KR101665016B1 - 복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 조성물 - Google Patents

복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명의 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 수포성구내염바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV), 엔테로바이러스 71(Enterovirus 71) 및 구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus) 등의 바이러스가 감염된 세포에서 세포 생존을 늘리고, 세포 내 바이러스 수를 감소시키는 것을 확인하였고, 세포 내 바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인하였으며, 본 발명의 혼합 추출물이 작약 추출물 또는 일부 조합의 추출물에 비해 바이러스 감염 억제에서 현저한 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로바이러스 71 및 구제역 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

복합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 조성물{Composition for the prevention and treatment of antiviral comprising extracts of crude drug complex}
본 발명은 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 수포성구내염바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV), 엔테로바이러스 71(Enterovirus 71) 및 구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus)에 대한 항바이러스용 약학적 조성물, 및 건강기능식품에 관한 것이다.
수포성구내염바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)는 수포성구내염을 일으키는 바이러스 병원체로서, 두 가지 혈청형(인디아나형과 뉴저지형)으로 대별되는데 뉴저지형에 감염되었을 경우에 더욱 뚜렷한 병변을 나타내는 등 병원성이 인디아나형 보다 강한 것으로 알려져 있다. 주로 아메리카 대륙에서만 발생하고 있어서 신대륙 질병이라고도 하는데 미국에서는 간헐적으로 발생하다가 2004년부터는 매년 발생하고 있으며, 멕시코 남부, 중앙아메리카 국가, 남아메리카 북부, 브라질 등은 수포성구내염이 빈번하게 발생하는 대표적인 지역이다.
수포성구내염은 수포가 형성되는 임상증상만으로 보면 구제역(Foot-and-Mouth Disease), 수포진(Vesicular Exanthema), 돼지수포병(Swine Vesicular Disease) 등의 질환들과 감별이 불가능하기 때문에 실험실에서의 신속한 정밀진단이 필수적이다. 뚜렷한 임상증상이 있는 경우에는 원인체에 대한 바이러스 분리 혹은 역전사중합효소 연쇄반응법 등의 진단법으로 판정하나, 임상증상이 없는 경우에는 원인체 분리가 곤란하기 때문에 혈청학적인 검사방법으로 진단한다. 수포성구내염바이러스에 감염되면 숙주동물에서는 보통 5-8일이 경과하면 혈액 내에 특이항체가 생성되는데 이를 검출하는 방법으로는 보체결합법, 중화시험법, 효소결합면역측정법 등이 있다. 많은 종류의 가축에서 발생하는 수포성 구내염은 국제수역사무국(O.I.E.)에 의해 구제역과 함께 List A로 분류되는 악성전염병으로서, 발생국가에 막대한 경제적 피해를 입히는 질병이다. 수포성 구내염에 대한 감수성 가축은 말, 소, 면양, 산양 및 돼지 등의 거의 모든 포유동물들을 포함하며, 냉혈동물도 감염될 수 있다고 확인된 바 있다. 수포성 구내염에 의한 치사율은 매우 낮으나 반추동물이나 돼지에서 발병한 경우, 혀와 입술, 구강점막, 유두 및 발굽 제관부의 상피에 수포가 형성되어, 가축의 가치를 매우 떨어뜨린다. 또한, 수포성 구내염 바이러스는 사람에게도 감염될 수 있으며, 경증의 감기와 유사한 질병을 일으키는 것으로 보고되었다.
뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV)는 뉴캐슬병(Newcastle Disease, ND)을 일으키는 바이러스로서, 뉴캐슬병은 국제적으로 가장 중요한 가축 질병 15종 중 하나로, 급성 열성 호흡기 질병이며, 면역이 없는 가금류에 감염되는 경우 100% 폐사하는 법정 제1종 전염병이다. 뉴캐슬병은 병원성이 강한 바이러스에 의해 발생하는 악성 아시아형과 병원성이 약한 바이러스에 의해 일어나는 아메리카형이 있다. 우리나라는 뉴캐슬병 바이러스 상재 지역이고, 우리나라와 활발한 교역을 하고 있는 동남아시아, 중국, 및 대만에는 다양한 뉴캐슬병 바이러스들이 유행하고 있어서 대한 잠재적인 위험 요인이 존재한다.
가금류의 뉴캐슬병의 감염경로는 분비물, 대변, 호흡기 배설물 및 감염된 조류시체와의 직접적인 접촉 등 공기, 경구 등을 통하여 감염되며, 주요 증상으로는 기침, 호흡곤란, 식욕부진, 황백색 설사 후에 녹색 설사 등이 있고, 마비, 경련, 선회운동, 머리, 날개, 다리가 뒤틀림, 기낭 혼탁이 나타난다. 가금류의 뉴캐슬병은 일령에 관계없이 모든 일령에 발생하며, 전염성이 매우 높으며, 백신을 접종하지 않은 닭에 감염될 때는 100% 폐사율을 초래하는 가금류에 있어 무서운 제1종 법정 전염병으로서 매년 발생주의보를 발표하고 있으나, 발생이 계속 증가하고 있을 뿐 아니라 전국적으로 발생되는 추세에 있기 때문에 양계 농가에 큰 피해를 주고 있다. 오늘날까지, 뉴캐슬병에 대한 알려진 치료법 또는 치유법은 없다.
엔테로바이러스(Enterovirus)는 피코르나비리대 과(Picornaviridae family) 엔테로바이러스 속에 속하며 24-30 nm 크기를 가지는 매우 작은 정이십면체의 피막이 없는 바이러스이다. 유전체로 단일 가닥의 RNA를 가지기 때문에 RNA 바이러스로 분류된다. 엔테로바이러스의 경우, 바이러스의 유전체를 둘러싸고 있는 단백질 껍질인 캡시드(capsid)는 12개의 펜타머(pentamer)로 구성되어 있으며, 각각의 펜타머는 VP1, VP2, VP3, VP4의 네가지 폴리펩티드(polypeptide)로 이루어진 5개의 프로토머(protomer)로 구성되어 있다. 인간과 동물에게서 질환을 일으키는 엔테로바이러스는 폴리오바이러스(poliovirus)와 비폴리오 엔테로바이러스(non-polio enteroviruses)로 크게 구분되며, 비폴리오 엔테로바이러스는 다시 콕사키바이러스 A, 콕사키바이러스 B, 에코바이러스, 및 기타 엔테로바이러스로 구분된다.
폴리오바이러스는 소아마비의 원인체로 잠복기간은 3~35일이며 15세 이하, 특히 1~3세 소아에서 자주 발생한다. 에코바이러스는 주로 1~4세 소아에 감염되어 무균성 수막염, 상부 호흡기 감염, 발진, 기타 열성 질환, 유아의 설사 등 다양한 질환을 유발한다. 콕사키바이러스는 다시 A군과 B군(A군에는 23종, B군에는 6종)으로 나뉘는데 다양한 질병을 일으키는 콕사키바이러스의 잠복기간은 2~9일로 콕사키A군 바이러스는 피부와 점막에 포진성 구협염과 수족구병을 일으키며, 콕사키B군 바이러스는 심장, 늑막, 췌장, 간 등에 다양한 질병을 일으켜 측흉통, 심근염, 심막염을 유발한다. A군과 B군은 모두 뇌막과 운동신경 단위에 영향을 미쳐 무균성 수막염과 마비를 일으킬 수 있다. 엔테로바이러스의 분류 중 기타 엔테로바이러스란 수많은 엔테로바이러스의 종류에 관한 분류의 편의를 위해, 1969년 이후 새로 분리된 균주에 대해 단순히 숫자만 부여한 것이다. 기타 엔테로바이러스 중 엔테로바이러스 70은 급성출혈성 결막염의 원인 바이러스로 1969년에 아프리카의 가나에서 크게 유행한 바 있는데, 이 무렵 미국에서 아폴로 11호의 달 착륙이 있었기 때문에 이 바이러스에 의한 감염증을 아폴로 눈병이라 부르기도 했었다. 엔테로바이러스 71은 수막염 이외에 흔히 수족구병(hand-foot and mouth disease)이나 포진성 구협염을 일으키며, 드물게는 뇌나 폐에 심각한 합병증을 일으켜 사망에 이르게 하기도 한다. 이 엔테로바이러스 71은 1997년에서 1998년에 걸쳐 대만에서 크게 유행한 적이 있으며 국내에서도 2000년에 유행한 바가 있다.
구제역(Foot-and-mouth disease, FMD)은 발굽이 둘로 갈라진 동물에 감염되는 바이러스 수포성 질병으로 빠른 복제와 전파력이 특징이다. 이 질병은 그 경제적 중요성으로 인하여 국제수역사무국(OIE)에 의하여 리스트(List) 질병으로 분류되어 있으며, 축산물의 국가간 교역에 있어 매우 중요한 요소로 작용하고 있다. 병원체는 단일 가닥의 양극성 RNA 바이러스로 피코나비리데(Piconaviridae) 과, 아프소바이러스(Apthovirus) 속에 속하며 7개의 다른 혈청형(A, O, C, Asia1, SAT 1, SAT2 및 SAT3)으로 분류되고 있다.
현재 전 세계적으로 항바이러스제를 개발하기 위해 막대한 노력을 기울이고 있는데, 인간면역결핍 바이러스-1과 B형 간염 치료에 라미부딘(lamibudine), 헤르페스바이러스 감염증 치료에 갠시클로비르(gancyclovir), 호흡기합포체바이러스(respiratory syncytial virus) 및 감염증에 주로 쓰이나 위급 시 다양한 바이러스감염증에 사용되는 리바비린(ribavirin) 등이 허가되어 시판되고 있으며, A형 인플루엔자 바이러스 치료를 위해 허가된 아만타딘(amantadine)과 유사물질인 리만타딘(rimantadine) 뿐만 아니라 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니다아제 저해물질로서 인공합성된 자나미비르(zanamivir, Relenza)와 오셀타미비르(oseltamivir, TAMIFLU™)도 허가되어 시판 중에 있다. 그러나, 자나미비르는 흡입 및 정맥 투여해야 하는 단점이 있으며, 오셀타미비르는 경구투여가 가능하나 최근 내성 바이러스의 출현 보고와 경구투여시 구토와 현기증 등의 부작용이 있어 단점으로 지적되고 있다(Ward P et al., J. Antimicrob. Chemother., 55(supp1), p.i5-i21, 2005). 따라서, 백신 및 치료제와 더불어 부작용없이 안전한 천연물질 성분의 항바이러스제의 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 천연물 유래의 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로 바이러스 71 및 구제역 바이러스 등의 바이러스 유래 질병 예방 및 치료제를 개발하기 위하여 연구하던 중, 한방에서 사용되는 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물이 상기와 같은 바이러스가 감염된 세포에서 세포 생존을 늘리고, 세포 내 바이러스 수를 감소시키는 것을 확인하였고, 세포 내 바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인하였으며, 본 발명의 혼합 추출물이 작약 추출물 또는 일부 조합의 추출물에 비해 바이러스 감염 억제에서 현저한 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 상기 혼합 추출물을 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로 바이러스 71 및 구제역 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 수포성구내염바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV), 엔테로바이러스 71(Enterovirus 71) 및 구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus)에 대한 항바이러스용 약학적 조성물, 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 수포성구내염바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV), 엔테로바이러스 71(Enterovirus 71) 및 구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 바이러스 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로바이러스 71 및 구제역 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 바이러스 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 수포성구내염, 뉴캐슬병, 수족구병, 수막염, 포진성 구협염 및 구제역으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 바이러스성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 수포성구내염, 뉴캐슬병, 수족구병, 수막염, 포진성 구협염 및 구제역으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 바이러스성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 수포성구내염바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV), 엔테로바이러스 71(Enterovirus 71) 및 구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus) 등의 바이러스가 감염된 세포에서 세포 생존을 늘리고, 세포 내 바이러스 수를 감소시키는 것을 확인하였고, 세포 내 바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인하였으며, 본 발명의 혼합 추출물이 작약 추출물 또는 일부 조합의 추출물에 비해 바이러스 감염 억제에서 현저한 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로바이러스 71 및 구제역 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 수포성구내염바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)를 감염시킨 세포에서 바이러스가 복제하면서 나타내는 형광을 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 수포성구내염바이러스를 감염시킨 세포에서 세포 생존과 세포 내 존재하는 바이러스 숫자를 나타낸 도이다. * : 실험결과는 독립적으로 세 번 실험한 결과이며, Student's t-test로 분석하여 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
도 3은 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV)를 감염시킨 세포에서 바이러스가 복제하면서 나타내는 형광을 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 뉴캐슬병 바이러스를 감염시킨 세포에서 세포 생존과 바이러스의 M mRNA를 측정하여 세포 내 존재하는 바이러스 숫자를 나타낸 도이다. * : 실험결과는 독립적으로 세 번 실험한 결과이며, Student's t-test로 분석하여 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
도 5는 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 엔테로바이러스 71(Enterovirus 71, EV71)를 감염시킨 세포에서 세포 생존을 사진과 그래프로 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 혼합 추출물, 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물을 처리한 후 뉴캐슬병 바이러스를 감염시키고 12시간 후 세포에서 바이러스가 복제하면서 나타내는 형광을 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 혼합 추출물, 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물을 처리한 후 뉴캐슬병 바이러스를 감염시키고 24시간 후 세포에서 바이러스가 복제하면서 나타내는 형광을 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 혼합 추출물, 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물을 처리한 후 뉴캐슬병 바이러스를 감염시킨 세포에서 바이러스의 M mRNA를 측정하여 세포 내 존재하는 바이러스 숫자를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 혼합 추출물은 음양곽 1 중량부에 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 금은화, 원지 및 목향을 각각 0.5 내지 5 중량부의 혼합비로 혼합하여 추출한 것이 바람직하고, 상기 혼합 추출물은 물, C1~C2의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 제조된 것이 바람직하며, 상기 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것이 바람직하다.
상기 바이러스는 수포성구내염바이러스(Vesicular Stomatitis Virus, VSV), 뉴캐슬병 바이러스(Newcastle disease virus, NDV), 엔테로바이러스 71(Enterovirus 71) 및 구제역 바이러스(Foot-and-mouth disease virus)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물은 작약 단독 추출물 또는 일부 조합의 혼합 추출물(천궁, 방풍,당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석 및 감초)에 비해 바이러스 감염 억제에 현저한 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 제조하여, 본 발명의 혼합 추출물의 수포성구내염바이러스 감염 억제 효과를 형광현미경과 트립판 블루 염색(trypan blue staining) 방법으로 확인한 결과, 바이러스만 감염시켰을 때에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 바이러스가 복제하면서 나타내는 형광이 감소하는 것을 확인하였고(도 1), 바이러스만 감염시켰을 때에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 세포 생존이 증가하고, 세포 내 존재하는 바이러스 수가 감소하는 것을 확인하였다(도 2).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 혼합 추출물의 뉴캐슬병 바이러스 감염 억제 효과를 형광현미경, 트립판 블루 염색 방법과 RT-PCR 분석법으로 확인한 결과, 바이러스만 감염시켰을 때에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 바이러스가 복제하면서 나타내는 형광이 감소하는 것을 확인하였고(도 3), 바이러스만 감염시켰을 때에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 세포 생존이 증가하고, 세포 내 존재하는 바이러스의 증식이 억제됨을 확인하였다(도 4).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 혼합 추출물의 엔테로 바이러스 71 감염 억제 효과를 형광현미경과 트립판 블루 염색 방법으로 확인한 결과, 바이러스만 감염시켰을 때에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 본 발명의 혼합 추출물의 농도가 증가함에 따라 세포 생존이 증가되는 것을 확인하였다(도 5).
또한, 본 발명자들은 본 발명의 혼합 추출물 외에 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물의 뉴캐슬병 바이러스 감염 억제 효과를 형광현미경 및 RT-PCR 분석법으로 확인한 결과, 뉴캐슬병 바이러스 감염시키고 12시간 후에 형광현미경으로 확인했을 때, 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 바이러스가 복제하면서 나타내는 형광이 현저히 감소하는 것을 확인하였고(도 6), 뉴캐슬병 바이러스를 감염시키고 24시간 후에 형광현미경으로 확인했을 때, 12시간 후 확인했을 때보다 형광이 강해졌고, 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 바이러스가 복제하면서 나타내는 형광이 현저히 감소하는 것을 확인하였으며(도 7), RT-RCR 분석법으로 확인했을 때, 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 세포 내 존재하는 바이러스의 증식이 현저히 억제되는 것을 확인하였다(도 8).
따라서, 본 발명의 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물은 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로바이러스 71 및 구제역 바이러스 등의 바이러스가 감염된 세포에서 세포 생존을 늘리고, 세포 내 바이러스 수를 감소시키는 것을 확인하였고, 세포 내 바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인하였으며, 본 발명의 혼합 추출물이 작약 추출물 또는 일부 조합의 추출물에 비해 바이러스 감염 억제에서 현저한 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로바이러스 71 및 구제역 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내주사, 직장 내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 생지황, 복령, 인삼 및 꿀의 혼합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 상기 조성물은 1일 0.0001 내지 1g/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 200 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 건강기능식품을 제공한다.
상기 혼합 추출물은 음양곽 1 중량부에 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 금은화, 원지 및 목향을 각각 0.5 내지 5 중량부의 혼합비로 혼합하여 추출한 것이 바람직하고, 상기 혼합 추출물은 물, C1~C2의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 제조된 것이 바람직하며, 상기 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것이 바람직하다.
상기 바이러스는 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로바이러스 71 및 구제역 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물은 작약 단독 추출물 또는 일부 조합의 혼합 추출물(천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석 및 감초)에 비해 바이러스 감염 억제에 현저한 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물은 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로바이러스 71 및 구제역 바이러스 등의 바이러스가 감염된 세포에서 세포 생존을 늘리고, 세포 내 바이러스 수를 감소시키는 것을 확인하였고, 세포 내 바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인하였으며, 본 발명의 혼합 추출물이 작약 추출물 또는 일부 조합의 추출물에 비해 바이러스 감염 억제에서 현저한 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로바이러스 71 및 구제역 바이러스에 대한 항바이러스용 건강기능식품으로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 혼합 추출물이 상기와 같은 항바이러스용으로 이용되기 위해서는, 식품학 또는 약제학적 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으며 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료, 환, 과립, 정제 또는 캅셀 형태이다.
본 발명의 건강기능식품은, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 혼합 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명에 따른 건강 기능 식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 항바이러스용 건강기능식품을 원하는 사람의 연령, 성별, 체중, 상태, 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 바람직하게는 성인기준 1일 0.01g 내지 10.0g 정도로 포함되는 것이 좋으며, 이러한 함량을 갖는 건강기능식품을 섭취함으로써 항바이러스 효과를 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 혼합 추출물은 음양곽 1 중량부에 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 금은화, 원지 및 목향을 각각 0.5 내지 5 중량부의 혼합비로 혼합하여 추출한 것이 바람직하고, 상기 혼합 추출물은 물, C1~C2의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 제조된 것이 바람직하며, 상기 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것이 바람직하다.
상기 바이러스성 질환은 수포성구내염, 뉴캐슬병, 수족구병, 수막염, 포진성 구협염 및 구제역으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물은 작약 단독 추출물 또는 일부 조합의 혼합 추출물(천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석 및 감초)에 비해 바이러스 감염 억제에 현저한 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물은 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로바이러스 71 및 구제역 바이러스 등의 바이러스가 감염된 세포에서 세포 생존을 늘리고, 세포 내 바이러스 수를 감소시키는 것을 확인하였고, 세포 내 바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인하였으며, 본 발명의 혼합 추출물이 작약 추출물 또는 일부 조합의 추출물에 비해 바이러스 감염 억제에서 현저한 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로바이러스 71 및 구제역 바이러스에 대한 바이러스성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 바이러스성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 혼합 추출물은 음양곽 1 중량부에 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 금은화, 원지 및 목향을 각각 0.5 내지 5 중량부의 혼합비로 혼합하여 추출한 것이 바람직하고, 상기 혼합 추출물은 물, C1~C2의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 제조된 것이 바람직하며, 상기 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것이 바람직하다.
상기 바이러스성 질환은 수포성구내염, 뉴캐슬병, 수족구병, 수막염, 포진성 구협염 및 구제역으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물은 작약 단독 추출물 또는 일부 조합의 혼합 추출물(천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석 및 감초)에 비해 바이러스 감염 억제에 현저한 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물은 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로바이러스 71 및 구제역 바이러스 등의 바이러스가 감염된 세포에서 세포 생존을 늘리고, 세포 내 바이러스 수를 감소시키는 것을 확인하였고, 세포 내 바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인하였으며, 본 발명의 혼합 추출물이 작약 추출물 또는 일부 조합의 추출물에 비해 바이러스 감염 억제에서 현저한 효과를 나타내는 것을 확인함으로써 수포성구내염바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 엔테로바이러스 71 및 구제역 바이러스에 대한 바이러스성 질환 예방 및 개선용 건강기능식품으로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교 , 박하엽 , 마황, 망초, 대황 , 석고, 길경 , 황금, 백출, 산치자, 형개 , 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물의 제조
모든 생약은 국내산으로 구입하여 시료로 사용하였다. 하기 표 1의 조성을 갖는 생약 약 49g에 물 1ℓ를 가한 후 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 그 후, 100℃에서 3시간 동안 열수추출하여 약 100㎖ 부피의 혼합 추출물을 얻었고, 상기 혼합 추출물을 동결건조하여 약 9.6g의 동결건조물을 얻었다. 상기 혼합 추출물 또는 이의 동결건조물을 본 발명에 사용하였다. 이하 본 발명의 혼합 추출물이라 기재하였다.
원료명 중량(g)
음양곽 1.69
금은화 1.69
원지 1.69
목향 1.69
천궁 1.69
방풍 1.69
당귀 1.69
작약 1.69
연교 1.69
박하엽 1.69
마황 1.69
망초 1.69
대황 1.69
석고 2.62
길경 2.62
황금 2.62
백출 1.31
산치자 1.31
형개 1.31
생강 4.6
활석 6.37
감초 4.5
< 비교예 1> 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교 , 박하엽 , 마황, 망초, 대황 , 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석 및 감초 추출물의 제조
모든 생약은 국내산으로 구입하여 시료로 사용하였다. 하기 표 2의 조성을 갖는 생약 약 43g에 물 1ℓ를 가한 후 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 그 후, 100℃에서 3시간 동안 열수추출하여 약 100㎖ 부피의 추출물을 얻었고, 상기 추출물을 동결건조하여 약 10.5g의 동결건조물을 얻었다. 상기 추출물 또는 이의 동결건조물을 본 발명에 사용하였다. 이하 <비교예 1>의 혼합 추출물이라 기재하였다.
원료명 중량(g)
천궁 1.69
방풍 1.69
당귀 1.69
작약 1.69
연교 1.69
박하엽 1.69
마황 1.69
망초 1.69
대황 1.69
석고 2.62
길경 2.62
황금 2.62
백출 1.31
치자 1.31
형개 1.31
생강 4.5
활석 6.37
감초 4.5
< 비교예 2> 작약 추출물의 제조
작약은 국내산으로 구입하여 시료로 사용하였다. 작약 약 50g에 물 1ℓ를 가한 후 상온에서 1시간 동안 방치하였다. 그 후, 100℃에서 3시간 동안 열수추출하여 약 100㎖ 부피의 작약 추출물을 얻었고, 상기 작약 추출물을 동결건조하여 약 8g의 동결건조물을 얻었다. 상기 작약 추출물 또는 이의 동결건조물을 본 발명에 사용하였다. 이하 작약 추출물이라 기재하였다.
< 실시예 2> 세포 배양
마우스 대식 세포주 RAW 264.7 세포 또는 사람 자궁경부암 세포주 HeLa 세포를 10% 소 태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS), 100 U/ml 페니실린(penicilin) 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(Invitorgen Life Tehchnologies)을 사용하여 배양하였다. 상기 세포는 37℃, 95% 습도, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였으며 2 내지 3일마다 새로운 배양액으로 계대배양하였다.
< 실시예 3> 본 발명의 혼합 추출물의 수포성구내염바이러스 ( VSV - GFP ) 감염 억제 확인
<3-1> 형광현미경을 이용한 바이러스 감염 억제 확인
본 발명의 혼합 추출물의 수포성구내염바이러스 감염 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, RAW 264.7 세포를 24 웰 플레이트에 1×105 세포/웰의 농도로 분주하여 FBS가 10% 함유된 DMEM 배지로 24시간 동안 배양하고, 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 혼합 추출물 0.9 mg/ml 처리한 후 12시간 동안 더 배양하였다. 그 후 수포성구내염바이러스인 VSV-GFP를 1 MOI 감염시킨 뒤 12시간 동안 더 배양하였다. 이때, 양성 대조군으로 1000 U/ml IFN-β(interferon-β)를 사용하였다. 이를 형광학현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 바이러스만 감염시켰을 때에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 바이러스가 복제하면서 나타내는 형광이 감소하는 것을 확인하였다(도 1).
<3-2> 트립판 블루 염색( trypan blue staining) 방법을 이용한 바이러스 감염 억제 확인
본 발명의 혼합 추출물의 수포성구내염바이러스 감염 억제 효과를 확인하기 위해 트립판 블루 염색 방법을 이용하여 세포 생존 및 세포 내 존재하는 바이러스 숫자를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 배양한 세포를 세포의 배지를 제거하고 0.05% trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 부유시켜서 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 각 웰당 적정량을 첨가하여 세포를 모은 다음 2,000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 세포만 남긴 다음 다시 PBS를 1ml 첨가하여 잘 섞은 후 세포 부유액과 0.5% trypan blue(Gibco BRL)를 동량으로 섞은 후 2분간 처리한 후 현미경을 이용하여 살아있는 세포를 계수하였다. 이 때, 양성 대조군으로 1000U/㎖ IFN-β를 사용하였다. 세포의 생존율은 배지에 대한 백분율로 나타내었다.
그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 바이러스만 감염시켰을 때에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 세포 생존이 증가하고, 세포 내 존재하는 바이러스 수가 감소하는 것을 확인하였다(도 2).
< 실시예 4> 본 발명의 혼합 추출물의 뉴캐슬병 바이러스( NDV - GFP ) 감염 억제 확인
<4-1> 형광현미경을 이용한 바이러스 감염 억제 확인
본 발명의 혼합 추출물의 뉴캐슬병 바이러스 감염 억제 효과를 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 뉴캐슬병 바이러스(NDV-GFP)를 감염시킨 후 확인하였다.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 바이러스만 감염시켰을 때에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 바이러스가 복제하면서 나타내는 형광이 감소하는 것을 확인하였다(도 3).
<4-2> 트립판 블루 염색 및 역전사 중합효소 연쇄반응(RT- PCR , reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용한 바이러스 감염 억제 확인
본 발명의 혼합 추출물의 뉴캐슬병 바이러스 감염 억제 효과를 확인하기 위해 트립판 블루 염색을 이용하여 세포 생존을 확인하고, RT-PCR 분석법을 이용해서 세포 내 존재하는 바이러스 숫자를 확인하였다
구체적으로, 트립판 블루 염색은 상기 실시예 <3-2>와 동일한 방법을 이용하였고, RT-PCR 분석법은 상기 실시예 <3-1>에 기재된 방법으로 배양한 세포를 4℃에 보관된 PBS로 세척한 후 스크래퍼를 이용하여 세포를 분리하였다. 상기 분리된 세포를 1,200 rpm, 4℃에서 2분 동안 원심분리하여 상층액을 버리고 펠렛(pellet)을 수득하였다. 그런 다음, 제조사에서 제공한 프로토콜로 RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 총 RNA를 추출하였다. DEPC 처리 증류수를 사용하여 용해한 RNA는 A260/280 비율(Versa Max microplate reader, Molecular Devices)로 흡광도를 측정하여 순도와 농도를 확인하였다. 역전사효소-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하여 전사된 mRNA 발현량을 확인하였다. 동량의 RNA를 올리고(dt)15 프라이머를 이용하여 cDNA로 합성한 후 Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems) 시약과 7500 Fast Real time-PCR system(Applied Biosystems) PCR 기계를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 50℃에서 20초, 95℃에서 10분간 Matrix(M) 단백질과 GAPDH 간의 상대적인 밴드 강도를 그래프로 나타내었다. 상기 RT-PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다.
목적
유전자		 Primer
명칭 서열 방향 서열번호
APMV-1 M APMV-1M_F AGTGATGTGCTCGGACCTTC 정방향 서열번호 : 1
APMV-1M_R CCTGAGGAGAGGCATTTGCTA 역방향 서열번호 : 2
GAPDH GAPDH_F TGACCACAGTCCATGCCATC 정방향 서열번호 : 3
GAPDH_R GACGGACACATTGGGGGTAG 역방향 서열번호 : 4
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 바이러스만 감염시켰을 때에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 세포 생존이 증가하고, 세포 내 존재하는 바이러스의 증식이 억제됨을 확인하였다(도 4).
< 실시예 5> 본 발명의 혼합 추출물의 엔테로바이러스 71( EV71 ) 감염 억제 확인
본 발명의 혼합 추출물의 엔테로바이러스 71 감염 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, HeLa 세포를 24 웰 플레이트에 1×105 세포/웰의 농도로 분주하여 FBS가 10% 함유된 DMEM 배지로 24 h 동안 배양하고, 본 발명의 혼합 추출물을 각각 0.5, 1, 2% 처리한 후 12시간 동안 더 배양하였다. 그 후 엔테로바이러스 71인 EV71을 1 MOI 감염시킨 뒤 12시간 동안 더 배양하였다. 이 때, 양성 대조군으로 1000 U/㎖ IFN-β를 사용하였다. 이를 현미경을 통해 관찰하였고, 배양한 세포를 이용하여 상기 실시예 <3-2>와 동일한 방법으로 트립판 블루 염색을 하여 세포 생존을 확인하였다.
그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 바이러스만 감염시켰을 때에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 본 발명의 혼합 추출물의 농도가 증가함에 따라 세포 생존이 증가되는 것을 확인하였다(도 5).
< 실시예 6> 본 발명의 혼합 추출물 및 다른 추출물의 뉴캐슬병 바이러스( NDV - GFP ) 감염 억제 확인
<6-1> 바이러스 감염 12시간 후 다양한 추출물의 바이러스 감염 억제 확인
본 발명의 혼합 추출물, 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물의 뉴캐슬병 바이러스 감염 억제 효과를 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 각각의 추출물을 두 가지 농도로 처리한 후, 뉴캐슬병 바이러스(NDV-GFP)를 감염시키고 12시간 후에 확인하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 바이러스가 복제하면서 나타내는 형광이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 6).
<6-2> 바이러스 감염 24시간 후 다양한 추출물의 바이러스 감염 억제 확인
본 발명의 혼합 추출물, 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물의 뉴캐슬병 바이러스 감염 억제 효과를 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 각각의 추출물을 두 가지 농도로 처리한 후, 뉴캐슬병 바이러스(NDV-GFP)를 감염시키고 24시간 후에 확인하였다.
그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 뉴캐슬병 바이러스를 감염시킨 후 12시간 후보다 형광이 강해졌고, 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 바이러스가 복제하면서 나타내는 형광이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 7).
<6-3> RT- PCR 분석법을 이용한 바이러스 감염 억제 확인
본 발명의 혼합 추출물, 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물의 뉴캐슬병 바이러스 감염 억제 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 <4-2>와 동일한 방법으로 각각의 추출물을 두 가지 농도로 처리한 후, RT-PCR 분석법을 이용해서 세포 내 존재하는 바이러스 숫자를 확인하였다.
그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이, 뉴캐슬병 바이러스만 감염시켰을 때를 100%로 보았을 때, 작약 추출물을 처리한 경우에는 약 75% 바이러스의 증식이 감소하였고, <비교예 1>의 추출물을 처리한 경우에는 약 55% 바이러스의 증식이 감소한 반면, 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 경우에는 약 100% 바이러스의 증식이 감소하는 것을 확인하였다(도 8). 이에, 작약 추출물 및 <비교예 1>의 추출물에 비해서 본 발명의 혼합 추출물을 처리한 후 바이러스를 감염시켰을 때 세포 내 존재하는 바이러스의 증식이 현저히 억제되는 것을 확인하였다.
<110> KOREA INSTITUTE OF ORIENTAL MEDICINE <120> Composition for the prevention and treatment of antiviral comprising extracts of crude drug complex <130> PN16287 <150> KR 14/134,095 <151> 2014-10-06 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APMV-1M_F <400> 1 agtgatgtgc tcggaccttc 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APMV-1M_R <400> 2 cctgaggaga ggcatttgct a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_F <400> 3 tgaccacagt ccatgccatc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_R <400> 4 gacggacaca ttgggggtag 20

Claims (10)

  1. 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 엔테로바이러스 71(Enterovirus 71)의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 음양곽 1 중량부에 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 금은화, 원지 및 목향을 각각 0.5 내지 5 중량부의 혼합비로 혼합하여 추출한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 물, C1~C2의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 제조된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 엔테로바이러스 71(Enterovirus 71)의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  6. 제5항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 음양곽 1 중량부에 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 금은화, 원지 및 목향을 각각 0.5 내지 5 중량부의 혼합비로 혼합하여 추출한 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
  7. 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 수족구병, 수막염 또는 포진성 구협염의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 음양곽 1 중량부에 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 금은화, 원지 및 목향을 각각 0.5 내지 5 중량부의 혼합비로 혼합하여 추출한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 음양곽, 금은화, 원지 및 목향의 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 수족구병, 수막염 또는 포진성 구협염의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  10. 제9항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 음양곽 1 중량부에 천궁, 방풍, 당귀, 작약, 연교, 박하엽, 마황, 망초, 대황, 석고, 길경, 황금, 백출, 산치자, 형개, 생강, 활석, 감초, 금은화, 원지 및 목향을 각각 0.5 내지 5 중량부의 혼합비로 혼합하여 추출한 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
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