KR102637692B1 - DEAD-box 단백질 억제제를 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물 - Google Patents

DEAD-box 단백질 억제제를 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DEAD-box 단백질(DDX) 억제제를 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에서 DDX10은 TNF-α 또는 IFN-γ와 같은 사이토카인에 의해 억제되는 것을 확인하여, DDX10이 사이토카인과 관련이 있음을 확인하였다. 또한, 상기 DDX10이 과발현될 경우 B형 간염 바이러스의 복제가 증가하고, DDX10이 억제될 경우 B형 간염 바이러스의 복제가 감소하는 것을 확인함으로써 DDX10이 B형 간염 바이러스의 복제 과정에 필수적인 프로바이러스(proviral) 단백질임을 확인하였다. 이에, DDX10 억제제를 통해 DDX10을 억제함으로써 B형 간염 바이러스를 억제하는 등 상기 DDX10을 B형 간염 치료를 위한 새로운 타겟으로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

DEAD-box 단백질 억제제를 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물 {Antiviral composition against hepatitis B virus comprising inhibitor of DEAD-box protein}
본 발명은 DEAD-Box 단백질 억제제를 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물 등에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)는 세계적인 주요 건강 질환 중 하나로, B형 간염 바이러스 감염은 간경변, 급성 및 만성 간염, 및 원발성 간세포 암(hepatocellular carcinoma, HCC)의 주된 원인이 될 수 있다. 백신이 개발되었음에도 불구하고 3명 중 1명이 B형 간염 바이러스의 위험에 노출 되어있고, 전세계의 약 2억 4천만명에서 3억 5천만명이 감염되어 있다. 이는 무증상 감염, 만성 간염, 간경변, 간세포암으로 이행하는 다양한 임상경과를 보인다. 전체 간세포 암 발생 원인의 53%를 차지하고 있는 B형 간염 바이러스는 특히 아시아에서 높은 감염을 보인다. 아시아 대부분의 국가에서 보균자의 비율이 5~35%에 이른다. B형 간염 바이러스 감염으로 인한 임상 증상과 관련 있는 것으로 숙주 인자, 바이러스 인자 및 환경 인자 등이 있다.
현재 사용되는 만성 간염 치료제로는 면역조절제(immunomodulators)인 인터페론과 뉴클레오시드 유사체(nucleoside analogue)인 라미부딘 등이 있다. 이들 중 지난 십여년간 효과가 인정되었던 인터페론-α는 가격이 비싸며 부작용이 있고, 출생 직후 감염이 문제가 되는 아시아 지역 환자에게는 그 효과가 떨어지는 단점을 지닌다. 또 다른 치료제인 뉴클레오티드 유사체의 경우, 경구 투여할 수 있는 장점을 지니지만, DNA polymerase에 작용하여 바이러스 증식을 억제하기 때문에 비증식형 바이러스에는 직접 작용할 수 없어 체내에서 B형 간염 바이러스를 완전히 제거하기 어렵고, 내성 발생 등의 문제점이 알려져 있다. 이에, 새로운 개념의 항 바이러스제의 개발이 필요한 실정이며, 이를 위해서는 B형 간염 바이러스의 생활사에 대한 분자적 규명이 선행되어야 한다.
B형 간염 바이러스는 Hepadnaviridae과에 속하며 부분 이중 가닥 형태의 3.2kb 원형 DNA 게놈인 rcDNA를 포함한다. B형 간염 바이러스의 수명주기는 광범위하게 연구되었지만, 여전히 B형 간염 바이러스 복제와 관련된 많은 숙주 인자는 완전히 이해되지 않았다.
사이토카인(cytokine)은 B형 간염 바이러스 관련 질병의 면역 병리 발생에서 중심적인 역할을 한다. 사이토카인 중에서도 종양 괴사 인자-알파(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)는 B형 간염 바이러스에 대한 면역 반응을 촉진하는 데 관여하며, 인터페론 감마(Interferon-gamma, IFN-γ)는 항 바이러스 활동에 중요한 역할을 하는 일종의 염증성 사이토카인이다. T 세포는 감염된 세포를 죽이지만 비세포 용해 방식으로 HBV 유전자 발현과 복제를 억제하는 항 바이러스 사이토카인을 분비하여 바이러스를 제어 할 수도 있다. 다른 한편으로, T 세포에 의해 분비되는 종양 괴사 인자(TNF)는 바이러스에 감염된 세포를 죽일 수 있다.
한편, DEAD-box protein(DDX)은 추정 RNA 헬리카제(helicase) 중 하나이며 보존된 모티프 Asp-Glu-Ala-Asp(DEAD)로 구성된다. DEAD box protein은 핵 및 미토콘드리아 RNA 스플라이싱, 번역 개시, 리보솜 및 이어맞추기 복합체(spliceosome) 조립과 같은 RNA 이차 구조의 변형을 포함하여 많은 세포 과정에 관여하는 추정 ATP 의존성 RNA helicase 계열에 속한다. DDX는 새로운 인간 DEAD-box RNA helicase 유전자 중 하나로 염색체 11q22-q23에 위치하며, 일반적으로 리보솜 조립에 참여하는 것으로 알려져 있고, 이전 연구에 따르면 DDX가 종양 발달에 복잡한 역할을 한다는 것을 확인하였다.
그러나, DDX family 중에서도 DDX10과 사이토카인 및 B형 간염 바이러스의 관련성에 대해서는 아직 알려진 바가 없다. 이에, 본 발명자들은 DDX10과 사이토카인 및 B형 간염 바이러스의 관련성을 확인하여 새로운 B형 간염 바이러스 치료의 타겟으로 활용하고자 하였다.
한국공개특허공보 제10-2019-0128999호
본 발명자들은 사이토카인이 B형 간염 바이러스를 억제하고, DDX10은 사이토카인에 의해 억제되는 것을 확인하여, DDX10이 사이토카인과 관련이 있음을 확인하였다. 또한, DDX10을 과발현 및 억제하였을 때 B형 간염 바이러스의 복제를 확인함으로써 DDX10이 B형 간염 바이러스의 복제 과정에 필수적인 프로바이러스(proviral) 단백질임을 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 DDX10(DEAD-box protein 10) 억제제를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물 및 상기 항 바이러스용 조성물을 유효성분으로 포함하는 B형 간염 예방, 치료, 또는 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 DDX10 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스 후보물질의 스크리닝 방법 및 B형 간염 발병 위험도 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 DDX10(DEAD-box protein 10) 억제제를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물로서,
상기 DDX10 억제제는 DDX10 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 mRNA, 및 DDX10 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 발현 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항 바이러스용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항 바이러스용 조성물을 유효성분으로 포함하는, B형 간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 DDX10 억제제는 사이토카인;
DDX10 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 및 RNA 간섭(RNAi); 및
DDX10 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드모사체, 기질유사체, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 사이토카인은 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 또는 인터페론-감마(IFN-γ)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 DDX10 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 DDX10 단백질은 서열번호 2의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 DDX10 억제제는 B형 간염 바이러스의 복제 또는 전사를 저해할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 DDX10 억제제는 세포 내 B형 간염 e 항원(HBeAg) 또는 B형 간염 표면 항원(HBsAg)의 수준을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 DDX10 억제제는 DDX10의 도메인(domain) 중 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 DEAD 도메인을 억제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) In vitro 상에서 DDX10(DEAD-box protein 10)을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포 내에서 DDX10 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 처리 전에 비해 상기 DDX10 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준이 감소된 경우 상기 후보물질을 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스 물질로 선정하는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, B형 간염 발병 위험도 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 시료를 채취하는 단계;
(b) 채취된 시료에서 DDX10(DEAD-box protein 10) 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 DDX10 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가된 경우 B형 간염 발병 위험이 높은 것으로 예측하는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 후보물질은 뉴클레오티드, DNA, RNA, 아미노산, 앱타머, 단백질, 줄기세포, 줄기세포 배양액, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물, 및 천연추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 (b) 단계는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR, quantitative PCR, quantitative real-time PCR), 마이크로어레이(microarray), 서던 블롯팅(southern blotting), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군에서 선택되는 방법을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 DDX10(DEAD-box protein 10) 억제제를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 DDX10(DEAD-box protein 10) 억제제를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물의 B형 간염 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 DDX10(DEAD-box protein 10) 억제제를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물의, B형 간염 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물은 DDX10 억제제를 유효성분으로 포함하는 것으로서, 본 발명에서 상기 DDX10은 TNF-α 또는 IFN-γ와 같은 사이토카인에 의해 억제되는 것을 확인하여, DDX10이 사이토카인과 관련이 있음을 확인하였다. 또한, 상기 DDX10이 과발현될 경우 B형 간염 바이러스의 복제가 증가하고, DDX10이 억제될 경우 B형 간염 바이러스의 복제가 감소하는 것을 확인함으로써 DDX10이 B형 간염 바이러스의 복제 과정에 필수적인 프로바이러스(proviral) 단백질임을 확인하였다. 이에, DDX10 억제제를 통해 DDX10을 억제함으로써 B형 간염 바이러스를 억제하는 등 상기 DDX10을 B형 간염 치료를 위한 새로운 타겟으로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 간종양 세포주에 TNF-α 및 IFN-γ를 처리한 후 실시한 질량 분석법의 분석 절차를 순서대로 나타낸 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 간종양 세포주에 TNF-α 및 IFN-γ를 처리하는 과정의 개략도를 나타낸 도면이다.
도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 간종양 세포주에서 TNF-α 및 IFN-γ 처리에 의한 DDX10 mRNA 수준 감소를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 구현예에 따른 DDX10 과발현 플라스미드를 구축하여 DDX10의 발현을 확인한 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 간종양 세포주에서 DDX10 과발현에 의한 HBV 복제 증가를 확인한 도면이다.
도 3c는 본 발명의 일 구현예에 따른 간종양 세포주에서 DDX10 과발현에 의한 B형 간염 항원(HBeAg 및 HBsAg)의 수준 증가를 확인한 도면이다.
도 4a는 본 발명의 일 구현예에 따른 DDX10을 억제하는 siDDX10을 구축하여 DDX10의 발현을 확인한 도면이다.
도 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 siDDX10 발현에 의한 HBV 복제 감소를 확인한 도면이다.
도 4c는 본 발명의 일 구현예에 따른 siDDX10 발현에 의한 HBeAg 및 HBsAg의 수준 감소를 확인함으로써 HBV 복제 감소 효과를 확인한 도면이다.
도 4d는 본 발명의 일 구현예에 따른 siDDX10 발현에 의한 HBV mRNA 수준 감소를 확인한 도면이다.
도 4e는 본 발명의 일 구현예에 따른 siDDX10 발현에 의한 HBeAg 및 HBsAg의 수준 감소를 확인함으로써 HBV 전사 감소 효과를 확인한 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일 구현예에 따른 DDX10 과발현에 의한 HBV mRNA 수준 증가를 확인한 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일 구현예에 따른 DDX10 과발현에 의한 HBeAg 및 HBsAg의 수준 증가를 확인한 도면이다.
도 6a는 본 발명의 일 구현예에 따른 DDX10 과발현에 의한 HBV 인핸서 활성 증가를 확인한 결과이다.
도 6b는 본 발명의 일 구현예에 따른 DDX10 과발현에 의한 간 세포 핵 인자(HNF) 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 7a는 본 발명의 일 구현예에 따른 DDX10의 각 도메인 제거 돌연변이 모식도를 나타낸 것이다.
도 7b는 본 발명의 일 구현예에 따른 DDX10의 각 도메인 제거 돌연변이들이 HBV의 복제에 미치는 영향을 확인한 결과이다.
본 발명은 DDX10(DEAD-box protein 10) 억제제를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물로서,
상기 DDX10 억제제는 DDX10 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 mRNA, 및 DDX10 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 발현 또는 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항 바이러스용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “항바이러스”란 체내에서 바이러스의 증식을 억제하여 체내에 침입한 바이러스의 작용을 약하게 하거나 소멸하게 하는 것을 의미하며, 보다 상세하게는 바이러스의 핵산 합성과정, 유전자 발현 과정, 또는 바이러스 복제 과정 등을 저해함으로써 바이러스의 증식을 억제하는 것을 의미하며, 본 발명에서는 B형 간염 바이러스를 대상으로 한다.
본 발명에 있어서, “DDX10(DEAD-box protein 10)”은 ATP-의존성 추정 RNA helicase로, 본 발명에 따른 DDX는 슈퍼패밀리(superfaily, SF) 2 헬리카제(helicase)의 가장 큰 패밀리로서, 다른 SF2 단백질과 2개의 RecA-유사 도메인 및 공통서열 모티프 세트로 구성된 헬리카제 코어를 공유한다. DEAD-box 단백질은 ATPase 및 헬리카제 활성 및 이들의 조절에 관여하는 것으로 나타난 9개의 보존된 모티프가 존재하며, 모티프 Ⅱ에는 이름의 유래인 Asp(D)-Glu(E)-Ala(A)-Asp(D) 서열이 포함된다.
본 발명에 있어서, “DDX10 억제제”란 DDX10 단백질을 코딩하는 유전자의 복제, 상기 유전자의 mRNA로의 전사, 및 DDX10 단백질의 활성(기능) 저하를 야기하는 물질을 모두 포함하는 의미로 사용되며, 예컨대 상기 DDX10 억제제는 사이토카인; DDX10 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로RNA(miRNA), 및 RNA 간섭(RNAi); 및 DDX10 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩타이드, 펩타이드모사체, 기질유사체, 앱타머, 및 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 있어서, 상기 DDX10 단백질을 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA, miRNA, 및 RNAi 등에서 우라실(U) 염기와 티민(T) 염기는 서로 호환될 수 있다.
본 발명에 있어서, “도메인(domain)”이란 하나 이상의 동정 가능한 구조적 또는 기능적 특징 또는 특성(예를 들면, 결합능, 단백질-단백질 상호작용을 위한 부위로서의 기능)을 갖는 폴리펩타이드의 모티프를 지칭한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 개별 작용특성을 담당하고, 많은 경우에 나머지 단백질 및/또는 도메인의 작용 손실 없이 다른 단백질에 첨가, 제거 또는 전이될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 DDX10 억제제는 DDX10의 도메인(domain) 중 하나 이상을 억제할 수 있으며, 예컨대 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 도메인 1(domain 1), 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 DEAD 도메인(DEAD domain), 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 헬리카제 도메인(helicase domain), 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 도메인 2(domain 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 도메인을 억제할 수 있다. 이때, 상기 도메인 1은 서열번호 7의 염기서열, DEAD 도메인은 서열번호 9의 염기서열, 헬리카제 도메인은 서열번호 11의 염기서열, 도메인 2는 서열번호 13의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실험예에 따르면 DDX10의 도메인 중 DEAD 도메인을 억제할 경우 DDX10의 복제가 억제될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DDX10 억제제는 DDX10의 도메인을 억제하는 경우라면 DDX10의 도메인과 도메인 사이에 존재하는 염기 서열의 결실, 삽입, 또는 치환에 상관없이 DDX10을 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 사이토카인은 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 또는 인터페론-감마(IFN-γ)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 DDX10 단백질은 서열번호 1(NCBI reference sequence NP_004389.2)의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 서열번호 2(NCBI reference sequence NM_004398.4)의 염기서열에 의해 암호화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실험예에서는 간종양 세포주에 TNF-α 및 IFN-γ를 처리하였을 때 DDX10 mRNA 수준이 감소되는 것을 확인하였다(실험예 2 참조).
본 발명의 다른 실험예에서는 DDX10의 과발현에 의해 B형 간염 바이러스의 복제(실험예 3 참조) 및 전사(실험예 5 참조)가 증가되고 간 세포 핵 인자(HNF) 발현이 증가되는 것을 확인하였으며(실험예 6 참조), DDX10을 억제시킬 경우 세포 내 B형 간염 e 항원(HBeAg) 또는 B형 간염 표면 항원(HBsAg)의 수준이 감소되는 등 B형 간염 바이러스의 복제 및 전사가 감소되는 것을 확인하였다(실험예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서는 DDX10의 각 도메인이 없는 돌연변이 중 DEAD 도메인이 없는 돌연변이에서 바이러스의 복제가 억제되는 것을 관찰하여, DDX10의 DEAD 도메인이 proviral 기능에 중요한 역할을 하는 것을 확인하였다(실험예 7 참조).
또한, 본 발명은 상기 항 바이러스용 조성물을 유효성분으로 포함하는, B형 간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 항 바이러스용 조성물을 유효성분으로 포함하는, B형 간염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서 “예방”이란 B형 간염의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 B형 간염과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 B형 간염과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제 (TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명의 DDX10 억제제를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 항 바이러스용 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 항 바이러스용 조성물은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) In vitro 상에서 DDX10(DEAD-box protein 10)을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 세포 내에서 DDX10 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 후보물질 처리 전에 비해 상기 DDX10 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준이 감소된 경우 상기 후보물질을 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스 물질로 선정하는 단계.
본 발명에 있어서, “후보물질”은 DDX10의 발현 증감을 측정하기 위하여 스크리닝에서 사용되는 미지의 물질을 의미하며, 뉴클레오티드, DNA, RNA, 아미노산, 앱타머, 단백질, 줄기세포, 줄기세포 배양액, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물, 및 천연추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, B형 간염 발병 위험도 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다:
(a) 피검체로부터 시료를 채취하는 단계;
(b) 채취된 시료에서 DDX10(DEAD-box protein 10) 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 상기 DDX10 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가된 경우 B형 간염 발병 위험이 높은 것으로 예측하는 단계.
또한, 본 발명은 DDX10(DEAD-box protein 10) 억제제를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, B형 간염의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 DDX10(DEAD-box protein 10) 억제제를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물의 B형 간염 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 DDX10(DEAD-box protein 10) 억제제를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물의, B형 간염 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명에 있어서, “개체” 또는 “피검체”는 B형 간염 발병 위험도를 예측 또는 치료 하기 위한 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, “시료”는 발병 위험도를 예측하고자 하는 피검체로부터 채취된 것이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 각종 분비물, 소변, 대변 등일 수 있다. 상기 시료는 검출 또는 진단에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 균질화(homogenization), 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, “측정” 또는 “검출”은 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재 및 부존재의 측정 또는 검출, 및 복제량 또는 발현량의 측정 또는 검출을 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어서, “발현”은 폴리펩티드(polypeptide)가 구조 유전자로부터 생산 되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 유전자의 mRNA로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩티드(들)로의 해독을 포함한다.
본 발명의 스크리닝 방법 또는 발병 위험도 예측을 위한 정보제공방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR, quantitative PCR, quantitative real-time PCR), 마이크로어레이(microarray), 서던 블롯팅(southern blotting), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군에서 선택되는 방법을 이용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 세포주 및 세포 배양 조건
인간 간암 세포주(HepG2 및 Huh7)를 사용하여 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지에서 유지하였으며, 배지를 1 %의 페니실린-스트렙토마이신(Gibco; BRL, 미국) 및 10 %의 열 불활성화된 소 태아 혈청(Capricorn)과 혼합하였다. 세포는 습도가 높은 환경의 37 ℃에서 5 % CO₂를 유지하는 배양기에서 배양하였다.
실시예 2. 플라스미드 구조
HBV 1.2mer의 구조는 이전 문헌을 참고하였다(Ahn, S. H., Park, Y. K. and Kim, K. (2015). BIO-PROTOCOL 5(8):e1449). 주형으로 Huh7의 cDNA 라이브러리를 사용하여 PCR을 수행하였으며, DDX10 유전자에 대한 forward primer - ccggaattcggggcaaaacgg(서열번호 3) 및 reverse primer - cggggtaccttagctttgacttcttag(서열번호 4)를 사용하였다. 그런 다음, DDX10 유전자의 PCR 산물을 얻어서 pCMV-myc 벡터(Clone tech, CA, 미국)에 삽입하여 Myc-DDX10 플라스미드를 서브클론 하였다.
실시예 3. 세포 형질감염
Huh7 및 HepG2 세포를 80 %의 융합으로 6 웰 또는 12 웰(Sigma-aldrich)과 같은 플레이트에 접종하고 24 시간 후, 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 사용하여 세포를 공동 형질 감염시켰다. 형질감염 72 시간 후, 세포를 채취하였으며, 병용 처리를 위해 사용된 사이토카인 농도는 TNF-α 0.02 μg/ml 및 IFN-γ 500 U/ml이었다.
실시예 4. LC-MS/MS 분석 및 단백질 프로파일링
MS/MS 스펙트럼은 서열 역방향 유인(decoy) 데이터베이스인 IPI 인간 단백질(버전 3.87,91,491 항목 포함)에 대해 BioworkdBrowser rev.3.1의 SEQUEST를 사용하여 조사하였다. 2 개의 절단된 절단 부위가 허용될 때 완전한 트립신 특이성이 요구되었으며, 전구체 이온 및 단편 이온에 대한 질량 허용 오차는 각각 10ppm 및 0.8Da로 지정되었다.
실시예 5. 생물 정보학 도구에 의한 프로 바이러스 유전자의 선택
펩타이드 검증에서 얻은 단백질 폴드(fold) 변화 데이터를 사용하여 Ingenuity 소프트웨어(Qiagen GmbH, Hilden, 독일)를 통해 경로 분석을 수행하였다. 사용된 래퍼런스(reference) 세트는 독창성 지식 기반(유전자+내인성 화학 물질)이며 기준 옵션을 포함하는 것은 직간접적이고, 필터링 설정은 오직 분자 및 분자 관계만을 고려하였다. 종(species) 설정은 인간으로 하였으며, 다양한 결과 중 가장 높은 질병 및 생체 기능이 선택되었다.
실시예 6. 실시간 정량적 PCR(real-time quantitative PCR)
사이토카인으로 처리된 Huh7 세포는 제조업체의 지침에 따라 트리졸(trizol) 시약(Sigma)으로 용해시켰다. 2 μg의 RNA를 사용하였으며, RNA의 순도는 A260/280 비율로 확인되었다. 추출된 총 RNA는 High-capacity RNA-to-cDNA 키트(Thermo fisher science)를 이용하여 역전사 반응에 사용하였으며, cDNA의 합성은 PCR 열순환기(thermocycler)에서 수행하였다.
실시간 정량적 PCR 증폭은 SYBR Green PCR master mix(Applied Biosystems)를 사용하여 QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System 기계에서 수행하였으며, 상대적 정량화 결과는 비교적인 ΔΔCt 방법으로 평가하였다. 결과는 교정기(calibrator)에 대해 n 배 차이로 측정되었다(RQ = 2-ΔΔCt).
실시예 7. 웨스턴 블롯팅
채취된 세포를 RIPA 버퍼(buffer)[150 mM NaCl, 20 mM Tris/HCl, 100X 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail)(Thermo Scientific), 1 % NP-40, 2 mM KCl, pH 7.4]로 용해시켰다. 그런 다음, 13000 RPM에서 20 분 동안 원심분리 한 후 상층액을 제거하였다. 상기 상층액을 제거한 샘플을 4X SDS 샘플 버퍼(Laemmli 샘플 버퍼, Life Science)와 혼합하고 95 ℃에서 3 분 동안 끓였다. 추출된 단백질을 80 V에서 2 시간 동안 SDS-PAGE로 분리하고, 미니 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride, PVDF) 멤브레인(Trans-Blot Turbo)으로 옮겼다. 상기 멤브레인(membrane)을 TBS-T(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 % Tween 20)로 세척 하고, 멤브레인을 블로킹하기 위해 5 %의 스킴밀크(skim milk) 버퍼를 사용하였다. 1 차 항체는 TBS-T와 1 : 2000의 비율로 혼합하여 사용하였으며, 상기 항체로 항 DDX(proteintech), 항 HNF4α(Santa cruz California, 미국), 항 HNF1α(Santa cruz), 항 HNF3β(Santa cruz)를 사용하였다.
실시예 8. ELISA
세포 내 B형 간염 e 항원(HBeAg) 및 B형 간염 표면 항원(HBsAg)의 수준은 제조업체의 지침에 따라 ELISA 키트(Wantai, Beijing, 중국)로 평가되었다. HBeAg 수준은 1 : 5 비율로 희석되었고 HBsAg 수준은 1 : 25 비율로 희석되었다. 흡광도 값은 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 450nm에서 측정되었다.
실시예 9. 서던 블롯팅
형질 감염 3 일 후, 세포를 채취하였다. 채취된 세포는 PBS 버퍼로 헹구고 HEPES 버퍼 100μl로 용해시켰으며, 용해물을 PEG 버퍼로 원심분리 하여 코어 캡시드(core capsid)를 침전시켰다. 그 후 코어 캡시드를 SDS 버퍼에 함유된 프로테나아제(proteinase) K로 37 ℃에서 3 시간 동안 분해하였다. 총 DNA는 1 % 아가로스(agarose) 겔 상에서 90 V로 3 시간 동안 전기 영동을 사용하여 분리하고 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 멤브레인(GE Healthcare)으로 옮겼다. 그런 다음, 디곡시게닌(digoxigenin, DIG) 표지된 DNA 프로브와 혼성화하고 DIG 검출 키트(Sigma-aldrich)로 검출하였다.
실시예 10. 노던 블롯팅
형질 감염 72 시간 후, 세포를 트리졸 시약으로 용해하고 15 μg의 RNA를 사용하였으며, 총 RNA는 겔에서 분리되었다. 겔 농도는 1X MOPS 버퍼(Biosesang) 내 1.5 % 포름알데히드-아가로스이며, 이를 양전하를 띠는 나일론 멤브레인(Sigma-aldrich)으로 옮기고, 멤브레인을 프로브로 혼성화하였다. 프로브는 디곡시게닌(digoxigenin, DIG) 표지된 RNA 프로브를 사용하였으며, 제조업체 설명서에 따라 DIG 검출 키트(Roche Diagnotics, Indianapolis, IN)로 검출하였다. 로딩 대조군, 28S 및 18S rRNA는 아가로스 겔에서 분리되었다.
실시예 11. 인핸서 루시퍼라제 분석
HBV 인핸서 영역을 포함하는 루시퍼라제(luciferase) 리포터 플라스미드를 구축하였으며, 상기 리포터들의 활성은 다음과 같이 평가되었다:
대략적으로 융합 70 %에서 세포를 6-웰 플레이트에 분주하고, 24 시간 후 세포를 형질 감염시켰다. 형질 감염된 플라스미드 혼합물은 0.5 μg, 1 μg DDX, 0.5 μg 베타-갈락토시다아제(β-gal) 및 0.5 μg 인핸서(enhancer)-루시퍼라제(pEnhI.II)를 함유하고 있다. 형질 감염 48 시간 후, 세포를 채취하였으며, 채취된 세포를 5X 세포 용해 완충액(Promega)으로 용해시켰다. 그런 다음, 상층액을 사용하여 루시퍼라제 활성을 평가하였다. Steady Glo-Luciferase 시스템(Promega, Madison, WI)을 사용하였으며, 데이터 결과는 적어도 세 번의 독립적인 실험을 반복하여 얻었다.
[실험예]
실험예 1. 질량 분석법의 실험 절차
사이토카인은 간세포 암종(HCC) 및 간경변과 같은 B형 간염 바이러스(HBV)와 관련된 병인에서 중추적 인자로 작용한다. 종양괴사인자-알파(TNF-α)를 생성하는 HBV 특이적 CTL(cytotoxic T cell)은 전염증성 사이토카인으로서, HBV에 감염된 간세포를 죽이는데 작용할 수 있다. IFN-γ는 주로 항 바이러스 T 세포의 중심 분자로 알려져 있지만, 활성화 유도된 T 세포 사멸의 유도, 항 종양 T 세포 아폽토시스(apoptosis) 및 조절 T 세포 생성과 같은 면역 조절 기능을 담당할 수도 있다.
Huh7 간종양 세포주는 TNF-α 및 인터페론-감마(IFN-γ)로 처리하고 3 일 후에 채취하였다. 반면, 대조군은 pcDNA로 형질 감염시켰다. 이후 세포 용해물을 RIPA 버퍼로 용해하여 단백질을 추출하였으며, 세포 용해물을 SDS-PAGE 겔에서 전기영동하고 Cod Blue 시약으로 염색한 다음 10 개로 분획하였다. 분획화된 겔을 트립신을 이용하여 겔 내 분해로 분해하고 포름산으로 추출하였다. 이 추출된 펩타이드로 LC-MS/MS(액체 크로마토그래피-질량 분석) 분석을 수행하였다. 상기 실험 절차는 도 1에 나타내었다.
또한, 하기 표 1에는 사이토카인에 의해 억제된 바이러스 감염 관련 19개의 분자를 나열하였다. 적절한 스크리닝 과정을 거친 후 이들 중 DEAD-box protein 10(DDX10)을 선택하였다.
실험예 2. 사이토카인에 의한 DDX10 발현 감소 확인
사이토카인과 DDX10의 상호 작용을 조사하기 위해, 도 2a에 나타낸 바와 같이 먼저 Huh7을 pcDNA로 형질 감염시키고, 형질 감염 후 사이토카인(TNF-α 및 IFN-γ)을 처리하였다. 그런 다음 실시간 PCR을 통해 mRNA 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 TNF-α 및 IFN-γ 의 처리 시간이 증가함에 따라 DDX10의 mRNA 수준은 시간 의존적으로 감소하였다.
결과적으로 TNF-α 및 IFN-γ 는 DDX10 발현을 감소시키는 것을 알 수 있었다.
실험예 3. DDX10의 과발현에 따른 HBV 복제 증가 확인
사이토카인이 HBV를 억제한다는 것은 이미 잘 알려져 있으며, 도 2b에서 사이토카인은 DDX10 발현을 억제하는 것을 확인하였다. DDX10이 HBV의 프로바이러스 단백질로 작용할 것이라는 가정 하에 myc 태그된 DDX10 플라스미드를 구축하고, 도 3a에 나타낸 바와 같이 DDX10 플라스미드 발현 테스트를 수행하여 발현이 잘 되었는지 확인하였다.
HepG2 및 Huh7 간종양 세포주에서 각각 DDX10 및 HBV 1.2mer의 공동 형질 감염 후, 서던 블롯팅을 실시한 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 DDX10의 발현이 증가함에 따라 HBV의 복제가 증가하였다.
또한, HBeAg 및 HBsAg 수준을 ELISA로 측정한 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이 서던 블롯팅 결과와 일치하여 DDX10의 발현이 증가함에 따라 HBeAg 및 HBsAg의 양이 증가하였다.
결과적으로 DDX10은 HBV 복제를 향상시키는 것을 알 수 있었다.
실험예 4. DDX10의 침묵에 의한 HBV 복제 하향 조절
HBV의 복제에 DDX10이 필요한지 여부를 확인하기 위해 siDDX10(TGCAGAACTATGAAAAGATAAAT, 서열번호 5)을 구축하고, 도 4a에 나타낸 바와 같이 실시간 PCR을 수행하여 siDDX10 발현에 따른 DDX10 발현을 확인하였다.
이후 HepG2 및 Huh7에서 HBV 1.2mer로 공동 형질 감염시키고 서던 블롯팅을 실시한 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 siDDX10 발현에 의해 HBV DNA의 양이 현저하게 감소하였으며, 도 4c에 나타낸 ELISA 분석 결과도 서던 블롯팅 결과와 동일하게 siDDX10 발현에 의해 HBsAg 및 HBeAg 수준이 감소하는 것을 확인하였다.
또한, DDX10의 녹다운(knockdown)이 HBV 전사에 영향을 미치는지 여부를 알기 위해 노던 블롯팅을 수행한 결과, 도 4d에 나타낸 바와 같이 DDX10의 침묵은 HBV 전사를 감소시켰으며, 도 4e에 나타낸 HBsAg 및 HBeAg에 대한 ELISA 분석 결과도 이와 일치하는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, HBV의 복제 및 전사에 DDX10이 관여하는 것을 알 수 있었다.
실험예 5. DDX10의 과발현에 따른 HBV 전사 증가 확인
DDX10이 HBV의 전사에 관여하는지 여부를 확인하기 위해, HBV RNA를 DDX10의 과발현 후 노던 블롯팅으로 확인하였다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 DDX10의 양이 증가함에 따라 HBV RNA 발현도 증가하였으며, ELISA를 통해 HBeAg 및 HBsAg 수준을 확인한 결과 도 5b에 나타낸 바와 같이 상기 HBeAg 및 HBsAg의 수준이 증가하는 것을 확인하였다.
이에, DDX10은 HBV의 전사를 촉진하는 것을 알 수 있었다.
실험예 6. 간 세포 핵 인자에 대한 DDX10의 효과
도 5a에서는 DDX10이 HBV의 전사를 증가시켰음을 확인하였다. 간 세포 핵 인자(hepatocyte nuclear factor, HNF)는 HBV 프로모터에 결합할 수 있으므로 HBV의 전사에 중요한 조절 역할을 한다. HNF 중 HNF1α는 간 포도당 및 아미노산, 분화 및 정상 구조 유지, 간 발달 사이의 균형을 조절하는 주요 조절 인자이며, HNF4α는 간 세포 핵 인자의 중심 조절자 중 하나로, 세 가지 다른 핵 수용체에 결합하여 HBV 관련 유전자 발현 수준과 복제를 제어한다. 이러한 수용체는 HBV 게놈, 인핸서 II(Enh II) 및 인핸서 I(Enh I)의 프리-코어 영역에 위치한다.
이에, 루시퍼라제 태그된 인핸서(Ⅰ+Ⅱ)를 구축하고 DDX10으로 형질 감염시켰다. 그런 다음, DDX10이 HBV 인핸서에 어떤 영향을 미치는지 확인한 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 인핸서 활성은 DDX10 증가와 함께 약간 증가하였다.
또한, 웨스턴 블롯팅을 통해 DDX10이 과발현되었을 때 간 세포 핵 인자(HNF) 발현을 확인한 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이 DDX10 과발현에 의해 HNF 발현이 증가되는 것을 확인하여, HBV의 HNF가 HBV 인핸서 활성을 증가시키는데 관여하는 것을 확인하였다. HNF 중 프로바이러스 인자인 HNF4α 및 HNF1α의 발현은 약간 증가하였고 항 바이러스 인자인 HNF3β의 발현은 일정하였다.
이러한 결과로부터, DDX10이 HBV 전사 인자의 양을 증가시킴으로써 HBV 복제를 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.
실험예 7. DDX10의 HBV 복제 증가에 관계된 도메인 확인
DDX10이 HBV의 프로바이러스 단백질로 작용하기 때문에 이 단백질의 어느 도메인이 해당 역할을 하는지를 알기 위하여 도 7a에 나타낸 바와 같이 DDX10의 각 도메인이 없는 돌연변이 플라스미드를 제작하였다.
Huh7 간종양 세포주에서 각각 DDX10 및 제작한 돌연변이 DDX10을 HBV 1.2mer와 공동 형질 감염 후, 서던 블롯팅을 실시한 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이 DDX10의 DEAD 도메인이 없는 경우 바이러스 복제증진 효과가 감소한 것으로 보아 DDX10의 DEAD 도메인이 proviral 기능에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> RESEARCH & BUSINESS FOUNDATION SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Antiviral composition against hepatitis B virus comprising inhibitor of DEAD-box protein <130> MP20-184 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 875 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DDX10 <400> 1 Met Gly Lys Thr Ala Asn Ser Pro Gly Ser Gly Ala Arg Pro Asp Pro 1 5 10 15 Val Arg Ser Phe Asn Arg Trp Lys Lys Lys His Ser His Arg Gln Asn 20 25 30 Lys Lys Lys Gln Leu Arg Lys Gln Leu Lys Lys Pro Glu Trp Gln Val 35 40 45 Glu Arg Glu Ser Ile Ser Arg Leu Met Gln Asn Tyr Glu Lys Ile Asn 50 55 60 Val Asn Glu Ile Thr Arg Phe Ser Asp Phe Pro Leu Ser Lys Lys Thr 65 70 75 80 Leu Lys Gly Leu Gln Glu Ala Gln Tyr Arg Leu Val Thr Glu Ile Gln 85 90 95 Lys Gln Thr Ile Gly Leu Ala Leu Gln Gly Lys Asp Val Leu Gly Ala 100 105 110 Ala Lys Thr Gly Ser Gly Lys Thr Leu Ala Phe Leu Val Pro Val Leu 115 120 125 Glu Ala Leu Tyr Arg Leu Gln Trp Thr Ser Thr Asp Gly Leu Gly Val 130 135 140 Leu Ile Ile Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Tyr Gln Thr Phe Glu Val 145 150 155 160 Leu Arg Lys Val Gly Lys Asn His Asp Phe Ser Ala Gly Leu Ile Ile 165 170 175 Gly Gly Lys Asp Leu Lys His Glu Ala Glu Arg Ile Asn Asn Ile Asn 180 185 190 Ile Leu Val Cys Thr Pro Gly Arg Leu Leu Gln His Met Asp Glu Thr 195 200 205 Val Ser Phe His Ala Thr Asp Leu Gln Met Leu Val Leu Asp Glu Ala 210 215 220 Asp Arg Ile Leu Asp Met Gly Phe Ala Asp Thr Met Asn Ala Val Ile 225 230 235 240 Glu Asn Leu Pro Lys Lys Arg Gln Thr Leu Leu Phe Ser Ala Thr Gln 245 250 255 Thr Lys Ser Val Lys Asp Leu Ala Arg Leu Ser Leu Lys Asn Pro Glu 260 265 270 Tyr Val Trp Val His Glu Lys Ala Lys Tyr Ser Thr Pro Ala Thr Leu 275 280 285 Glu Gln Asn Tyr Ile Val Cys Glu Leu Gln Gln Lys Ile Ser Val Leu 290 295 300 Tyr Ser Phe Leu Arg Ser His Leu Lys Lys Lys Ser Ile Val Phe Phe 305 310 315 320 Ser Ser Cys Lys Glu Val Gln Tyr Leu Tyr Arg Val Phe Cys Arg Leu 325 330 335 Arg Pro Gly Val Ser Ile Leu Ala Leu His Gly Arg Gln Gln Gln Met 340 345 350 Arg Arg Met Glu Val Tyr Asn Glu Phe Val Arg Lys Arg Ala Ala Val 355 360 365 Leu Phe Ala Thr Asp Ile Ala Ala Arg Gly Leu Asp Phe Pro Ala Val 370 375 380 Asn Trp Val Leu Gln Phe Asp Cys Pro Glu Asp Ala Asn Thr Tyr Ile 385 390 395 400 His Arg Ala Gly Arg Thr Ala Arg Tyr Lys Glu Asp Gly Glu Ala Leu 405 410 415 Leu Ile Leu Leu Pro Ser Glu Lys Ala Met Val Gln Gln Leu Leu Gln 420 425 430 Lys Lys Val Pro Val Lys Glu Ile Lys Ile Asn Pro Glu Lys Leu Ile 435 440 445 Asp Val Gln Lys Lys Leu Glu Ser Ile Leu Ala Gln Asp Gln Asp Leu 450 455 460 Lys Glu Arg Ala Gln Arg Cys Phe Val Ser Tyr Val Arg Ser Val Tyr 465 470 475 480 Leu Met Lys Asp Lys Glu Val Phe Asp Val Ser Lys Leu Pro Ile Pro 485 490 495 Glu Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Leu Ala Val Ala Pro Arg Val Arg Phe 500 505 510 Leu Gln Lys Met Gln Lys Gln Pro Thr Lys Glu Leu Val Arg Ser Gln 515 520 525 Ala Asp Lys Val Ile Glu Pro Arg Ala Pro Ser Leu Thr Asn Asp Glu 530 535 540 Val Glu Glu Phe Arg Ala Tyr Phe Asn Glu Lys Met Ser Ile Leu Gln 545 550 555 560 Lys Gly Gly Lys Arg Leu Glu Gly Thr Glu His Arg Gln Asp Asn Asp 565 570 575 Thr Gly Asn Glu Glu Gln Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu Met 580 585 590 Glu Glu Lys Leu Ala Lys Ala Lys Gly Ser Gln Ala Pro Ser Leu Pro 595 600 605 Asn Thr Ser Glu Ala Gln Lys Ile Lys Glu Val Pro Thr Gln Phe Leu 610 615 620 Asp Arg Asp Glu Glu Glu Glu Asp Ala Asp Phe Leu Lys Val Lys Arg 625 630 635 640 His Asn Val Phe Gly Leu Asp Leu Lys Asp Glu Lys Thr Leu Gln Lys 645 650 655 Lys Glu Pro Ser Lys Ser Ser Ile Lys Lys Lys Met Thr Lys Val Ala 660 665 670 Glu Ala Lys Lys Val Met Lys Arg Asn Phe Lys Val Asn Lys Lys Ile 675 680 685 Thr Phe Thr Asp Glu Gly Glu Leu Val Gln Gln Trp Pro Gln Met Gln 690 695 700 Lys Ser Ala Ile Lys Asp Ala Glu Glu Asp Asp Asp Thr Gly Gly Ile 705 710 715 720 Asn Leu His Lys Ala Lys Glu Arg Leu Gln Glu Glu Asp Lys Phe Asp 725 730 735 Lys Glu Glu Tyr Arg Lys Lys Ile Lys Ala Lys His Arg Glu Lys Arg 740 745 750 Leu Lys Glu Arg Glu Ala Arg Arg Glu Ala Asn Lys Arg Gln Ala Lys 755 760 765 Ala Lys Asp Glu Glu Glu Ala Phe Leu Asp Trp Ser Asp Asp Asp Asp 770 775 780 Asp Asp Asp Asp Gly Phe Asp Pro Ser Thr Leu Pro Asp Pro Asp Lys 785 790 795 800 Tyr Arg Ser Ser Glu Asp Ser Asp Ser Glu Asp Met Glu Asn Lys Ile 805 810 815 Ser Asp Thr Lys Lys Lys Gln Gly Met Lys Lys Arg Ser Asn Ser Glu 820 825 830 Val Glu Asp Val Gly Pro Thr Ser His Asn Arg Lys Lys Ala Arg Trp 835 840 845 Asp Thr Leu Glu Pro Leu Asp Thr Gly Leu Ser Leu Ala Glu Asp Glu 850 855 860 Glu Leu Val Leu His Leu Leu Arg Ser Gln Ser 865 870 875 <210> 2 <211> 3217 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DDX10 <400> 2 gcgtttgtcc catgctggtt ccgtgagtct ggccttaggt gtctcgtgtc tggggttgat 60 ccgagctgtc gccgccgccg ccgcaatggg caaaacggcc aactctccgg gttcgggagc 120 ccgacccgac ccggtgcgga gcttcaatcg ctggaagaaa aaacacagcc ataggcagaa 180 caaaaagaag cagttgagga agcaactgaa gaaacccgaa tggcaggtcg agcgcgagag 240 tatcagccgc ctcatgcaga actatgaaaa gataaatgta aatgaaatca caagattttc 300 agattttccc ttgtccaaaa aaacattgaa aggtttgcaa gaagctcagt accgtttggt 360 gactgagata cagaagcaga ccattggatt ggctttgcaa ggtaaagatg tacttggagc 420 ggccaaaact ggatctggca agactctggc ttttcttgtt ccagtgctgg aagccttata 480 tcgtctgcaa tggacttcaa cagatgggct gggggttctc ataatatcac ctacgagaga 540 actggcctat cagacctttg aggttctccg aaaagtagga aagaatcatg acttctcagc 600 tggtctcatc attggtggaa aggatctaaa acacgaagct gagaggatca acaacataaa 660 tatactcgtg tgcacaccag gtcggcttct tcaacacatg gatgaaacag tatcttttca 720 tgctaccgac ctccaaatgt tagttcttga tgaagcagat agaatcttgg atatgggctt 780 tgctgatacc atgaatgctg ttattgaaaa tctccccaag aaacgtcaga ctttactttt 840 ctcagcaaca caaactaaat ctgtaaagga ccttgcacgc ttgagtttga aaaaccctga 900 gtatgtctgg gttcatgaaa aagcaaaata tagcacccct gccactttgg aacagaacta 960 catagtctgt gagctgcagc aaaaaataag tgtgctgtat tcctttttga gaagccatct 1020 gaagaagaag agcattgtat ttttttccag ttgcaaagag gtccagtatc tgtaccgagt 1080 gttttgccgg ctacgtcctg gtgtttctat ccttgcactc catggtcgac agcagcaaat 1140 gagaagaatg gaagtctata atgagtttgt ccgtaagaga gctgcagtac tctttgctac 1200 tgatattgca gccaggggtc tggatttccc ggccgtgaat tgggttcttc agtttgattg 1260 tcctgaggat gccaacacat atattcacag agcaggtaga actgccaggt acaaagagga 1320 tggtgaagct ttgctaattt tgctaccctc agaaaaagct atggtgcagc agcttcttca 1380 gaagaaagta cctgtgaagg aaatcaaaat caatccagaa aaacttatag atgtccagaa 1440 aaaattggaa tctattttag ctcaagatca agatttaaaa gaaagagctc aaaggtgttt 1500 cgtctcctat gtacgatctg tatatctgat gaaggataaa gaagtatttg atgtgagcaa 1560 gttacctata cctgaatatg ccctgtctct tggtcttgct gtggcaccac gcgtaagatt 1620 tcttcagaaa atgcagaaac aacccaccaa agaattggta aggagccaag ccgataaagt 1680 aattgagcca agggctccct ccctcaccaa tgacgaagtg gaagaattta gagcctactt 1740 caatgagaaa atgtccatcc ttcaaaaagg tggaaaaaga ctcgaaggga cagagcacag 1800 acaggataat gatactggta atgaagaaca ggaagaagaa gaagacgatg aagaagaaat 1860 ggaagagaaa ctggcaaaag caaaaggatc tcaagcccca tctcttccta acaccagtga 1920 ggcacagaag atcaaggaag ttcctacaca gttcttggac agagatgagg aggaagaaga 1980 tgctgatttc ttgaaggtga agcggcataa tgtgtttgga ttggacctta aagacgagaa 2040 aacattacag aagaaagaac cttctaaatc cagcatcaag aaaaaaatga ccaaagttgc 2100 agaagcaaaa aaagtaatga agagaaattt taaagtgaat aagaagataa catttactga 2160 tgaaggggag ttggttcagc agtggccaca aatgcagaaa tctgccatca aggatgctga 2220 ggaagatgat gacacaggtg gtatcaactt acataaagca aaggaaagac ttcaggaaga 2280 ggacaaattt gacaaagaag aatataggaa aaaaattaag gcaaagcatc gggagaaaag 2340 actgaaagaa agggaagcca gaagagaagc caacaagaga caagcaaagg ccaaagatga 2400 agaggaagcc tttctggatt ggagtgatga tgatgatgat gatgatgatg gatttgatcc 2460 aagcacactc ccagatccag ataaatacag aagctctgaa gattcagata gtgaagatat 2520 ggaaaataaa ataagtgata ccaagaagaa gcaggggatg aagaagagga gcaacagtga 2580 agtggaagac gtgggaccaa caagtcataa cagaaagaag gccaggtggg acactttaga 2640 gcctttggat accggcctgt ctttagcaga ggatgaagag ctggtgttac atctgctaag 2700 aagtcaaagc taaatacttc ctgcgcctgc cttctccttg aaaccttggt tatgactgcg 2760 taggcaagaa gttgaaaaac agttgatttg ggggcactta ggtaccatat gccccattcc 2820 caaagggcac atttctggat agaagcgatc gtatctccaa gtccctctca caggacatgc 2880 tttgtgccat cactgagcat actcagatcg agggtggatg ataccatttc ctgaccccgt 2940 tttccagcat gtgttctgtt agatttttat ccatgggttc ctacgccttg tcattggaaa 3000 cactgccttt gtcttactgg caagttctgg agctcttgtg tcattgttag aaatccctgt 3060 cttgcttact gtacagaagt ttctgttgct gttaaaattg ctcatgattt cgacgtattt 3120 aatattttca aagagactat gatggaccag ccctgagaaa gaatgagtat ttttgaattg 3180 agatgatcaa taataaacat atttcctata aaagaaa 3217 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DDX10 forward primer <400> 3 ccggaattcg gggcaaaacg g 21 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DDX10 reverse primer <400> 4 cggggtacct tagctttgac ttcttag 27 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siDDX10 <400> 5 tgcagaacta tgaaaagata aat 23 <210> 6 <211> 92 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> domain 1 <400> 6 Met Gly Lys Thr Ala Asn Ser Pro Gly Ser Gly Ala Arg Pro Asp Pro 1 5 10 15 Val Arg Ser Phe Asn Arg Trp Lys Lys Lys His Ser His Arg Gln Asn 20 25 30 Lys Lys Lys Gln Leu Arg Lys Gln Leu Lys Lys Pro Glu Trp Gln Val 35 40 45 Glu Arg Glu Ser Ile Ser Arg Leu Met Gln Asn Tyr Glu Lys Ile Asn 50 55 60 Val Asn Glu Ile Thr Arg Phe Ser Asp Phe Pro Leu Ser Lys Lys Thr 65 70 75 80 Leu Lys Gly Leu Gln Glu Ala Gln Tyr Arg Leu Val 85 90 <210> 7 <211> 276 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> domain 1 <400> 7 atgggcaaaa cggccaactc tccgggttcg ggagcccgac ccgacccggt gcggagcttc 60 aatcgctgga agaaaaaaca cagccatagg cagaacaaaa agaagcagtt gaggaagcaa 120 ctgaagaaac ccgaatggca ggtcgagcgc gagagtatca gccgcctcat gcagaactat 180 gaaaagataa atgtaaatga aatcacaaga ttttcagatt ttcccttgtc caaaaaaaca 240 ttgaaaggtt tgcaagaagc tcagtaccgt ttggtg 276 <210> 8 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DEAD domain <400> 8 Thr Glu Ile Gln Lys Gln Thr Ile Gly Leu Ala Leu Gln Gly Lys Asp 1 5 10 15 Val Leu Gly Ala Ala Lys Thr Gly Ser Gly Lys Thr Leu Ala Phe Leu 20 25 30 Val Pro Val Leu Glu Ala Leu Tyr Arg Leu Gln Trp Thr Ser Thr Asp 35 40 45 Gly Leu Gly Val Leu Ile Ile Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Tyr Gln 50 55 60 Thr Phe Glu Val Leu Arg Lys Val Gly Lys Asn His Asp Phe Ser Ala 65 70 75 80 Gly Leu Ile Ile Gly Gly Lys Asp Leu Lys His Glu Ala Glu Arg Ile 85 90 95 Asn Asn Ile Asn Ile Leu Val Cys Thr Pro Gly Arg Leu Leu Gln His 100 105 110 Met Asp Glu Thr Val Ser Phe His Ala Thr Asp Leu Gln Met Leu Val 115 120 125 Leu Asp Glu Ala Asp Arg Ile Leu Asp Met Gly Phe Ala Asp Thr Met 130 135 140 Asn Ala Val Ile Glu Asn Leu Pro Lys Lys Arg Gln Thr Leu Leu Phe 145 150 155 160 Ser Ala Thr Gln Thr Lys Ser Val Lys Asp Leu Ala Arg Leu Ser Leu 165 170 175 Lys Asn Pro Glu Tyr Val 180 <210> 9 <211> 546 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DEAD domain <400> 9 actgagatac agaagcagac cattggattg gctttgcaag gtaaagatgt acttggagcg 60 gccaaaactg gatctggcaa gactctggct tttcttgttc cagtgctgga agccttatat 120 cgtctgcaat ggacttcaac agatgggctg ggggttctca taatatcacc tacgagagaa 180 ctggcctatc agacctttga ggttctccga aaagtaggaa agaatcatga cttctcagct 240 ggtctcatca ttggtggaaa ggatctaaaa cacgaagctg agaggatcaa caacataaat 300 atactcgtgt gcacaccagg tcggcttctt caacacatgg atgaaacagt atcttttcat 360 gctaccgacc tccaaatgtt agttcttgat gaagcagata gaatcttgga tatgggcttt 420 gctgatacca tgaatgctgt tattgaaaat ctccccaaga aacgtcagac tttacttttc 480 tcagcaacac aaactaaatc tgtaaaggac cttgcacgct tgagtttgaa aaaccctgag 540 tatgtc 546 <210> 10 <211> 162 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> helicase domain <400> 10 Thr Leu Glu Gln Asn Tyr Ile Val Cys Glu Leu Gln Gln Lys Ile Ser 1 5 10 15 Val Leu Tyr Ser Phe Leu Arg Ser His Leu Lys Lys Lys Ser Ile Val 20 25 30 Phe Phe Ser Ser Cys Lys Glu Val Gln Tyr Leu Tyr Arg Val Phe Cys 35 40 45 Arg Leu Arg Pro Gly Val Ser Ile Leu Ala Leu His Gly Arg Gln Gln 50 55 60 Gln Met Arg Arg Met Glu Val Tyr Asn Glu Phe Val Arg Lys Arg Ala 65 70 75 80 Ala Val Leu Phe Ala Thr Asp Ile Ala Ala Arg Gly Leu Asp Phe Pro 85 90 95 Ala Val Asn Trp Val Leu Gln Phe Asp Cys Pro Glu Asp Ala Asn Thr 100 105 110 Tyr Ile His Arg Ala Gly Arg Thr Ala Arg Tyr Lys Glu Asp Gly Glu 115 120 125 Ala Leu Leu Ile Leu Leu Pro Ser Glu Lys Ala Met Val Gln Gln Leu 130 135 140 Leu Gln Lys Lys Val Pro Val Lys Glu Ile Lys Ile Asn Pro Glu Lys 145 150 155 160 Leu Ile <210> 11 <211> 486 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> helicase domain <400> 11 actttggaac agaactacat agtctgtgag ctgcagcaaa aaataagtgt gctgtattcc 60 tttttgagaa gccatctgaa gaagaagagc attgtatttt tttccagttg caaagaggtc 120 cagtatctgt accgagtgtt ttgccggcta cgtcctggtg tttctatcct tgcactccat 180 ggtcgacagc agcaaatgag aagaatggaa gtctataatg agtttgtccg taagagagct 240 gcagtactct ttgctactga tattgcagcc aggggtctgg atttcccggc cgtgaattgg 300 gttcttcagt ttgattgtcc tgaggatgcc aacacatata ttcacagagc aggtagaact 360 gccaggtaca aagaggatgg tgaagctttg ctaattttgc taccctcaga aaaagctatg 420 gtgcagcagc ttcttcagaa gaaagtacct gtgaaggaaa tcaaaatcaa tccagaaaaa 480 cttata 486 <210> 12 <211> 427 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> domain 2 <400> 12 Asp Val Gln Lys Lys Leu Glu Ser Ile Leu Ala Gln Asp Gln Asp Leu 1 5 10 15 Lys Glu Arg Ala Gln Arg Cys Phe Val Ser Tyr Val Arg Ser Val Tyr 20 25 30 Leu Met Lys Asp Lys Glu Val Phe Asp Val Ser Lys Leu Pro Ile Pro 35 40 45 Glu Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Leu Ala Val Ala Pro Arg Val Arg Phe 50 55 60 Leu Gln Lys Met Gln Lys Gln Pro Thr Lys Glu Leu Val Arg Ser Gln 65 70 75 80 Ala Asp Lys Val Ile Glu Pro Arg Ala Pro Ser Leu Thr Asn Asp Glu 85 90 95 Val Glu Glu Phe Arg Ala Tyr Phe Asn Glu Lys Met Ser Ile Leu Gln 100 105 110 Lys Gly Gly Lys Arg Leu Glu Gly Thr Glu His Arg Gln Asp Asn Asp 115 120 125 Thr Gly Asn Glu Glu Gln Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu Met 130 135 140 Glu Glu Lys Leu Ala Lys Ala Lys Gly Ser Gln Ala Pro Ser Leu Pro 145 150 155 160 Asn Thr Ser Glu Ala Gln Lys Ile Lys Glu Val Pro Thr Gln Phe Leu 165 170 175 Asp Arg Asp Glu Glu Glu Glu Asp Ala Asp Phe Leu Lys Val Lys Arg 180 185 190 His Asn Val Phe Gly Leu Asp Leu Lys Asp Glu Lys Thr Leu Gln Lys 195 200 205 Lys Glu Pro Ser Lys Ser Ser Ile Lys Lys Lys Met Thr Lys Val Ala 210 215 220 Glu Ala Lys Lys Val Met Lys Arg Asn Phe Lys Val Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Thr Phe Thr Asp Glu Gly Glu Leu Val Gln Gln Trp Pro Gln Met Gln 245 250 255 Lys Ser Ala Ile Lys Asp Ala Glu Glu Asp Asp Asp Thr Gly Gly Ile 260 265 270 Asn Leu His Lys Ala Lys Glu Arg Leu Gln Glu Glu Asp Lys Phe Asp 275 280 285 Lys Glu Glu Tyr Arg Lys Lys Ile Lys Ala Lys His Arg Glu Lys Arg 290 295 300 Leu Lys Glu Arg Glu Ala Arg Arg Glu Ala Asn Lys Arg Gln Ala Lys 305 310 315 320 Ala Lys Asp Glu Glu Glu Ala Phe Leu Asp Trp Ser Asp Asp Asp Asp 325 330 335 Asp Asp Asp Asp Gly Phe Asp Pro Ser Thr Leu Pro Asp Pro Asp Lys 340 345 350 Tyr Arg Ser Ser Glu Asp Ser Asp Ser Glu Asp Met Glu Asn Lys Ile 355 360 365 Ser Asp Thr Lys Lys Lys Gln Gly Met Lys Lys Arg Ser Asn Ser Glu 370 375 380 Val Glu Asp Val Gly Pro Thr Ser His Asn Arg Lys Lys Ala Arg Trp 385 390 395 400 Asp Thr Leu Glu Pro Leu Asp Thr Gly Leu Ser Leu Ala Glu Asp Glu 405 410 415 Glu Leu Val Leu His Leu Leu Arg Ser Gln Ser 420 425 <210> 13 <211> 1284 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> domain 2 <400> 13 gatgtccaga aaaaattgga atctatttta gctcaagatc aagatttaaa agaaagagct 60 caaaggtgtt tcgtctccta tgtacgatct gtatatctga tgaaggataa agaagtattt 120 gatgtgagca agttacctat acctgaatat gccctgtctc ttggtcttgc tgtggcacca 180 cgcgtaagat ttcttcagaa aatgcagaaa caacccacca aagaattggt aaggagccaa 240 gccgataaag taattgagcc aagggctccc tccctcacca atgacgaagt ggaagaattt 300 agagcctact tcaatgagaa aatgtccatc cttcaaaaag gtggaaaaag actcgaaggg 360 acagagcaca gacaggataa tgatactggt aatgaagaac aggaagaaga agaagacgat 420 gaagaagaaa tggaagagaa actggcaaaa gcaaaaggat ctcaagcccc atctcttcct 480 aacaccagtg aggcacagaa gatcaaggaa gttcctacac agttcttgga cagagatgag 540 gaggaagaag atgctgattt cttgaaggtg aagcggcata atgtgtttgg attggacctt 600 aaagacgaga aaacattaca gaagaaagaa ccttctaaat ccagcatcaa gaaaaaaatg 660 accaaagttg cagaagcaaa aaaagtaatg aagagaaatt ttaaagtgaa taagaagata 720 acatttactg atgaagggga gttggttcag cagtggccac aaatgcagaa atctgccatc 780 aaggatgctg aggaagatga tgacacaggt ggtatcaact tacataaagc aaaggaaaga 840 cttcaggaag aggacaaatt tgacaaagaa gaatatagga aaaaaattaa ggcaaagcat 900 cgggagaaaa gactgaaaga aagggaagcc agaagagaag ccaacaagag acaagcaaag 960 gccaaagatg aagaggaagc ctttctggat tggagtgatg atgatgatga tgatgatgat 1020 ggatttgatc caagcacact cccagatcca gataaataca gaagctctga agattcagat 1080 agtgaagata tggaaaataa aataagtgat accaagaaga agcaggggat gaagaagagg 1140 agcaacagtg aagtggaaga cgtgggacca acaagtcata acagaaagaa ggccaggtgg 1200 gacactttag agcctttgga taccggcctg tctttagcag aggatgaaga gctggtgtta 1260 catctgctaa gaagtcaaag ctaa 1284

Claims (13)

  1. DDX10(DEAD-box protein 10) 억제제를 유효성분으로 포함하는 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스용 조성물로서,
    상기 DDX10 억제제는 DDX10 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자의 mRNA, 및 DDX10 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 발현 또는 활성을 억제하고,
    상기 DDX10 억제제는 서열번호 5로 표시되는 염기서열인 것을 특징으로 하는, 항 바이러스용 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 DDX10 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 항 바이러스용 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 DDX10 단백질은 서열번호 2의 염기서열에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는, 항 바이러스용 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 DDX10 억제제는 B형 간염 바이러스의 복제 또는 전사를 저해하는 것을 특징으로 하는, 항 바이러스용 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 DDX10 억제제는 세포 내 B형 간염 e 항원(HBeAg) 또는 B형 간염 표면 항원(HBsAg)의 수준을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 항 바이러스용 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 DDX10 억제제는 DDX10의 도메인(domain) 중 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 DEAD 도메인을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항 바이러스용 조성물.
  9. 제1항의 항 바이러스용 조성물을 유효성분으로 포함하는, B형 간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 하기 단계를 포함하는, B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스 후보물질의 스크리닝 방법:
    (a) In vitro 상에서 DDX10(DEAD-box protein 10)을 발현하는 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 세포 내에서 DDX10 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 후보물질 처리 전에 비해 상기 DDX10 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준이 감소된 경우 상기 후보물질을 B형 간염 바이러스에 대한 항 바이러스 물질로 선정하는 단계.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 후보물질은 뉴클레오티드, DNA, RNA, 아미노산, 앱타머, 단백질, 줄기세포, 줄기세포 배양액, 화합물, 미생물 배양액 또는 추출물, 천연물, 및 천연추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR, quantitative PCR, quantitative real-time PCR), 마이크로어레이(microarray), 서던 블롯팅(southern blotting), 노던 블롯팅(northern blotting), 웨스턴 블롯팅(western blotting), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역화학염색법(immunohistochemistry), 및 면역형광염색법(immunofluorescence)으로 이루어진 군에서 선택되는 방법을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 스크리닝 방법.
  13. 하기 단계를 포함하는, B형 간염 발병 위험도 예측을 위한 정보제공방법:
    (a) 피검체로부터 시료를 채취하는 단계;
    (b) 채취된 시료에서 DDX10(DEAD-box protein 10) 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 DDX10 단백질 또는 이를 코딩하는 mRNA 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가된 경우 B형 간염 발병 위험이 높은 것으로 예측하는 단계.
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Viruses 2017, 9, 18*
김나연, 건국대학교 대학원 석사학위논문 ‘Mechanism of Cytokine-mediated Suppression of Hepatitis B Virus‘ 2020.2.*

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