KR101274008B1 - 재조합 ＳＡＲＳ-ＣｏＶ ｎｓｐ12, 이것의 제조방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사스 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV) 게놈 복제 활성을 지닌 재조합 SARS-CoV 비구조단백질 nsp12, 그의 발현 벡터, 그의 생산 방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 SARS-CoV 게놈 복제 활성을 지닌 재조합 SARS-CoV nsp12 단백질을 숙주세포에서 수용성으로 과발현시켜 고순도로 손쉽게 정제하는 것이 가능하다. 이와 같이 얻어진 재조합 SARS-CoV nsp12를 이용하여 SARS-CoV의 복제 기작 연구에 중요한 인 비트로 복제 시스템을 구축할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 얻어진 재조합 SARS-CoV nsp12은 항바이러스제 개발을 위한 타겟으로 이용될 수 있다. 또한 본 발명에서는 SARS-CoV nsp12의 활성 조건을 밝힌 바, 본 발명에 따르면 nsp12의 RdRp 활성을 저해할 수 있는 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.

Description

재조합 SARS-CoV nsp12, 이것의 제조방법 및 용도{RECOMBINANT SARS-CoV nsp12 AND THE USE THEREOF, AND THE METHOD FOR PRODUCING IT}
본 발명은 사스 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV) 게놈 복제 활성을 지닌 재조합 SARS-CoV 비구조단백질 nsp12, 그의 생산 방법 및 용도에 관한 것이다.
1937년 닭에서 처음 코로나바이러스가 발견된 이래 현재까지 코로나비리데과( Coronaviridae family)에는 사람뿐만 아니라 소, 돼지, 고양이, 개, 새, 그리고 설치류 등의 동물에 감염하는 약 15종의 바이러스가 발견되고 있다. 소, 돼지, 닭, 말 등의 동물 감염은 축산물 시장에 매우 심각한 피해를 주고 있으며, 특히 돼지유행성설사병, 전염성위장염, 전염성 기관지염 등은 코로나바이러스에 의한 질병으로 전세계적으로 발생하는 동물 질병이며, 전파속도가 빠르고 폭발적이며 새끼에 감염 될 경우 폐사율이 대단히 높으나 치료제가 없어 농장에 큰 피해를 주고 있다. 사람에 감염하는 코로나바이러스(human coronavirus)는 성인의 일반적인 감기의 원인 중 10-30％ 정도를 차지하며, 최근의 중증급성호흡기증후군(severe acute respiratory syndrome: 이하"사스")은 2002년 11월부터 중국 광동지역을 중심으로 발생하여 홍콩, 싱가포르, 베트남, 캐나다, 미국 등 전 세계 26개국으로 급속도로 확산되어 심각한 경제적 피해는 물론 많은 인적 피해까지 주었던 질환이다. 이 질환은 변종 코로나 바이러스의 일종인 SARS-CoV에 의해 유발되는 바이러스성 호흡기 질환이며, 발열과 기침, 호흡곤란, 비정형 폐렴 등 증상을 보인다. 원인균인 SARS-CoV의 잠복기는 약 2∼7일 정도이며, 감염자 중 10∼20％ 정도는 급성호흡곤란증후군으로 발전하고 7∼8％정도의 사망률을 보여 위험성이 매우 높다. 세계보건기구(WHO, 2003)에 의하면 2003년 사스 발병 기간 중 전 세계에 약 8000여명의 감염자가 발생하여 이들 중 770여명이 사망한 것으로 알려지고 있다. 2004년 4월 이후 몇 건의 감염 의심환자를 제외하고는 현재까지 추가적인 감염은 없는 것으로 알려지고 있다. 그러나 여전히 재발 가능성이 남아있으므로 WHO 및 미국 질병통제센터(CDC)에서는 지구상에서 일어나는 중증급성호흡기증후군 발병상황을 지속적으로 감시하고 있는 상황이다.
SARS-CoV는 유전자 구조상 코로나비리데 과, 코로나바이러스 속(Coronavirus genus)에 속하며, 약 29.7 kb 크기의 단일가닥(single strand) 양성 RNA 게놈을 지닌 바이러스이며, 게놈의 5' 말단에 캡(cap)이 있고 3' 말단에는 폴리아데노신 테일(poly(A) tail)이 있다. SARS-CoV 게놈은 바이러스의 복제에 있어서 중요한 시스-작용요소(cis-acting element)인 5'과 3'비번역부위(untranslated region; 이하 'UTR')사이에 14 개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)과 9개의 내재서열(intergenic sequence)이 존재한다. 내재서열(intergenic sequence)의해 8 개의 하위 RNA 게놈(subgenomic RNA)이 추가적으로 만들어지며, 각각의 하위 RNA 게놈(subgenomic RNA)에서 8개의 바이러스 구조 및 보조단백질들(structural and accessory protein)이 번역된다(translation). 오픈 리딩 프레임 1(ORF1)은 ORF1a와 ORF1b로 구성되어 있으며 ORF1b는 1 리보조말 프레임 쉬프트(-1 ribosomal frameshift)를 통해 번역되어 다단백질(polyprotein)을 생성하고 이는 바이러스가 코딩하는 2종류의 단백질 분해효소에 의해 절단되어 최종 16개의 복제에 관여할 것으로 추측되는 단백질을 생성하게되어 SARS-CoV는 총 28개의 단백질을 만들어 낸다(Snijder et al., J. Mol. Biol. 331:991-1004).
일반적으로 RNA 바이러스 RNA-의존적 RNA 복제효소(RNA-dependent RNA polymerase: 이하 RdRp )는 감염된 세포 내에서 바이러스 RNA 유전자의 중요 시스 작용 요소 RNA를 인식하여 복제를 시작하고 세포 내 여러 단백질들과도 상호작용을 하는 등 바이러스의 복제에 있어서 필수적인 역할을 하는 것으로 알려지고 있다. SARS-CoV nsp12는 ORF1b로부터 코딩되는 첫번째 단백질로서 3C-유사 단백질분해효소(3C-like proteinase, nsp5)에 의해 절단되어 생성되며 코로나바이러스 유래 RdRp가 공통적으로 지니고 있는 SDD 모티브(motif)를 지니고 있다. 이는 SARS-CoV의 RNA 유전자 복제가 바이러스 유전자에는 코딩되어 있지만 세포 내에는 존재하지 않는 RdRp인 nsp12에 의해 이루어 질 것이라는 것을 예측하게 하고 있다.
현재 여러 코로나바이러스에 대한 백신 및 치료제가 없는 상황에서 치료제 개발의 중요한 작용점이 될 수 있는 RdRp의 확보는 치료제 스크리닝에 매우 중요하다. 특히 SARS-CoV와 같이 감염성과 치사율이 높은 바이러스의 경우 실험실에서 바이러스의 세포배양을 통한 치료제 스크리닝은 제약이 많아 이들 대체할 수 있는 인비트로 스크리닝 시스템의 개발이 필요한 실정이다. 이러한 이유로 SARS-CoV 뿐만 아니라 코로나비리데 과에 속하는 바이러스 유래 RdRp를 발현 및 정제해서 인 비트로 복제 시스템을 구축하려는 노력은 코로나바이러스 과의 토로바이러스 속(Torovirus genus)이나 코로나바이러스 속 바이러스를 대상으로 오랜 기간 연구가 시도된 바 있으나 성공적인 연구결과가 보고된 바 없다. 1980년대부터 코로나바이러스 속에 속하는 쥐간염바이러스(murine hepatitis virus)의 복제 기작에 대한 연구가 여러 다른 코로나바이러스 연구에 비해 가장 활발히 진행되고 있으나, 아직까지도 재조합 RdRp를 얻지 못하고 있어, in vitro에서의 복제 기작 연구가 이루어 지지 못하고 있다. 그 이유는 복제 효소의 발현양이 적고, 대부분 불용성이며, 정제된 복제효소를 획득하였다 하더라도 바이러스게놈을 인식하여 복제하지는 못하는데 기인하고 있다. SARS-CoV 경우 GST로 표지된 nsp12를 대장균에서 발현하였으나 대부분 단백질이 불용성으로 발현이 되고 정제 중 여러 조각으로 잘려 특성을 연구하기 힘든 점이 보고된 바 있다(Cheng et al., Virology 335:165-176). 부분정제(partial purification)를 통해 얻어진 여러 잘린 조각을 지닌 nsp12는 바이러스 게놈 유래의 RNA를 복제할 수 있는 능력을 보여 주지는 못하였다. 코로나비리데 과와 함께 니도바이렐 목(Nidovirale order)에 속하며 코로나비리데 과에 속해 있는 바이러스보다 작은 유전자를 지닌 아터리바이러스 속(Arterivirus genus)내 에퀸 아터리티스바이러스(equine arteritis virus)의 정제된 재조합 RdRp 경우도 바이러스 게놈 유래의 RNA를 복제하지는 못하는 것으로 보고된 바 있다(Beerens et al., J. Virol. 81:8384-8395). 코로나바이러스들에 대한 인 비트로 RNA 복제시스템(in vitro replication system)은 RNA 복제연구, cis-acting RNA 부위 맵핑(mapping)을 통한 항바이러스 타겟 발굴, 복제효소 활성억제제 스크리닝에 사용될 수 있으며 RdRp 본연의 특성을 지닌 재조합 복제효소는 이 시스템의 가장 중요한 요소 이다. 위에서 기술한 연구결과를 포함한 기존의 보고에서는 바이러스 RNA 유전자 복제에 중요한 바이러스 유래 cis-acting RNA인 바이러스 양성가닥 및 음성가닥의 3-UTR을 인식하여 RNA 합성을 개시하는 복제효소 본연의 특성을 지닌 RdRp를 수용성 재조합단백질로 발현 정제하여 인비트로 RNA 복제시스템(in vitro replication system)을 구현하지 못하였다.
본 발명의 목적은 SARS-CoV 게놈 복제 활성을 지닌 재조합 SARS-CoV nsp12를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 숙주세포에서 상기 재조합 SARS-CoV nsp12를 발현시키기 위한 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 SARS-CoV nsp12를 발현시키기 위한 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수용성 재조합 SARS-CoV nsp12를 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SARS-CoV의 RNA-의존적 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)의 활성을 저해하는 물질을 스크리닝하기 위한 조성물 및 이를 이용한 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 사스 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV) nsp12의 생물정보학적 분석을 통해 예측된 nsp12의 N-말단에서 9개의 아미노산 서열이 제거되어 있고, N-말단에 수 개의 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 SARS-CoV nsp12를 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 SARS-CoV nsp12를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 재조합 SARS-CoV nsp12를 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한 본 발명은 SARS-CoV nsp12의 N-말단에서 9개의 아미노산 서열이 제거되어 있고, N-말단에 수 개의 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 SARS-CoV nsp12 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하여 재조합 SARS-CoV nsp12의 발현을 유도하고, 상기 숙주세포를 파쇄하고, 세포 파쇄액으로부터 상기 단백질을 분리 및 정제하는 것을 포함하는 재조합 SARS-CoV nsp12의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 SARS-CoV nsp12, 염화망간 및 뉴클레오시드 삼인산(nucleoside triphosphate, NTP)을 포함하는 SARS-CoV의 RNA-의존적 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) 활성 저해제 스크리닝용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조성물과 후보물질을 접촉시키고, 후보물질이 SARS-CoV nsp12의 RNA 합성을 촉진하는지 또는 저해하는지를 결정하는 것을 포함하는 RdRP 활성 저해제 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명은 보다 구체적으로 설명한다.
본 발명은 SARS-CoV nsp12의 N-말단에서 -1 리보조말 프레임 쉬프트(-1 ribosomal frame shift)가 일어나는 slippery sequence 이전 부분의 9개의 아미노산 서열이 제거되어 있고, N-말단에 수 개의 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 SARS-CoV nsp12를 제공한다.
SARS-CoV는 nsp12를 만들어 낼 때 RNA의 2차 구조로 인해 nsp12의 N-말단에서 -1 리보조말 프레임 쉬프트가 일어나 DNA 서열 상의 오픈 리딩 프레임과는 다른 아미노산 서열을 N-말단에 일부 포함하게 된다(Plant et al., PLoS Biol. 3:e172). 본 발명에서는 -1 리보조말 프레임 쉬프트가 일어나는 slippery sequence 이전의 아미노산 서열 부분인 N-말단으로부터 9개의 아미노산(SADASTFFK)을 제외한 slippery sequence 이 후의 아미노산 서열 부분만을 클로닝하여 이의 N-말단에 수 개의 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열을 결합시킨 재조합 SARS-CoV nsp12를 제조한다.
본 발명은 재조합 SARS-CoV nsp12의 용이한 분리, 정제를 위해 SARS-CoV nsp12의 N-말단에 수 개의 히스티딘을 결합시킨다. 표지자로서 히스티딘을 붙이는 것은 간단할 뿐만 아니라 히스티딘 표지는 그 크기가 작아서 SARS-CoV nsp12의 RdRp 활성에 영향을 미치지 않고, 또한 다른 단백질과의 상호작용을 일으킬 가능성이 낮기 때문이다. N-말단에 붙이는 히스티딘의 개수는 SARS-CoV nsp12의 RdRp 활성에 영향을 미치지 않으면서 컬럼을 이용한 분리, 정제가 용이한 경우이면 몇 개이든 제한되지 아니한다. 본 발명의 한 구체예에서, SARS-CoV nsp12의 N-말단에 결합되는 히스티딘의 개수는 6∼8 개일 수 있다. 본 발명의 일 실시예 에서는 6개의 히스티딘이 포함되어 있는 발현벡터에 nsp12의 slippery sequence 이 후의 아미노산 서열을 클로닝하여, N-말단에 6개의 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 SARS-CoV nsp12를 제조한다.
SARS-CoV nsp12의 slippery sequence 이 후의 아미노산 서열의 N-말단에 결합되는, 수 개의 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열은 히스티딘 외의 수 개의 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. 히스티딘 외의 아미노산 서열은 본 발명의 재조합 SARS-CoV nsp12의 발현을 위해 제작된 재조합 벡터로부터 유래되는 것으로, 벡터를 이용하여 제작된 재조합 단백질에서 일반적으로 볼 수 있는 추가 서열(extra sequences)에 해당한다. 따라서 재조합 SARS-CoV nsp12의 발현을 위해 어떠한 재조합 벡터를 이용하느냐에 따라 상기 추가 서열의 구성은 변화할 수 있다. 이러한 추가 서열은 히스티딘 서열의 전후에 약 2∼10개 가량 포함될 수 있으며, 재조합 단백질의 활성도에는 영향을 미치지 아니한다.
하기 실시예에서는 상기 재조합 SARS-CoV nsp12의 발현을 위한 발현 벡터를 제작하고, 이를 통해 대장균에서 재조합 SARS-CoV nsp12를 발현시킨 후 여러 방법을 이용해 수용성을 높이고, 여러 컬럼을 이용해 수용성의 재조합 단백질을 정제하였다. 히스티딘이 부착된 본 발명의 재조합 SARS-CoV nsp12은 단백질의 분리, 정제가 쉽고 용이하였다. 정제된 재조합 단백질의 활성을 확인하기 위해 폴리아데노신 주형을 이용한 활성도를 측정하였으며, SARS-CoV의 양성 게놈의 3'UTR 부위인 3 (+)UTR RNA과 음성게놈의 3'부위인 3 (-)UTR RNA[양성게놈(positive strand genome)의 5'UTR에 대한 대응 염기서열(complementary sequence)]를 주형으로 이용하여 재조합 SARS-CoV nsp12의 RNA 합성 능력을 평가하였다. 그 결과, 본 발명의 재조합 SARS-CoV nsp12는 RdRp로서의 활성이 우수하여, 이를 통해 인 비트로 복제 시스템을 확립할 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 재조합 SARS-CoV nsp12는 분리 및 정제가 쉬우면서도 SARS-CoV 게놈 복제 활성을 지니는 재조합 SARS-CoV nsp12 단백질을 발현할 수 있도록 하는 재조합 단백질 발현벡터에 의해 발현될 수 있다.
이러한 재조합 단백질 발현벡터로서, 본 발명은 SARS-CoV nsp12의 N-말단에서 9개의 아미노산 서열이 제거되어 있고, N-말단에 수 개의 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 SARS-CoV nsp12 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
상기 발현 벡터의 제작을 위해서는 먼저 SARS-CoV에 감염된 세포주에서 SARS-CoV 게놈을 분리한 후, SARS-CoV nsp12의 N-말단에서 9개의 아미노산 서열을 제외한 slippery sequence 이후 부분을 코딩하는 유전자를 역전사중합효소 연쇄반응(RT-PCR)으로 수득하고, 수득한 유전자를 제한효소를 이용하여 공지의 발현벡터에 삽입하게 된다. 이러한 공지의 발현 벡터는 재조합 SARS-CoV nsp12를 발현시킬 숙주 세포에 따라 선택될 수 있을 것이다. 수득한 유전자를 발현 벡터에 삽입할 때에는 수득한 유전자의 N-말단에 수 개의 히스티딘이 결합되도록 수 개의 히스티딘을 코딩하는 염기서열을 삽입할 수 있다. 다르게는 목적 유전자의 N-말단에 수 개의 히스티딘이 결합되도록 설계된 공지의 발현 벡터를 사용할 수도 있다. 이러한 발현 벡터의 예로는 pQE vector (Qiagen), pET vector (Novagen), pRSET vector (Invitrogen), pTrc vector (Invitrogen) 등이 포함된다. 본 발명의 한 구체예에서는 목적 유전자의 N-말단에 수 개의 히스티딘이 결합되도록 설계된 공지의 발현 벡터인 pTrcHisB에 SARS-CoV nsp12의 N-말단에서 9개의 아미노산 서열을 제외한 slippery sequence 이후 부분을 코딩하는 유전자를 삽입한 도 1의 개열지도를 갖는 발현벡터 pTrcSARSnsp12를 제공한다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 상기 재조합 단백질 발현벡터 pTrcSARSnsp12는 발현벡터인 pTrcHisB의 NheI/BamHI 절단 부위에 SARS-CoV nsp12의 cDNA가 삽입되어 있는 구성을 가지고 있다. 재조합 단백질 발현벡터 pTrcSARSnsp12를 제작하기 위해서는, 먼저, SARS-CoV에 감염된 세포주에서 SARS-CoV 게놈을 분리한 후, RT-PCR을 통해 SARS-CoV nsp12를 코딩하는 유전자를 수득하고, 수득한 유전자를 제한효소를 이용하여 분리, 정제를 용이하게 하기 위해 6개의 히스티딘 표지를 가지고 있는 pTrcHisB 벡터에 클로닝하여 제작할 수 있다. 이렇게 제작된 재조합 단백질 발현벡터 pTrcSARSnsp12는 SARS-CoV nsp12가 숙주세포에서 발현될 때 단백질의 N-말단에 6개의 히스티딘이 결합되어 있도록 해 준다. 히스티딘이 결합된 SARS-CoV nsp12는 히스티딘과의 결합력이 우수한 컬럼에 의해 쉽게 분리, 정제될 수 있다.
본 발명에서는 SARS-CoV nsp12 단백질에 히스티딘 표지를 붙일 수 있는 재조합 단백질 발현벡터로서 pTrcSARSnsp12를 구체예로서 개시하고 있으나, SARS-CoV nsp12 단백질의 분리, 정제에 용이하도록 히스티딘 표지를 붙여줄 수 있는 재조합 단백질 발현 벡터라면 어떠한 것이든 이용 가능할 것이다.
본 발명의 재조합 SARS-CoV nsp12는 도 1의 개열지도를 갖는 발현벡터 pTrcSARSnsp12에 의해 발현되는 재조합 SARS-CoV nsp12를 포함한다. 상기 발현벡터 pTrcSARSnsp12에 의해 발현되는 재조합 SARS-CoV nsp12는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열은 본래의 SARS-CoV nsp12의 전체 아미노산 서열인 서열번호 2의 아미노산 서열의 N-말단에서 9개의 아미노산이 제거되고, 대신 N-말단에 6개의 히스티딘(굵은 글씨체로 표시)과 재조합 과정에서 부가적으로 삽입된 추가 서열을 포함하는 아미노산 서열(MGGSHHHHHHGMA)이 결합되어 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 SARS-CoV nsp12은 본 발명의 한 예시에 불과할 뿐이며, 앞서 설명한 바와 같이 N-말단에 포함되는 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열은 히스티딘의 개수나 재조합 과정에서 부가적으로 삽입되는 추가 서열의 구성 등에 따라 변경될 수 있다.
본 발명은 또한 SARS-CoV nsp12의 N-말단에서 9개의 아미노산 서열이 제거되어 있고, N-말단에 수 개의 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 SARS-CoV nsp12 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 재조합 SARS-CoV nsp12를 생산하기 위한 숙주세포는 배양이 쉽고 재조합 단백질을 효율적으로 생산해 낼 수 있는 것이면 어떠한 것이든 이용 가능하다. 이러한 숙주세포의 예로는 박테리아, 효모 등의 미생물, 곤충 세포, 동물 세포 등을 들 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서 상기 숙주세포는 대장균(Escherichia coli)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대장균 Top10 균주를 발현벡터 pTrcSARSnsp12로 형질전환한 균주를 개시하나, 본 발명의 숙주 세포는 이에 제한되지 아니한다.
본 발명은 또한 SARS-CoV nsp12의 N-말단에서 9개의 아미노산 서열이 제거되어 있고, N-말단에 수 개의 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 SARS-CoV nsp12 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하여 재조합 SARS-CoV nsp12의 발현을 유도하고, 상기 숙주세포를 파쇄하고, 세포 파쇄액으로부터 상기 단백질을 분리 및 정제하는 것을 포함하는 재조합 SARS-CoV nsp12의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 숙주 세포의 특성에 맞는 배양 조건에 따라 배양된다. 숙주세포의 생육을 위한 배양 배지는 숙주세포에 따라 달라질 것이다. 또한, 재조합 SARS-CoV nsp12의 발현을 유도하는 조건은 재조합 SARS-CoV nsp12 코딩하는 유전자가 삽입되는 발현벡터의 종류에 따라 변경될 것이다.
상기 재조합 SARS-CoV 비구조단백질 nsp12의 발현 유도 시 숙주세포에 삼투압 스트레스(osmotic stress)를 유발하거나 쉐퍼론(chaperone) 단백질을 발현시킴으로써 수용성 재조합 SARS-CoV 비구조단백질 nsp12의 발현을 유도할 수 있다. 기존의 연구들에서는 복제 효소의 발현양이 적고, 대부분 불용성이어서 인 비트로 복제 시스템 구축에 어려움이 있었던 것 과는 달리 본 발명의 생산 방법을 이용하면 수용성 재조합 SARS-CoV nsp12를 다량 수득할 수 있다. 하기 실시예에서는 삼투압 스트레스의 유발을 위해 바테인(bateine)이나 솔비톨(sorbitol)을 이용하였으며, 다르게는 여러 종류의 쉐퍼론 단백질을 발현시켜 SARS-CoV 비구조단백질 nsp12의 수용성을 증진시켰다.
재조합 SARS-CoV nsp12의 발현이 유도되면 숙주세포를 파쇄하고 세포 파쇄액을 히스티딘 잔기와 결합할 수 있는 컬럼에 통과시켜 상기 단백질을 분리, 정제하게 된다.
이때 단백질의 분리, 정제를 위해 사용하는 컬럼은 히스티딘 잔기와 결합할 수 있는 것이면 어떠한 것이든 가능하다. 예를 들어, Ni-세파로즈(Ni-sepharose), HisPur 코발트 레진(HisPur cobalt resin), Talon 레진(Talon resin) 등을 이용할 수 있다.본 발명의 한 구체예에서는 히스티딘 잔기와 결합할 수 있는 컬럼으로써 Ni-NTA 세파로우즈 컬럼(Ni-nitrilotriacetic acid-Sepharose column)을 이용할 수 있다. 이렇게 분리된 단백질의 순도를 높이기 위해서는 추가의 정제 컬럼을 이용할 수 있다. 이러한 추가적인 정제 컬럼으로는 예를 들어, 이온 교환 컬럼(ion exchange column) 이나 겔 여과 컬럼(gel filtration column) 등을 이용할 수 있다. 이온 교환 컬럼으로는 예를 들어, Q 세파로즈, DEAE(diethylamino ethyl) 세파로즈, CM(carboxymethyl) 세파로즈, SP(sulphopropyl) 세파로즈 컬럼 등이 있으며, 겔 여과 컬럼으로는 예를 들어, 세파크릴(sephacryl), 세파덱스(sephadex), 수퍼로즈(superpose) 컬럼 등이 있다. 본 발명의 한 구체예에서는 추가적인 정제 컬럼으로써 큐 세파로우즈 컬럼(Q-Sepharose column)를 이용할 수 있다.
본 발명자들은 재조합 SARS-CoV nsp12의 RdRp 활성을 분석하는 과정에서 SARS-CoV nsp12가 최적의 RdRp 활성을 나타내는 조건을 밝혔다. 하기 실시예를 통해 확인할 수 있는 바와 같이 SARS-CoV nsp12가 최적의 RdRp 활성을 나타내기 위해서는 망간 이온의 존재가 필수적이다. SARS-CoV nsp12가 최적의 RdRp 활성을 나타내는 조건은 인 비트로 복제 시스템(in vitro replication system)의 구축뿐만 아니라, SARS-CoV에 대한 항바이러스제의 개발에 있어서 중요한 의미를 갖는다. 즉, SARS-CoV nsp12가 최적의 RdRp 활성을 나타내는 조건에서 SARS-CoV에 대한 항바이러스제의 후보 물질을 처리하였을 때 SARS-CoV nsp12가 RNA를 합성하는지의 여부를 조사하면 상기 후보 물질의 항바이러스제로서의 가능성을 판단할 수 있게 된다.
따라서 본 발명은 SARS-CoV nsp12, 염화망간 및 뉴클레오시드 삼인산(nucleoside triphosphate, NTP)을 포함하는 SARS-CoV의 RNA-의존적 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) 활성 저해제 스크리닝용 조성물 및 상기 스크리닝용 조성물과 후보물질을 접촉시키고, 후보물질이 SARS-CoV nsp12의 RNA 합성을 촉진하는지 또는 저해하는지를 결정하는 것을 포함하는 SARS-CoV의 RdRp 활성 저해제 스크리닝 방법을 제공한다. SARS-CoV의 RdRp 활성 저해제에 대한 후보 물질을 스크리닝하기 위해서는 SARS-CoV nsp12가 최적의 RdRp 활성을 나타내는 조건 하에서 후보 물질을 처리하였을 때 SARS-CoV nsp12의 RNA 합성이 촉진되는지 또는 저해되는지를 조사함으로써 수행할 수 있다. 따라서 SARS-CoV의 RdRp 활성 저해제 스크리닝용 조성물에는 SARS-CoV nsp12와 함께 SARS-CoV nsp12가 RNA를 중합하기 위해 필요한 기질인 NTP, 그리고 최적의 RdRp 활성을 나타낼 수 있도록 하는 염화망간이 포함될 수 있다. 상기 스크리닝용 조성물에는 추가로 RNA 합성을 위해 필요한 주형 및 프라이머가 포함될 수 있다. 또한, 추가로 완충용액 등이 포함될 수 있다.
후보 물질이 처리된 조건 하에서 SARS-CoV nsp12가 RNA를 합성하는지 여부를 쉽게 판별하기 위하여 NTP은 마커로 표지할 수 있다. 예를 들어, 상기 마커는 형광물질, 발광물질 또는 방사성 동위원소일 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서 NTP는 디곡시제닌(digoxigenin), 비오틴(biotin) 또는 플루오레세인(fluorescein)이 표지된 ATP, GTP, CTP, UTP 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서 NTP는 방사성 동위원소가 표지된 ATP, GTP, CTP, UTP 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 방사선 동위원소가 표지된 NTP를 사용하면 방사선 동위원소 측정기에 의해 RNA의 합성 여부를 쉽게 확인할 수 있게 된다. 따라서 본 발명은 또한 조성물과 후보물질을 접촉시키고, 마커가 표지된 RNA의 합성 여부를 측정함으로써 후보물질이 SARS-CoV nsp12의 RNA 합성을 촉진하는지 또는 저해하는지를 결정하는 것을 포함하는 SARS-CoV의 RdRP 활성 저해제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 SARS-CoV의 RdRp 활성 저해제에 대한 후보 물질을 스크리닝하기 위한 고효율 스크리닝(high-throughput screening) 시스템을 구축할 수 있게 된다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명에 따르면 SARS-CoV 게놈 복제 활성을 지닌 재조합 SARS-CoV nsp12 단백질을 숙주세포에서 수용성 단백질로 과발현시켜 고순도로 손쉽게 정제하는 것이 가능하다. 이와 같이 얻어진 재조합 SARS-CoV nsp12를 이용하여 SARS-CoV의 복제 기작 연구에 중요한 인 비트로 복제 시스템을 구축할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 얻어진 재조합 SARS-CoV nsp12은 항바이러스제 개발을 위한 타겟으로 이용될 수 있다. 또한 본 발명에서는 SARS-CoV nsp12의 활성 조건을 밝힌바, 본 발명에 따르면 nsp12의 RdRp 활성을 저해할 수 있는 물질을 효과적으로 스크리닝할 수 있다.
도 1은 본 발명의 재조합 발현벡터 pTrcSARSnsp12의 구조에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 재조합 발현벡터 pTrcSARSnsp12의 제조 방법 및 구조에 대한 모식도이다.
도 3는 본 발명의 재조합 발현벡터, pTrcSARSnsp12를 사용하여 형질 전환시킨 대장균 TOP10 균주를 솔비톨을 첨가하여 배양하거나 GroES/GroEL 쉐퍼론을 동시에 발현하여 얻은 전체 세포 파쇄액(T), 수용성 세포 파쇄액(S), 불용성 세포파쇄액(P)을 전기영동 한 후 쿠마시블루로 염색한 결과와 항-(His) 항체를 이용해 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타내는 도면이다. (-)는 솔비톨 첨가 혹은 쉐퍼론 동시 발현을 하지 않은 대조군 시료를 나타낸다.
도 4는 SARS-CoV nsp12의 정제를 위해, 이미다졸 농도 구배를 이용하여 용출한 분획에 대해 전기영동을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명에 따라 정제된 SARS-CoV nsp12에 대해 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동 한 결과와 항-His 항체를 이용해 웨스턴 블롯을 수행한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6는 정제된 SARS-CoV nsp12를 이용해 폴리아데노신을 주형으로 RdRp 활성도 검사를 수행하는데 있어서 올리고 유리딘 프라이머의 유무가 활성도에 미치는 영향을 젤을 내려 확인한 도면이다.
도 7는 정제된 SARS-CoV nsp12의 망간 이온에 대한 최적의 활성 조건을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8는 정제된 SARS-CoV nsp12의 칼륨이온에 대한 최적의 활성 조건을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 정제된 SARS-CoV nsp12의 시간에 대한 최적의 활성 조건을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10는 정제된 SARS-CoV nsp12의 pH에 대한 최적의 활성 조건을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 11는 정제된 SARS-CoV nsp12의 온도에 대한 최적의 활성 조건을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 SARS-CoV 게놈 유래 RNA 주형을 사용한 SARS-CoV nsp12의 RdRp 활성도 검사 및 다아데노신기[poly(A) tail]의 기능 분석의 결과를 나타낸 도면이다.
도 13는 SARS-CoV nsp12의 SARS-CoV 게놈 유래 (+)3 UTR151?A RNA와 (-)3 UTR121 RNA주형의 합성여부를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
발명의 실시를 위한 형태
실시예 1: 재조합 SARS-CoV nsp12 발현 벡터의 제조
RdRp 활성을 지닌 SARS-CoV nsp12 단백질을 얻기 위해 SARS-CoV가 감염된 세포(FDA, 미국 식품의약국)에서 하기 방법으로 SARS-CoV RNA를 분리하고 SARS-CoV nsp12를 코딩하는 cDNA를 제조하였다. SARS-CoV 게놈 RNA를 포함하는 세포 내 전체 RNA는 트리졸(Invitrogen)을 이용해 감염된 세포에서 분리한 후 순차적으로 페놀/클로로포름 추출과 이소프로필 알코올 침전을 수행하고, 70％ 에탄올로 세척하여 수득하였다. 다음, RNA 절단효소가 결여된 증류수에 용해시킨 RNA에 아래에 기술한 R1 프라이머와 임프롬Ⅱ (ImProm-Ⅱ, Promega) 역전사 효소를 첨가하여 cDNA를 합성하였다. RNA와 R1 프라이머를 섞은 후, 70℃에서 5분간 가열하고 얼음에서 신속히 냉각시켰다. 다음, 상기 혼합액을 역전사효소 완충용액, 1 mM dNTP 각각, 20U의 임프롬Ⅱ(ImProm-Ⅱ, Promega) 역전사효소와 함께 42℃에서 60분간 반응시킨 뒤 70℃에서 15분간 열처리하여 효소를 불활성화 시켰다.
역전사에 의해 합성된 SARS-CoV nsp12를 코딩하는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 cDNA를 주형으로 상기한 F1 프라이머와 R1 프라이머를 이용하여 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 그리고 72℃에서 3분의 조건으로 총 25회 중합연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. 다음, 증폭한 DNA를 제한효소 XbaI과 BamHI으로 절단한 후 제한효소 NheI과 BamHI으로 절단한 히스티딘 6개 표지를 지닌 발현벡터인 pTrcHisB에 삽입하여, SARS-CoV nsp12의 N 말단에 히스티딘 6개 표지를 지닌 단백질을 발현하는 약 7 kbp 크기의 발현벡터를 제작하고 이를 발현벡터 pTrcSARSnsp12 라 명명하였다(도 1).
F1 프라이머 : 5'-GCTCTAGAGTTTGCGGTGTAAGTGCAGC-3'(SEQ ID No.: 4)
R1 프라이머 : 5'-CGGGATCCTACTGCAAGACTGTATGTGG-3'(SEQ ID No.: 5)
상기 재조합 발현벡터 pTrcSARSnsp12에 삽입되어 있는 SARS-CoV nsp12 코딩 cDNA는 -1 리보조말 프레임 쉬프트가 일어나는 slippery sequence 이 후 부분만이 클로닝되어 있다. 따라서 상기 재조합 발현벡터 pTrcSARSnsp12에 의해 발현되는 재조합 SARS-CoV nsp12는 본래의 SARS-CoV nsp12의 아미노산 서열인 서열번호 2의 아미노산 서열 중에서 slippery sequence 이 전 부분의 아미노산 서열을 포함하는 N-말단으로부터 9개의 아미노산 서열(SADASTFFK)이 6개의 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열(MGGSHHHHHHGMA)로 치환되어 있다. 상기 재조합 발현벡터 pTrcSARSnsp12에 의해 발현되는 재조합 SARS-CoV nsp12는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시된다.
실시예 2: 재조합 SARS-CoV nsp12 발현 및 수용성 증가
재조합 SARS-CoV nsp12는 여러 코로나바이러스의 경우와 마찬가지로 과발현시 발현되는 단백질의 대부분 불용성으로 발현이 되어 수용성 단백질의 정제가 용이 하지 않다. 따라서 본 발명에서는 바테인과 솔비톨을 이용하여 삼투압 스트레스를 유발시키거나 단백질의 3차 구조의 형성을 도와 주는 쉐퍼론 단백질을 함께 발현 시킴으로서 재조합 SARS-CoV nsp12의 수용성을 크게 증가시켰다. 바테인과 솔비톨을 이용한 경우 pTrcSARSnsp12로 형질전환된 균주를 바테인과 솔비톨이 포함된 배지에서 SARS-CoV nsp12을 발현시켰다. 쉐퍼론 단백질을 이용할 경우, pTrcSARSnsp12와 쉐퍼론 단백질이 코딩되어 있는 벡터와 함께 형질 전환 시킨 후, SARS-CoV nsp12를 발현시켰다. 쉐퍼론단백질로는 DnaK, DnaJ, GrpE, GroES, GroEL, TF 등을 이용할 수 있다. 재조합 SARS-CoV nsp12의 수용성 분석은 초음파 분쇄기를 이용하여 세포를 파쇄한 후, 전체 세포 파쇄액(total lysate, T)과 전체 세포 파쇄액을 원심분리 하여 얻은 수용성 세포 파쇄액(supernatant, S) 및 불용성 세포 파쇄액(pellet, P)을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 후 쿠마시블루로 염색하거나 및 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과 솔비톨을 첨가하거나 GroES/GroEL 을 같이 발현 할 경우 nsp12가 수용성 단백질로 발현되는 것이 현저하게 증가함을 볼 수 있었다(도 3).
실시예 3: SARS-CoV nsp12의 분리 및 정제
상기 실시예 2에서 수득된 pTrcSARSnsp12로 형질 전환된 균주로 SARS-CoV nsp12을 발현시킨 후, 8,000 rpm에서 원심분리해서 세균 세포 침전물을 수거하였다. 세균 세포 침전물은 PBS 완충용액[phosphate-buffered saline(pH 7.4)]으로 두 번 세척한 후 10 ml 완충용액 A[50 mM 인산나트륨(pH 8.0), 300 mM 염화나트륨(NaCl), 10 mM 이미다졸(imidazole), 10 mM β-메르캅토에탄올, 10％ 글리세롤, 1％ NP-40]에 현탁한 후 -80℃에서 냉동하였다. 냉동시킨 세포를 다시 녹인 후, 얼음 중탕 내에서 초음파 분쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액을 15,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 그 상등액을 완충용액 A로 평형화된 Ni-NTA 컬럼(Ni-nitrilotriacetic acid-Sepharose resin; Qiagen)과 혼합하여 단백질을 흡착시켰다. 다음 컬럼 볼륨의 20배에 해당하는 완충용액 A를 컬럼에 흘려 수지에 흡착되지 않은 단백질을 제거한 후, 20 mM 내지 500 mM 농도의 이미다졸을 포함하는 10 ml 완충용액 A를 이용하여 단백질을 용출하고 각각의 분획을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 확인하였다(도 4).
상기에서 수득한 분획 중 SARS-CoV nsp12를 포함하는 분획을 수거한 후 SARS-CoV nsp12의 순도를 높이고 농축하기 위해 완충용액 B[50 mM Tris-Cl(pH 7.5), 50 mM 염화나트륨, 1 mM 디티오트레이톨, 10％ 글리세롤]로 평형화 된 큐세파로우즈 컬럼(Q-Sepharose column, Amersham Pharmacia Biotech)에 결합시켰다. 후속하여, 컬럼 용적의 20배에 해당하는 완충용액 B를 컬럼에 흘려 수지에 흡착되지 않은 단백질을 제거한 후, 0.1 M에서 1 M 선형 농도 구배의 염화나트륨을 포함하는 완충용액 B를 이용하여 용출하고 각 분획을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분석하였다. 상기에서 수득한 분획 중 SARS-CoV nsp12를 포함하는 분획을 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동하고 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(도 5).
실시예 4: SARS-CoV nsp12의 RdRp 활성도 분석
상기 실시예 3에서 분리 및 정제된 재조합 SARS-CoV nsp12의 RdRp 활성은 동위원소로 표지한 기질이 삽입된 RNA 산물을 겔에 전기영동하여 분석하였다. 분리정제된 nsp12의 초기 RdRp 활성평가는 기 보고된 C형간염바이러스(hepatitis C virus) RdRp 반응 완충용액에(Oh et al., J. Virol. 73:7694-7702) 2 mM 염화망간을 추가로 첨가하여 실시되었다. SARS-CoV nsp12의 활성 유무를 확인 후, 하기 실시예 5에서 최적화된 조건을 확립하였고, 본 실시예에서는 최적화된 조건으로 RdRp 활성도를 분석하였다. 본 실시예에서 사용한 동위원소 표지된 기질은 3 μCi의 [α-32P]UTP(3,000 Ci/mmol; Amersham Pharmacia Biotech)이고, 총 25 ㎕의 용적에서 정제된 500 ng의 SARS-CoV nsp12, 50 mM Tris-Cl(pH 7.5), 50 mM 염화나트륨, 2 mM 염화망간, 1 mM 디티오트레이톨, 10％ 글리세롤, 20 U RNA 절단효소 저해제(Promega), 1 ㎍ 폴리아데노신(poly(A)) 주형, 10 pmol 올리고 유리딘(oligo(U)20)을 섞은 뒤 32℃에서 두 시간 동안 RdRp 반응을 진행시켰다. 다음, 20 ㎍ 글리코겐(Roche)을 포함하는 35 ㎕ 증류수와 60 ㎕ 산성 페놀 유탁액(페놀, 클로로포름, 10％ SDS, 0.5 M EDTA [1:1:0.2:0.4])를 추가해 반응을 정지시켰다. 원심분리 후 상등액에 존재하는 RNA는 5 M 암모늄 아세트산염-이소프로필 알코올(1:5)을 첨가해 침전 시키고 70％ 에탄올로 세척하여 회수하였다. 상온에서 건조된 반응물은 변성 로딩 완충용액(95％ 포름아마이드, 10 mM EDTA, 0.025％ 자이린 시아놀, 0.025％ 브로모페놀 블루)에 녹인 후 RNA를 열 변성처리 한 뒤 얼음에서 급속히 냉각한 후 8 M 요소-5％ 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동 분석하였다. 전기영동 후의 겔은 방사선 사진(autoradiography)을 위해 X-레이 필름(BioMax MS, Kodak)에 노출시켰다(Oh et al., J. Virol. 73:7694-7702).
그 결과 SARS-CoV nsp12는 폴리아데노신 RNA를 주형으로 사용 시 프라이머가 존재할 경우에만 동위원소로 표지한 기질을 삽입하는 활성을 보여 프라이머 의존성을 보이고 있음을 알 수 있었다(도 6).
실시예 5: SARS-CoV nsp12 활성도 검사 최적 조건 분석
상기 실시예 4에서 실시된 폴리아데노신을 주형으로 하고 올리고 유리딘 프라이머가 존재하는 RdRp 활성도 분석 조건에서 정제된 SARS-CoV nsp12가 최적의 활성을 지니는 조건을 분석하였다. 망간 이온농도, 칼륨 이온농도, 반응시간, 반응온도, pH에 대한 여러 조건에서 정량분석 하였다. 본 실시예에서 사용한 동위원소 표지된 기질은 3 μCi의 [α-32P]UTP (3,000 Ci/mmol; Amersham Pharmacia Biotech)이고 RdRp 반응은 총 50 ㎕의 용적에서 정제된 500 ng의 SARS-CoV nsp12, 50 mM Tris-Cl(pH 7.5), 50 mM 염화나트륨, 2 mM 염화망간, 1 mM 디티오트레이톨, 10％ 글리세롤, 20 U RNA 절단효소 저해제(Promega), 1 ㎍ 폴리아데노신(poly(A)) 주형, 바이오틴이 표지된 10 pmol 올리고 유리딘(biotin-labeled oligo(U)12)을 섞은 뒤 스트렙트에비딘(streptavidin)이 부착된 플래시플레이트(Flashplate, PerkinElmer life sciences.)에서 32℃에서 두 시간 동안 진행되었다. 반응 후 PBS 완충용액으로 두 번 세척한 후 다기능섬광측정기 Top Counter(PerkinElmer life sciences)를 사용하여 합성된 RNA에 삽입된 동위원소의 양(counter per minute, cpm)을 측정하였다. 그 결과 2 mM 망간 이온, 30∼34℃, pH 7∼8의 반응조건에서 SARS-CoV nsp12는 최적의 RdRp 활성을 보임을 알 수 있었다(도 7 내지 11).
실시예 6: SARS-CoV 게놈 유래 SARS-CoV 3'(+)UTR RNA 주형 제조
하기 실시예 7에서 RdRp 활성도 검사에 이용할 SARS-CoV 게놈 유래 RNA 주형으로 3'(+)UTR RNA를 T7 RNA 중합효소를 이용한 인 비트로 전사(in vitro transcription)로 제조하였다. 상기 실시예 1에서 수득한 SARS-CoV 게놈 RNA를 이용하여 R3 프라이머로 역전사하였다. 합성된 SARS-CoV 게놈 중 일부인 3(+)UTR 코딩 cDNA를 주형으로 F3 프라이머와 R3 프라이머로 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 그리고 72℃에서 1분의 조건으로 총 25회 중합연쇄반응을 실시하여, 17개의 아데노신이 연결된 3 (+)UTR DNA 주형을 얻었다. 같은 방법으로 F3 프라이머와 R4 프라이머를 이용하여 다아데노신기[poly(A) tail]가 없는 3 (+)UTR DNA 주형을 만들었다. 이 PCR산물들을 pCR2.1-TOPO vector(Invitrogen)에 넣어서 pTOPO 3 (+)UTR-1, pTOPO 3 (+)UTR-2의 재조합 클론을 만들었다. 제한효소 XhoI과 BglⅡ를 이용해 pTOPO 3 (+)UTR-1, pTOPO 3 (+)UTR-2 클론의 T7 RNA 중합효소 프로모터 부분을 제거하고 각각의 프라이머를 이용해 PCR을 하고, 최종적으로 PCR 산물을 제한효소 BsaI으로 잘랐다. 최종 만들어진 DNA로부터 T7 MEGAscript kit(Ambion)을 이용한 인 비트로 전사로 RNA 주형를 제조하였다. T7 RNA 중합효소로 전사 시킨 후, DNA 주형은 DNA 절단 효소(Ambion)로 37℃에서 30분간 처리해 제거하였다. 다음, RNA 전사체는 산성 페놀-클로로포름(Sigma)으로 추출하고, 이소프로필 알코올로 침전시켜 정제된 RNA를 얻었다. RNA 농도는 260 nm의 흡광도에서 측정하였다. pTOPO 3 (+)UTR-1으로부터 전사된 RNA는 339개의 SARS-CoV 게놈 유래의 뉴클레오타이드와 17개의 다아데노신기(3 (+)UTR339+17A로 명명)로 구성되며, pTOPO 3 (+)UTR-2으로부터 전사된 RNA는 다아데노신기를 포함하지 않는 339개의 SARS-CoV 게놈 유래의 뉴클레오타이드만(3 (+)UTR339?A로 명명)으로 구성되어있다.
F3 프라이머 : 5'- TAATACGACTCACTATAGG
ACACTCATGATGACCACAC- 3'(SEQ ID No.: 6)
R3 프라이머 : 5'- GGTCTCTTTTTTTTTTTTTTTTTT - 3'(SEQ ID No.: 7)
R4 프라이머 : 5'- GTCCATTCTCCTAAGAAGCTA - 3'(SEQ ID No.: 8)
상기 프라이머에서 밑줄 친 부위는 T7 RNA 중합효소 프로모터 부위이고 SARS-CoV 게놈과 상보적인 부분은 굵은체로 나타냈다.
실시예 7: SARS-CoV 게놈 유래 RNA 주형을 사용한 SARS-CoV nsp12의 RdRp 활성도 검사 및 다아데노신기의 기능 분석
상기 실시예 3에서 분리, 정제한 재조합 SARS-CoV nsp12의 RdRp 활성을 동위원소로 표지한 기질이 삽입되는지를 분석하여 확인하였다. 본 실시예에서 사용한 동위원소 표지된 기질은 10 μCi의 [α-32P]UTP(3,000 Ci/mmol)이고 상기 실시예 6에서 제작된 RNA를 사용하였다. RdRp 반응은 총 25 ㎕의 용적에서 정제된 500 ng의 SARS-CoV nsp12, 50 mM Tris-Cl(pH 7.5), 50 mM 염화나트륨, 2 mM 염화망간, 1 mM 디티오트레이톨, 10％ 글리세롤, 20 U RNA 절단효소 저해제(Promega), 0.5 mM ATP, CTP, 및 GTP 각각, 5 μM UTP와 500 ng의 RNA 주형을 섞은 뒤 32℃에서 두 시간 동안 진행시켰다. 반응이 끝난 후에는 실시예 4에 기술한 방법에 따라 8 M 요소-8％ 폴리아크릴아마이드 겔에서 전기영동하여 분석하였다. 그 결과 SARS-CoV nsp12는 SARS-CoV 게놈을 주형으로 동위원소로 표지한 기질을 삽입함으로써 SARS-CoV 게놈의 일부인 3'(+)UTR339?A 및 3'(+)UTR 339+17A RNA를 주형으로 이용해 주형을 복제한다는 사실을 확인하였다(도 12). SARS-CoV nsp12가 다아데노신기[poly(A)]의 유무에 상관없이 3'(+)UTR339?A 및 3'(+)UTR339+17A RNA 주형에 동위원소로 표지한 기질을 삽입함으로서 SARS-CoV nsp12가 다아데노신기[poly(A)]가 없는 3'(+)UTR339?A RNA 주형에서도 RNA 합성을 개시할 수 있는 능력을 확인하였다.
실시예 8 SARS-CoV 3'(+)UTR 151?A RNA 및 3'(-)UTR121 RNA 주형 제조
하기 실시예 9에서 RdRp 활성도 검사에 이용할 SARS-CoV 게놈 유래 3'(+)UTR151?ARNA 와 3'(-)UTR121 RNA를 실시예 6에서와 같은 방식으로 T7 RNA 중합효소를 이용한 인 비트로 전사로 제조하였다. 3'(+)UTR151?A RNA는 아래에 기술한 F4 프라이머와 상기한 R4 프라이머를 사용하여 얻은 PCR DNA 절편을 기질로하는 인 비트로 전사반응으로 얻은 다아데노신기[poly(A)]를 포함하지 않는 SARS-CoV 3 말단의 151개의 뉴클리오타이드로 구성되어 있다. 3 (-)UTR121 RNA의 합성을 위한 DNA 주형은 R5 프라이머로 역전사 후, 아래에 기술한 F5 프라이머와 R5 프라이머를 사용하여 얻은 PCR DNA 절편을 사용하여 제작되었으며, 전사된 RNA는 SARS-CoV 게놈 유래 5 (+)UTR 에 상보적 염기서열을 지닌 음성가닥 RNA 3 말단의 121개 뉴클리오타이드를 지니고 이다.
F4 프라이머 : 5'- TAATACGACTCACTATAGG
ACCACATTTTCATCGAGGCC - 3'(SEQ ID No.: 9)
F5 프라이머 : 5'- ATATTAGGTTTTTACCTAC - 3'(SEQ ID No.: 10)
R5 프라이머 : 5'- TAATACGACTCACTATAGG
TAGGTGCACTAGGCATGC - 3'(SEQ ID No.: 11)
상기 프라이머에서 밑줄 친 부위는 T7 RNA 중합효소 프로모터 부위이고 SARS-CoV 게놈과 상보적인 부분은 굵은체로 나타냈다.
실시예 9: SARS-CoV nsp12 의 SARS-CoV 게놈 유래
3'(+)UTR151?A RNA와 3'(-)UTR121 RNA 주형을 사용한 RNA 합성능 분석
실시예 7에서 기술한 방법에 따라 실시예 8에서 제작된 SARS-CoV 3 (+)UTR151?A RNA와 3 (-)UTR121 RNA를 주형으로 RdRp 반응을 진행한 후 수득한 결과물을 같은 겔에 내려 분석함으로서 SARS-CoV nsp12의 활성을 분석하였다. 그 결과 3'(+)UTR151?A RNA를 주형과 3'(-)UTR121 RNA를 주형 모두에서 SARS-CoV nsp12가 동위원소로 표지한 기질을 삽입함으로 SARS-CoV nsp12의 RNA 합성능력을 확인할 수 있었으며 양성가닥 RNA 바이러스에 감염된 세포 내에서 바이러스 게놈의 복제 시 양성가닥이 더 많이 만들어 지는 것과 일치하게 인 비트로에서도 nsp12에 의해 양성가닥 RNA의 합성이 더 효과적으로 일어남을 볼 수 있었다(도 13). 또한 SARS-CoV nsp12의 활성에 망간이온이 반드시 필요함을 재확인하였다.
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Claims (21)

  1. 사스 코로나바이러스(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS-CoV) nsp12의 N-말단에서 9개의 아미노산 서열이 제거되어 있고, N-말단에 6 내지 8 개의 히스티딘을 포함하는 8 내지 18 개의 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 SARS-CoV nsp12.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 SARS-CoV nsp12가 도 1의 개열지도를 갖는 발현벡터 pTrcSARSnsp12에 의해 발현되는 것인 재조합 SARS-CoV nsp12.
  3. 제1항에 있어서, 상기 재조합 SARS-CoV nsp12가 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인 재조합 SARS-CoV nsp12.
  4. SARS-CoV nsp12의 N-말단에서 9개의 아미노산 서열이 제거되어 있고, N-말단에 6 내지 8 개의 히스티딘을 포함하는 8 내지 18 개의 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 SARS-CoV nsp12 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 상기 발현 벡터가 도 1의 개열지도를 갖는 발현벡터 pTrcSARSnsp12인 발현 벡터.
  6. 제4항에 있어서, 상기 재조합 SARS-CoV nsp12가 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인 발현 벡터.
  7. SARS-CoV nsp12의 N-말단에서 9개의 아미노산 서열이 제거되어 있고, N-말단에 6 내지 8 개의 히스티딘을 포함하는 8 내지 18 개의 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 SARS-CoV nsp12 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
  8. 제7항에 있어서, 상기 발현 벡터가 도 1의 개열지도를 갖는 발현벡터 pTrcSARSnsp12인 숙주 세포.
  9. 제7항에 있어서, 상기 재조합 SARS-CoV nsp12가 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인 숙주세포.
  10. 제7항에 있어서, 상기 숙주세포가 대장균인 숙주세포.
  11. SARS-CoV nsp12의 N-말단에서 9개의 아미노산 서열이 제거되어 있고, N-말단에 6 내지 8 개의 히스티딘을 포함하는 8 내지 18 개의 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 SARS-CoV nsp12 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하여 재조합 SARS-CoV 비구조단백질 nsp12의 발현을 유도하고, 상기 숙주세포를 파쇄하고, 세포 파쇄액으로부터 상기 단백질을 분리 및 정제하는 것을 포함하는 재조합 SARS-CoV 비구조단백질 nsp12의 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 재조합 SARS-CoV 비구조단백질 nsp12의 발현 유도시 숙주세포에 삼투압 스트레스를 유발하거나 쉐퍼론 단백질을 발현시키는 것을 포함하는 재조합 SARS-CoV 비구조단백질 nsp12의 생산 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 분리 및 정제가 Ni-NTA 세파로우즈 컬럼(Ni-nitrilotriacetic acid-Sepharose column)을 이용하여 수행되는 것인 생산 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 분리 및 정제가 추가로 큐 세파로우즈 컬럼(Q-Sepharose column)을 이용하여 수행되는 것인 생산 방법.
  15. SARS-CoV nsp12, 염화망간 및 뉴클레오시드 삼인산(nucleoside triphosphate, NTP)을 포함하는 RNA-의존적 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) 활성 저해제 스크리닝용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 SARS-CoV nsp12가 SARS-CoV nsp12의 N-말단에서 9개의 아미노산 서열이 제거되어 있고, N-말단에 6 내지 8 개의 히스티딘을 포함하는 8 내지 18 개의 아미노산 서열이 결합되어 있는 재조합 SARS-CoV nsp12인 스크리닝용 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 재조합 SARS-CoV nsp12가 도 1의 개열지도를 갖는 발현벡터 pTrcSARSnsp12에 의해 발현되는 것인 스크리닝용 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 상기 재조합 SARS-CoV nsp12가 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것인 스크리닝용 조성물.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NTP가 마커로 표지된 ATP, GTP, CTP 또는 UTP인 스크리닝용 조성물.
  20. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조성물과 후보물질을 접촉시키고, 후보물질이 SARS-CoV nsp12의 RNA 합성을 촉진하는지 또는 저해하는지를 결정하는 것을 포함하는 RdRP 활성 저해제 스크리닝 방법.
  21. 제20항에 있어서, 후보물질이 SARS-CoV nsp12의 RNA 합성을 촉진하는지 또는 저해하는지를 결정시 마커가 표지된 RNA의 합성 여부를 측정하는 것을 포함하는 RdRP 활성 저해제 스크리닝 방법.
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