CN112105727B - 乙型肝炎病毒衍生多肽及其抗病毒用途 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及乙型肝炎病毒衍生多肽及其用途,根据一方面的多肽增加第I型干扰素的表达,不止抗HIV‑1和抗HBV,更对所有病毒都显示出抗病毒作用,而且还与现有的抗病毒剂并用施用而具有协同效果,并且具有能够有效地用于治疗诸如艾滋病或肝病等的病毒性疾病。
Description
技术领域
本公开涉及乙型肝炎病毒衍生多肽及其抗病毒用途。
背景技术
导致后天性免疫缺陷综合症(Acquired Immune Deficiency Syndrome:AIDS)的人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus:HIV)于2015年感染3800万人,是全球需要关注的感染源。尽管引入了高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active AntiretroviralTherapy,HARRT),但很难完全根治该病毒。
传统药物具有靶向病毒酶,例如逆转录酶(reverse transcriptase:RT)、蛋白水解酶(protease),和整合酶(integrase:IN)。拉替拉韦(Raltegravir,艾生特(ISENTRESS)/MK-0518)是原型整合酶链转移抑制剂(prototypical integrase strand transferinhibitor:INSTI),其大大降低病毒载量并被批准用于临床。然而,已经在临床以及优化的HAART方法中确认了对拉替拉韦的抗性。
一方面,全世界约有二亿四千万至三亿五千万人感染了乙型肝炎病毒(HepatitisB virus:HBV),其显示出无症状感染、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌过渡的各种临床过程。HBV占所有肝细胞癌原因的53%,其感染率很高,尤其是在亚洲。在大多数的亚洲国家中,HBV带菌者的比例高达5%至35%。宿主因素、病毒因素和环境因素等与HBV感染引起的临床症状相关。
当前用于治疗慢性肝炎的治疗剂包括作为免疫调节剂(immunomodulators)的干扰素以及作为核苷类似物(nucleoside analogue)的拉米夫定等。其中,在最近十年间其效果受公认的干扰素-α具有价格昂贵、带有副作用,以及对于出生后立即出现感染问题的亚洲患者效果较差的缺点。对于作为另一种治疗剂的核苷类似物,其具有经口服施用的优点。但是,由于核苷类似物作用于DNA聚合酶并抑制病毒增殖,因此不能直接作用于非增殖性病毒,导致很难从体内完全清除HBV,还存在诸如产生耐药性等的问题。
在这些技术背景下,需要开发能够通过抗HIV-1和抗HBV效果缓和艾滋病或肝病等的新治疗剂。
发明内容
技术问题
一方面提供一种由选自序列号1、序列号2,和序列号3中的任何一个氨基酸序列组成的多肽。
另一方面提供一种包括所述多肽的用于抗病毒的药物组合物。
另一方面提供一种用于预防或治疗后天性免疫缺陷综合症(Acquired ImmuneDeficiency Syndrome:AIDS)的药物组合物,其包括所述多肽。
另一方面提供一种用于预防或治疗肝病的药物组合物,其包括所述多肽。
另一方面提供一种用于抗病毒的保健功能食品,其包括所述多肽。
另一方面提供一种用于预防或治疗病毒感染及与其相关的症状的方法,其包括向个体施用所述药物组合物。
技术方案
一方面提供一种由选自序列号1、序列号2,和序列号3中的任何一个氨基酸序列组成的多肽。
所述"多肽(Polypeptide)"是指由通过酰胺键(或肽键)连接的两个或更多个的氨基酸所组成的聚合物。所述多肽可以由选自序列号1、序列号2,和序列号3中的任何一个氨基酸序列组成,具体地,可以由序列号2的氨基酸序列组成。所述多肽可以包括与所述序列号1、序列号2,或序列3的氨基酸序列分别具有约70%或更多、约75%或更多、约80%或更多、约85%或更多、约90%或更多、约92%或更多、约95%或更多、约97%或更多、约98%或更多,或约99%或更多的序列同源性的多肽。
此外,保护基可以结合到所述多肽的N-或C-末端以获得更好的化学稳定性、增强的药理特性(半衰期,吸水性,效力,效能等)、改变的特异性(例如,广泛的生物学活性谱),和减少的抗原性。所述保护基可以是乙酰基、芴甲氧羰基、甲酰基、棕榈酰基、肉豆蔻基、硬脂基,或聚乙二醇(PEG),但是可以包括但不限于能够改善多肽的修饰,尤其是多肽稳定性的任何成分。
所述术语"稳定性"可以指保存稳定性(例如,室温保存稳定性)以及保护本发明的多肽免受蛋白酶在体内攻击的体内(in vivo)稳定性。
此外,所述多肽可以额外包括为靶向序列、标签(tag),或标记的残基的特定目的而制备的氨基酸序列。
所述术语"同源性(Homology)"是指与野生型氨基酸序列相似的程度,可以通过使用本领域公知的比较程序进行同源性的比较,并且可以将两个或多个序列之间的同源性计算为百分比(%)。
所述多肽可以衍生自天然,或者可以通过本领域广泛已知的各种多肽合成方法获得。例如,多肽可以通过使用多核苷酸重组和蛋白质表达系统制备,或者可以通过诸如肽合成的化学合成进行体外合成和无细胞蛋白质合成等来制备。此外,例如,所述多肽可以是肽、植物衍生组织或细胞的提取物,或通过培养微生物(例如细菌类或真菌类,特别是酵母)而获得的产物,具体地,所述多肽可以衍生自乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)聚合酶,更具体地,衍生自HBV聚合酶的preS1区域。
所述多肽可以具有抗病毒活性。例如,所述病毒可以为选自以下的至少一种:腺病毒、天花病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、带有严重高热的血小板减少综合征(SevereFever with Thrombocytopenia Syndrome)的病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus)、人类免疫缺陷病毒-1(Human Immunodeficiency Virus-1:HIV-1)和乙型肝炎病毒,具体地,可以为选自人类免疫缺陷病毒-1(Human Immunodeficiency Virus-1:HIV-1)和乙型肝炎病毒中的至少一种。
另一方面提供一种包括所述多肽的用于抗病毒的药物组合物。
对于所述药物组合物,"多肽"等与上述相同。
此外,所述组合物可以进一步包括抗病毒剂。
所述抗病毒剂可以是选自阿昔洛韦,泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、安佩那韦、阿巴卡韦、安沙霉素、西多福韦、达芦那韦、地拉韦啶、依法韦仑、依曲韦林、泛昔洛韦、金丝桃素、茚地那韦、拉米夫定、洛布卡韦、奈非那韦、奈韦拉平、乐复能、利托那韦、沙奎那韦、司他夫定、替拉那韦、病毒唑、利巴韦林、扎西他滨、齐多夫定、马拉维若、雷特格韦、埃替格韦、去羟肌苷、泰诺福韦、恩曲他滨、洛匹那韦、阿扎那韦、恩夫韦肽、克拉夫定、恩替卡韦、阿德福韦、奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、金刚烷胺,和替比夫定中的至少一种,具体地,可以是选自克拉夫定、恩替卡韦,和阿德福韦中的至少一种,更具体地,可以是恩替卡韦。
所述组合物可以进一步包括所述抗病毒剂以显着增加抗病毒效果,从而表现出协同效果。例如,当所述抗病毒剂是恩替卡韦,抗HBV效果和对第I型干扰素的表达的效果可以通过协同效果而显着增加。
例如,所述病毒可以为选自以下的至少一种:腺病毒、天花病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、带有严重高热的血小板减少综合征的病毒(Severe Fever withThrombocytopenia Syndrome)、流感病毒、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)、人类免疫缺陷病毒-1(Human Immunodeficiency Virus-1:HIV-1)和乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus:HBV)等,具体地,可以为选自人类免疫缺陷病毒-1(Human ImmunodeficiencyVirus-1)和乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus:HBV)中的至少一种。
所述多肽可以抑制病毒的增殖。具体地,所述多肽可以通过抑制HIV-1整合酶的乙酰化来抑制所述HIV-1整合酶的活性,从而抑制HIV-1增殖。此外,所述多肽可以增加细胞中的线粒体的活性氧,并可以增加包括在第I型干扰素的IFN-α和IFN-β的表达,从而抑制HBV的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)或或核衣壳(Nucleocapsid)的合成来抑制HBV的增殖。
在不限于特定理论的情况下,在IFN的抗病毒作用中起作用的IFN诱导蛋白为核糖核酸(RNA)依赖性蛋白激酶(PKR)、2',5'-寡腺苷酸合成酶(OAS)以及核糖核酸酶L(RNaseL)和Mx蛋白GTP酶(GTPase)。双链RNA分别调节由IFN诱导PKR激酶和2',5'-寡腺苷酸依赖性RNase L催化的蛋白质磷酸化和RNA降解,并在由IFN诱导性RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR1)的RNA编辑中也起作用。IFN还诱导诱导性一氧化氮合成酶(iNOS2)和主要组织相容性复合体(MHC)I和II蛋白,其均在对感染的免疫反应中起作用(参考临床微生物学评论(ClinMicrobiol Rev.)2001 10月;14(4):778-809)。所述文献在此全文引入作为参考。
因此,根据一实施例的多肽可以增加IFN表达以具有对所有病毒的抗病毒活性。
所述术语"预防"可以是指通过施用根据一方面的药物组合物来抑制由病毒引起的个体疾病或延迟发病的所有行为。
所述术语"治疗"可以是指通过施用根据一方面的药物组合物使由病毒引起的个体疾病的症状好转或被有利地改变的所有行为。
根据一方面,所述多肽通过抑制HIV-1整合酶的乙酰化来抑制HIV-1的增殖。可以通过抑制HIV-1的增殖来显示出对艾滋病的治疗效果。
此外,根据一方面,所述多肽可以通过增加线粒体应激来增加细胞内的活性氧,并且增加第I型干扰素(Type I interferon)的表达来抑制核衣壳的合成,从而可以抑制HBV的增殖并表现出对肝病的治疗效果。
所述药物组合物可以单独包括有效成分,或者可以以包括一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物的形式来提供。
具体地,所述载体可以是例如胶体悬浮液、粉末、盐水、脂质、脂质体、微球体(microspheres),或纳米球型粒子。这些载体可以与运送单元形成复合物或可能与运送单元相关联,且可以通过使用本领域已知的运送系统在体内运送,例如脂质、脂质体、微粒子、金、纳米粒子、聚合物、缩合反应剂、多糖类、聚氨基酸、树枝状分子、皂苷、吸附增强物质,或脂肪酸。
所述药物组合物可以包括在通常在制剂化中使用的药学上可接受的载体,即乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁,和矿物油等。
此外,当所述药物组合物被制剂化时,可以通过使用通常使用的稀释剂或赋形剂如润滑剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保存剂、填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂,和表面活性剂等来进行制备。经口服施用的固体制剂可以包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂,和胶囊剂等。这种固体制剂可以通过将所述组合物与至少一种赋形剂例如淀粉、碳酸钙(calciumcarbonate)、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose),和明胶等混合而制备。此外,除简单的赋形剂外,还可以使用润滑剂,例如硬脂酸镁或滑石粉。用于口服的液体制剂可以包括悬浮剂、内用溶液、乳剂,和糖浆等。除了通常使用的简单稀释剂即水和液体石蜡外,可以包括各种赋形剂,例如润湿剂,甜味剂、芳香剂,和保存剂等。用于非口服施用的制剂可以包括灭菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳剂、冻干燥剂和栓剂。对于非水溶剂和悬浮剂,可以使用丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油的植物油,和如油酸乙酯的可注射酯等。作为栓剂的基质,可以使用Witepsol,聚乙二醇,吐温(tween)61,可可脂,月桂酸酯脂,甘油明胶等。当以滴眼剂形式制备时,可以使用已知的稀释剂或赋形剂等。
所述术语"药学上可接受的"是指对暴露于所述组合物的细胞或人显示无毒的性质。
另外,所述药物组合物可以通过与现时已知的用于抗病毒的组合物混合来提供。换句话说,可以将所述药物组合物与具有白内障抗病毒效果的已知组合物并行施用。
所述"施用"是指以适当方法将预定的物质导入个体。
所述术语"个体"是指需要治疗由病毒引起的疾病的对象,更具体地,可以是指哺乳动物,例如人类或非人类的灵长类动物、小鼠(mouse)、狗、猫、马,和牛等。
所述药物组合物可以根据所需方法经口服施用或非口服施用(例如,肌肉内、静脉内、腹腔内、皮下、皮内或局部),并且施用量根据患者的状况和体重、疾病的程度、药物的形式、施用途径和时间不同,但可以由本领域技术人员适当选择。
所述药物组合物可以以药学有效量施用。所述术语"药学有效量"是指足以以适用于医学治疗的合理收益/风险比治疗疾病的量。有效剂量水平可以根据包括以下项的因素以及在其他医学领域中熟知的其他因素来决定:患者疾病的类型和严重性、药物活性、药物敏感性、施用时间、施用途径和排泄率、治疗期间,或同时使用的药物。具体地,所述药物组合物可以以0.01mg/kg/天至1000mg/kg/天的量来施用,更具体地,可以以0.1mg/kg/天至500mg/kg/天的量来施用。所述施用可以是每天施用一次或分成数次来施用。
根据一方面的药物组合物可以施用为单独的治疗剂或通过与其它抗炎剂并用来施用,并可以与现时的抗炎剂一起同时,分开或依次施用,且可以单次或多次施用。考虑到上述所有因素,重要的是以最小的量能获得最大的效果而又没有副作用的量来施用,并且该量可以由本领域普通技术人员容易地确定。
具体地,所述药物组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别、状况、体重、体内活性成分的吸收率、失活率、排泄速度、疾病的种类,以及所并用的药物而变化,并且可以根据施用途径、肥胖的严重程度、性别、体重,和年龄等而增加或减少。
另一方面提供一种用于预防或治疗后天性免疫缺陷综合症(Acquired ImmuneDeficiency Syndrome:AIDS)的药物组合物,其包括所述多肽。
所述后天性免疫缺陷综合症可以由HIV-1感染引起的。
另一方面提供一种用于预防或治疗肝病的药物组合物,其包括所述多肽。
所述肝病可以由HBV感染引起,具体地,可以是选自肝炎、肝硬化和肝癌中的至少一种,并且更具体地,可以由乙型肝炎发展。
另一方面提供包括所述多肽的用于抗病毒的保健功能食品。
关于所述保健功能食品,"多肽"、"AIDS"、"肝病",和"病毒"等可以与上述相同。
所述术语"改善"可以指至少减轻与治疗状况相关的参数如症状的程度的所有行为。此时,所述保健功能食品可以在相应疾病发病之前或之后与用于治疗的药剂同时或分开使用以预防或改善艾滋病或肝病。
在所述保健功能食品中,可以将有效成分直接加到食品中,或者,可以与其他食品或食品成分一起使用,且可以根据常规方法适当地使用。有效成分的混合量可以根据目的用途(用于预防或改善)适当地确定。通常,在食品或饮料的制备中,相对于原料,具体地,可以以其量为约15重量%或更少添加所述保健功能食品,更具体地,可以以其量为约10重量%或更少添加所述保健功能食品。但是,以健康和卫生作为目的或健康控制作为目的而长期摄入时,所述量可以等于或少于上述范围。
所述保健功能食品可以通过进一步包括诸如载体、填充剂、增量剂、结合剂、润湿剂、崩解剂,或表面活性剂等的稀释剂、赋形剂或添加剂中的至少一种来制备成选自片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、粉末剂、胶囊剂和液体剂型中的一种剂型。所述可以添加的食品包括各种食物类、粉末、颗粒、片剂、胶囊、糖浆剂、饮料、口香糖、茶、维生素复合剂,和保健功能食品等。
所述载体、赋形剂,稀释剂和添加剂的具体实例可以是选自乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、赤藓醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯聚吡咯烷酮、纤维素、聚乙烯聚吡咯烷酮、甲基纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁,和矿物油中的一种。
所述保健功能食品除了包括所述有效成份外,还可以包括其他成分作为必要成分而没有特别限制。例如,所述保健功能食品可以包括各种香味剂、或天然碳水化合物等作为附加成分,如在普通饮料中一样。上述天然碳水化合物的实例可以包括普通的糖,例如,诸如葡萄糖和果糖等的单糖;诸如麦芽糖和蔗糖等的二糖;和诸如糊精和环糊精等的多糖,以及糖醇,例如木糖醇、山梨糖醇,和赤藓醇等。作为上述香味剂以外的香味剂,可以有利地使用天然香味剂(索马甜,甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A,甘草甜素等))和合成香味剂(糖精,阿斯巴甜等)。所述天然碳水化合物的比例可以由本领域普通技术人员适当地确定。
根据一方面的保健功能食品可以包括多种营养剂、维生素、矿物(电解质)、诸如合成香味剂和天然香味剂等的香味剂、着色剂和填充剂(奶酪,巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。这些成分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比例也可以由本领域普通技术人员适当地选择。
另一方面提供一种用于预防或治疗病毒感染及与其相关的症状的方法,其包括向个体施用所述药物组合物。
所述"多肽"、"个体"、"施用"、"药物组合物"、"病毒"等与上述相同。
有益效果
根据一方面的多肽增加第I型干扰素的表达,不止对抗HIV-1和抗HBV,更对所有病毒都显示出抗病毒作用,而且还与现有的抗病毒剂并用施用而具有协同效果,并且具有能够有效地用于治疗诸如艾滋病或肝病等的病毒性疾病。
附图说明
图1的A)为示出与根据一方面的乙型肝炎病毒衍生多肽(Poly5、Poly6和Poly7)的位置有关的模式图,且B)示出抗人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)效果的分析结果。
图2的A)示出根据一方面的多肽的细胞毒性评估,B)示出根据一方面的多肽的抗HIV-1活性的评估,C)示出根据一方面的多肽对HIV-1绿色荧光蛋白(Green FluorescentProtein:GFP)表达抑制的评估,且D)和E)示出叠氮胸苷(Azidothymidine:AZT)和根据一方面的多肽的细胞变性抑制效果的评估。
图3的A)示出根据一方面的多肽和其他抗HIV-1试剂对HIV-1GFP表达抑制的评估,B)示出根据一方面的多肽和其他抗HIV-1试剂对p24表达抑制的评估,且C)示出根据一方面的多肽和其他抗HIV-1试剂对HIV-1水平抑制的评估。
图4a和图4b示出根据一方面的多肽和其他抗HIV-1试剂随时间对HIV-1水平抑制的评估。
图5的A)示出根据一方面的多肽和其他抗HIV-1试剂的2-LTR环和整合的cDNA量的比较数据,B)示出根据一方面的多肽和其他抗HIV-1试剂的p300表达的比较数据,且C)示出根据一方面的多肽和其他抗HIV-1试剂的是否进行整合酶的乙酰化的比较数据。
图6a和图6b示出多肽候选物Poly5、Poly6,和Poly7以及各物质的抗病毒效果的比较,以及通过候选物处理的细胞生存力分析,其中,图6a示出根据一方面的乙型肝炎病毒衍生多肽(Poly6)和候选多肽(Poly5,Poly7)的s/e抗原减少效果的比较,且图6b示出根据一方面的多肽的细胞生存力分析结果。
图7示出根据一方面的多肽在慢性感染阶段中的HBV复制抑制以及根据一方面的多肽在HBV易感细胞中的抗HBV效果的评估,其中,A)示出乙型肝炎表面抗原(HBsAg)水平,B)示出乙型肝炎E抗原(HBeAg)水平,C)示出病毒滴度,D)示出Southern印迹杂交结果,且E)示出根据一方面的多肽的施用量与HBV复制之间的关系(IC50)。
图8的F)示出在磷酸缓冲盐溶液(PBS)、恩替卡韦(entecavir:ETV),和根据一方面的多肽处理后确认核心蛋白和衣壳形成的结果,G)示出根据用量用每种物质和HBV病毒粒子感染HepG2-hNTCP-C4后测量HBsAg的结果,且H)示出测量病毒DNA的结果以根据一方面的多肽的用量确认感染模型中的抗HBV效果。
图9a和图9b示出根据一方面的多肽对小鼠模型的HBV抑制效果,其中,图9a示出根据PBS、拉米夫定(3TC),和根据一方面的多肽的处理的HBsAg水平,且图9b示出根据PBS、拉米夫定(3TC),和根据一方面的多肽的处理的HBV DNA水平。
图10示出根据一方面的多肽的线粒体氧化应激生成评估,其中A)示出根据每种物质的处理随时间的线粒体活性氧(mtROS)水平(鱼藤酮是线粒体氧化应激的阳性对照),B)示出根据一方面的多肽的根据浓度的mtROS水平,且C)示出根据根据一方面的多肽的处理和氧化应激抑制剂(MitoTempo)处理的线粒体活性氧水平。
图11a和11b为确认根据一方面的多肽的第I型干扰素(Type 1IFN)的增加模式的图,其中,图11a示出根据所述多肽的处理的IFN-β、RIG-I和ISG15的mRNA水平,图11b的B)示出在hMH55-293-ISRE细胞中用每种物质处理的细胞上清液在处理后的荧光素酶(luciferase)的表达水平,且11b的C)为评估在小鼠模型中根据每种物质的处理的IFN-βmRNA表达水平的图。
图12示出通过中和第I型干扰素受体阻断poly6的抗HBV效果,其中,A)示出通过一方面的处理而减少的e抗原和细胞外HBV DNA水平通过中和抗体处理而恢复,且B)示出通过一方面的处理而增加的第I型干扰素mRNA水平减少。
图13示出通过根据一方面的多肽和恩替卡韦(ETV)的并用处理的抗病毒协同效果,其中,A)示出根据并用处理的细胞外HBV DNA减幅协同效果,且C)示出根据并用处理的s和e抗原减少水平。
图14为确认根据恩替卡韦(ETV)和根据一方面的多肽的并用处理的第I型干扰素的增加模式的协同效果,其中,A)示出根据并用处理的IFN-α、IFN-β,和TNF-α的mRNA水平,且B)示出在hMH55-293-ISRE细胞中进行并用处理的细胞上清液在处理后的荧光素酶的表达水平。
具体实施方式
在下文中,将参考实施例更详细地描述本公开。然而,这些实施例仅用于说明本公开,并且本公开的范围不限于这些实施例。
实施例
实施例1.确认抗人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)效能
参考例.统计分析
通过使用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析对照组和试验组之间的统计比较。统计学显着性的p值设定如下:p<0.05(*),0.01(**)或0.001(***)。所有试验独立重复三次。
试验例1.确认显示出抗HIV-1效果的乙型肝炎病毒(HBV)聚合酶衍生的肽
本实验例的目的在于确认HBV聚合酶衍生肽是否具有抗HIV-1效果。具体地,由于在具有基因型C2感染的慢性患者的乙型肝炎病毒中,preS1起始部位的15、18,和21个核苷酸的缺失可以通过调节病毒的增殖来促进疾病进展,在本实验中,从与15、18和21个核苷酸的缺失的序列相对应的聚合酶区域中选择3种肽候选物质。这些肽被称为Poly5(GRLVF,序列号1)、Poly6(GRLVFQ,序列号2),或Poly7(GRLVFQT,序列号3),每个肽都是通过PeptronInc.中基于9-芴甲氧羰基(9-fluorenylmethoxycarbonyl;Fmoc)的固相方法而合成的,且如通过高效液相色谱法测定,实施例中使用的所有肽的纯度为95%或更高。分析基于细胞的抗病毒效果以评估所述三种多肽的抗HIV-1效果。用HIV-1(4×105CCID50)感染MT-4细胞(4×105细胞数)1小时。所述MT-4细胞从NIH/AIDS研究和参考试剂计划(Research andReference Reagent Program)中获得。通过使用从单个双顺反子核糖核酸(bicistronicRNA)共表达Nef和增强绿色荧光蛋白(eGFP)的pBR_HIV-1_M_NL4-3_IRES_eGFP载体(DS441)和脂质体(Lipofectamine)2000试剂(生命技术公司,Life Technologies)将HIV-1转染293FT细胞48小时,然后收集含有作为病毒前体的HIV-1的上清液,并使用p24酶联免疫吸附测定(ELISA)(ABI)测定病毒滴度。为了增幅感染性HIV-1,将作为病毒前体的HIV-1以0.5的感染复数(multiplicity of inpection:MOI)感染MT-4细胞72小时。接下来,在离心并过滤所收集的上清液后,使用p24 ELISA以测定感染性病毒的滴度,并保存在-70℃直至使用。
在使用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞后,使用二甲基亚砜(DMSO;DimethylSulfoxide)、叠氮胸苷(Azidothymidine:AZT;3-Azido-3-deoxythymidine),和Poly5至Poly7处理感染的细胞。此时,DMSO和AZT购自Sigma-Aldrich。培养2天后,使用荧光显微镜获得绿色荧光蛋白(GFP)图像。通过使用ImageJ软件程序(美国国立卫生研究院)以每面积像素为单位确定相对GFP强度。收集上清液和细胞并进行RNA提取,然后通过执行RT-qPCR来确定病毒滴度,并且通过使用p24 ELISA测量上清液中生成的病毒。通过使用四甲基偶氮唑蓝(MTT)分析来测定针对被处理的试剂的细胞生存力。
为了确认HSP90(细胞信号转导(Cell Signaling))在Poly5至Poly7的抗病毒效果中的效果,将MT-4细胞用HIV-1感染1小时,然后通过用HSP90抗体(1μg/ml)或17-AAG(Calbiochem,1μM)处理1小时以阻断HSP90活性,并且用DMSO,AZT或Poly6处理细胞,并培养48小时。通过使用GFP抗体(圣克鲁斯生物技(Santa Cruz Biotechnology))以蛋白免疫印迹法分析确认HIV-LTR依赖性GFP的合成。
以DMSO(0.5%)、AZT(5nM),或每种10μM的三种候选物质处理受HIV-1感染的MT-4细胞,并在两天后,通过执行GFP成像和p24 ELISA来确认HIV-1的滴度。结果,确认了Poly5和Poly7减少了病毒的产生,尤其是Poly6大大减少了病毒的产生(图1B)。
试验例2.细胞毒性分析
在本试验例中,在检查Poly6的效果之前,测定了Poly6对细胞的毒性效果,以排除Poly6由于其非特异性细胞毒性而影响HIV-1增殖的可能性。具体地,以1×104细胞数制备MT-4细胞,并根据浓度处理Poly6且培养5天。通过使用MTT分析试剂盒(Promega)测定是否具有细胞毒性。为了分析在由HIV感染引起的细胞毒性导致细胞死亡时Poly6的抗细胞毒性效果,使用HIV-1(1×104CCID50)感染MT-4细胞(1×104细胞数)并培养5天后,分析细胞生存力。此外,执行p24 ELISA以评估上清液中的HIV-1滴度。结果,对于浓度高达25μM的MT-4细胞,Poly6在5天内未引起显着的细胞毒性(图2A)。为了从293FT细胞产生HIV-1,将细胞用pBR_HIV-1_M_NL4-3_IRES_eGFP载体转染,并通过p24 ELISA评估MT-4细胞中Poly6的抗HIV-1活性。HIV-1增殖由Poly6根据浓度而抑制,且平均50%抑制浓度(IC50)为约0.2664μM(图2B)。此外,取决于HIV-1LT的活性的GFP表达也通过Poly6随浓度逐渐减少(图2C)。在受HIV-1感染的MT-4细胞中,由于病毒增殖激活了细胞死亡信号传递通路,导致细胞破坏。因此,可以得知在AZT处理后,由于AZT的抗病毒效果,最终在MT-4细胞中显示出细胞保护效果。与AZT相似,在分析Poly6对于受HIV-1感染的MT-4细胞的细胞变性抑制效果的结果中,如图2所示,在AZT(图2D)和Poly6(图2E)中显示随浓度的细胞保护效果。浓度为5μM的Poly6足以从HIV-1诱导的细胞死亡中使约100%的细胞保持健康。随着通过Poly6的抗HIV-1效果的细胞保护能力增加,通过抑制HIV-1,细胞上清液中的病毒p24水平相对减少(图2E)。换言之,综合上述试验结果,在本试验例中,可以得知Poly6通过抑制HIV-1的增殖并抑制细胞变性来在保护MT-4细胞的生存能力中起着关键作用。
试验例3.确认人外周血单个核细胞(PBMC)中的HIV-1增殖抑制效果
在本试验例中,执行了试验以确认Poly6在体外(Ex-vivo)的抗HIV-1效果。具体地,人外周血单个核细胞(PBMCs)受HIV-1感染。通过使用Biocoll(BIOCHROME)分离人外周血单个核细胞(PBMC),并将其在添加有10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum:FBS)、1μg/ml的血凝素(phytohemagglutinin:PHA;Sigma-Aldrich),和IL-2(100U/ml;PEPROTECH)的RPMI1640培养基中培养3天。用聚羟基脂肪酸酯(PHA)刺激的PBMC细胞以0.1的感染复数(multiplicity of infection;MOI)感染HIV-1,并用试剂处理,然后培养5天。为了确定PBMCs中的病毒滴度,从细胞中分离出病毒RNA,并如上所述通过RT-qPCR进行分析。使用荧光显微镜观察GFP的表达,并使用GFP抗体进行蛋白质印迹分析。
此时,为了评估HIV-1病毒滴度,按照制造商的规程进行了p24ELISA(p24 ELISA,ABL,罗克维尔(Rockville),MD)。使用QIAamp UltraSens病毒试剂盒(QIAGEN)纯化培养细胞的上清液和细胞的HIV-1RNA,并通过使用HIV-1的Gag区中的特异的引物以RT-qPCR进行定量。磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehide-3-phosphate dehydrogenase:GAPDH)被用作标准化的参考基因。在RTqPCR使用了诸如GagF,GCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAG(正方向,序列号4)、GagR,TCCCCTTGGTTCTCTCATCTGG(逆方向,序列号5)、GAPDH-F,AATCCCATCACCATCTTCCA(正方向,序列号6),和GAPDH-R,TGGACTCCACGACGTACTCA(逆方向,序列号7)的引物组。HIV-1Genesig标准试剂盒(引物设计)用于标准化病毒滴度。
在PBMC细胞受HIV-1感染后,将其与DMSO(0.5%)、AZT(5nM)、拉替拉韦(Raltegravir,10nM),或Poly6(10μM)一起培养5天,然后可以发现,在与DMSO相比时,Poly6可以以与AZT或拉替拉韦中的水平相似的水平下显着减少PBMC细胞中GFP和p24蛋白的表达。此外,还确认了在与DMSO相比时,Poly6以与AZT或拉替拉韦中的水平相似的水平下显着降减少PBMC细胞中的HIV-1增殖(图3C)。这些结果显示出Poly6能够抑制MT-4细胞中的HIV-1增殖,更能够抑制人PBMC细胞中的HIV-1增殖。
试验例4.确认HIV-1整合抑制效果
在本试验例中,为了分析HIV-1DNA的在宿主基因组的整合,进行了两个长末端重复序列(2-LTR)和Alu聚合酶链反应(PCR)。具体地,2-LTR PCR用于检测未整合到细胞质中而剩下所发生的圆形病毒DNA,且Alu PCR被执行以用于整合的病毒DNA的增幅。将试剂处理48小时,然后使用QIAamp MinElute病毒旋转试剂盒(Virus Spin Kit)(QIAGEN)从感染HIV-1的MT-4细胞中提取病毒DNA。对于用于2-LTR PCR分析的引物和探针,使用2-LTR F(MH535),AACTAGGGAACCCACTGCTTAAG(正方向,序列号8)、2-LTR R(MH536),TTCACAGATCAAGGATATCTTGTC(逆方向,序列号9),和作为2-LTR探针的FAM-ACACTACTTGAAGCACTCAA-TAMRA(序列号10),且使用Alu-1F,TCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGG(正方向,序列号11)、Alu-1R,CCCTAGTTAGCCAGAGAGCTCCCA(逆方向,序列号12)、二级Alu PCR上游引物、Alu-2F,ACAGCCTCCTAGCATTTCGT(正方向,序列号13)、Alu-2R,AGCGGAAAGTCCCTTGTAGA(逆方向,序列号14),和作为Alu PCR探针的FAM-AGCATGGGATGGAGGACCCG-TAMRA(序列号15)。
此外,在本试验例中,为了揭示Poly6的整合抑制机制,通过使用整合酶和p300抗体(圣克鲁斯生物技)进行了蛋白质印迹法和免疫沉淀分析。为了进行免疫沉淀分析,将MT-4细胞感染HIV-1 1小时,然后用DMSO(0.5%)、AZT(5nM)、拉替拉韦(10nM),或Poly6(10μM)处理48小时。通过在细胞中用RIPA(Abcam)缓冲液进行处理并裂解细胞,然后预先用10μl的蛋白质A/G PLUS-琼脂糖(sc2003,圣克鲁斯)洗涤全部裂解液,并收集上清液。将上清液与20μg的抗体一起在4℃下培养1小时,然后向其中加入10μl蛋白质A/G PLUS-琼脂糖,并在360℃下旋转的同时在4℃下培养过夜。经过最后一次洗涤后,收集免疫沉淀物,并将所生成的沉淀物上样以进行蛋白质印迹法分析。
一方面,当MT-4细胞受HIV-1感染时,HIV-1的增殖通过多个阶段而进行。由于诸如病毒的附着、整合、转录或病毒合成的HIV-1生命周期中具有多个阶段,新开发的抗HIV-1试剂存在多种作用机制。因此,为进一步揭示Poly6抑制HIV-1的基本机制,通过使用Poly6和诸如AZT(逆转录酶抑制)、拉替拉韦(整合酶抑制)、瑞托那韦(ritonavir),和T20(抑制病毒出现)等的能够在MT-4细胞中抑制HIV-1生命周期的各种阶段的各种抗HIV-1药物进行了时间过程(TOA;time-of-addition)分析。此时,T-20、拉替拉韦,和瑞托那韦是通过NIH/AIDS研究和参考试剂计划(NIH)获得的。在TOA分析中,在与每种药物靶向的增殖阶段相对应的时间点很好地确认了每种代表药物对HIV-1增殖的抑制,且在6小时和8小时之间的时间点,Poly6开始失去药物效果(图4a)。如作为具有相似抑制机制的整合酶抑制剂的拉替拉韦的TOA结果所示,细胞内GFP分析也支持TOA结果(图4b)。当综合这样的结果时,可以得知Poly6通过抑制病毒整合酶的活性而显示出抗HIV-1效果。
试验例5.具体确认Poly6的HIV-1活性抑制机制
进行本试验例以证明关于由Poly6抑制HIV-1整合酶的TOA数据。具体地,通过使用Alu PCR和2-LTR PCR在受HIV-1感染的MT-4细胞中检测到整合酶环的形成。已知当HIV-1cDNA进入细胞核但不发生整合时,HIV-1cDNA自身复制形成2-LTR环。与作为整合酶抑制剂的拉替拉韦不同,Poly6可提高2-LTR环的水平,并且在受HIV-1感染的MT-4细胞中整合的cDNA数量显着减少(图5A)。这结果显示出Poly6通过阻断整合酶的整合过程来抑制HIV-1增殖。已知在病毒的细胞内的整合阶段中通过诸如p300的细胞内因子乙酰化整合酶的过程,为了确认通过Poly6作用的整合抑制活性的基本机制,首先通过免疫印迹调查Poly6如何影响未受感染MT-4细胞和受HIV-1感染MT-4细胞中p300蛋白的表达。结果,发现与DMSO,AZT或拉替拉韦相比,Poly6在未受感染的MT-4细胞中更有效地减少了p300表达(图5B)。接下来,为了确认减少的p300是否在通过整合酶的免疫沉淀后对病毒整合酶的乙酰化产生抑制效果,将抗体应用于经DMSO、AZT、拉替拉韦,或Poly6处理的受感染MT-4细胞的细胞。随后,使用特异于乙酰化赖氨酸(细胞信号转导)的抗体进行免疫印迹。结果,可以确认了Poly6和拉替拉韦抑制了整合酶的乙酰化(图5C)。
当综合这样的结果时,可以得知Poly6的HIV-1活性抑制是通过抑制p300整合酶的乙酰化而实现的。
实施例2.确认抗HBV效能
试验例1.确认显示出抗HBV效能的HBV聚合酶衍生肽和细胞生存力分析
本实验例的目的在于确认显示出抗HBV效果的HBV聚合酶衍生肽,且分析在处理其时的细胞生存力。为了评估上述的Poly5(GRLVF,序列号1)、Poly6(GRLVFQ,序列号2),或Poly7(GRLVFQT,序列号3,图1A)的这三种候选肽的抗病毒效果,根据制造商的规程使用脂质体2000试剂(生命技术公司)来以PBS(0.5%)、恩替卡韦(Entecavir:ETV,Sigma-Aldrich,30nM),或三种候选物(10μM)处理HepG2.2.15(HBV永久整合作为人源性肝癌细胞的HepG2细胞)或以pHBV-1.2X-野生型(Wildtype;WT)(基因型C)瞬时转染的HepG2细胞(根据制造商的规程使用脂质体2000试剂(生命技术公司)),然后,进行定量PCR和ELISA来确认病毒颗粒复制和表面抗原(HBsAg)。此时,在Peptron Inc.中通过基于固相方法合成各个肽,并且如通过高效液相色谱法测量,各个肽有95%以上的纯度。此外,下表1中显示了用于TaqMan探针杂交PCR的用于定量实时PCR和探针的寡核苷酸。
【表1】
结果,虽然在用Poly5、Poly6或Poly7处理48小时的所有组中,s抗原和e抗原都减少,当在比较各种浓度时,在Poly6组中观察到最显着的抗原减少效果,并且当处理24小时时,与ETV相比,仅在Poly6处理组中观察到显着的外膜抗原的减少效果(图6a)。因此,在本试验中,通过选择衍生自与preS1的18个核苷酸(nt)缺失重叠的聚合酶区域的Poly6肽,并确认其抗HBV效果。
在本实验例中,在调查Poly6的抗病毒效果之前,观察到通过Poly6的细胞生存力以检查Poly6由于其非特异性细胞毒性而影响HBV增殖的可能性。
具体地,将HepG2、HepG2.2.1,和HepG2-hNTCP-C4细胞(在细胞膜上表达NTCP受体)放在96微孔板(1x104细胞/孔)中,并通过增加ETV(30nM)和Poly6浓度来培养5天。对于MTS分析,将细胞滴定96水溶液(Cell-Titer96Aqueous One Solution)直接添加到每个孔中,并将板培养3小时。在490nm下读取板,并且每个分析重复3次。此时,为了进行HBV感染分析,每三天收集一次含有2%DMSO的HepG2.2.15细胞上清液,持续15天,然后用6%PEG8000在冰上沉淀病毒粒子1小时,然后在4℃和100,000g下超速离心3小时来浓缩。将粒子(pellet)重构在含有10%FBS的1X PBS中,然后在-80℃下保存直至使用。将细胞接种在6孔板中,并在4%PEG8000存在下以8x104GEq/细胞接种过夜。在下一天,将细胞用PBS洗涤3次,并用PBS(0.5%)、ETV(30nM),或Poly6(10μM)处理5天直至进行分析。
结果,随着时间的经过,对于HepG2、HepG2.2.15,和HepG2-hNTCP-C4细胞,Poly6没有显着显示高达10μM的细胞毒性,并且不影响细胞生存力(图6b)。
试验例2.确认Poly6在体外(In vitro)系统中的抗病毒效能
与急性感染不同,已知慢性乙肝病毒感染会引起严重的肝病,例如肝硬化和肝细胞癌。因此,开发克服慢性感染的抗HBV药物很重要。然而,由于HBV基因组已整合到宿主染色体中,因此从人的肝脏和血清中完全清除病毒仍然是一个难题。因此,在本实验例中,为了评估Poly6的抗病毒效果,用Poly6处理持续表达HBV的HepG2.2.15永久细胞株。另外,将HepG2细胞接种到6孔板中,然后用pHBV-1.2X-WT瞬时转染HepG2细胞。用PBS(0.5%)、ETV(30nM)或Poly6(10μM)处理具有pHBV-1.2X-WT的HepG2细胞或HepG2-2.15细胞24小时或48小时,然后通过使用上清液和粒子执行各种分析。为了从培养上清液中测量分泌的HBsAg和HBeAg,根据提供的试验方法进行了HBsAg(BIOKIT)和HBeAg(AccuDiag)ELISA。为了检测8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OHdG)活性,根据制造商的规程进行了8-OHdG分析试剂盒(OxiSelect氧化DNA损伤ELISA试剂盒(Oxidative DNA Damage ELISA kit),Cell Biolabs)和ELISA。
结果,在用PBS、ETV和Poly6处理2天后,在Poly6处理组中观察到向细胞外部的HBsAg和HBeAg水平在统计学上显着减少,并且Poly6使病毒增殖水平显着减少。ETV也减少了病毒增殖,但是在ETV和PBS之间没有统计学显著性。(图7A)至7C),图8G)和图8H))。
为了测量向细胞外部分泌的病毒粒子的量,执行了Southern印迹杂交法分析。具体地,在4℃下以24,000rpm超速离心3小时之前,去除细胞碎片,然后在冰上用8%PEG6000(Sigma)沉淀来自上清液的病毒粒子。用PBS收获粒子,根据制造商的说明,使用QIAamp DNAmini试剂盒(QIAGEN)收集HBV DNA。使用定量实时PCR(Q-PCR)测量病毒DNA。使用靶向小表面基因的QPCR引物组进行PCR扩增,这个引物组设计成用于扩增a101-bp产物(表2)。使用商业的SensiFAST SYBR Lo-ROX试剂盒(BIOLINE)和HBV Genesig标准试剂盒(Primerdesign)进行Q-PCR,以校准病毒载量。此外,为了检测细胞外HBV DNA,收集上清液,并如上所述使用6%PEG8000(Sigma)沉淀HBV粒子。从PBS中收集病毒粒子,并用裂解缓冲液(0.25%SDS,250mM Tris-HCl,pH 7.4和250mM EDTA)提取DNA。将纯化的HBV DNA在1%琼脂糖凝胶上分离,并通过Southern印迹杂交法转移到尼龙膜(Hybond N+;Amersham)上,并与32P标记的野生型全长HBV DNA探针杂交。使用随机引物DNA标记试剂盒(TaKaRa)进行分析。使用BAS 2500图像分析仪(富士胶卷(Fuji Photo Film))进行自动射线照相术(Autoradiography)并进行分析。
【表2】
结果,在Southern印迹杂交法分析中,与PBS条件相比,Poly6和ETV中向细胞外部分泌的病毒粒子的量明显减少(图7D)。在根据浓度确认变化的结果,Poly6对HBV的IC50为约2.468μM(图7E)。
试验例3.具体确认Poly6的HBV抑制机制
在本试验中,通过核衣壳(Nucleocapsid)表达的分析、线粒体活性氧测量,和对第I型干扰素的试验来确认Poly6在细胞中的抗病毒机制。
具体地,在使用抗HBc抗体(Dako,Agilent Tech)进行蛋白质印迹法分析的结果,确认与PBS或ETV相比,在Poly6处理组中HBcAg和衣壳明显减少。即使当使用Image J程序对其进行定量时,也确认了统计显着性(图8F)。
已经发现,当试剂被吸收到细胞中并引起氧化应激时,表达细胞因子如第I型干扰素可能引起包括增殖,细胞死亡或抗病毒效果的各种反应的机制。因此,为了揭示通过Poly6的氧化应激介导的作用的抗病毒效果的机制,将pHBV-1.2X野生型转染的HepG2细胞或HepG2.2.15细胞以4x105细胞/孔接种在6孔培养板上24小时,并用PBS、ETV或Poly6处理。将细胞培养适当的时间后,将细胞与5μM的MitoSox(分子探针(Molecular probes))一起在37℃下恒温处理30分钟。为了进行流动细胞测量分析,将细胞粒子重悬于FACS缓冲液(PBS中的1%FBS和1mM EDTA)中,并用4%多聚甲醛固定。为防止线粒体功能障碍,将10μM的MitoTempo(SigmaAldrich)预处理12小时,并将0.5μM的鱼藤酮(Rotenone;SigmaAldrich)试剂用作通过线粒体应激的ROS诱导的阳性对照组。
结果,与PBS相比,在鱼藤酮或Poly6处理组中,HepG2细胞中线粒体应激产生的活性氧(mtROS)从2小时显着增加到24小时(图10A)。确认了通过Poly6处理的线粒体活性氧增加显示出浓度依赖性(图10B)。相反,在恩替卡韦处理组中未观察到线粒体活性氧的增加模式。通过鱼藤酮和Poly6的处理而增加的线粒体活性氧通过作为mtROS特异性抗氧化物质的MitoTEMPO的处理而再次减少(图10C))。
第I型干扰素被宿主细胞诱导以调节病毒感染(Stetson&Medzhitov,2006)。因此,为了确认Poly6对HepG2-2.15细胞和小鼠肝脏中IFN-I产生的影响,检查了IFN-β、RIG-I和ISG15的mRNA水平。
结果,观察到与PBS组相比,在Poly6处理组中IFN-β、RIG-I和ISG15的mRNA水平显着增加,且在恩替卡韦理组中未观察到统计显著性(图11a)。此外,为了通过间接使用荧光素酶报道基因进行第I型干扰素生物测定和中和分析来测量IFN水平,使用hMH55-293-ISRE细胞,其通过使用5μg嘌呤霉素(puromycin;SigmaAldrich)在3'末端整合与荧光素酶报道基因相关的干扰素敏感反应元件(ISRE)。从用每种试剂处理24小时或48小时的细胞中收集上清液后,将上清液添加到hMH55-293-ISRE细胞中6小时。培养后,将细胞用PBS洗涤,并在室温下用报告裂解缓冲液(Reporter Lysis Buffer;E1500,Promega)裂解30分钟。加入荧光素酶分析试剂(E1500,Promega),并使用TECAN m200读数器(TECAN)测量发光。在下一天,将PBS(0.5%)、ETV(30nM)或Poly6(10μM)加入细胞中48小时。结果,确认了荧光素酶表达水平根据Poly6处理在24小时显着增加(图11b)。
一方面,通过中和第I型干扰素受体阻断干扰素与受体之间的相互作用后,为了研究Poly6的抗HBV效果的变化,在处理PBS、ETV,和Poly6的2小时前,通过处理中和抗体来阻断受体的激活并进行培养。用每种物质处理后培养48小时后,通过ELISA和qPCR评估抗HBV的效果。结果,确认了通过阻断IFN受体使在GAPDH抗体处理中由Poly6减少的HBeAg水平再次显着升高,且HBV DNA水平也恢复到了PBS处理组的水平(图12A)。类似地,观察到通过Poly6处理增加的IFN-β、RIG-1和ISG15的mRNA水平也通过用中和抗体处理而再次减少(图12B),确认Poly6直接/间接影响I型IFN-I的表达。
总之,基于上述结果,证明了Poly6通过增加细胞中线粒体的活性氧来通过第I型干扰素(IFN-I)途径刺激IFN-β,从而抑制HBV复制,同时具有抑制HBcAg和蛋白包膜的机制。
试验例4.确认Poly6在体内(In vivo)系统的抗病毒效能
进行了本试验例以确认Poly6在小鼠模型(体内)中的效果。首先,为了建立形质转换的小鼠模型,在Macrogen中生成表达HBV W4P突变的转基因小鼠,并在Macrogen中在无菌条件下随机饲养和维持小鼠。将试验动物存储在无特定病原体的试验动物中心。简而言之,向C57BL/6N雌性小鼠腹膜内每48小时间隔(5IU)注射孕马血清促性腺激素(Pregnant MareSerum Gonadotropin:PMSG)(7.5IU)和人绒毛膜促性腺激素(human chorionicgonadotropin:hCG),持续5周至8周,以用于超排卵。注射后,将这些雌性小鼠与C57BL/6N雄性小鼠交配。在下一天,牺牲具有阴道栓的雌性小鼠并收获受精的胚胎,并通过使用用于生成转基因小鼠的标准显微注射程序(Macrogen)将HBV W4P完整基因组共显微注射到一个细胞胚胎中。使用显微注射器将用于显微注射的HBV DNA(4ng/μl)直接注射到精子核中后,将显微注射的胚胎在37℃下培养1小时至2小时。将14至16个注射的单细胞阶段胚胎通过外科方法移植入假孕受体小鼠(ICR;pseudopregnant recipient mice)的输卵管。F0出生后,对转基因(transgene)的存在使用尾切样品来执行测试的基因分型(genotyping),并以PCR分析确认通过苯酚提取法的基因组DNA(genomic DNA)PCR筛选。
然后,将Poly6(50μg/kg)和3TC(拉米夫定,Sigma-Aldrich,500μg/kg)每周两次静脉内施用到表达HBV病毒粒子的转基因小鼠模型中,该HBV病毒粒子在preS1区(基因型A,pHY92-W4P)中包括W4P突变。在第4周和第8周时,通过收集眼窝副鼻洞血液来测量小鼠血清中的HBVDNA和HBsAg水平。
结果,注射Poly6和3TC的小鼠的血清中的HBsAg水平与第4周注射PBS的小鼠的血清进行比较而显示出相似的结果,但与3TC相比,Poly6在8周时的HBsAg水平显着减少(图9a)。此外,与PBS相比,在Poly6和3TC中,HBV DNA水平在8周内减少了约两倍(图9b)。最后,评估了小鼠模型的肝脏中的IFN-β的mRNA水平。在处理3TC和Poly6的组中,IFN-βmRNA水平在第4周和第8周的肝组织中显着增加,并且观察到其在处理Poly6的组中具有更高的表达(图11b的C)。
当综合所述结果时,可以得知Poly6影响体内形质转变的小鼠模型系统,其中HBsAg和HBV病毒粒子水平减少。
试验例5.通过Poly6的恩替卡韦并用处理的第I型干扰素增强协同效果和由其引起的抗HBV效果
确认通过恩替卡韦和Poly6的并用处理的抗HBV效果和第I型干扰素增强协同效果,所述恩替卡韦通过抑制核中HBV聚合酶的活性并将其转化为磷酸化形式的机制而目前被用作HBV抗病毒剂,且所述Poly6被确认为增加第I型干扰素(IFN-I)。将HepG2-2.15细胞在6孔培养板上以5x105细胞/孔培养24小时,并单独处理或PBS、ETV或Poly6或并用其中两种物质来进行处理。将细胞培养48小时后,收集上清液,并进行ELISA、实时荧光定量PCR(qPCR)和乳酸脱氢酶(LDH)测定。
结果,当单独处理ETV或Poly6时,与PBS相比,细胞外HBV DNA水平在统计学上显着地减少,但是并用两种物质进行处理时,显示出更显着的减少效果,并将其与各单独处理组进行比较时确认到显着差异(图13A)。在测量细胞外s抗原和e抗原水平的结果,与PBS组相比,ETV处理组未显示出显著的减少效果,但在Poly6单独处理组中确认到统计学显著性,且当并用两种物质时,与每个单独处理组相比,观察到显着的减少现象(图13C)。
一方面,测量LDH水平以确认通过各物质的单独和并用处理的非特异性细胞毒性水平,通过与对照组相比,没有显示出显着差异,从而确认没有细胞毒性(图13B)。
一方面,为了确认两种物质并用处理对于第I型干扰素的增加水平的协同效果,通过提取单独处理组和并用处理组的mRNA来观察IFN-α、IFN-β,和TNF-α的表达水平,结果,确认与单独处理组相比,并用处理组中与第I型干扰素相关的mRNA水平显着增加(图14A)。此外,通过使用hMH55-293-ISRE细胞的荧光素酶报告基因来间接测量IFN水平。与以上结果一致,与PBS和各物质单独处理组相比,在ETV和Poly6并用处理组中确认到荧光素酶表达水平的统计学上显着的增加(图14B)。
基于上述结果,证明Poly6的恩替卡韦并用处理对第I型干扰素的增加和由其的对HBV的抗病毒效果的协同效果,因此,当并用施用时,预期对抑制肝病具有协同作用。
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Claims (21)
1.一种由选自序列号1、序列号2,和序列号3中的任何一个氨基酸序列组成的多肽。
2.根据权利要求1所述的多肽,所述多肽由序列号2的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的多肽,所述多肽衍生自乙型肝炎病毒聚合酶。
4.根据权利要求1所述的多肽,所述多肽具有抗病毒活性。
5.一种用于抗病毒的药物组合物,其包括权利要求1的多肽。
6.根据权利要求5所述的药物组合物,其中,所述病毒是选自腺病毒、天花病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、带有严重高热的血小板减少综合征病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒-1和乙型肝炎病毒中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的药物组合物,其中,所述多肽具有抗病毒活性,并且所述病毒是选自人类免疫缺陷病毒-1和乙型肝炎病毒中的至少一种。
8.根据权利要求5所述的药物组合物,其进一步包括抗病毒剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物,其中,所述抗病毒剂是选自阿昔洛韦、泛昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、安佩那韦、阿巴卡韦、安沙霉素、西多福韦、达芦那韦、地拉韦啶、依法韦仑、依曲韦林、金丝桃素、茚地那韦、拉米夫定、洛布卡韦、奈非那韦、奈韦拉平、乐复能、利托那韦、沙奎那韦、司他夫定、替拉那韦、病毒唑、利巴韦林、扎西他滨、齐多夫定、马拉维若、雷特格韦、埃替格韦、去羟肌苷、泰诺福韦、恩曲他滨、洛匹那韦、阿扎那韦、恩夫韦肽、克拉夫定、恩替卡韦,和阿德福韦中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的药物组合物,其中,所述抗病毒剂为恩替卡韦。
11.根据权利要求5所述的药物组合物,其中,所述多肽抑制病毒的增殖。
12.根据权利要求5所述的药物组合物,其中,所述多肽通过抑制人类免疫缺陷病毒-1整合酶的乙酰化来抑制所述人类免疫缺陷病毒-1整合酶的活性。
13.根据权利要求5所述的药物组合物,其中,所述多肽增加细胞中的线粒体的活性氧。
14.根据权利要求5所述的药物组合物,其中,所述多肽增加第I型干扰素的表达。
15.根据权利要求5所述的药物组合物,其中,所述多肽抑制乙型肝炎病毒的乙型肝炎核心抗原或核衣壳的合成。
16.一种用于预防或治疗后天性免疫缺陷综合症的药物组合物,其包括权利要求1的多肽。
17.根据权利要求16所述的药物组合物,其中,所述后天性免疫缺陷综合症是由人类免疫缺陷病毒-1感染引起的。
18.一种用于预防或治疗肝病的药物组合物,其包括权利要求1的多肽。
19.根据权利要求18的药物组合物,其中,所述肝病是选自肝炎、肝硬化和肝癌中的至少一种。
20.根据权利要求18的药物组合物,其中,所述肝病是乙型肝炎。
21.根据权利要求18的药物组合物,其中,所述肝病是由乙型肝炎病毒感染引起的。
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