KR101673894B1

KR101673894B1 - 황금 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 엔테로 바이러스에 기인한 질환의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101673894B1
Application number: KR1020140037453A
Authority: KR
Inventors: 고현정; 허문영; 김현표; 송재형; 조성찬; 송혁환
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 한국생명공학연구원
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2016-11-09
Also published as: KR20150113484A

Abstract

본 발명은 항엔테로바이러스를 갖는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 황금의 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은(1) 베로(vero) 세포에서의 세포독성 및 EV71, CVB3, CVA16의 항바이러스 활성실험, 세포병변 억제실험; (2) EV71에 대한 항바이러스 활성을 확인하기 위한 enterovirus 71의 VP단백질에 대한 Western blot 분석법; (3) replicon system(pRibFluc-EV71)을 이용한 Replicon 분석법을 통한 항바이러스 활성 메카니즘 분석실험; (4) BALB/c 마우스를 이용한 CVB3 바이러스에 대한 항바이러스 활성 측정을 위한 in vivo 동물실험 등의 광범위한 시험관내 실험(in vitro test) 및 생체내 동물실험(in vivo test)를 통하여, 본 발명의 상기 시료들이 강력한 항 엔테로바이러스 활성을 나타냄을 확인함으로, 상기 조성물을 엔테로 바이러스에 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

황금 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 엔테로 바이러스에 기인한 질환의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising the extract of Scutellaria baicalensis and the compound isolated therefrom for preventing and treating the viral disease caused by enterovirus}

본 발명은 황금 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 엔테로 바이러스에 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.

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엔테로바이러스(Enterovirus)는 27~30 nm 크기의 envelope를 갖지 않는 바이러스로써 정이십면체의 형태를 이루고, 현재까지 약 68여종 이상의 혈청형이 알려져 있다. 이것은 분류학적으로 Picornaviridae과의 Enterovirus속에 속하며, 이들 속에는 3가지 혈청형의 Poliovirus (PV: 1~3)와 23가지 혈청형의 Coxsackievirus A군 (CVA: 1~22, 24), 6가지 혈청형의 Coxsackievirus B군 (CVB: 1~6), 그리고 28가지 혈청형의 Echovirus군 (ECV: 1~7, 9, 11~21, 24~27, 29~33) 및 기타 Human Enterovirus (EV: 68~116)등으로 구성되어 있다 [1-4]. 그러나 최근 enterovirus 연구자들은 RdRp (RNA dependent RNA polymerase)유전자의 염기서열을 이용한 계통분석을 통하여 enterovirus 속을 HEV (Human Enterovirus) A~D의 유전자형으로 분류하기도 한다 [1,5]. HEV-A에는 11가지 혈청형의 CVA와 EV71이 속하며, HEV-B는 모든 CVB와 ECV, EV69, EV73 및 CVA9의 38가지 혈청형이 여기에 포함된다. HEV-C는 11가지의 CVA를 포함하며, 마지막으로 HEV-D에는 EV68과 EV70의 두 가지 혈청형만이 여기에 속한다 [6].

엔테로바이러스(Enterovirus)s의 게놈은 약 7.2~7.5kb 크기의 single stranded positive sense RNA의 형태를 갖는다. 그것은 하나의 ORF (open reading frame)와 5´및 3´말단에 단백질로 발현되지 않는 NCR (non-coding region)로 구성되어 있다. ORF는 하나의 polyprotein으로 발현되는데, 약 2,185개의 아미노산으로 이루어져 있다 [7]. 이 polyprotein은 바이러스의 단백질 분해효소에 의해서 여러 개의 다른 단백질로 나누어진다. 하나의 polyprotein은 P1, P2, P3로 구분되어 있는데, P1부분은 바이러스의 캡시드 단백질의 구성요소인 VP4, VP2, VP3, VP1을 순서대로 암호화 하고 있다. P2부분은 2A^pro 단백질분해효소와 현재까지 기능이 정확하게 알려지지 않은 단백질을 암호화하고 있으며, P3부분은 VPg 단백질과 3C^pro 단백질분해효소 및 RdRp가 암호화되어 있다. VPg 단백질은 primer로써 3´쪽에 작용하여, negative sense strand 게놈 형성에 관여 한다 [8]. 5´NCR은 700~800 bp로 구성되어 있고, 매우 복잡한 2차 구조를 형성한다. 이러한 RNA의 2차 구조의 기능은 첫째로 RdRp에 의해서 positive sense RNA가 합성 될 때 시작점으로 제공되고, 둘째는 cap-independent 단백질 합성이 가능하도록 해 준다 [9]. 3´NCR은 100~150 bp로 구성되어 있으며, 이것의 2차 구조는 RNA 게놈의 주형으로 제공되는 negative sense RNA가 합성될 때 primer의 기능에 관여한다고 알려져 있다 [10-14].

엔테로바이러스(Enterovirus)는 주로 하절기에 유ㆍ소아 층에 침범하여 감염자의 면역학적 특성에 따라 중증감염을 초래하기도 한다. 특히 위생이 나쁜 환경에서 흔하게 전파되는 전염성 병원체로써 감염경로는 분변-구강이며, 오염된 물과 토양을 통한 경구적인 전파로 이어진다. 감염자에서 배출된 분변속의 바이러스가 오수나 폐수를 통해 지하수, 하천, 해수로 흘러들어가 다시 사람에게로 전염되는데, 드물게는 호흡기 분비물을 통해서도 감염 된다 [15,16]. Enterovirus는 소화기를 통해 감염된 후 인후두 부위나 소장의 림프절에서 일차적으로 증식한 후 신체의 각 장기로 이동 한다 [17]. 임상증상은 감기 등의 가벼운 증상부터 심각한 마비까지 매우 다양하다. 소아인 경우 비폴리오성 enterovirus 감염은 50%정도 불현성 감염으로 나타지만, 나머지 경우 상기도 감염이나, 소화기증상, 결막염, 중이염, 피부발진, 무균성수막염, 포진성구협염, 수족구병, 고환염 등의 증상을 보인다. 드물게 심근염, 뇌염, Guillian-Barre syndrome, 실조증, 말단신경염, 횡단성척수염, 사지마비, 당뇨병, 유행성출혈성 각결막염 등 치명적이거나 합병증을 남기는 경우도 보고되어 있다 [18-22]. Enterovirus에 의한 대표적인 증상은 무균성수막염이고 주로 하절기에 발생하지만 봄이나 늦가을, 그리고 겨울에도 산발적으로 발생하는 경우가 있어 일 년 내내 감염될 위험이 존재한다. 또한 주된 발생 연령층은 영유아나, 경우에 따라 소아 및 노령층에서도 발생할 수 있다 [23,24].

현재 개발되어 있는 항바이러스제제에 대한 바이러스 내성의 증가로 인하여, 최근에는 안전성과 보다 높은 효과, 그리고 저렴한 생산비용을 갖는 항바이러스제제들이 개발 중이지만 아직도 많은 바이러스들에서 치료 효과를 갖는 제제는 없다 [25]. 그런 이유로 아시아, 유럽 그리고 미국 등지의 과학자들은 약용식물을 기반으로 한 전통의학으로부터 항바이러스 제제에 대한 자료들을 이용하고 있다 [26-28]. 약용 식물들은 종종 여러 항바이러스 효과를 나타내는데, 이들은 부작용과 내성의 잠재성이 적고 생산비용이 낮다. 이미 많은 약용 식물들은 바이러스에 감염된 사람이나 동물들에 적용되어 강력한 항바이러스 효과를 나타내고 있다 [29,30].

엔테로바이러스(Enterovirus)에 속하는 많은 바이러스의 경우, 적절한 마우스 모델이 없어 항바이러스제 연구에 있어서 큰 걸림돌이 되고 있다. 최근 EV71에 대한 세포 수용체가 규명되고, 인간 수용체를 가지고 있는 형질도입 마우스가 개발되어 연구가 진행되고 있으나, 아직까지 널리 사용되고 있지 못하고 있는 실정이다 [31, 32]. 반면에, Enterovirus 중 CVB3는 인간 뿐 아니라 마우스에서도 감염이 되는 것으로 알려져 있으며, 간, 심장, 뇌, 척수 및 췌장에 감염되는 것으로 알려져 있다 [33, 34]. CVB3 감염의 경우, 앞서 설명한 것과 같이 사람에 감염된 경우 대부분 특이한 증상이 없이 지나가는 것으로 알려져 있지만, 일부 제1형 당뇨병의 발병과 연관이 있음이 보고되었다 [35]. 또한, 췌장에 존재하는 Acinar 세포와 베타세포가 CVB3 에 감염되는 것이 보고되었으며, 마우스 모델에 있어서도 CVB3에 의한 췌장 감염이 일어나는 것이 잘 알려져 있다 [36, 37].

Picornaviridae과에 속하는 EV71, CVB3, CVA16은 외피 비보유 positive-sense, single-stranded RNA viruses이다 [38, 39]. 영유아와 어린이에게서 EV71 및 CVA16 감염은 감염 초기 단계에서 발열, 두통, 인후통 등의 가벼운 감기증상과 함께 수족구병을 유발한다. EV71 및 CVA16 감염 후 수일이 지나면 손, 발, 입안에 궤양과 발진을 유발할 뿐만 아니라 호흡기, 장, 심장, 중추 신경 시스템도 감염을 유발한다 [38, 39]. 또한, EV71는 종종 소아마비와 같은 급성 이완성 마비와 뇌염을 일으킬 수 있다. CVB3는 소아 및 청소년층에서 가벼운 복통에서 본격적인 심낭염 및 심근염에 이르기까지 다양한 질병을 유발 한다고 알려져 있다 [40]. 그러나, 최근 여러 나라에서 EV71, CVB3 및 CV16의 반복적인 발생에도 불구하고, 사용 가능한 백신 또는 효과적인 항 바이러스 치료제의 개발이 어려운 실정이다. 따라서, EV71, CVB3 및 CVA16 감염을 치료하는 효과적인 항바이러스 치료제의 개발이 시급한 실정이다.

엔테로바이러스(Enterovirus)에 대한 항바이러스제 개발은 지속적으로 연구되어져 왔다. 플레코나릴(Pleconaril)은 감수성이 있는 세포의 수용체와 결합을 하는 바이러스의 캡시드 단백질에 결합하여 바이러스가 세포내로 들어가는 것을 방해함으로써 항바이러스 활성을 나타낸다고 보고되어 있다 [41]. Pleconaril은 임상적으로는 78%, 바이러스학적으로는 92%, 실험적으로는 88%에서 enterovirus 감염 환자에게서 바이러스를 억제하는 활성을 나타낸 것으로 보고되고 있으나, 부작용으로 인해 FDA의 승인을 받지 못하였고 이것의 사용은 대부분 생명이 위험한 상황에 한정되며, 이것에 대한 내성 바이러스 또한 보고되고 있는 실정이다 [42-44]. 또한 RNA 바이러스 및 DNA 바이러스에 광범위한 항바이러스 활성을 나타내는 항바이러스제인 리바비린(Ribavirin) 역시 다양한 바이러스에서 약제내성을 나타내는 것으로 보고 되어있다 [45].

황금 (Scutellaria baicalensis Georgi)은 꿀풀과에 속하는 여러해살이 식물로 중국, 일본, 한국에서 약용식물로 널리 사용되고 있다. 황금의 주요 효능은 염증, 호흡기 감염, 소화기 감염에 효과가 있다고 알려져 있다 [46]. 황금의 주요 성분으로는 바이칼레인(baicalein), 바이칼린(baicalin), 우고닌(wogonin), 노르우고닌(norwogonin), 오록실린(oroxylin) A, β-시토스테롤(sitosterol), 모슬로플라본(mosloflavone) 등이 알려져 있다 [47]. Oroxylin A는 항암효과[48], 항미생물[49] 효과, 인식강화[50] 등 많은 생물학적 활성을 가지고 있다고 알려져 있다. Oroxylin A의 항암 효과는 가장 활발히 연구되는 분야로 세포자살 [51], 전이억제 [52], 세포주기 억제 [53]등 다양한 메커니즘으로 항암효과를 나타낸다고 알려져 있다.

오록실린(Oroxylin) A는 O-methyl기를 가지고 있는 flavone으로 황금에서 발견되었으며, 황금은 바이칼레인(baicalein) 및 우고닌(wogonin) 등의 생리활성 물질을 가지고 있는 유용한 약용 식물이다 [54]. Oroxylin A 는 다양한 약리작용을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 항염, 항암, 항혈전 작용을 타나내는 것이 보고되었다 [55]. 또한 최근 연구를 통해 황금 추출물과 에틸아세테이트 및 클로로포름 분획물이 influenza virus [56], RSV [57], HBV [58, 59], 및 HIV-1 [60]에 항바이러스 활성을 나타내는 것이 보고되었으며, 이러한 항바이러스 활성이 wogonin, oroxylin 또는 baicalein등에 의해 나타나는 것으로 보고되었다. 이와 더불어 최근 황금의 수용성 추출물 및 baicalein이 dengue virus의 복제를 억제하여 항바이러스 활성을 나타냄이 보고되었다 [61, 62].

그러나, 아직까지 오록실린(oroxylin) A, 노르우고닌(norwogonin), 모슬로플라본(mosloflavone) 및 이들을 포함하는 황금 추출물과 분획물이 엔테로바이러스(enterovirus)에 대한 항바이러스 활성을 가지고 있음은 보고된 바 없다.

이에 본 발명에서는 황금 추출물 및 클로로포름 분획물, 그리고 클로로포름 분획물 중 포함된 오록실린(oroxylin) A, 노르우고닌(norwogonin), 모슬로플라본(mosloflavone)이 CVB3, CVA16 및 EV71에 대한 광범위 항바이러스 활성을 나타냄을 Vero세포에서 세포병변 억제 효과실험 및 세포독성 실험 등의 in vitro과 in vivo 동물실험을 통해 증명하고, 본 연구를 통해 황금 추출물, 분획물 및 황금에 포함된 norwogonin, oroxylin A, mosloflavone의 enterovirus 감염치료 효과를 최초로 규명하였다.

본 연구에서는 엔테로바이러스(enterovirus)속에 속하는 EV71, CVB3 및 CVA16에 대하여 황금 추출물 및 이로부터 분리된 오록실린(oroxylin) A, 노르우고닌(norwogonin), 모슬로플라본(mosloflavone) 화합물 시료를 대상으로 (1) Vero 세포에서의 세포독성 및 EV71, CVB3, CVA16의 항바이러스 활성실험, 세포병변 억제실험(실험예 1); (2) EV71에 대한 항바이러스 활성을 확인하기 위한 enterovirus 71의 VP단백질에 대한 Western blot 분석법 (실험예 2); (3) replicon system (pRibFluc-EV71)을 이용한 Replicon 분석법을 통한 항바이러스 활성 메카니즘 분석실험 (실험예 3); (4) BALB/c 마우스를 이용한 CVB3 바이러스에 대한 항바이러스 활성 측정을 위한 in vivo 동물실험(실험예 4) 등의 광범위한 시험관내 실험(in vitro test) 및 생체내 동물실험(in vivo test)를 통하여, 본 발명의 상기 시료들이 강력한 항 엔테로바이러스(enterovirus) 활성을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황금 추출물 또는 이로부터 분리된 노르우고닌(norwogonin), 오록실린(oroxylin) A, 및 모슬로플라본(mosloflavone)으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 엔테로 바이러스에 기인한 감염증의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 황금 추출물 또는 이로부터 분리된 노르우고닌(norwogonin), 오록실린(oroxylin) A, 및 모슬로플라본(mosloflavone)으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물 및 기존 항엔테로 바이러스제와의 조합을 유효성분으로 함유하는 엔테로 바이러스에 기인한 감염증의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.

또한, 황금 추출물 또는 이로부터 분리된 노르우고닌(norwogonin), 오록실린(oroxylin) A, 및 모슬로플라본(mosloflavone)으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 항엔테로 바이러스제를 제공한다.

본 발명은 황금 추출물 또는 이로부터 분리된 노르우고닌(norwogonin), 오록실린(oroxylin) A, 및 모슬로플라본(mosloflavone)으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 엔테로 바이러스에 기인한 감염증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 황금 추출물은 황금의 줄기, 엽 및 뿌리줄기를 포함하는 전초의 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 조추출물은 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 메탄올 또는 물 및 메탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 메탄올에 가용한 추출물임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 비극성용매 가용 추출 분획물은 본원의 조추출물로부터 헥산, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 또는 에틸아세테이트, 바람직하게는 헥산, 또는 클로로포름 용매에 가용한 추출물만을 정제한 비극성 용매에 가용한 추출 분획물들을 포함한다.

본원에서 정의되는 극성용매 가용 추출물은 상기 조추출물로부터 비극성용매 가용분획물들을 제거하고 남은 물, 메탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 용매, 바람직하게는 물 또는 부탄올, 보다 바람직하게는 부탄올에 가용한 추출 분획물을 포함한다.

본원에서 정의되는 엔테로바이러스(enterovirus)는 3가지 혈청형의 Poliovirus (PV: 1~3); 23가지 혈청형의 Coxsackievirus A군 (CVA: 1~22, 24); 6가지 혈청형의 Coxsackievirus B군 (CVB: 1~6); 28가지 혈청형의 Echovirus군 (ECV: 1~7, 9, 11~21, 24~27, 29~33) 및 기타 인체 Enterovirus (EV: 68~116)으로 구성된 군으로부터 선택된 혈청형, 보다 바람직하게는 EV71, CVB3, 또는 CVA16 혈청형을 가짐을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 엔테로바이러스(enterovirus)에 기인한 질환은 수족구병, 상기도 감염증, 소화기증상, 결막염, 중이염, 피부발진, 무균성수막염, 포진성구협염, 고환염, 심근염, 뇌염, 길라안-바레 증후군 (Guillian-Barre syndrome), 실조증, 말단신경염, 횡단성척수염, 사지마비, 당뇨병, 유행성출혈성 각결막염, 궤양, 발진, 소아마비와 같은 급성 이완성 마비, 심낭염, 제1형 당뇨병, 또는 췌장 감염증, 바람직하게는, 상기도 감염증, 결막염, 무균성수막염, 포진성구협염, 심근염, 뇌염, 제1형 당뇨병, 또는 췌장 감염증을 포함한다.

본원에서 정의되는 기존 항엔테로바이러스(enterovirus)제는 플레코나릴(Pleconaril), 루핀트리비르(Rupintrivir), 타미플루(Oseltamivir; Tamiflu), 렐렌자(Zanamivir, Relenza), 페라미비르(Peramivir), 아만타딘(Amantadine, Symmetrel), 리만타딘(Rimantadine), 리바비린(Rivabirin), 또는 타리바비린(Taribavirin)으로부터 선택된 항바이러스제이며, 바람직하게는 플레코나릴(Pleconaril), 루핀트리비르(Rupintrivir) 또는 리바비린(Rivabirin)을 포함한다.

상기 질환은 사람을 포함한 포유동물에 발생하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 황금 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 0.1 ~ 50 중량% 포함한다.

본 발명의 화합물은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

본원에서 정의되는 약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동일한 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아 세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 하이드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포 네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조 방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 추출물 및 화합물들은 하기와 같은 제조방법으로 수득될 수 있다.

예를 들어, 이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 황금 추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다. 건조된 황금 전초를 세척 및 세절 후 정제수를 포함한 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물, 메탄올, 에탄올 및 이의 혼합용매를 수회 섞은 다음에 30℃ 내지 150℃, 바람직하게는 실온에서 12시간 내지 30일, 바람직하게는 1일 내지 7일 동안 초음파 추출법, 열수 추출법, 상온 추출법 또는 환류추출법, 바람직하게는 상온 추출법을 약 1 내지 20회, 바람직하게는 2 내지 10회 반복 수행하여 얻은 추출액을 여과, 감압 농축, 및 건조하여 본 발명의 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 극성용매 또는 비극성용매 가용 추출물은 상기에서 얻은 조추출물, 바람직하게는 30 내지 90% 에탄올 조추출물 중량의 약 0.0005 내지 5배, 바람직하게는 0.05 내지 0.5배 부피 (v/w%)의 물을 가한 후, n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 및 부탄올을 이용한 통상적인 분획과정을 수행하여 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 등의 비극성 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출 분획물; 및 부탄올, 물 등의 극성용매에 가용한 극성용매 가용 추출 분획물을 수득할 수 있다.

상기에서 수득한 n-헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트 등의 비극성 용매에 가용한 비극성 용매 가용 추출 분획물, 바람직하게는 헥산 가용분획물을 헥산 및 메틸렌클로라이드 혼합용매를 극성을 증가시키는 방법을 이용하여 플래쉬 컬럼크로마토그래피, RP C18 컬럼크로마토그래피 또는 실리카겔 오픈 컬럼크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 이용한 정제방법을 선택적으로 수회 반복 수행하여 본 발명의 화합물인 레이노우디올(reynoudiol)을 각각 정제 및 수득할 수 있다.

본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 추출물 및 화합물들을 대상으로 한, (1) 베로(vero) 세포에서의 세포독성 및 EV71, CVB3, CVA16의 항바이러스 활성실험, 세포병변 억제실험(실험예 1); (2) EV71에 대한 항바이러스 활성을 확인하기 위한 enterovirus 71의 VP단백질에 대한 Western blot 분석법 (실험예 2); (3) replicon system(pRIBFluc-EV71)을 이용한 Replicon 분석법을 통한 항바이러스 활성 메카니즘 분석실험 (실험예 3); (4) BALB/c 마우스를 이용한 CVB3 바이러스에 대한 항바이러스 활성 측정을 위한 in vivo 동물실험(실험예 4) 등의 광범위한 시험관내 실험(in vitro test) 및 생체내 동물실험(in vivo test)를 통하여, 본 발명의 상기 시료들이 강력한 항 엔테로바이러스 활성을 나타냄을 확인함으로, 상기 조성물을 엔테로 바이러스에 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.

따라서, 본원 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 황금 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 엔테로 바이러스에 기인한 질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

또한, 황금의 줄기, 엽 및 뿌리줄기는 오랫동안 식용되거나 생약으로 사용되어 오던 약재로서 본 발명의 황금 추출물로부터 분리된 화합물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

본 발명의 추출물 또는 화합물을 함유하는 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물 또는 화합물을 함유하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물 또는 화합물을 함유하는 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물 또는 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 황금 추출물 또는 이로부터 분리된 노르우고닌(norwogonin), 오록실린(oroxylin) A, 및 모슬로플라본(mosloflavone)으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 엔테로 바이러스에 기인한 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물 또는 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 엔테로 바이러스로 인한 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물 또는 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등))및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

또한, 본 발명은 엔테로 바이러스에 기인한 질환의 개선을 위한 황금 추출물 또는 이로부터 분리된 노르우고닌(norwogonin), 오록실린(oroxylin) A, 및 모슬로플라본(mosloflavone)으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 주성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 엔테로 바이러스에 기인한 질환의 개선을 위한 황금 추출물 또는 이로부터 분리된 노르우고닌(norwogonin), 오록실린(oroxylin) A, 및 모슬로플라본(mosloflavone)으로 구성된 군으로부터 선택된 화합물을 주성분으로 함유하는 식품 또는 식품첨가물을 제공한다.

또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품 안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 화합물이 포함된 기능성 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류 우유류, 저지방 우유류, 유당분해우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품 마가린, 쇼트닝 및 피자를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물 또는 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, (예를 들어, 포도당, 과당 등); 디사카라이드, (예를 들어 말토스, 슈크로스 등); 및 폴리사카라이드, (예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1~20 g, 바람직하게는 약 5~12 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 황금 추출물 및 이로부터 분리된 화합물은 (1) 베로(vero) 세포에서의 세포독성 및 EV71, CVB3, CVA16의 항바이러스 활성실험, 세포병변 억제실험(실험예 1); (2) EV71에 대한 항바이러스 활성을 확인하기 위한 enterovirus 71의 VP단백질에 대한 Western blot 분석법 (실험예 2); (3) replicon system(pRIBFluc-EV71)을 이용한 Replicon 분석법을 통한 항바이러스 활성 메카니즘 분석실험 (실험예 3); (4) BALB/c 마우스를 이용한 CVB3 바이러스에 대한 항바이러스 활성 측정을 위한 in vivo 동물실험(실험예 4) 등의 광범위한 시험관내 실험(in vitro test) 및 생체내 동물실험(in vivo test)를 통하여, 본 발명의 상기 시료들이 강력한 항 엔테로바이러스 활성을 나타냄을 확인함으로, 상기 조성물을 엔테로 바이러스에 기인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하다.

도 1는 본 발명의 시료의 EV71 감염에 의한 세포 독성에 미치는 효과를 나타낸 도이며(여기에서, (A) 비감염 세포(Noninfected cells); (B) norwogonin 시료 처치 비감염 세포(noninfected cells treated with norwogonin); (C) oroxylin A 시료 처치 비감염세포(noninfected cells treated with oroxylin A); (D) mosloflavone 시료 처치 비감염세포(noninfected cells treated with mosloflavone); (E) 리바비린 처치 비감염세포(noninfected cells treated with ribavirin); (F) EV71-감염 세포(EV71-infected cells); (G) norwogonin 시료 EV71-감염 세포 (EV71-infected cells treated with norwogonin); (H) oroxylin A 시료 EV71-감염 세포 (EV71-infected cells treated with oroxylin A); (I) mosloflavone 시료 EV71-감염 세포 (EV71-infected cells treated with mosloflavone); (J) 리바비린 처치 EV71-감염 세포 (EV71-infected cells treated with ribavirin)을 각각 나타냄);
도 2는 본 발명의 시료의 CVB3 감염에 의한 세포 독성에 미치는 효과를 나타낸 도이며(여기에서, (A) 비감염 세포(Noninfected cells); (B) norwogonin 시료 처치 비감염 세포(noninfected cells treated with norwogonin); (C) oroxylin A 시료 처치 비감염세포(noninfected cells treated with oroxylin A); (D) mosloflavone 시료 처치 비감염세포(noninfected cells treated with mosloflavone); (E) 리바비린 처치 비감염세포(noninfected cells treated with ribavirin); (F) CB3-감염 세포(CB3-infected cells); (G) norwogonin 시료 CB3-감염 세포 (CB3-infected cells treated with norwogonin); (H) oroxylin A 시료 CB3-감염 세포 (CB3-infected cells treated with oroxylin A); (I) mosloflavone 시료 CB3-감염 세포 (CB3-infected cells treated with mosloflavone); (J) 리바비린 처치 CB3-감염 세포 (CB3-infected cells treated with ribavirin)을 각각 나타냄);
도 3는 본 발명의 시료의 CVA16 감염에 의한 세포 독성에 미치는 효과를 나타낸 도이며(여기에서, (A) 비감염 세포(Noninfected cells); (B) norwogonin 시료 처치 비감염 세포(noninfected cells treated with norwogonin); (C) oroxylin A 시료 처치 비감염세포(noninfected cells treated with oroxylin A); (D) mosloflavone 시료 처치 비감염세포(noninfected cells treated with mosloflavone); (E) 리바비린 처치 비감염세포(noninfected cells treated with ribavirin); (F) CVA16-감염 세포(CVA16-infected cells); (G) norwogonin 시료 CVA16-감염 세포 (CVA16-infected cells treated with norwogonin); (H) oroxylin A 시료 CVA16-감염 세포 (CVA16-infected cells treated with oroxylin A); (I) mosloflavone 시료 CVA16-감염 세포 (CVA16-infected cells treated with mosloflavone); (J) 리바비린 처치 CVA16-감염 세포 (CVA16-infected cells treated with ribavirin)을 각각 나타냄);
도 4는 본 발명의 시료의 EV71에 대한 항바이러스 활성을 나타낸 도이며(결과는 독립적인 삼중 실험치의 백분율 수치의 형균(mean) ± S.D.로 나타냄);
도 5는 본 발명의 시료의 CVB3에 대한 항바이러스 활성을 나타낸 도이며(결과는 독립적인 삼중 실험치의 백분율 수치의 형균(mean) ± S.D.로 나타냄);
도 6는 본 발명의 시료의 CVA16에 대한 항바이러스 활성을 나타낸 도이며(결과는 독립적인 삼중 실험치의 백분율 수치의 형균(mean) ± S.D.로 나타냄);
도 7는 본 발명의 시료의 EV71 바이러스 Capside 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 8는 본 발명의 시료의 EV71 바이러스 복제(replication) 및 번역(translation)에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 9는 CVB3 감염된 BALB/c 마우스에서 황금 추출물 및 oroxylin A 투여에 의한 마우스 체중 변화를 측정한 도이며;
도 10은 CVB3 감염된 BALB/c 마우스에서 황금 추출물 및 oroxylin A 투여에 의한 췌장 조직 분석를 수행한 도이며; (A) A : 비감염군; B : 바이러스 감염군; C : 황금 methanol 추출물 처치 바이러스 감염군; D : oroxylin A 시료 처치 바이러스 감염군 (B) 췌장의 acini cell 수를 나타냄.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 황금 추출물 및 분획

1-1. 황금의 조추출물의 제조

청주시 상당구에 위치한 대림건재약업사로부터 구입한 건조한 황금 1.2kg에 메탄올(methanol) 6.0 L를 가하여 실온에서 24시간 침지하여 추출하고 감압농축기를 이용하여 농축하여 메탄올(methanol) 추출물 66.3 g을 (이하, “SBM”이라 함) 얻어 CVB3에 대한 항바이러스 활성을 측정하였다.

1-2. 극성 용매 및 비극성용매 가용 추출물의 분획

실시예 1-1에서 얻은 메탄올 추출물 (66.3 g)을 증류수에 현탁(suspension)하고, 당 업계에 통상적인 분획방법에 따라 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), n-부탄올(BuOH)로 차례대로 분획하고 감압 건조하여 클로로포름 가용 분획물 (15.0g, 이하, SBC라 함),에틸아세테이트 가용 분획물 (18.2 g, 이하, SBE라 함), n-BuOH 가용 분획물 (13.6g, 이하, SBB라 함)을 얻은 후 물 분획(이하, SBW라 함)로 분획하였고 각 분획물들의 항바이러스 활성을 실험한 결과 클로로포름층에서 유의적인 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인 하였다 (표 1).

Antiviral activity of S. baicalensis Georgi against CVB3 in vero cell

	Coxsackievirus B3
Compound	CC₅₀ ^a	IC₅₀ ^b	TI^c
Methanol (SBM)	62.5	9.53±0.85	1.6
Chloroform (SBC)	37.5	9.76±0.26	2.4
Ethyl acetate (SBE)	91.6	ND^d	1.8
Butanol (SBB)	113.5	ND^d
Water	ND^d	ND^d
Results are presented as the mean IC₅₀ values ± S.D obtained from three independent experiments carried out in triplicate. ^a Concentration required to reduce cell growth by 50% (μg/mL). ^b Concentration required to inhibit virus-induced CPE by 50% (μg/mL). ^c Therapeutic index = CC₅₀/IC₅₀ ^d Not determined

1-3. 활성 화합물의 분리

실시예 1-2에서 항바이러스 활성을 나타낸 chloroform층을 C18 실리카 겔 컬럼 흡착 크로마토그래피 (C-18 silica gel column adsorption chromatography, 2.5 × 25 cm)에 methanol과 water 3:7, 4:6, 6:4, 8:2, 10:0 비율의 혼합용매를 500ml 각각 두 번 용출용매로 이용하여 11개의 분획으로 분리하였다. Fraction 6에서 13번 분획물을 sephadex LH-20 컬럼(25-100 μm, Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany)컬럼 크로마토그래피 (2.5 × 170 cm)에 100% methanol을 이용하여 분리 정제하였으며, 활성이 확인된 물질들은 ESI-MS, ¹HNMR과 ¹³C NMR 분석을 실시하여 문헌에 기재된 물성티와 비교하여 norwogornin (표 2), oroxylin A (표 3), 그리고 mosloflavone (표 4)으로 각각 그 구조를 동정하였다 [63-65]

¹H-NMR and ¹³C-NMR chemical shifts of norwogonin

Position	¹³C-NMR	¹H-NMR
2	163.0
3	104.6	6.93 (S)
4	182.2
5	153.1
6	98.8	6.34 (s)
7	145.6
8	125.1
9	153.7
10	103.9
1’	130.9
2’	126.5	8.16 (dd, J=6.0, 2.0)
3’	129.0	7.59 (m)
4’	131.9	7.59 (m)
5’	129.0	7.59 (m)
6’	126.5	8.16 (dd, J=6.0, 2.0)
-OH		8.83 (s)
-OH		10.54 (s)
-OH		12.27 (s)

Norwogornin 의 구조

¹H-NMR and ¹³C-NMR chemical shifts of oroxylin A

Position	¹³C-NMR	¹H-NMR
2	163.2
3	104.6	6.95(s)
4	182.2
5	152.7
6	130.7
7	157.6
8	94.4	6.63(s)
9	152.5
10	104.3
1’	131.5
2’	126.4	8.05 (dd, J=6.4, 1.6)
3’	129.1	7.58(m)
4’	132.0	7.58(m)
5’	129.1	7.58(m)
6’	126.4	8.05 (dd, J=6.4, 1.6)
-OCH3	59.934	3.76 (s)
-OH		10.79 (s)
-OH		12.92 s)

Oroxylin A의 구조

¹H-NMR and ¹³C-NMR chemical shifts of mosloflavone

Position	¹³C-NMR	¹H-NMR
2	163.4
3	104.9	7.02 (s)
4	182.3
5	152.0
6	131.9
7	158.8
8	91.7	6.95 (s)
9	152.7
10	105.3
1’	130.6
2’	126.4	8.09 (dd, J=6.8, 1.2)
3’	129.1	7.59 (m)
4’	132.1	7.59 (m)
5’	129.1	7.59 (m)
6’	126.4	8.09 (dd, J=6.8, 1.2)
-OCH3	60.0	3.74 (s)
-OCH3	56.4	3.93 (s)
-OH		12.76 (s)

Mosloflavone 의 구조

Antiviral activity of Norwogonin, Oroxylin A and Mosloflavone against EV71, CVB3 and CVA16 in vero cell

	Enterovirus 71			Coxsackievirus B3			Coxsackievirus A16-
Compound	CC₅₀ ^a	IC₅₀ ^b	TI^c	CC₅₀ ^a	IC₅₀ ^b	TI^c	CC₅₀ ^a	IC₅₀ ^b	TI^c
Norwogonin	>50	31.9±6.23	1.6	>50	13.5±9.83	3.7	>50	ND^d	-
Oroxylin A	>50	20.6±1.93	2.4	>50	3.17±1.19	16	>50	17.5±13.7	2.7
Mosloflavone	>50	27.8±6.67	1.8	>50	3.92±2.15	13	>50	ND^d	-
Ribavirin	>50	ND^d		>50	ND^d		>50	ND^d	-
Results are presented as the mean IC₅₀ values ± S.D obtained from three independent experiments carried out in triplicate. ^a Concentration required to reduce cell growth by 50% (μg/mL). ^b Concentration required to inhibit virus-induced CPE by 50% (μg/mL). ^c Therapeutic index = CC₅₀/IC₅₀ ^d Not determined

참조예 1. 바이러스와 세포주 및 시약

Enterovirus는 충청남도 보건환경연구원 미생물검사과에서 제공받았으며 37℃에서 vero 세포(CCL-81, ATCC)에서 증식시켰다. Vero 세포는 DMEM media에 10% FBS와 0.01% 항생제를 첨가하여 유지하였다. 항생제와 trypsinEDTA (15400-054), FBS (16000-044) 그리고 DMEM media (12491-015)는 Gibco사 제품을 사용 하였다. Tissue culture dish (353003)는 Falcon사 제품을 사용하였고 sulforhodamine B (SRB(S9012-25G))는 SigmaAldrich에서 구매하였다. Ribavirin (R0182)은 DUCHEFA (Netherlands)사에서 구입하였고 항바이러스 화합물의 용해용액은 DMSO를 사용하였으며, DMEM media에 희석하였다. DMSO의 최종 농도는 세포배양에 전혀 영향이 없는 최대 농도인 0.1%로 사용하였다. 또한 0.1% DMSO는 세포대조군으로 사용하였다.

실험예 1. 항바이러스 활성 시험

상기 실시예 시료의 항바이러스 활성과 세포독성의 측정은 바이러스에 의해 일어나는 세포 병변을 억제시키는 능력에 대하여 SRB assay로 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 [66, 67].

1-1. 항바이러스 활성 시험

즉, 96-well culture plate (Nunc, Denmark) 각각의 well에 각 바이러스에 감수성을 갖는 세포를 2 X 10⁴의 수로 준비하였다. 24시간 후 96-well culture plate에 각각의 세포가 90%정도 자랐을 때 실험에 이용하였다. 각 well에 media를 제거한 후, 각 세포에 대하여 PBS로 1회 세척하였다. 그 후, 1% FBS와 각각의 바이러스가 포함된 90μL의 DMEM에 적합한 농도의 norwogonin, oroxylin A, mosloflavone 10μL를 첨가하였다. Norwogonin, oroxylin A, mosloflavone 의 항바이러스 활성은 0.4 μg/mL, 2 μg/mL, 10 μg/mL, 및 50 μg/mL 4개의 농도에서 확인하였다.

4개의 well은 화합물을 처리하지 않고 바이러스만 처리한 세포대조구로 사용하였고, 또 다른 4개의 well은 바이러스와 화합물을 모두 처리하지 않은 세포 대조구로 사용하였다. CO₂ 배양기 (VS-9108MS, Vision, Korea)에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 2일 동안 배양 후 세포의 형태를 위상차현미경 (Axiovert 10; Zeiss, Wetzlar, Germany)에서 4 X 10배율로 관찰 한 후 이미지를 기록하였다.

1-2. 세포독성 시험

96 well plates에 배양한 각각의 세포는 바이러스를 처리한 well 옆에 0.4 μg/mL, 2 μg/mL, 10 μg/mL, 및 50 μg/mL 4개의 농도의 norwogonin, oroxylin A, 및 mosloflavone 를 처리 한 후 37℃에서 2일 동안 CO₂ 배양기에 배양 한 후 SRB assay로 세포독성을 평가하였다.

1-3. 실험 결과

황금 methanol 추출물 및 분획물들의 CVB3에 대한 항바이러스 활성 및 세포독성

황금 methanol 추출물을 이용하여 chloroform, ethyl acetate, butanol, water층으로 분획하였고 황금 methanol 추출물 및 각 분획층을 이용하여 CVB3에 대하여 항바이러스 활성을 실험을 진행하였다. 황금 methanol 추출물 및 각 분획층의 활성 실험 농도는 50 μg/mL, 10 μg/mL, 2 μg/mL 및 0.4 μg/mL을 사용 하였다. 각각의 추출물 및 분획층의 세포독성은 실험에 사용한 최대 약제 농도인 50 μg/mL에서 water 분획층을 제외한 모든 분획층에서 세포독성을 나타내었다. 그러나 10 μg/mL의 약제 농도에서는 추출물 및 각각의 분획층에서 모두 세포독성을 나타내지 않았다. 항바이러스 활성 실험결과 CVB3에 대하여 10 μg/mL 농도의 황금 methanol 추출물 및 chloroform 분획층에서는 약 50%의 항바이러스 활성을 나타내었으나 ethyl acetate, butanol, water 분획층에서는 항바이러스 활성을 나타내지 않았다. CVB3에 대하여 황금 methanol 추출물 및 chloroform 분획층의 IC₅₀(약제의 50% 억제농도) 값은 각각 9.35 μg/mL, 9.76 μg/mL 값을 나타내었다 (표 1).

EV71, CVB3, CVA16에 대한 norwogonin, oroxylin A 와 mosloflavone의 항바이러스 활성과 세포독성

Norwogonin, oroxylin A 및 mosloflavone에 대하여 세포독성과 EV71, CVB3, CVA16의 항바이러스 활성을 측정하였다. 사용된 Vero 세포에 대하여 norwogonin, oroxylin A 와 mosloflavone 모두의 CC₅₀은 실험한 최대 농도인 50 μg/mL에서는 나타나지 않았다. 바이러스 활성을 50% 억제하는 항바이러스 효과를 나타내는 IC₅₀은 EV71에 대하여 norwogonin은 31.9 μg/mL, oroxylin A는 20.6 μg/mL, mosloflavone은 27.8 μg/mL의 값을 보였고 CVB3에는 norwogonin은 13.5 μg/mL, oroxylin A는 3.17 μg/mL, mosloflavone은 3.92 μg/mL 보였다. 그러나 CVA16에 대하여 oroxylin A는 17.5 μg/mL의 IC₅₀ 값을 나타내었으나 norwogonin, mosloflavone은 50%이상의 항바이러스 활성을 나타내지 않았다. 또한 양성대조군으로 사용한 ribavirin에서는 EV71, CVB3, CVA16 모든 바이러스에 대하여 50%이상의 항바이러스 활성을 나타내지 않았다 (표 4).

Norwogonin, oroxylin A 와 mosloflavone의 EV71, CVB3, CVA16에 대한 세포병변 억제 효과

Vero 세포에 EV71 (도 1), CVB3 (도 2), CVA16 (도 3)를 감염 시키고 2일 후 세포병변을 현미경을 이용하여 이미지화 하였다. 세포에 바이러스를 감염시키지 않고 약제도 처리 한지 않은 정상대조군(도 1A, 도 2A 및 도 3A)과 바이러스 감염 없이 norwogonin 50μg/mL을 처리한 군 (도 4B, 도 5B 및 도 6B), oroxylin A 50μg/mL을 처리한 군 (도 1C, 도 2C 및 도 3C), mosloflavone 50μg/mL을 처리한 군 (도 1D, 도 2D 및 도 3D)과 ribavirin 50μg/mL을 처리한 군 (도 1E, 도 2E 및 도 3E)에서 정상대조군과 같이 정상적인 세포의 모양을 보여 주었다.

이 결과로 Norwogonin, oroxylin A, mosloflavone과 ribavirin은 세포독성을 나타내지 않는다는 것을 확인하였다. EV71, CVB3, CVA16을 감염시키고 약제를 처리하지 않은 감염대조군 (도 1F, 도 2F 및 도 3F), EV71, CVB3, CVA16을 감염시키고 norwogonin 50μg/mL을 처리한 군 (도 1G, 도 2G 및 도 3G), oroxylin A 50μg/mL을 처리한 군 (도 1H, 도 2H 및 도 3H), mosloflavone 50μg/mL을 처리한 군 (도 1I, 도 2I 및 도 3I)과 ribavirin 50μg/mL을 처리한 군 (도 1J, 도 2J 및 도 3J)에서 감염대조군과 ribavirin 처리군은 각각의 바이러스에 의한 세포병변을 나타내었다. Norwogonin, oroxylin A, mosloflavone은 EV71, CVB3 모두에 세포병변을 억제하여 정상적인 세포모양을 보여 주었다.

그러나 CVA16에 대하여 oroxylin A는 세포병변을 억제하였으나 norwogonin, mosloflavone은 세포병변을 억제하지 못하였다. 각각의 군을 이미지화한 후 microplate reader를 이용하여 cell viability를 측정하였다. EV71에 대하여 Norwogonin, oroxylin A, mosloflavone은 모두 60% 이상의 cell viability 보였고 (도 4), CVB3에는 각각의 compound가 50% 이상의 cell viability를 보였다 (도 5). 그러나 CVA16에는 oroxylin A만 50% 이상의 cell viability를 보였다 (도 6).

실험예 2. VP-Western blot 분석 시험

EV71에 대하여 norwogonin, oroxylin A, 및 mosloflavone의 항바이러스 활성을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 enterovirus 71의 VP단백질에 대한 Western blot분석법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 [68].

2-1. 실험과정

Vero 세포는 6-well culture plate에 well당 5 X 10⁵ 개의 세포농도로 배양하였다. 24시간 후에 배양용액을 제거한 후 PBS로 세척하였다. 그 후 1% FBS가 포함된 900μL의 바이러스 배양액 (media)에 norwogonin, oroxylin A, 및 mosloflavone 과 ribavirin을 50μg/mL농도가 되게 100μL 첨가하였다. 그 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에 48시간 동안 배양 후 RIPA lysis buffer(Cat. Number 89900, Pierce)를 이용하여 세포를 용해시켰다. 그리고 용해된 세포를 원심분리하여 단백질이 포함된 상층액만 분리하였다. 단백질이 포함된 상층액을 10분 동안 100℃ 에서 가열한 후 12% 아크릴아미드 겔 (acrylamide gel, Cat. Number 456-1043, BIO-RAD)을 이용하여 100V 에서 1시간 동안 전기영동을 실시하였다. 그 후 기기 (iBlotGel Transfer Device, Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 20V에서 7분 동안 acrylamide gel에 있는 단백질을 iBlotTransfer Stack, PVDF, regular-size(IB401001, invitrogen)으로 옮겨 주었다. membrane은 5 % skim milk (232100, Difco)에 상온에서 1시간 동안 반응 시킨 후 PBST(Phosphate buffer saline Tween-20)로 3번 세척해 주었다. 그 후 mouse anti-enterovirus 71 monoclonal antibody (MAB 979, Millipore)를 5% skim milk에 1:1000의 비율로 희석한 1차 항체를 상온에서 2시간동안 membrane에 반응시킨 후 다시 PBST로 3번 세척해 주었다. 이 실험에서 대조군으로 사용한 α-Tubulin은 mouse monoclonal IgG1 (SC-32293, Santa Cruz) 항체를 1차 항체로 사용하여 같은 방법으로 수행하였다. Enterovirus 71의 VP단백질과 대조군인 α-Tubulin을 확인하기 위한 2차 항체는 polyclonal goat anti-mouse IgG(H+L) HRP (SA001-500, GenDEPOT)를 사용하였다. polyclonal goat anti-mouse IgG(H+L) HRP를 5% skim milk에 1:5000의 비율로 희석한 후 상온에서 1시간동안 membrane에 반응 시킨 후, PBST로 3번 세척하고 측정기기(ChemiDoc XRS Plus Imaging System, BIO-RAD,Hercules, CA, USA)을 이용하여 측정하였다.

2-2. Norwogonin , oroxylin A 와 mosloflavone 의 EV71 VP 단백질 발현 억제 효과

Norwogonin, oroxylin A 와 mosloflavone의 EV71에 대한 항바이러스 활성을 Western blot분석을 통하여 확인 하였다. EV71 감염 48시간 후 EV71의 VP 단백질을 확인하였다. Norwogonin, oroxylin A 와 mosloflavone은 EV71 감염 48시간 후 각각의 바이러스 VP 단백질의 발현을 억제하였다. 그러나 대조약제로 사용한 ribavirin은 50μg/mL의 농도에서 각각의 바이러스 VP단백질의 발현을 억제하지 못하였다 (도 7).

결국, 세포내에서 CPE 억제 실험과 western blot을 통하여 norwogonin, oroxylin A 및 mosloflavone이 EV71, CVB3, CVA16에 대한 항바이러스 활성을 확인하였다.

실험예 3. 항바이러스 활성 메카니즘 분석 시험

Norwogonin, oroxylin A 와 mosloflavone의 항바이러스 활성 메카니즘을 분석하기 위해 Frank J. M. van Kuppeveld 그룹으로부터 제공 받은 replicon system(pRibFluc-EV71)을 이용하여 문헌에 기재된 Replicon 분석법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 [69].

3-1.실험과정

pRibFluc-EV71은 EV71의 P1 capside coding 부위가 firefly luciferase gene으로 대체되어서 세포내에서 virus의 life cycle중 entry, penetration, uncoating, assembly, release등을 제외한 replication, translation에 대한 효과만 명확하게 관찰할 수 있는 system이다 [69].

pRibFluc-EV71 plasmid를 MluI enzyme(1071A, TaKaRa)을 이용하여 linearize하고, T7 RNA polymerase(P1280, promega)에 의해 in vitro transcription을 수행 하였다. Transcription된 RNA를 vero cell에 x-treme(04476093001, Roche))을 이용하여 2μg trasfection한 후 norwogonin, oroxylin A, mosloflavone를 10μg/mL농도로 8시간 처리하였다. 그 후 one-glo(E6120, Promega)를 이용하여 firefly luciferase activity를 측정하다.

3-2. Norwogonin , oroxylin A 와 mosloflavone 의 EV71 replication 과 traslation 억제 효과

Norwogonin, oroxylin A 와 mosloflavone의 EV71에 대한 replication과 traslation 억제 효과를 replicon system을 이용하여 분석하였다. pRibFluc-EV71을 trasfection한 후 8시간 후에 firefly luciferase activity를 확인하였다. Norwogonin은 8시간 후에 firefly luciferase activity를 약 50% 억제 하였으나, oroxylin A 와 mosloflavone은 firefly luciferase activity를 억제하지 못하였다 (도 8). 반면에 엔테로바이러스 protease 억제제로 알려진 rupintrivir는 동일조건에서 95%이상 firefly luciferase activity를 억제하였다.

norwogonin, oroxylin A 및 mosloflavone 활성기전을 알아보기 위하여 세포내에서 EV71 replicon system (pRIBFluc-EV71)을 이용하여 이 화합물들의 활성기전을 분석한 결과, norwogonin은 세포내에서 바이러스의 replication 또는 translation에 일정부분 관여 하여 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 하지만 이러한 효과가 바이러스 감염 vero세포에서 확인된 항바이러스 효과에 비해서 상대적으로 약한 것을 감안하면 norwogonin이 replication/translation외에 다른 기전을 통해서 항바이러스효과를 나타낼 가능성을 배제할수 없다. 반면에 oroxylin A 및 mosloflavone은 바이러스의 replication 또는 translation에는 관여하지 않는 것을 확인하였다.

실험예 4. in vivo 항바이러스 활성 시험

상기 실시예 시료들의 CVB3 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 in vivo 동물실험 상에서 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 [70]. 이 실험에서는 norwogonin, oroxylin A 및 mosloflavone 중에서 세포실험을 통해서 가장 높은 항바이러스 효과를 보이는 것으로 확인된 oroxylin A와 황금 methoanl 추출물을 사용하였다.

4-1.실험과정

CVB3에 대한 황금 methanol 추출물 및 oroxylin A의 항바이러스 활성을 in vivo에서 확인하기 위하여 BALB/c 마우스를 이용하여 실험하였다.

Male BALB/c 마우스(4주령, 15g)는 ㈜코아텍에서 구입하였다. 구입한 BALB/c 마우스는 1주일 동안 적응시킨 후 정상대조군, 바이러스감염대조군, 바이러스감염 후 황금추출물 투여군, 바이러스 감염 후 oroxylin A 투여군 등 4개의 군으로 군당 5마리씩 분리 하였다. CVB3는 1 × 10⁶TCID₅₀/100 μL로 복강에 감염 시켰다. 황금 methanol 추출물은 0.5% CMC (Carboxymethyl cellulose) 에 30 mg/kg의 농도로 녹여 경구투여 하였고, oroxylin A는 PBS에 10 mg/kg의 농도로 녹여 복강투여 하였다. 약제 투여는 실험기간인 5일 동안 매일 같은 시간에 투여 하였고, 체중 측정 역시 실험기간 동안 매일 측정 하였다. 실험 종료 후 마우스의 췌장 조직을 이용하여 조직염색 (H&E staining)을 통하여 바이러스에 의한 Acinar cell을 포함한 조직 손상 정도를 확인하였다.

4-2. In vivo 실험을 통한 CVB3 에 대한 황금 methanol 추출물과 oroxylin A의 항바이러스 활성

세포실험을 통하여 EV71, CVB3, 및 CVA16에 대한 Norwogonin, oroxylin A, mosloflavone의 항바이러스 활성을 확인한 후, In vivo에서의 항바이러스 활성을 확인하기 위하여 CVB3에 감염된 BALB/c 마우스를 이용하여 CVB3에 대한 황금 methanol 추출물과 oroxylin A의 항바이러스 활성을 측정하였다. 현재 enterovirus속에 포함되어 있는 coxsackievirus A, B, 및 enterovirus 중 마우스에 감염을 일으키는 type은 coxsackievirus B가 유일하다. 그러므로 CVB3를 이용하여 마우스 실험을 통해 in vitro에서 EV71, CVB3, 및 CVA16 등 Enterovirus에 대한 광범위 항바이러스 활성을 나타내는 황금 추출물 및 Oroxylin A 등이 실제로 in vivo에서도 활성을 나타내는 지 확인해 보았다.

본 실험 결과, 체중은 정상대조군은 정상적으로 증가 하였으나 바이러스감염군은 정상대조군에 비하여 약 10% 정도 감소하였다. 황금 methanol 추출물 투여군과 oroxylin A 투여군 역시 정상대조군에 비하여 약 10% 정도 체중이 감소하였고 바이러스 감염대조군과 유의적인 차이를 보이지 않았다 (도 9).

체중에서 두드러진 회복효과가 없음에도 불구하고 조직손상에서 개선효과가 나타나는지를 확인하기 위해서 CVB3 감염에 의해서 가장 두드러지게 나타나는 것으로 잘 알려진 췌장의 조직손상을 분석하였다. 마우스의 췌장을 이용하여 조직 염색을 통하여 바이러스에 의한 조직 손상 정도를 확인한 결과 정상대조군에서는 췌장의 acinal cell이 정상적인 형태를 보였으나 바이러스감염 대조군에서는 바이러스 감염에 의하여 acinal cell이 대부분 손상 되었다. 그러나 황금 methanol 추출물과 oroxylin A를 투여한 군에서는 바이러스 감염 대조군 보다 acinal cell이 덜 손상 받은 것을 확인 할 수 있었다 (도 10).

본 연구 결과로 황금 추출물과 황금 chloroform 분획물에서 CVB3에 항바이러스 활성을 나타내었고 황금 chloroform 분획물에서 분리한 norwogonin, oroxylin A 및 mosloflavone의 EV71, CVB3, CVA16에 대한 항바이러스 활성을 확인 하였다. 특히 oroxylin A와 황금추출물의 경우 CBV3 감염 마우스 수준에서도 췌장의 조직손상 개선효과가 나타났다. 그러므로 norwogonin, oroxylin A 및 mosloflavone은 enterovirus에 대한 새로운 항바이러스 후보물질로 사용이 가능할 것으로 기대된다.

실험예 5. 독성검정

식약청의 예규에 따라 ICR 마우스 (male, 6 weeks, 오리에트사로부터 구입)를 대상으로 급성독성을 검정하였다. 그 결과, 황금 추출물, 은 300 mg/kg의 경구투여까지 급성독성 (마우스가 죽지 않았다는 것인가?)을 보이지 않았다.

이상의 실험예의 결과 황금 추출물은 안전하게 엔테로 바이러스 (influenza virus) 감염증에 사용이 가능함을 확인하였다.

본 발명의 추출물 또는 화합물을 아래와 같은 제형으로 투여할 수 있으며, 아래의 제제 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

제제예 1. 산제의 제조

SBM 추출물 --------------------------------------- 20 mg

유당 -------------------------------------------- 100 mg

탈크 --------------------------------------------- 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

SBB 추출물 --------------------------------------- 10 mg

옥수수전분 -------------------------------------- 100 mg

유당 -------------------------------------------- 100 mg

스테아린산 마그네슘 ------------------------------- 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

norwogonin 화합물 -------------------------------- 10 mg

결정성 셀룰로오스 --------------------------------- 3 mg

락토오스 --------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 --------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충진하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

SBC 추출물 --------------------------------------- 10 mg

만니톨 ------------------------------------------ 180 mg

주사용 멸균 증류수 ----------------------------- 2974 mg

Na₂HPO₄12H₂O -------------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

oroxylin A -------------------------------------- 10 mg

이성화당 ----------------------------------------- 10 g

만니톨 -------------------------------------------- 5 g

정제수 ------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

SBW 추출물 ----------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 ----------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 ---------------------------- 70 ㎍

비타민 E -------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B1 ------------------------------------ 0.13 ㎎

비타민 B2 ------------------------------------ 0.15 ㎎

비타민 B6 ------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 ------------------------------------ 0.2 ㎍

비타민 C --------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ----------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 -------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 --------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 ----------------------------------- 적량

황산제1철 ------------------------------------ 1.75 ㎎

산화아연 ------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 --------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ------------------------------------ 15 ㎎

제2인산칼슘 ------------------------------------ 55 ㎎

구연산칼륨 ------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 -------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 --------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

mosloflavone 화합물 -------------------------- 1000 ㎎

구연산 --------------------------------------- 1000 ㎎

올리고당 --------------------------------------- 100 g

매실농축액 --------------------------------------- 2 g

타우린 ------------------------------------------- 1 g

정제수를 가하여 -------------------------- 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

Claims

노르우고닌(norwogonin) 화합물을 유효성분으로 함유하는 EV71, CVB3, 또는 CVA16 혈청형으로 구성된 군으로부터 선택된 혈청형의 엔테로바이러스에 대한 항엔테로 바이러스제.
노르우고닌(norwogonin) 화합물을 유효성분으로 함유하는 수족구병, 상기도 감염증, 결막염, 무균성수막염, 포진성구협염, 심근염, 뇌염, 제1형 당뇨병, 또는 췌장 감염증으로부터 선택된 엔테로 바이러스에 기인한 감염증의 예방 및 치료용 약학조성물.
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노르우고닌(norwogonin) 화합물을 유효성분으로 함유하는 수족구병, 상기도 감염증, 결막염, 무균성수막염, 포진성구협염, 심근염, 뇌염, 제1형 당뇨병, 또는 췌장 감염증으로부터 선택된 엔테로 바이러스에 기인한 감염증의 예방 및 개선용 건강기능식품.
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