化183bp的PCR产物；115bp和68bp的两种片段的存在表明存在OAS3.R844X突变。
根据所述方法的另一优选的实施方案，所述多态性为381位密码子第三位的单核苷酸多态性(SNP)。优选地，所述SNP为密码子AGG-381由G替换为C，其使氨基酸由精氨酸变为丝氨酸(R381S)。遗传学数据显示变体Ser-381与登革患者针对DSS风险的显性保护作用有关(表VI)。该SNP可通过如上所述的任何合适的基因分型测定来检测。例如，该测定可包括对用成对的OAS3特异性引物(例如在表III中给出的特异性针对OAS3外显子6的PCR引物(SEQ ID NO：70和126))扩增的基因组DNA进行直接测序。
本发明的主题还包括分离的OAS3蛋白，其包含序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：30，或由其组成。
本发明的主题还包括分离的OAS3蛋白片段，其包含序列SEQ ID NO：9或由其组成；该OAS3片段(包括SEQ ID NO：7的1至843位残基)包括OAS3的第一个和第二个OAS结构域，但缺少第三个(C端)OAS结构域的大部分。
本发明的主题还包括：
-分离的多核苷酸，其包含序列SEQ ID NO：6或由其组成，其编码SEQID NO：7的OAS3蛋白，
-分离的多核苷酸，其包含序列SEQ ID NO：8或由其组成，其编码SEQID NO：9的OAS3蛋白片段，
-分离的多核苷酸，其包含序列SEQ ID NO：28或29或由其组成，其编码SEQ ID NO：30的OAS3蛋白变体。
本发明的主题还包括重组载体，优选包含如下多核苷酸的表达载体，所述多核苷酸具有选自以下的序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29。
本发明的主题还包括经如下多核苷酸转染或转化的宿主细胞，所述多核苷酸包含选自以下的序列：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29，或由其组成。
根据本发明的一个优选实施方案，其为表达重组人OAS3的HeLa-Tet-Off细胞系，称为HeLa-Tet-Off/OAS3#C417-1，该细胞系于2008年2月26日保藏于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，登记号为I-3927。
根据本发明的另一优选实施方案，其为表达截短的重组人OAS3的a-Tet-Off细胞系，称为HeLa-Tet-Off/OAS3/delta/1C，该细胞系于2008年4月17日保藏于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，登记号为I-3968。
根据本发明的一个优选实施方案，其为表达重组人OAS3的HepG2-Tet-Off细胞系，称为HeLa-Tet-Off/OAS3#F8，该细胞系于2009年5月15日保藏于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，登记号为I-4158。
这些源于HeLa或HepG2细胞的细胞系(可被多种病毒感染)可用于测定病毒对OAS3介导的抗病毒活性的敏感性。
本发明的主题还包括包含上述多核苷酸的非人转基因动物。
本发明的主题还包括包含上述多核苷酸的转基因植物。
本发明的OAS3蛋白/多核苷酸使用众所周知的重组DNA技术和遗传改造技术来制备。例如，使用特异性引物通过聚合酶链式反应由DNA模板扩增得到含OAS3ORF的序列。然后通过使用适当的限制位点将PCR片段用克隆进表达载体中。OAS3蛋白在适合于OAS3蛋白表达的条件下，在该表达载体修饰的宿主细胞或转基因动物/植物中表达，并且从宿主细胞培养物或转基因动物/植物中回收OAS3蛋白。
除非另外指明，本发明的实施将采用本领域技术人员已知的以下范畴中的常规技术：细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学。这些技术在文献中有充分的解释。例如见，Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL，2000，Wiley and son Inc，Library of Congress，USA)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，(Sambrook等，2001，Cold Spring Harbor，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Mullis等，美国专利No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harries & S.J.Higgins编，1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames & S.J.Higgins编，1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson和M.Simon，主编，Academic Press，Inc.，New York)，特别是154和155卷(Wu等编)以及185卷，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel编)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller和M.P.Calos编，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer和Walker编，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986)；以及Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。Current Protocols in Human Genetics(John Wiley & Sons，Inc，2008)，特别是第12章“Vectors For Gene Therapy”和第13章“Delivery Systems for Gene Therapy”)。
-图1示意带有c-myc表位标签的人重组OAS3(克隆OAS3C 17.1)的核苷酸(A)和氨基酸(B)序列。这些核苷酸和氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO：23和24。OAS3 mRNA参照序列(SEQ ID NO：27)与克隆的OAS3 cDNA之间的差异用下划线(如果为同义)或粗体(如果不同义)表示。翻译起始和终止密码子用粗体表示。对应于C端c-myc表位的额外的核苷酸和氨基酸序列用下划线表示。5’NotI和3’EcoRV限制位点用斜体显示。
-图2示意表达重组人OAS3的可诱导HeLa-Tet-Off/OAS3#C417-1细胞系的构建。
-图3示意在HeLa细胞中检测OAS3。在(A)中，以每个细胞不同的病灶形成单位(AP61FFU)用CHIK病毒株06-49(CHIK 06-49)感染HeLa.Tet-Off细胞。感染后(p.i.)20小时，将感染细胞上清液中产生的病毒颗粒在假鳞斑伊蚊(Aedes pseudoscutellaris)AP61细胞中用病灶免疫测定进行滴定。在(B)中，在加入CHIKV(每个细胞1个AP61FFU的感染复数(1MOI))前5小时，用1,000IU/ml的人IFN-α处理HeLa.Tet-Off细胞或进行模拟处理(对照)。在感染后18h，如上所述测定病毒后代的产生。在(C)中，示意全长和截短形式的OAS3。在(D)中，使用OAS3特异性抗体通过免疫印迹分析了经诱导的(-Tet)或未诱导的(+Tet)Tet-Off/OAS3细胞中OAS3的异位表达，用1,000IU/ml的IFN-α(+IFN)处理HeLa.Tet-Off细胞或模拟处理(模拟)。以β-肌动蛋白为看家蛋白对照。
-图4示意在表达OAS3的HeLa细胞中CHIKV的生长抑制。在(A)中，用CHIKV(1MOI)感染细胞18小时，并用抗CHIK.E2单克隆抗体3E4通过流式细胞术对其进行分析。在以下细胞中进行分析：模拟感染的细胞(无病毒)、在病毒加入前5h用1,000IU/ml的人IFN-α孵育的经CHIKV感染之HeLa.Tet-Off细胞(+IFN)或模拟处理的细胞(对照)以及在四环素存在(+tet)或不存在(-tet)下经CHIKV感染的Tet-Off/OAS3细胞。在(B)中，用CHIKV以不同的MOI感染细胞，在感染后18和24小时测定病毒后代的产生。在(C)中，在感染后的不同时间监测CHIKV的生长抑制。在(D)中，用SINV或SFV以1MOI感染细胞，在感染后18小时测定病毒后代产生。
-图5示意WN病毒对OAS3抗病毒活性的敏感性。用每个细胞0.1、1.0或10AP61FFU的WN病毒株IS-98-ST1感染HeLa.Tet-Off和经诱导的HeLa.Tet-Off/OAS3#C417-1。在感染后48小时将感染细胞上清液中产生的感染性病毒颗粒在假鳞斑伊蚊AP61细胞中用病灶免疫测定进行滴定。
-图6示意在表达OAS3的细胞中WN病毒的生长抑制。用每个细胞0.1AP61FFU的WN病毒株IS-98-ST1感染HeLa.Tet-Off和经诱导的HeLa.Tet-Off/OAS3#C417-1，并在感染后的不同时间(24、48和72小时)将感染细胞上清液中产生的感染性病毒颗粒在假鳞斑伊蚊AP61细胞中用病灶免疫测定进行滴定。
-图7示意OAS3表达对CHIKV复制的影响。在(A)中，用抗CHIKHMAF抗体(左)或抗CHIKV E2单克隆抗体3E4(右)对以CHIKV(病毒)感染或模拟感染(mock infected，m.i.)的HeLa.Tet-Off细胞(对照)和HeLa.Tet-Off/OAS3(OAS3)细胞的细胞提取物进行免疫印迹测定。使用β-肌动蛋白作为蛋白对照。在(B)中，在用CHIKV(1MOI)感染的HeLa.Tet-Off细胞(对照)和HeLa.Tet-Off/OAS3细胞(OAS3)后8小时，对其病毒RNA产生进行实时RT-PCR分析。
-图8示意截短形式的OAS3的抗甲病毒活性。用1MOI的CHIKV感染HeLa.Tet-off(对照)、HeLa.Tet-Off/OAS3(OAS3)和HeLa.Tet-Off/OAS3/delta/1C(OAS3ΔC末端)细胞，并在感染后18小时测定病毒后代产生。按照Student’s t检验对数值进行统计学比较(***：P＜0.001)。
-图9示意截短形式的OAS3的抗黄病毒活性。用1MOI的WNV感染HeLa.Tet-off(对照)、HeLa.Tet-Off/OAS3(OAS3)和HeLa.Tet-Off/OAS3/delta/1C(OAS3ΔC末端)细胞，并在感染后18小时测定病毒后代产生。按照Student’s t检验对数值进行统计学比较(***：P＜0.001)。
-图10示意DV-1病毒对I型IFN途径的敏感性。A：HepG2.Tet-Off细胞系对DV感染的易感性。用递增量(AP61FFU/每细胞)的DV-1病毒株FGA/NA d1d感染细胞。在感染后40小时，利用单克隆抗体4E11(其对DV E糖蛋白具有反应性)通过流式细胞术分析细胞。B：DV-1病毒对I型IFN途径的敏感性。在DV感染(10MOI)5小时前，用1,000IU.mL-1人IFN-α(+IFN)预处理HepG2.Tet-Off细胞或不进行处理(模拟处理)。在感染后40小时，如前所述测定病毒后代产生(Duarte dos Santos等，Virology，2000，274，292-)。
-图11：表达OAS3的HepG2细胞中登革病毒的生长抑制。在2μg.mL-1四环素存在(未诱导)或不存在(经诱导)的情况下，用不同感染复数的1型登革病毒株FGA/NA d1d感染亲代HepG2.Tet-Off细胞和HepG2.Tet-Off/OAS3#F8细胞克隆。在感染后40小时，用甲醇/丙酮在-20℃固定细胞20分钟。用缀合有FITC的抗登革E单克隆抗体4E1进行免疫荧光测定。用DAPI对细胞核染色。一式三份实验来确定对病毒抗原呈阳性的HepG2细胞的百分数。在感染复数为25时测定病毒后代产生。如前所述进行病毒滴定(Duarte dos Santos等，Virology，2000，274，292-)。
-图12：表达OAS3的HepG2细胞对登革病毒感染显示抗性。用感染复数为30AP61FFU/细胞的1型登革病毒株FGA/NA d1d(Duarte dos Santos等，Virology，2000，274，292-)感染亲代HepG2.Tet-Off细胞和经诱导的HepG2.Tet-Off/OAS3#F8细胞克隆或进行模拟感染。在感染后40小时，如图11的图注中所述进行免疫荧光测定。
-图13：表达OAS3的HepG2细胞对西尼罗病毒感染显示抗性。用感染复数为1AP61FFU/细胞的西尼罗病毒株IS-98-ST1(Lucas等，Virology J.，2004，1，9-)感染亲代HepG2.Tet-Off和经诱导的HepG2.Tet-Off/OAS3#F8细胞克隆，或进行模拟感染。在感染后40小时，用甲醇/丙酮在-20℃下固定细胞20分钟。用缀合有cy3的抗西尼罗E单克隆抗体E24进行免疫荧光测定。用DAPI对细胞核进行染色。
-图14显示IFN-α能够在人上皮HeLa细胞中建立针对YFV 17D的抗病毒状态。用1PFU/细胞的YFV 17D感染HeLa细胞，然后在感染后的多个时间点用1,000IU/ml的人IFN-α处理或进行模拟处理(对照)。在感染后72小时测定病毒后代产生。
-图15显示，无论感染后的时间点或感染复数为何，YFV的17D减毒活毒株均显示出对人细胞中OAS3介导之抗病毒作用的预料之外的抗性。将HeLa(对照)和经诱导的HeLa.Tet-Off/OAS3(OAS3)细胞暴露于低(图A；1PFU/细胞)或高(图B；10PFU/细胞)病毒输入的YFV毒株17D。
-图16：表达OAS3的HepG2细胞对黄热病疫苗17D-204无抑制作用。用在Vero E6细胞中培养一次的STAMARIL黄热病减毒活疫苗(Sanofi-Pasteur)感染亲代HepG2.Tet-Off细胞和经诱导的HepG2.Tet-Off/OAS3#F8细胞克隆或进行模拟感染。在感染后40小时，用甲醇/丙酮在-20℃下固定细胞20分钟。用抗法国嗜神经病毒HMAF和缀合有FITC的山羊抗小鼠Ig进行免疫荧光测定。用DAPI对细胞核染色。
-图17示意截短的人重组OAS3(OAS3I-843)的核苷酸(A)和氨基酸(B)的序列。这些核酸和氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26。OAS3 mRNA参照序列与克隆的OAS3 cDNA片段之间的变化用下划线(如果为同义)或粗体(如果不同义)表示。翻译起始和终止密码子用粗体表示。对应于C端c-myc表位的额外的核苷酸和氨基酸序列用下划线表示。5’NotI和3’EcoRV限制位点用斜体显示。
实施例1：HeLaTet-Off/OAS3细胞系的建立和评估
1)材料和方法
a)细胞培养
HeLa.Tet-Off细胞系购买自BD BIOSCIENCES CLONTECH。将HeLa.Tet-Off细胞在添加了10％热灭活胎牛血清(FCS)、4mM L-谷氨酰胺、100UI/ml青霉素、10μg/ml链霉素和200μg.mL-1 G418(INVITROGEN)的DMEM(INVITROGEN)中、于37℃在5％CO2下培养。
HeLa.Tet-Off/OAS3细胞系(CNCM I-3927)在添加了10％FCS、4mM L-谷氨酰胺、100UI/ml青霉素、10μg/ml链霉素、200μg.mL-1 G418、100μg.mL-1潮霉素B(BD BIOSCIENCES CLONTECH)和2μg.mL-1四环素(SIGMA-ALDRICH)的DMEM中培养。细胞以单层生长；预期细胞密度为80％至100％；细胞倍增时间约为2天。经胰蛋白酶消化收集细胞；每周取其1/10进行传代培养。细胞的寿命有限(15至20代)。在添加了20％FCS、10％DMSO、4mM谷氨酰胺、100UI/ml青霉素、10μg/ml链霉素、200μg.mL-1 G418、100μg.mL-1潮霉素B和2μg.mL-1四环素的DMEM中冷冻细胞。
HeLa.Tet-Off/OAS3/delta/1C(OAS3ΔC末端)细胞系(CNCM I-3968)在添加了10％FCS、20mM L-谷氨酰胺、10,000UI/ml青霉素、10μg/ml链霉素、200μg.mL-1 G418、100μg.mL-1潮霉素B(BD BIOSCIENCES CLONTECH)和10μg.mL-1四环素(SIGMA-ALDRICH)的DMEM中培养。细胞以单层生长；预期细胞密度为90％；细胞倍增时间约为2天。经胰蛋白酶消化收集细胞；每周取其1/10进行传代培养。细胞的寿命有限(25代)。在添加了20％FCS、10％DMSO、4mM谷氨酰胺、10,000UI/ml青霉素、10μg/ml链霉素、200μg.mL-1 G418、100μg.mL-1潮霉素B和10μg.mL-1四环素的DMEM中冷冻细胞。
b)建立表达OAS3蛋白的HeLa.Tet-Off细胞系
用在PCR4-TOPO载体(INVITROGEN)中分别克隆的人OAS3的两个重叠cDNA片段作为表达全长OAS3蛋白(SEQ ID NO：24的1至1,087位氨基酸和图1)或截短形式OAS3ΔC末端(或OAS3[1-843]，SEQ ID NO：26的1至843位氨基酸和图3C、9和17)的模板。在表I中列出了参照OAS3序列(GenBank登记号NM-006187；SEQ ID NO：27)与本研究中所用的OAS3 cDNA(图1)的核苷酸和氨基酸的不同。
表I：OAS3 mRNA参照序列与克隆的OAS3 cDNA之间核苷酸和氨基酸
变化
Figure BPA00001303941600191
*翻译水平的差异用灰色突出显示
通过PCR对OAS3序列进行以下修饰：在3’开放读码框末端侧翼添加额外的10残基序列EQKLISKEDL(SEQ ID NO：10)以及其后的终止密码子，针对OAS3的引物对为pTet-OAS3-univ1和pTet-OAS3-rev2，针对OAS3[1-843]的引物对为pTet-OAS3-univ1bis和pTet-OAS3-rev2bis(表II)。
表II：引物序列(SEQ ID NO：11至22)
Figure BPA00001303941600211
酶识别位点用下划线表示。与终止密码子互补的序列用粗体表示。在OAS3序列(SEQ ID NO：23和25)下游和上游末端的侧翼分别具有NotI和EcoRV限制性酶切位点。用NotI和EcoRV消化PCR产物，并随后插入到pTRE2hyg表达载体(BD BIOSCIENCES CLONTECH)的唯一NotI和EcoRV位点中，从而得到pTRE2hyg-OAS3(图1)和pTRE2hyg/OAS3CΔC末端(OAS31-843)。以该结构，OAS3插入片段在Tet-Off表达系统的控制下。Tet-Off系统可通过去除阻遏物四环素(Tet)来诱导外源基因的表达。按照制造商推荐的方法采用转染试剂Fugene 6(ROCHE)用pTRE2hyg-OAS3或pTRE2hyg/OAS3CΔC末端转染HeLa.Tet-Off细胞(BD BIOSCIENCES CLONTECH)。通过向培养基中加入2μg/ml Tet来阻抑Tet-Off表达系统。利用含抑制剂G418和潮霉素的生长培养基来筛选转染细胞，然后在10μg.mL-1阻遏物四环素(Tet)的存在下通过有限稀释从单个细胞进行克隆。为进行Tet去除，用胰蛋白酶消化细胞单层，并用无添加的DMEM清洗至少5次，然后更换成只添加基因毒性药物的DMEM/10％FBS。使用引物对OAS3-For和OAS3-Rev(表II)通过RT-PCR分析来确定相对于未诱导细胞(+Tet)，而言经诱导细胞(-Tet)中重组OAS3 mRNA的产生水平。根据这些实验，筛选出可诱导的HeLa.Tet-Off/OAS3#C417-1和HeLa.Tet-Off/OAS3/delta/1C(OAS3ΔC末端)克隆。HeLa-Tet-Off/OAS3#C417-1细胞系于2008年2月26日保藏于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，登记号为I-3927。HeLa-Tet-Off/OAS3/delta/1C细胞系于2008年4月17日保藏于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，登记号为I-3968。这两个HeLa.Tet-Off/OAS3细胞系在存在2μg.mL-1 Tet的阻遏条件下培养。
c)病毒
如先前所述(Bréhin等，Virology，2008，371，185-195)，利用假鳞斑伊蚊(AP61)细胞单层产生临床分离物基孔肯雅病毒株06-49(CHIKV 06-49；Schuffenecker等，PLoS Medicine 3，2006，e263)，并通过病灶免疫检测测定滴定病毒(Desprès等，Virology，1993，196，209-219)。感染滴度表示为AP61细胞中的病灶形成单位(FFU)。为了测定其抗病毒作用，向培养基中直接加入1,000IU.mL-1的人IFN-α(BIOSOURCE)。
d)免疫印迹测定
如先前所述(Bréhin等，Virology，2008，371，185-195)，对细胞蛋白质进行免疫印迹分析。用抗CHIKV HMAF抗体或抗CHIK.E2单克隆抗体3E4(Bréhin等，Virology，2008，371，185-195)检测病毒蛋白表达。用抗OAS3 N端(Santa-Cruz)或C端(ABGENT)抗体检测OAS3蛋白表达。
e)流式细胞术分析
使细胞脱壁，而后用含3.2％多聚甲醛的PBS进行固定。对固定的细胞进行透化处理，用抗CHIKV HMAF抗体染色，并如先前所述(Bréhin等，Virology，2008，371，185-195)进行流式细胞术分析。
2)结果
首先，评估了亲代HeLa.Tet-Off细胞系对CHIKV感染的易感性(图3A)。对以感染复数(MOI)1感染的这些细胞中的CHIKV复制进行分析显示，后代病毒产生量在感染后18小时达到～7.0log FFU.mL-1。通过用单克隆抗体3E4(其对CHIKV E2糖蛋白有反应性)进行的流式细胞术分析(Bréhin等，Virology，2008，371，185-195)，约50％的经CHIKV感染的HeLa.Tet-Off细胞呈病毒抗原阳性。而后，研究了IFN-α在HeLa.Tet-Off细胞中建立抗病毒状态的能力。在暴露于CHIK(1MOI)前5小时用1,000IU.mL-1人IFN-α预处理HeLa.Tet-Off细胞，导致感染后18小时病毒滴度降低约1.5log(图3B)。因此，IFN依赖性抗病毒途径在HeLa.Tet-Off细胞中起作用，并在细胞水平上提供抗CHIKV保护。然而，一旦在感染的HeLa.Tet-Off细胞中建立了病毒复制，CHIKV感染细胞在感染后5小时对IFN-α显示完全的抗性。
选择在Tet-Off表达系统控制下上调的OAS3蛋白表达的稳定HeLa-Tet-Off/OAS3#C417-1细胞克隆来评价大形式的OAS的抗病毒活性。重组OAS3蛋白包含3个相邻的OAS单元(结构域I、II和HI)，包括3个潜在的活性催化位点(图3C)。通过用靶向人OAS3蛋白C末端区域的多克隆免疫血清对细胞裂解物进行免疫印迹来分析重组OAS3蛋白的表达(图3D)。用1,000IU.mL-1IFN-α孵育5小时的细胞作为阳性对照。在IFN-α处理后，在HeLa.Tet-Off细胞中可明显地检测到内源OAS3分子的产生，而在未处理细胞中未观察到OAS3的基础表达。因此，IFN-α/β可积极地上调OAS3基因的表达。在未诱导的HeLa.Tet-Off/OAS3细胞(2μg.mL-1Tet)中观察到基础水平的重组OAS3蛋白，这表明阻遏不完全(图3D)。当将阻遏物Tet从细胞培养基中去除24小时后，与未诱导的细胞相比，重组OAS3蛋白的产生水平显著上升。
实施例2：OAS3对CHIKV的抗病毒作用
1)材料和方法
实验方法与在实施例1中所述的相同。
2)结果
为了研究人上皮细胞中OAS3蛋白对CHIKV生长的作用，以1MOI的CHIKV.06-49感染HeLa.Tet-Off/OAS3细胞18小时。根据用单克隆抗体3E4进行的流式细胞术所测定地，未诱导的HeLa.Tet-Off/OAS3和HeLa.Tet-Off细胞对CHIKV感染显示了相似的易感性(图4A)。在暴露于病毒24小时前诱导HeLa.Tet-Off/OAS3细胞可使CHIKV感染的细胞降低至少20％。作为阳性对照，IFN-α处理使感染的HeLa.Tet-Off细胞的百分数降低了75％。因此，CHIKV对人上皮细胞中OAS3的异位表达敏感。
为了进一步评估HeLa.Tet-Off/OAS3细胞抑制CHIKV生长的效力，将诱导的细胞暴露于输入量递增的CHIKV.06-49(图4B)。在感染后18小时，无论所测试MOI为何，重组OAS3蛋白的表达均使后代病毒的产生量降低了1.5至2.0log。在感染后24小时，在所测的较低MOI下，病毒滴度降低了约3.0log。因此，OAS3的表达可在人成纤维细胞中抑制CHIKV的细胞间传播。在中等MOI下，病毒后代仍降低至少2.0log。在10MOI下，病毒生长只降低了约0.5log，这表示在以高病毒输入量进行感染时，CHIKV具有抵抗OAS3抗病毒活性的能力。
动力学研究显示OAS3介导的CHIKV抑制在病毒的生命周期中都有效(图4C)。在感染后12小时，与HeLa.Tet-Off细胞相比，HeLa.Tet-Off/OAS3细胞的病毒滴度降低2.0log。在感染后24小时，诱导OAS3蛋白表达仍能将后代病毒的产生量降低至少1.5log。
对乳酸脱氢酶(LDH)(在细胞裂解时释放入培养基的细胞质酶，因此是膜完整性的度量)的测量显示，与感染的亲代细胞相比，感染的HeLa/Tet-Off/OAS3细胞的生存力在感染的最初24小时内没有显著降低。因此，对CHIKV感染的抗性与OAS3的抗病毒活性直接相关，而不与通过诱导凋亡将病毒感染细胞清除相关。
实施例3：在表达人OAS3的HeLa.Tet-Off重组细胞系中OAS3针对其它正义单链RNA病毒的抗病毒作用
1)材料和方法
实验方法与实施例1中所述的相同。此外，病毒产生和滴定如下所述进行。
病毒
如先前所述(Bréhin等，Virology，2008，371，185-195；国际申请WO02/081741)，利用假鳞斑伊蚊(AP61)细胞单层产生低传代数的西尼罗病毒(WNV)IS-98-ST1株(GenBank登记号AF 481864)，并通过病灶免疫检测测定滴定病毒(Desprès等，Virology，1993，196，209-219)。感染滴度表示为AP61细胞中的病灶形成单位(FFU)。辛德毕斯病毒株AR339(SINV AR339)和Semliki森林病毒株SF 64(SFV 64)利用非洲绿猴肾(VERO)细胞系进行增殖，并且感染滴度表示为VERO细胞中的噬斑形成单位(PFU)。为了测定其抗病毒作用，向培养基中直接加入1,000IU.mL-1的人IFN-α(BIOSOURCE)。
2)结果
在人上皮细胞中检测了大形式的OAS抑制SINV株AR339、SFV株SF 64和WNV株IS-98-ST1生长的能力(图4D、5和6)。以1MOI的甲病毒感染HeLa.Tet-off和经诱导的HeLa.Tet-Off/OAS3细胞。响应于OAS3蛋白的表达，在感染后18小时，SINV和SFV中的后代病毒产生量有相当程度的抑制(～2log)(图4D)。以0.1、1或10MOI的黄病毒(WNV)感染HeLa.Tet-off和经诱导的HeLa.Tet-Off/OAS3细胞48小时(图5和6)。根据病毒滴度的测定，显示了人上皮细胞通过有效抑制WN病毒复制而对OAS3表达产生应答。在0.1MOI下，与HeLa.Tet-off细胞相比，HeLa.Tet-Off/OAS3细胞中病毒滴度降低了1.5log(图6)。在感染后72小时，诱导OAS3蛋白表达能使后代病毒产生量降低至少1.0log。因此，与亲代细胞相比，表达OAS3的HeLa细胞对WN病毒感染显示了更低的易感性。总之，数据显示OAS3在人细胞中对RNA病毒(如甲病毒和黄病毒)有抗病毒作用。
实施例4：OAS3介导的CHIKV抑制的机制
1)材料和方法
实验方法与实施例1中所述的相同。此外，定量RT-PCR如下所述进行。
定量RT-PCR
基本如先前所述(Kajaste-Rudnistki等，J.Biol.Chem.，2006，281，4624-4637)，采用SYBR
Figure BPA00001303941600251
Green PCR通过ABI Prism 7700序列检测进行病毒RNA累积的实时RT-PCR分析。CHIKV E2基因的引物为Chik/E2/9018/+和Chik/E2/9235/-(表II)。用GAPDH mRNA作为内源序列对照以对每个样品进行归一化。在表II中给出了引物GAPDH-For和GAPDH-Rev。对于病毒RNA拷贝的定量，如先前所述(Vazeille等，PLoS One，2007，2(11)：e1168)，使用编码E2N端区域的体外CHIK RNA转录物来建立标准曲线。
2)结果
为了试图解释OAS3抗病毒作用的分子基础，确定了CHIKV生长的抑制是否是由于病毒结构蛋白累积的缺乏所致。在感染后18小时，从HeLa.Tet-Off和经诱导HeLa.Tet-Off/OAS3细胞中提取总蛋白质，并用抗CHIKV HMAF抗体通过免疫印迹检测衣壳蛋白(C)、包膜糖蛋白pE2(E2的前体)、E2和E1，而使用抗CHIKV E2单克隆抗体3E4通过免疫印迹特异性检测包膜糖蛋白pE2(E2的前体)和E2。如图7A中所显示地，响应于OAS3蛋白表达，存在背景水平的病毒结构蛋白。因此，CHIKV无法有效感染表达OAS3的HeLa细胞与病毒蛋白合成的显著降低有关。
确定了病毒蛋白合成的降低是否是由于病毒RNA累积的缺乏所致。在感染后8小时从HeLa.Tet-Off和经诱导的HeLa.Tet-Off/OAS3细胞中提取总RNA，用RT-PCR测定分析基因组和亚基因组病毒RNA的产生，所用引物基于CHIKV E2基因进行设计。根据实时RT-PCR分析确定，当与亲代细胞比较时，表达OAS3的细胞中病毒RNA水平降低了2log(图7B)。因此，OAS3的表达阻止了病毒RNA在感染细胞中的积累。根据这些结果，可得出以下结论，即OAS3表达影响了感染的人细胞中甲病毒的复制。
实施例5：在健康个体中OAS3遗传多态性对OAS3抗病毒作用的影响
1)材料和方法
实验方法与实施例1中所述的相同。此外，OAS3多态性的基因分型如下所述进行测定。
基因分型
使用表II中给出的引物对OAS3.R844X-F(SEQ ID NO：11)和OAS3.R844X-R(SEQ ID NO：12)通过PCR-RFLP测定对SNPOAS3.R844X进行基因分型。用Bgl II消化183bp长的PCR产物，检测到115和68bp两个片段则表示存在OAS3.R844X。
2)结果
对OAS3基因进行多态性筛查。对48位健康白种人个体进行全部16个外显子、两侧内含子和OAS3基因5’端(2kb)的重新测序，鉴定出在密码子CGA-844的第一位存在单核苷酸多态性(SNP)，其中用T替换C产生了无义突变(OAS3.R844X)(表I)。进一步在180位健康白种人个体中筛查该SNP，鉴定出2个杂合子(其等位基因频率为0.5％)。由于OAS3.R844X有可能从羧基端截短OAS3蛋白的约20％(图3C)，所以产生了含OAS3-1至OAS3-843序列的稳定HeLa.Tet-off/OAS3ΔC末端细胞克隆。应注意到，OAS3ΔC末端缺少D889残基(其构成定义OAS3第三结构域的活性催化位点的三联密码子)(Sarkar等，1999；Rambouillat等，2000)。为了评估OAS3突变体抑制CHIKV和WNV生长的能力，以1MOI的CHIKV-06-49或西尼罗病毒(WNV)IS-98-ST1株感染经诱导的HeLa.Tet-Off/OAS3和HeLa.Tet-off/OAS3ΔC末端细胞。如图8和9中所显示地，表达OAS3ΔC末端的细胞显示出对CHIKV和WNV感染的抗性，这表明OAS-1至OAS3-843序列仍可提供保护。对病毒生长的分析显示，与全长OAS3比较，OAS3ΔC末端的异位表达导致对CHIKV和WNV的较低抑制效力。这些结果表明，密码子CGA-844的SNP可对抗病毒活性具有影响。
实施例6：在表达人OAS3的HepG2.Tet-Off细胞系中OAS3对DV和WNV的抗病毒作用
1)材料和方法
a)细胞培养
HepG2.Tet-Off细胞系购自CLONTECH(#632106)。将HepG2.Tet-Off细胞在添加了10％热灭活胎牛血清(FCS)、4mM L-谷氨酰胺、100UI/ml青霉素G钠、100μg/ml硫酸链霉素(GIBCO，#15140-122)、0.1mM非必需氨基酸和100μg.mL-1G418(GIBCO，#10131-019)的DMEM(GIBCO，#41965)中于37℃在5％CO2下培养。
将HepG2.Tet-Off/OAS3#F8细胞系(CNCM I-4158)在添加了10％FCS、4mM L-谷氨酰胺、100UI/ml青霉素、100μg/ml链霉素、100μg.mL-1G418、100μg.mL-1G潮霉素B(CLONTECH，#631309)和2μg.mL-1的四环素(SIGMA-ALDRICH，#T-7660)的DMEM中培养。
b)建立表达OAS3蛋白的HeLa.Tet-Off细胞系
如实施例1中针对可诱导HeLa.Tet-Off/OAS3#C417-1的描述，筛选出表达全长的人OAS3蛋白(SEQ ID NO：24)的可诱导HepG2.Tet-Off/OAS3#F8克隆。HepG2.Tet-Off/OAS3#F8细胞系于2009年5月15号保藏于Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，登记号为I-4158。
将该细胞系培养在存在2μg.mL-1Tet的阻遏条件下。
c)病毒
如先前所述(Bréhin等，Virology，2008，371，185-195)，利用假鳞斑伊蚊(AP61)细胞单层产生低传代数的西尼罗病毒(WNV)IS-98-ST1株(GenBank登记号AF 481864；Lucas等，Virology J.，2004，1，9-)，并通过病灶免疫检测测定滴定病毒(Desprès等，Virology，1993，196，209-219)。如先前所述(Duarte dos Santos等，Virology，2000，274，292-)产生DV1株FGA/NA d1d以及进行病毒滴定。感染滴度表示为AP61细胞中的病灶形成单位(FFU)。为了测定其抗病毒作用，向培养基中直接加入1,000IU.mL-1的人IFN-α(BIOSOURCE)。
d)免疫荧光测定
用甲醇/丙酮在-20℃下固定经病毒感染的细胞20分钟。用缀合有FITC的抗登革E单克隆抗体4E1或缀合有cy3的抗WNV.E单克隆抗体E24进行免疫荧光测定。用DAPI对细胞核染色。
2)结果
首先，评估了亲代HepG2.Tet-Off细胞系对DV感染的易感性(图10A)。用每个细胞不同病灶形成单位(AP61FFU)的DV-1病毒株FGA/NAd1d感染细胞。在感染后40小时，使用单克隆抗体4E11(其对DV E糖蛋白有反应性)通过流式细胞术分析细胞。当DV-1病毒输入量为每个细胞30 AP61FFU时，登革E糖蛋白的阳性信号显示约50％的HepG2.Tet-Off细胞被DV-1感染。
然后，研究了IFN-α在HepG2.Tet-Off细胞中建立抗病毒状态的能力。在DV感染(10MOI)前5小时，用1,000IU.mL-1人IFN-α预处理HepG2.Tet-Off细胞，在感染后40小时引起约0.7log的病毒滴度降低(图10B)。因此，IFN依赖性抗病毒途径在HepG2.Tet-Off细胞中起作用，并可在细胞水平上提供抗DV保护。
为了研究在HepG2细胞中OAS3蛋白对DV生长的作用，用输入量递增的DV-1病毒株FGA/NA d1d感染经诱导的(-Tet)和未诱导的(+Tet)HepG2.Tet-Off/OAS3细胞和亲代HepG2.Tet-Off细胞。在感染后40小时，用抗登革E单克隆抗体进行免疫荧光测定，确定了病毒抗原呈阳性的HepG2细胞的百分数(图11和12)。以25的感染复数测定后代病毒产生量(图11)。重组OAS3蛋白的表达使DV感染细胞的百分数降低了至少75％(图11和12)，并且后代病毒产生量降低了2log(图11)。
因此，表达OAS3的HepG2细胞对DV感染显示抗性。
还通过免疫荧光测定分析了OAS3蛋白对HepG2细胞中WNV生长的作用。以感染复数1AP61FFU/细胞的西尼罗病毒株IS-98-ST1感染亲代HepG2.Tet-Off和经诱导的HepG2.Tet-Off/OAS3#F8细胞克隆。在感染后40小时，用缀合有cy3的单克隆抗体E24通过免疫荧光检测病毒抗原(WNV E糖蛋白)。该结果(图13)证实了在HeLa细胞中获得的结果(实施例3)，表明表达OAS3的人细胞对WNV感染显示抗性。
实施例7：在人细胞中黄热病毒17D-204减毒活疫苗株对大形式的人2’，5’-寡聚腺苷酸合成酶(OAS3)所介导的抗病毒作用显示出人意料的抗性
1)材料和方法
将减毒的黄热病毒(YFV)疫苗株(STAMARIL
Figure BPA00001303941600291
AVENTIS-PASTEUR)利用非洲绿猴肾(VERO)细胞系进行增殖，并且感染滴度表示为在VERO细胞中的噬斑形成单位(PFU)。为了测定其抗病毒作用，向培养基中直接加入1,000IU.mL-1的人IFN-α(BIOSOURCE)。如实施例6中所述，用抗法国嗜神经病毒HMAF抗体和缀合有FITC的山羊抗小鼠Ig实施免疫荧光测定。
2)结果
实施例2、3、4和6首次提供了以下证据，即由IFN-α/β介导的OAS3依赖性抗病毒活性代表了人细胞对甲病毒(如基孔肯雅病毒)和黄病毒(如西尼罗病毒及登革病毒)的主要防御策略。
研究了OAS3是否对黄热病毒(YFV)表现抗病毒活性。为此，利用非洲绿猴肾(VERO)细胞系使YFV 17D-204减毒活疫苗株(STAMARIL，Aventis-Pasteur)增殖两次，并且感染滴度表示为在VERO细胞中的噬斑形成单位(PFU)。用YFV17D(1PFU/细胞)感染HeLa细胞，然后在感染后不同时间点用1,000IU.mL-1的人IFN-α进行处理，或进行模拟处理(对照)。在感染后72小时测定病毒后代产生量。如图14中显示地，IFN-α能够在人上皮HeLa细胞中建立针对YFV 17D的抗病毒状态。为了评价OAS3抑制病毒生长的能力，在低(1PFU/细胞；图15A)或高(10PFU/细胞；图15B)病毒输入量下将HeLa(对照)和经诱导的HeLa.Tet-Off/OAS3(OAS3)细胞暴露于YFV株17D。这两个细胞群之间在YFV复制方面没有显著差异(图15)。动力学研究显示，无论感染后的时间点或感染复数为何，在人细胞中17D对OAS3介导的抗病毒作用均具有抗性。
通过对感染有YFV 17D的亲代HepG2.Tet-Off和HepG2.Tet-Off/OAS3#F8细胞克隆进行免疫荧光测定，证实了YFV 17D对OAS3介导之抗病毒作用的抗性(图16)。
YFV的减毒活病毒株对OAS3之抗黄病毒作用显示了出人意料的抗性，这为阐释黄病毒减毒机制开辟了新的途径。
实施例8：OAS3的非同义变体与登革休克综合征的致病机理相关
1)材料和方法
a)患者和对照
在3年期间(2000年6月-2003)，来自曼谷的两个医学中心(Mahidol大学的Ramathibodi医院和Siriraj医院)以及泰国Khon-Kaen省的一家医院的750名有症状的登革病毒(DV)感染患者(男性∶女性＝0.99)被纳入本研究中。他们的年龄为1至25岁，平均年龄9.6岁。怀疑被登革病毒感染的患者(根据以下临床特征：高烧、严重头痛、眼窝后疼痛、肌痛、关节疼痛、恶心和呕吐，以及皮疹)被医院收治进行临床观察和治疗。对登革病毒感染的诊断随后通过对急性后期和/或恢复期血清的比较性IgG和IgM酶联免疫吸附测定滴定来证实。根据不存在(DF)或存在(DHF)血管渗透性升高的迹象(表现为血浓缩或胸膜腔积液)对DF(登革热)和DHF(登革出血热)进行区分诊断。具体来说，基于以下全部4个特征而诊断为DHF：1)2-7天的持续高烧；2)出血倾向(如止血带检测呈阳性、瘀斑(petechii)、紫癜或呕血)，3)血小板减少(血小板计数≤100,000/μl)，以及4)由于血管渗透性提高(表现为血浓缩(红细胞比容增加20％或更多)或胸膜腔积液)而造成的血浆渗漏迹象。将由于不明确的临床症状而无法被划分为DF或DHF的一些登革患者归为“未知的DH/DHF状态”。按照WHO的标准，DHF的严重性被划分为四个级别。III级和IV级为脉压减小(特征为舒张压升高)至深度休克的DHF。继发感染被定义为登革特异性IgM/IgG比＜1.8。向患者及其父母和亲属详细解释了本研究的项目实验设计及目的。从每位受试者处得到了知情同意。每家医院的伦理委员会都认可本试验设计。
对照组由Ramathibodi医院的296名血液捐献者、Siriraj医院的216名血液捐献者和Khon-Kaen地区的184名种族相匹配的健康对照组成(男性∶女性＝1)。病例和对照组都来自泰国的曼谷和中部地区。利用EDTA收集患者和对照组的全血样品，用标准的苯酚/氯仿抽提法提取DNA。
在2004-2006年间，我们采用相同的临床和病毒诊断标准从Ramathibodi和Khon-Kaen医院纳入了另外254名患者(男性∶女性＝1.07)。
b)多态性鉴定和基因分型
通过对各DNA样品(24名登革患者和32名泰国对照者)基因组DNA的PCR扩增产物直接测序来鉴定多态性。表III中显示了测序OAS外显子、部分内含子和5’及3’区域的引物。
表III：OAS3测序引物(SEQ ID NO：31至142)
Figure BPA00001303941600311
  OAS2/外显子7   CAGAACTTGGCCTTGGAAAC   CCCATGCTTGGAAAAGAGAA   594
  OAS2/外显子8   GGAGATGCTCCCTGTGTCTT   GGGTTAGTGATGGGAACGTC   499
  OAS2/外显子9   TCCAAGCTGCAGAGTGTGAG   GCCCCTGCTAGGTTTTATCC   532
  OAS2/外显子10-1   CGCGGCCTCTAGAAAGTTAC   GGTTGTCACTGGGAGAGGAG   593
  OAS2/外显子10-2   AGGCAGGTAACCCCAGATTC   GCACAAGAGAGCCTCCAAAC   606
  OAS2/外显子10-3   TGGTTCTCTCCACCAGGTTC   GGATGGATCCTAGCTCCACA   496
  OAS2/外显子11-1   GTAGGGAAGAGGTGGCCAAG   GACTGGAAGGAAAAAGGAGGA   600
  OAS2/外显子11-2   GTCTTGCCTTGCTGAACTCC   AAGGCTAAAGCCCAAGGAAA   484
  OAS2/外显子11-3   CCAGCCAACCCTTTCATTAG   CACATGCTTGGTCTTTCTGG   450
  OAS3/pro1   TATTGACCCTTCTGCGTTCC   GCACACCTGAGCTCTCTTCC   607
  OAS3/pro2   GGAGAGAGGACCTGGGAGTT   CGACCATGGTGTAGGTGCTA   602
  OAS3/pro3   CCAGCCAGACAACTTTCCAG   TCGGATTTCTGGTTTCGTTT   609
  OAS3/外显子1   AAGTGGGTGTCAGGTCCAAG   TGTCAAGCGGGCTTAAGAGT   615
  OAS3/外显子2   ACAGTCTCTCCCCAGCACAC   CCCAGGTCAAACAGCAAGTT   490
  OAS3/外显子3   AAAGCTCCAGGCTCTCTTCC   TGCACAAGGGACATAAACAGA   481
  OAS3/外显子4   GGCTGAAGCTACCAGTGAGG   CTAATGTGCATCTGGGCTGA   580
  OAS3/外显子5   TCGAGGCTCAGAGAGGGTAA   GCCTCCCAATGTGTTGAGAT   451
  OAS3/外显子6   GGCACCTTTTTCAACTCTGC   CCAGCAAATCATCCTTCCTG   654
  OAS3/外显子7   CATGCAGTCGACCTTTGTCA   TCAATGCTTGGTCAAGTAGGAG   545
  OAS3/外显子8   CCACTGTGCAGTTACTGGATG   AAGCAAAGGAGGGGAGATGT   508
  OAS3/外显子9   CTAGGCAAAAGCCACGTCTG   GGAAGCAGAGTGAGGAGTGG   606
  OAS3/外显子10   CCCAATAGCTTTCCAACCAA   GCTGGGACGTAGCAATCTGT   500
  OAS3/外显子11   CCTCAGAACCTACCCACCAG   GGACATATCTGGGCCCTCTC   494
  OAS3/外显子12   TGACTTGTCCAAGGTCACACA   AAAGGGGCCCTCTTCTTTAG   566
  OAS3/外显子13   ATCCCAGACCACCCTTAGGA   CTCCACCAACCCAGGATCT   407
  OAS3/外显子14   AAAGTTTTGGGGTTGCTTTG   ATTGACCGTTTGTCCCTCAG   490
  OAS3/外显子15   TCTAGCCCCTGCAAAGTGTT   ATGGGAAAATGGAAGCACAG   395
  OAS3/外显子16-1   ATCTGTGGTGCCAAAGGAAG   GCAGGAGGAAAGATGTGAGC   591
  OAS3/外显子16-2   CCTCCCATGGCTTACACACT   CATAGCATGCATGTCCCAAC   599
  OAS3/外显子16-3   CAGGAGAGCATGCCCATATT   GAGAGCCTCCTGGATGGAC   259
  OAS3/外显子16-4   GAGATTCTGCATCCCCACAG   TAGACCCACTCCCTCATCCA   609
  OAS3/外显子16-5   CTCTGGCTGCAGAGGAGTCT   GCCCTGAGCTCTTGGATATG   597
  OAS3/外显子16-6   AACGCTAAGGGCACCTTCTT   GGGTGTTTTTAGGGTGACCA   603
  OAS3/外显子16-7   CACCCTGGTGTTGGCATATT   AGAAGGGTGAGAGCTTTATGG   634
利用Genalys软件(Takahashi等，J.Bioinform.Comput Biol.，2003，1，253-265)分析了测序结果。使用ABI Prism 7000序列检测系统，根据推荐的试验方案，通过Taqman测定对OAS3-R381S进行了基因分型。较常见的OAS3序列变体的381位密码子为AGG(其对应于精氨酸)。多态性OAS3-R381S(称为rs2285933)在OAS3的381位密码子的第三个核苷酸处将G替换为C(AGG变为AGC)，其将精氨酸变为丝氨酸。两个OAS3变体(R381和S381)的mRNA、ORF和氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO：28、29、30(R381)和SEQ ID NO：27、1和2(S381)。
c)统计学分析
我们采用等位基因计数(通过Haploview程序中应用的Person卡方检验(Barrett等，Bioinformatics，2005，21，263-265))进行了相关性研究。该程序允许我们进行排列组合检验以获得经验性P值。我们采用STATA第九版，根据所测试的遗传模型进行了代表编码基因型结果的对数回归分析。
2)结果
在2000-2003年期间，我们从曼谷的两家医院(Siriraj，SI和Ramathibodi，RA)募集了580名登革患者，从泰国东北部Khonkaen省(KK)的另一家医院募集了170名患者。我们收集了来自曼谷上述医院的512名血液捐献者和来自泰国东北部184名健康志愿者的DNA样品，以代表一般人群中的基因频率。之前已报道过部分这些患者和对照组的遗传研究(Sakuntabhai等，Nature Genetics，2005，37，507-513)。通过血清学测试证实了病毒诊断，并将患者按照WHO的标准划分为4个组：DF(无血浆渗漏迹象)、以及DHF1(有血浆渗漏迹象)、DHF2(自发出血)和DSS(休克)(表IV)。
表IV：所研究群体的疾病严重程度
Figure BPA00001303941600341
有51名患者无法按照WHO的标准划分为患DF或DHF(未分类(unclassified)；UC)。每种严重程度类型的患者比例在各医院之间有显著差异(P＝1.5×10-8)。这反映了医院类型(KK为二级卫生机构，SI和RA为医学院)和收治标准(KK为发热少于3天，SI和RA为疑似登革病例)的不同。
与针对登革感染的IgM应答占优势的患者相对，IgG应答占优势的患者中血浆渗漏(DHF1/DHF2/DSS相对于DF)和自发性出血(DHF2/DSS相对于DF/UC/DHF1)的风险有极其显著的提高(分别为P＝1.1×10-7和7.6×10-5)，但对于休克只有较弱显著性(DSS相对于其它，P＝0.038)(表V)。
表V：疾病严重程度和免疫应答
Figure BPA00001303941600351
这些发现与以下观点一致，即对DV有IgG应答的个体更易患该疾病的较严重形式。
为筛选带标签的多态性，在曼谷两家医院的患者中，用针对血浆渗漏风险(DHF1/DHF2/DSS相对于DF)、自发性出血风险(DHF2/DSS相对于DF/UC/DHF1)、休克风险(DSS相对于无休克DV患者)的等位基因计数来进行相关性检测(表VI)。
表VI：登革患者中OAS3-R381S的相关性研究
Figure BPA00001303941600361
*MAF：平均等位基因频率
如表VI中所显示地，所有多态性均不显示与疾病风险相关。然而，OAS3的一个非同义多态性取决于疾病的严重程度而具有显著不同的等位基因计数分布。该变体(OAS3-R381S：rs2285933)在OAS3的381位密码子的第三个核苷酸处将G替换为C，这使氨基酸从精氨酸变为丝氨酸。在两家医院中，相对于DSS，该多态性的C等位基因在DF、DHF1和DHF2中都更常见。在两家医院间每组患者和对照组间的等位基因频率没有显著区别。在综合分析中，C等位基因在一般人群中的频率为14％，DF中为20％，DHF1和DHF2中为15-16％，在DSS中为7％。DSS和非休克DV间的区别极其显著(P＝7.10-4)。我们进行了10,000次排列组合，获得经验性P值为0.0032。
遗传模式
为了得出OAS3-R381S的遗传模式，我们采用针对DSS的对数回归，比较了基于3种不同的遗传模式(C等位基因的加合、显性和隐性)的模型的可能性。C等位基因的隐性模型未显示显著的相关性，而C等位基因的显性(＜10-5P＜10-5，OR＝0.30 95CI＝0.17-0.53)和加合模型(17.93，P＜10-5)获得了极其显著的相关性水平。通过log可能性比例测试，显性模型比加合模型明显更为合适(P＝0.04)。因此我们在其余的分析中采用了显性模型。
在第三个群体中重复
我们对在同一流行期间(2001-2003年)来自第三家医院(KK)患者的OAS3-R381S进行了重复研究。与之前的结果相似，与无休克的DV患者相比，DSS组的C等位基因显示出较低的频率(对于C等位基因，频率分别为17％和8％，对于CG+GG，频率分别为32％和17％)。尽管由于患者数目少使得该差异没有统计学显著性，然而，当综合3家医院的所有患者时可获得更显著的相关性(对于C等位基因的显性模型，OR＝0.48，95CI＝0.31-0.75，P＝7×10-4)。
OAS3和免疫应答类型
我们进一步研究了OAS3-R381S的作用是否取决于对病毒的免疫应答类型。患者中的多态性和DSS与IgM免疫应答占优势之间没有显著的相关性。然而，在每家医院和所有医院联合时，在IgG应答占优势的患者中获得显著或接近显著的相关性(Chi2＝19.41，OR＝0.27 95CI＝0.14-0.53，P＜10-5)(表VII)。
表VII：在IgM和IgG免疫应答中的OAS3-R381S
Figure BPA00001303941600381
2004-2006年流行期间的患者相关性研究
在2004-2006年期间，我们在前两家医院(RA和KK，表IV)中获得了另外的患者。OAS3-R381S的相关性研究未显示与所有研究假设的显著相关性，然而，当把这些患者纳入到最初的病例/对照研究中时仍有显著的相关性(OR＝0.48，95CI＝0.31-0.75，P＝7×10-4)。该结果促使我们研究了2个阶段之间结果的不一致性。
可影响登革疾病严重程度的一个因素是病毒因素。我们使用2001-2006年间来自Siriraj医院和Khonkaen医院的患者数据(其中我们有471名患者的数据)研究了DV-4血清型的流行率(表VIII)。
表VIII：登革病毒血清型
A.研究年份的登革病毒血清型
Figure BPA00001303941600391
B.登革病毒血清型和临床严重程度
Figure BPA00001303941600392
C.登革病毒血清型和免疫应答类型
在2001-2003年期间DV1和DV2血清型占支配地位，而在2004年DV1减少，DV4的流行始于2004年并随后成为支配类型直至2006年(表5A)。不同的登革病毒血清型所导致的登革疾病的严重程度显著不同(P＝0.012，表5B)，DV2血清型与其它DV血清型相比导致更严重的病例。出乎意料的是，在免疫应答类型方面，各病毒血清型显著不同(Fisher精确性检验P＜10-4，表5C)，DV2和DV4显示了IgG占优势。这些结果与来自公共卫生部的数据类似。我们推测，OAS3-R381S的作用可对某些病毒血清型具有特异性。我们发现只有针对DV2时，OAS3-R381S对DSS才有显著的显性保护作用(OR＝0.24，95CI＝0.08-0.74，P＝0.0045，表IX)。
表IX：OAS3-R381S和登革病毒血清型
Figure BPA00001303941600401
根据对DF/DHF/DSS患者和对照组的OAS基因的系统性筛查，我们展示了OAS3基因的多态性与休克风险(DSS)以及登革病毒感染患者中疾病严重程度之间的相关性。变体(OAS3-R381S：rs2285933)为OAS3的381位密码子第三个核苷酸从G替换为C，其使氨基酸从精氨酸变为丝氨酸。与无休克登革病相比，C变体与对DSS的显性保护作用相关，频率比例为0.32∶0.13(OR＝0.48，95CI＝0.31-0.75，P＝7×10-4)。此外，只在IgG应答占优势的患者(OR＝0.46，95CI＝0.28-0.74，P＝8×10-4)和DV血清型2感染患者(OR＝0.24，95CI＝0.08-0.74，P＝0.0045)中发现了显著相关性。
这些结果支持了非同义多态性OAS3-R381S的功能性作用，并证明OAS3在登革发病机理中的作用，以及OAS3的变体与病毒血清型之间的相互作用。
我们的发现可对预测DV感染患者中疾病的严重程度以及开发针对登革病毒和其它有重大医学意义的正义单链RNA病毒的基于OAS3的预防法和疗法有重要作用。
Figure IPA00001303941200011
Figure IPA00001303941200021
Figure IPA00001303941200031
Figure IPA00001303941200041
Figure IPA00001303941200051
Figure IPA00001303941200061
Figure IPA00001303941200071
Figure IPA00001303941200091
Figure IPA00001303941200111
Figure IPA00001303941200121
Figure IPA00001303941200141
Figure IPA00001303941200151
Figure IPA00001303941200161
Figure IPA00001303941200171
Figure IPA00001303941200181
Figure IPA00001303941200191
Figure IPA00001303941200201
Figure IPA00001303941200211
Figure IPA00001303941200221
Figure IPA00001303941200231
Figure IPA00001303941200241
Figure IPA00001303941200251
Figure IPA00001303941200271
Figure IPA00001303941200281
Figure IPA00001303941200301
Figure IPA00001303941200311
Figure IPA00001303941200321
Figure IPA00001303941200331
Figure IPA00001303941200341
Figure IPA00001303941200351
Figure IPA00001303941200361
Figure IPA00001303941200371
Figure IPA00001303941200381
Figure IPA00001303941200391
Figure IPA00001303941200401
Figure IPA00001303941200451
Figure IPA00001303941200461
Figure IPA00001303941200471
Figure IPA00001303941200481
Figure IPA00001303941200491
Figure IPA00001303941200501
Figure IPA00001303941200511
Figure IPA00001303941200521
Figure IPA00001303941200531
Figure IPA00001303941200541
Figure IPA00001303941200551
Figure IPA00001303941200561
Figure IPA00001303941200571
Figure IPA00001303941200581
Figure IPA00001303941200591
Figure IPA00001303941200611
Figure IPA00001303941200621
Figure IPA00001303941200641
Figure IPA00001303941200661
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Figure IPA00001303941200691
Figure IPA00001303941200701
Figure IPA00001303941200731
Figure IPA00001303941200741
Figure IPA00001303941200751
Figure IPA00001303941200761
Figure IPA00001303941200771
Figure IPA00001303941200781
Figure IPA00001303941200791
Figure IPA00001303941200801

Claims (28)

1.分离的2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶3蛋白或编码所述2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶3蛋白的分离的多核苷酸，其作为药物。
2.权利要求1的蛋白质或多核苷酸，其具有人2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶3的序列。
3.权利要求1或2的蛋白质，其与SEQ ID NO：2的1至1087位残基具有至少70％的氨基酸序列同一性或80％的氨基酸序列相似性。
4.权利要求1至3中任一项的蛋白质，其在SEQ ID NO：2的第381位包含丝氨酸。
5.权利要求4的蛋白质，其包含选自SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
6.权利要求1或2的多核苷酸，其编码权利要求3至5中任一项所定义的蛋白质。
7.权利要求6的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：6的序列。
8.权利要求1、2、6和7中任一项的多核苷酸，其被插入到表达载体中。
9.权利要求1至8中任一项定义的分离的2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶3蛋白或多核苷酸，其用于预防或治疗正义单链RNA病毒感染。
10.权利要求9的蛋白质或多核苷酸，其用于治疗甲病毒属(Alphavirus)病毒的感染。
11.权利要求10的蛋白质或多核苷酸，其中所述病毒选自：基孔肯雅病毒、辛德毕斯病毒、东方型马脑炎病毒、西方型马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、罗斯河病毒、Semliki森林病毒、Barma森林病毒和O′nyong′nyong病毒。
12.权利要求9的蛋白质或多核苷酸，其用于治疗黄病毒属(Flavivirus)病毒的感染。
13.权利要求12的蛋白质或多核苷酸，其中所述病毒选自：登革病毒、日本脑炎病毒、Kyasanur森林病病毒、墨莱溪谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、蜱媒脑炎病毒、西尼罗脑炎病毒、黄热病毒和鄂木斯克出血热病毒。
14.权利要求9的蛋白质或多核苷酸，其用于治疗丙型肝炎病毒感染。
15.至少包含权利要求1至8中任一项所定义的2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶3的产品和不同于前一产品的第二产品，所述第二产品选自抗病毒、抗炎和免疫调节药物，其作为同时、分开或依次应用以预防或治疗权利要求9至14中任一项定义的正义单链RNA病毒感染的联合制剂。
16.用于体外评估个体对权利要求9至14中任一项定义的正义单链RNA病毒感染之易感性的方法，其包括：在从所述个体获得的核酸样品中检测所述2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶3基因的多态性。
17.权利要求16的方法，其中所述检测使用选自以下序列的OAS3特异性寡核苷酸：SEQ ID NO：11、12、62至86以及118至142。
18.权利要求16或17的方法，其中所述多态性选自：密码子Arg844突变为终止密码子(R844X)，以及381位精氨酸密码子突变为丝氨酸密码子(R381S)。
19.权利要求18的方法，其中采用PCR-RFLP测定来检测R844X突变，其包括：
a)使用引物对SEQ ID NO：11和12通过PCR扩增183bp产物，以及
b)用BglII核酸内切酶消化PCR产物，其中115bp和68bp两种片段的存在表明存在R844X突变。
20.权利要求18的方法，其中所述S381变体与登革病毒感染患者中针对登革休克综合征风险的显性保护作用相关。
21.分离的OAS3蛋白，其包含选自SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：30的序列。
22.分离的OAS3蛋白片段，其由SEQ ID NO：9序列组成。
23.分离的多核苷酸，其包含选自以下的序列：编码OAS3蛋白SEQ ID NO：7的序列SEQ ID NO：6、编码OAS3蛋白SEQ ID NO：30的序列SEQ ID NO：28或29以及编码OAS3蛋白片段SEQ ID NO：9的序列SEQ ID NO：8。
24.重组载体，其包含权利要求23所定义的多核苷酸序列。
25.用权利要求23中定义的多核苷酸序列或权利要求24中定义的重组载体转染或转化的宿主细胞。
26.权利要求25的宿主细胞，其为表达重组人2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶3的HeLa-Tet-Off细胞系，称为HeLa-Tet-Off/OAS3#C417-1，于2008年2月26日保藏在Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，登记号为I-3927。
27.权利要求25的宿主细胞，其为表达截短的重组人2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶3的HeLa-Tet-Off细胞系，称为HeLa-Tet-Off/OAS3/delta/1C，于2008年4月17日保藏在Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，登记号为I-3968。
28.权利要求25的宿主细胞，其为表达重组人2’-5’-寡聚腺苷酸合成酶3的HepG2-Tet-Off细胞系，称为HepG2-Tet-Off/OAS3#F8，于2009年5月15日保藏在Collection Nationale de Cultures de Microorganismes，25 rue du Docteur Roux，75724 Paris Cedex 15，登记号为I-4158。
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