KR101801769B1 - 젬시타빈(Gemcitabine)을 포함하는 항-엔테로바이러스 조성물 - Google Patents

젬시타빈(Gemcitabine)을 포함하는 항-엔테로바이러스 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 젬시타빈(gemcitabine)을 유효성분으로 포함하는 항엔테로바이러스(enterovirus) 조성물로서, 상기 조성물은 엔테로바이러스 및 이의 레플리콘의 증식을 억제함으로써, 엔테로바이러스의 작용을 약하게 할 수 있고, 상기 바이러스 감염에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 특히, 본 발명의 젬시타빈을 리바비린과 함께 병용 사용하는 경우, 우수한 항 바이러스 효과가 있음을 확인하였다.

Description

젬시타빈(Gemcitabine)을 포함하는 항-엔테로바이러스 조성물{ANTIVIRAL COMPOSITION FOR ENTEROVIRUS COMPRISING GEMCITABINE AS AN ACTIVE MATERIAL}
본 발명은 젬시타빈(gemcitabine)을 유효성분으로 포함하는 항엔테로바이러스(enterovirus) 조성물, 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물, 및 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 엔테로바이러스의 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 또한, 젬시타빈을 유효성분으로 포함하는 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.
엔테로바이러스(Enterovirus)는 Picornaviridae 과 Enterovirus 속에 속하며 24 ~ 30 ㎚ 크기의 정 20면체의 피막이 없는 바이러스로서 (+) 단일가닥 RNA를 유전물질로 가지고 있다.
엔테로바이러스는 3가지 혈청형의 폴리오바이러스(Poliovirus, PV: 1~3); 23가지 혈청형의 콕사키바이러스(Coxsackievirus) A군 (CVA: 1~22, 24); 6가지 혈청형의 콕사키바이러스(Coxsackievirus) B군 (CVB: 1~6); 28가지 혈청형의 에코바이러스(Echovirus)군 (ECV: 1~7, 9, 11~21, 24~27, 29~33) 및 기타 인체 엔테로 바이러스(Human Enterovirus, EV: 68~116)으로 구성되어 있다.
상기 엔테로바이러스의 유전물질은 하나의 open reading frame (ORF)과 5´ 및 3´말단에 단백질로 발현되지 않는 non-coding region (NCR)으로 구성되어 있는데, ORF는 전체 유전자의 약 90%를 차지하고 하나의 다단백질 (polyprotein)로 발현되는데, 상기 다단백질은 약 2,185개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 바이러스의 단백질 분해효소에 의해서 여러 개의 다른 단백질로 나누어진다.
하나의 다단백질은 P1, P2, P3로 구분되어 있는데, P1 부분은 바이러스의 캡시드 단백질의 구성요소인 VP4, VP2, VP3, VP1을 순서대로 암호화 하고 있고, 캡시드는 32 mer의 capsomer로 구성되어 있다. P2 부분은 2Apro 단백질분해효소와 현재까지 기능이 정확하게 알려지지 않은 단백질들을 암호화하고 있으며, P3부분은 VPg 단백질과 3Cpro 단백질분해효소 및 RNA 의존적 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase, RdRp)가 암호화 되어있다.
상기 VPg단백질은 primer로써 3´에 작용하여, negative sense strand의 게놈 형성에 관여 한다. 5´NCR은 700~800 bp로 구성되어 있고, 매우 잘 보존된 복잡한 RNA 2차 구조를 형성한다. 이러한 RNA 2차 구조는 두 가지 기능을 갖는데, 첫 번째는 RdRp에 의해서 positive sense RNA가 합성될 때 RNA 합성에 필요한 시작점을 제공한다. 두 번째는 cap-independent 단백질 합성과정에서 숙주의 ribosome이 최초로 결합하는 internal ribosomal entry site (IRES)를 제공함으로써 바이러스 단백질을 합성할 수 있도록 한다. 3´NCR은 100-150 bp로 구성되어 있으며, 이것의 2차 구조는 RNA 게놈의 주형인 negative sense RNA가 합성될 때 primer의 기능에 관여한다고 알려져 있다.
엔테로바이러스는 유아나 소아에 주로 감염하여 특히 위생상태가 나쁜 환경에서 흔히 전파되는 전염성 병원체로서 주로 경구적 경로로 전파되며 전 세계적으로 널리 분포되어 있다. 엔테로바이러스는 무증상 감염에서 설사, 감기, 수족구병, 포진성 구협염(herpangina), 출혈성 결막염 등 비교적 경미한 질환, 뇌수막염, 뇌염, 급성마비, 심근염 등 심각한 질환에 이르기까지 다양한 증상을 유발한다.
인간 엔테로바이러스(HEV) 종에는 4가지 종류가 있으며(HEV-A, -B, -C, 및 -D), 100가지 이상의 바이러스 혈청형을 포함한다(Palacios and Oberste, 2005). HEV-B의 한 종류이자 엔테로바이러스에서 가장 연구가 많이 된 바이러스 중 하나인 콕사키 바이러스(coxsackievirus) B군 3타입(CVB3)은 바이러스성 수막염, 심근염, 췌장염의 주된 원인이 된다(Sawyer 2002; Whitton et al., 2005).
또한, 엔테로바이러스 71(EV71)은 영유아 수족구병, 및 뇌간 뇌염 및 소아마비양 마비(poliomyelitis-like paralysis)와 같은 심각한 신경학적 증상의 원인이기도 하다(Chumakov et al., 1979; McMinn, 2002; Song et al., 2014a; Wang et al., 2003).
상기 엔테로바이러스의 감염 증상은 특히 면역력이 약한 영유아에게 문제를 일으키고, 돌연변이율이 높아 독성이 강한 신,변종의 출현이 예상되므로 이들에 대한 치료제나 예방 백신의 개발이 필요하다.
대한민국 공개특허 제10-2015-0113484호에는 황금 추출물을 포함하는 항엔테로바이러스제가 개시되어 있으며, 상기 항엔테로바이러스제로 다양한 엔테로바이러스 감염에 의한 질환을 치료할 수 있다고 개시되어 있다.
한편, 현재 엔테로바이러스의 치료제로 개발된 프레코나릴(Pleconaril), 루핀트리비르(Rupintrivir) 등은 부작용이 심각한 수준이어서 FDA의 승인을 받지 못하고 위급한 상황에만 제한적으로 사용되고 있다(Shang et al., 2013, Zhang et al., 2012). 또한 점차 기존에 알려진 치료 물질에 내성을 보이는 바이러스가 보고되고 있어, 새로운 작용기전으로 다양한 엔테로바이러스에 폭넓게 작용하는 치료약물의 개발이 시급하게 요구되고 있는 상황이다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 항엔테로바이러스 활성을 가지는 억제제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 종래에 암 치료제로 알려져 있던 젬시타빈(gemcitabine)이 다양한 엔테로바이러스의 증식을 억제하여 항바이러스 활성을 나타낼 수 있는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 젬시타빈(gemcitabine)을 유효성분으로 포함하는 항 엔테로바이러스(enterovirus) 조성물, 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물, 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물 및 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 젬시타빈을 포함하는 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 엔테로바이러스의 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 양태는 젬시타빈(gemcitabine)을 유효성분으로 포함하는 항 엔테로바이러스(enterovirus) 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 젬시타빈은 엔테로바이러스의 증식 또는 상기 바이러스의 레플리콘(replicon)의 증식을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 젬시타빈(gemcitabine)은 폐암, 췌장암, 방광암, 유방암을 비롯한 다양한 암종의 화학적 치료에 사용되는 뉴클레오시드 아날로그(nucleoside analog)로 알려져 있다. 본 발명자들은 상기 젬시타빈이 다양한 엔테로바이러스(enterovirus)의 증식과 상기 바이러스의 레플리콘(replicon) 증식을 억제하는 활성을 가지는 사실을 확인하여, 상기 바이러스의 감염으로 인한 질환에 대한 예방 또는 치료 용도를 새로이 발견하였다.
본 발명의 "엔테로바이러스(enterovirus)"는 27~30 nm 크기의 막(envelope)을 갖지 않는 바이러스로서, 정이십면체의 형태를 가지며, 약 7.2~7.5 kb 크기의 단일 가닥 양성 가닥 (single stranded positive sense) RNA를 유전물질로 포함하는 바이러스이다. 상기 엔테로바이러스는 숙주세포로 침입(entry)한 후, 세포질로 RNA를 방출하기 위해 uncapping을 일으킨 상기 바이러스 RNA는 스스로 5' NTR의 IRES(internal ribosomal entry site)에서 번역을 개시하기 위한 mRNA로 기능하여, 거대 다단백질(polyprotein)의 생산을 유도한다. 상기 바이러스 다단백질은 2Apro 및 3Cpro에 의해 VP4, VP2, VP3, VP1, 2Apro, 2B, 2C, 3A, 3B, 3Cpro, 및 3Dpol 의 개별적인 단백질로 프로세싱된다. 양성 가닥 RNA 바이러스 게놈을 복제하는 주형(template)으로 사용되는 음성 가닥(negative-sense) RNA 역시 생성된다. 이후, 증폭된 양성 가닥 RNA 게놈 및 구조 단백질(VP1, VP2, VP3, 및 VP4)가 바이러스 입자로 조립되고 숙주 세포로부터 방출된다. 구체적으로, 본 발명의 엔테로바이러스는 CVB3, EV71, 또는 인간 라이노바이러스(human rhinovirus)일 수 있고, 더욱 구체적으로는 상기 인간 라이노바이러스는 HRV-14, HRV-21, 또는 HRV-71일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 엔테로바이러스에 대한 항 바이러스 활성을 가지는 화합물을 발굴하기 위해 CVB3 및 EV71에서 항바이러스 활성 물질을 스크리닝하여, 젬시타빈을 엔테로바이러스 억제제로 발굴하였다(실험예 1). 상기 발굴된 젬시타빈이 엔테로바이러스의 증식을 억제하는 효과를 나타내는 사실을 확인하였을 뿐만 아니라, 상기 젬시타빈이 우수한 항 바이러스 활성을 나타내면서도 세포 독성이 낮은 사실을 확인하였다(실험예 2). 구체적으로는 젬시타빈에 의해 바이러스 단백질(VP1 및 3C) 및 RNA(2A-3C 영역) 합성이 억제되는 사실을 확인하였다(실험예 3).
본 발명의 다른 실시예에서는 젬시타빈이 다양한 엔테로바이러스에 대해서 폭넓은 억제 효과를 가지는 것을 확인하였다. 구체적으로, 단일 가닥의, 양성 센스 엔테로바이러스로 알려진, 엔테로바이러스 속의 한 종류인 라이노바이러스에 대한 젬시타빈의 항바이러스 활성 효과를 확인한 결과, 상기 젬시타빈이 CVB3, EV71 뿐만 아니라, 인간 라이노바이러스(human rhinovirus, HRV), 구체적으로는 HRV-14, HRV-21, 및 HRV-71에 대해서도 항바이러스 활성을 가지는 사실을 확인하였다 (실험예 4).
본 발명의 용어, "레플리콘"은 캡시드 단백질을 제거하고 리포터 단백질인 루시퍼라제를 대신 넣어서 바이러스 형성이 되지 않고 세포내에서 복제만을 확인할 수 있는 시스템이다. 본 발명의 일 실시예에서는 젬시타빈이 엔테로바이러스의 증식 뿐만 아니라, 상기 레플리콘의 증식을 억제하는 사실을 확인하였다(실험예 2). 구체적으로, 젬시타빈의 CVB3 및 EV71 레플리콘 증식 억제 효과를 확인한 결과, 세포 독성은 낮게 나타나면서도 농도 의존적으로 레플리콘의 증식을 억제하는 것을 확인하였다(각각 IC50 =~ 0.4 μM, IC50 =~ 1 μM).
본 발명의 일 실시예에서는 젬시타빈의 항바이러스 활성이 타겟팅하는 단계를 확인하고자 하였으며, IRES(internal ribosomal entry sites) 의존적 번역, 다단백질 처리와 같은 초기 세포 내 과정에 관련되지 않은 다른 방식으로 항바이러스 효과를 가지는 사실을 확인하였다(실험예 5).
또한, 본 발명의 항엔테로바이러스 조성물은 리바비린을 추가적으로 포함하는 것인 항엔테로바이러스 조성물일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 0.01 내지 50 μM의 젬시타빈 및 100 내지 500 μM의 리바비린을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "리바비린(ribavirin)"은 다양한 DNA와 RNA 바이러스에 작용하여 바이러스의 증식을 억제하는 것으로 알려져 있는 합성 뉴클레오시드 제제이다. 특히 C형 간염에서 단독으로 사용할 때에는 효과가 없지만 인터페론(interferon) 주사와 병용할 경우에 치료 효과가 높은 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 젬시타빈과 병용 투여할 수 있는 물질을 탐색한 결과, 상기 리바바린을 젬시타빈과 병용함에 따라, 상기 두 물질을 각각 처리하는 경우에 비하여 엔테로바이러스의 증식 억제 효과가 우수한 것을 확인하였다(실험예 6).
본 발명의 다른 양태는 젬시타빈(gemcitabine)을 유효성분으로 포함하는 엔테로바이러스(enterovirus) 감염 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 엔테로바이러스는 CVB3, EV71, 또는 인간 라이노바이러스(human rhinovirus)일 수 있고, 더욱 구체적으로, 상기 인간 라이노바이러스는 HRV-14, HRV-21, 또는 HRV-71인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "젬시타빈", "엔테로바이러스" 는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 용어, "엔테로바이러스 감염 질환"은 엔테로바이러스의 감염에 의해 발병되는 질환을 의미하여, 구체적으로는 상기도감염, 소화기증상, 결막염, 중이염, 피부발진, 무균성수막염, 포진성구협염, 수족구병, 고환염, 심근염, 뇌염, 길랑 바레 증후군 (Guillian-Barre syndrome), 실조증, 말단신경염, 횡단성척수염, 사지마비, 당뇨병, 유행성출혈성 각결막염, 뇌간 뇌염, 신경인성 폐부종, 또는 폐출혈 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기와 같은 질환은 엔테로바이러스의 감염에 의해 발병되며, 엔테로바이러스의 억제를 통해 증상을 억제 또는 완화할 수 있고, 전염을 방지할 수 있음이 당업계에 공지되어 있다(대한민국 공개특허 제10-2015-0113484호).
본 발명의 용어 "예방"은, 본 발명의 약학적 조성물의 투여로 엔테로바이러스 감염에 의한 질병의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어 "치료"는, 본 발명의 약학 조성물의 투여로 엔테로바이러스 감염에 의한 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 엔테로바이러스 감염에 의한 질병의 치료 또는 예방용 약학 조성물의 형태로 제조될 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 제제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 리바비린을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "리바비린"은 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 약학 조성물을 이를 필요로하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 엔테로바이러스의 증식을 억제하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 젬시타빈을 포함하는 약학 조성물과 리바비린을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것으로서, 상기 젬시타빈을 포함하는 약학 조성물과 상기 리바비린을 포함하는 약학 조성물은 순차적, 역순 또는 동시에 투여하는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 젬시타빈을 포함하는 약학 조성물의 농도는 0.01 내지 50 μM 이고, 상기 리바비린을 포함하는 약학 조성물의 농도는 100 내지 500 μM 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 .
본 발명의 젬시타빈 단독 또는 젬시타빈과 리바비린을 모두 포함하는 약학 조성물을 엔테로바이러스에 감염된 개체에 투여함으로써, 개체 내 엔테로바이러스의 증식을 억제할 수 있다. 상기 엔테로바이러스의 증식을 억제함으로써, 엔테로바이러스 감염에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 용어, "개체"는 엔테로바이러스에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 한편으로 인간을 제외한 동물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 젬시타빈을 포함하는 조성물을 개체에 투여함으로써, 상기 바이러스 감염에 의한 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물로 다양한 엔테로바이러스 아형 또는 변이형의 엔테로바이러스로 감염된 인간 또는 동물을 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기존의 엔테로바이러스 감염 질환의 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명의 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 젬시타빈(gemcitabine)을 유효성분으로 포함하는 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 조성물은 리바비린을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "젬시타빈", "엔테로바이러스", "엔테로바이러스 감염 질환", "예방", 및 "리바비린"은 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 젬시타빈의 항 엔테로바이러스 용도는 상기 전술한 바와 같으며, 그에 따라 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 젬시타빈을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 젬시타빈을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 본 발명의 조성물은 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량%, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량%의 양으로 첨가된다.　그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다.　상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.　상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다.　감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.　그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.　이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.　이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.　이들 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 젬시타빈을 유효성분으로 포함하는 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 조성물은 리바비린을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "젬시타빈", "엔테로바이러스", "엔테로바이러스 감염 질환", "예방", 및 "리바비린"은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어 "의약외품"은, 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 아니하며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염형 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미한다.
상기 의약외품 조성물은 특별히 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있다. 또한, 상기 의약외품 조성물은 피부 외용제 및 개인위생용품을 포함할 수 있다. 상기 피부 외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패취제, 크림제, 산제, 현탁제, 겔제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있으며, 상기 개인위생용품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크-업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선스크린 로션, 모발 손질 제품, 에어프레쉬너 겔, 세정 겔 등이 될 수 있다.
본 발명의 젬시타빈을 포함하는 조성물은 엔테로바이러스 및 이의 레플리콘의 증식을 억제함으로써, 엔테로바이러스의 작용을 약하게 할 수 있고, 상기 바이러스 감염에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 특히, 본 발명의 젬시타빈은 리바비린과 함께 병용 사용하는 경우, 우수한 항 바이러스 효과가 있음을 확인하였다.
도 1은 생리 활성을 가지는 화학 물질의 라이브러리의 스크리닝한 결과를 나타낸 도이다. 도 1의 A는 CVB3 레플리콘을 코딩하는 DNA의 개략도이다. 도 1의 B는 Vero 세포를 시험관 내 전사(in vitro-transcribed) CVB3-레플리콘 RNA로 형질전환하고, 동시에 1,280 생리 활성 화학 물질(10 μM)을 8시간 동안 처리한 다음, 상기 화학 물질의 처리 후 반딧불이 루시퍼라제 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이며, 이는 레플리콘의 억제효과를 나타낸다. 루핀트리비르(Rupintrivir, 10 μM)를 양성대조군으로 사용하였다. 젬시타빈을 포함하는 플레이트에서의 대표적인 결과를 도시하였다. DMSO 처리된 세포의 루시퍼라제 활성을 100% 인 것으로 고려하였다. 도 1의 C는 CVB3-감염된 HeLa 세포에서 최초 발굴 물질의 항 바이러스 활성을 추가적으로 확인한 도이다. HeLa 세포를 CVB3 (100 CCID50)로 감염시키고, 동시에 26개 발굴 물질 (2 및 10 μM)로 처리하였다. 루핀트리비르 (2 및 10 μM)를 양성 대조군으로 사용하였다. 루핀트리비르의 처리 48시간 후, MTT 어세이를 이용하여 세포 생존률을 분석하였다. DMSO-처리된 세포의 생존률은 0%로 고려하고, 감염되지 않은 세포의 생존률을 100%로 고려하였다. 도 1의 D는 젬시타빈의 화학 구조를 나타낸 도이다.
도 2는 발굴 물질의 세포 생존에 대한 효과를 나타낸 도이다. CVB3으로 감염되지 않은 HeLa 세포를 26개의 초기 발굴 물질로 처리하였다 (2 및 10 μM). 처리 48시간 후, MTT 어세이를 이용하여 세포 생존률을 분석하였다. DMSO 처리된 세포의 생존률을 100%인 것으로 고려하였다.
도 3은 5개 화합물의 항 바이러스 활성 및 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 상기 5개 화합물의 항 바이러스 활성 효능을 확인하고자, 본 발명자들은 CVB3 (100 CCID50)로 HeLa 세포를 감염시키고, 동시에 각 화합물을 표시된 농도로 처리하였다. 처리 48시간 후, MTT 어세이에서 세포 변성 효과의 감소에 의해 항 바이러스 활성을 결정하였다. DMSO 처리된 세포의 생존률을 0%인 것으로 고려하였고, 감염되지 않은 세포의 생존률을 100%인 것으로 고려하였다. CVB3 감염 되지 않은 동일한 세포를 각 화합물로 처리하여 CellTiter-Glo 어세이를 이용하여 세포 생존률을 분석하였다. DMSO 처리된 세포의 생존률을 100%인 것으로 고려하였다.
도 4는 생리 활성 화학 물질 라이브러리로부터 항 EV71 활성을 보이는 화합물을 스크리닝한 결과를 나타낸 도이다. 도 4의 A는 EV71 레플리콘을 코딩하는 DNA의 개략도이다. 도 4의 B는 Vero 세포를 시험관 내 전사된 EV71 레플리콘 RNA로 형질 감염시키고, 동시에 1,280 생리 활성 화학 물질 (10 μM)로 8시간 동안 처리하여, 반딧불이 루시퍼라제 활성을 분석한 결과를 나타낸다. 루핀트리비르 (rupintrivir, 10 μM)를 양성 대조군으로 사용하였다. 젬시타빈을 포함한 플레이트의 대표적인 결과를 나타내었다. DMSO 처리된 세포의 루시퍼라제 활성을 100%인 것으로 고려하였다.
도 5는 CVB 레플리콘의 복제에 대한 젬시타빈의 억제 효과를 나타낸 도이다. Vero 세포를 시험관 내 전사된 CVB3 레플리콘(도 5의 A) 또는 EV71 레플리콘(도 5의 C) RNA로 형질 감염시켰다. 동시에, 8시간 동안 표시된 농도로 젬시타빈을 처리한 후,반딧불이 루시퍼라제 활성을 분석하였다. DMSO 처리된 세포의 루시퍼라제 활성은 100%로 고려되었다.
동일한 조건에서, CVB3(도 5의 B) 또는 EV71(도 5의 D) 레플리콘 형질 감염된 세포의 생존률 CellTiter-Glo 시약을 이용하여 세포 생존률을 분석하였다. DMSO 처리된 세포의 활성은 100%인 것으로 고려되었다.
도 6은 젬시타빈의 세포 독성을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 24시간 동안 젬시타빈을 표시된 농도로 Vero 세포에 처리하였으며, CellTiter-Glo 시약을 이용하여 생존률을 분석하였다. DMSO 처리된 세포의 활성을 100%인 것으로 고려하였다.
도 7은 젬시타빈의 HeLa 세포에서의 CVB3 증식 억제능을 나타낸 도이다. 도 7의 A는 젬시타빈의 항 바이러스 활성 효과를 나타낸 도이다. HeLa 세포를 CVB3로 감염(100 CCID50)시키는 동시에 젬시타빈으로 처리하였다. 처리 48 시간 후, 항 바이러스 활성을 MTT 어세이를 이용하여 평가하였다. DMSO 처리된 세포의 생존률을 0%로 고려하였고, 감염되지 않은 세포의 생존률을 100%로 고려하였다. 도 7의 B는 젬시타빈으로 처리된, CVB3로 감염되지 않은 동일한 HeLa 세포의 생존률을 CellTiter-Glo 어세이를 이용하여 분석한 결과를 나타낸 도이다. 도 7의 C는 HeLa 세포를 CVB3 (5 MOI)로 감염시키는 동시에 증가하는 농도의 젬시타빈으로 처리한 결과를 나타낸 도이다. 처리 8시간 후, 바이러스 3C 단백질을 특정 항체로 염색하고 FITC-결합된 이차 항체(녹색)를 이용하여 가시화하였다. 핵 DNA는 DAPI 염색(파랑)으로 가시화하였다. 도 7의 D는 총 세포 추출물을 상기 감염된 HeLa 세포로부터 수득하여 항 VP1 및 항 3C 항체로 웨스턴 블랏팅을 수행한 결과를 나타낸 도이다. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 6의 E는 총 RNA를 상기 HeLa 세포로부터 수득하여, CVB3 바이러스 RNA의 2A-3C 영역에 대해 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다. GADPH mRNA를 로딩 대조군으로 분석하였다.
도 8은 활발하게 성장 중인 HeLa 세포에 대한 젬시타빈의 약한 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다. HeLa 세포를 낮은 밀도(10,000 또는 20,000 세포/웰)로 96 웰에서 배양하고, CVB3 감염 없이 젬시타빈을 표시된 농도로 처리하고 48시간 후, MTT 어세이를 이용하여 세포의 생존률을 분석하였다. DMSPO 처리된 세포의 활성을 100%인 것으로 고려하였다.
도 9는 EV71 감염된 세포에 대한 젬시타빈의 항 바이러스 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. LLC-MK2 유래 세포 (Derivative cells) 및 RD 세포를 EV71(BrCr 또는 H) (100 CCID50) 로 감염시키는 동시에 젬시타빈을 표시된 농도로 처리하였다. 처리 4일 후, LLC-MK2 유래 세포의 생존률을 MTT 시약을 이용하여 확인하였다. 처리 3일 후, RD 세포의 생존률을 MTT 시약을 이용하여 확인하였다. DMSO 처리된 세포의 생존률을 0%인 것으로 고려하였고, 감염되지 않은 세포의 생존률을 100%인 것으로 고려하였다.
도 10은 CVB3 감염 HeLa 세포에 대한 젬시타빈의 강력한 항 바이러스 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 자세한 과정은 도 7의 C 설명에 설명되어 있다. 각 농도에서 바이러스 3C 단백질의 형광 신호를 나타내는 세포를 계수하여, 총 세포에 대한 상대적인 비율을 계산하여 도시하였다. 세 번의 독립적인 실험에서 평균 및 표준 편차를 구하였다. 감염된 DMSO 처리된 세포의 수를 100%로 고려하였다.
도 11은 인간 라이노바이러스의 세 종류에 대한 젬시타빈의 항 바이러스 효과를 나타낸 도이다. H1HeLa 세포를 100 CCID50 인간 라이노바이러스 14 (도 11의 A), 21(도 11의 B), 또는 71(도 11의 C)로 감염시키는 동시에 표시된 농도의 젬시타빈을 처리하였다. 처리 3일 후, MTT 어세이에서 세포 변성 효과의 감소를 통해 항 바이러스 활성을 측정하였다. DMSO 처리된 세포의 생존률은 0%로 고려하였으며, 감염되지 않은 세포의 생존률은 100%인 것으로 고려하였다. 도 11의 D는 CVB3에 감염되지 않은, 젬시타빈을 처리한 동일한 세포에 대해 MTT 어세이를 이용하여 세포 독성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 첨가 시간에 의존적인 젬시타빈의 항 바이러스 활성을 나타낸 도이다. 5 MOI CVB3으로 감염된 HeLa 세포에 바이러스 감염 후 표시된 시간에 50 μM 젬시타빈이나 2 μM 루핀트리비르를 처리하였다. 감염 8시간 후, 감염된 세포는 항 3C 항체로 염색하여 시각화하였고, 총 세포 중에서 감염된 세포의 비율을 계산하였다. 세 번의 독립된 실험으로부터 평균 및 표준 편차를 구하였다.
도 13은 젬시타빈의 항 CVB3 효과는 2C, 3A, IRES 의존적 번역 또는 다단백질(polyprotein) 처리와 관련이 없음을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 13의 A는 Vero 세포를 시험관 내 전사된 CVB3-wt, CVB3-2C mt, 또는 CVB3-3A mt 레플리콘 RNA로 형질 감염 시키는 동시에 표시된 농도의 젬시타빈으로 처리하여 루시퍼라제 활성을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 상기 젬시타빈의 처리 8시간 후, 상기 세포의 루시퍼라제 활성을 분석하였으며, 각 레플리콘 마다, DMSO 처리된 세포의 루시퍼라제 활성은 100%인 것으로 고려하였다. 도 13의 B는 293T 세포를 CVB3 IRES 의존적 번역을 측정하는 이중-루시퍼라제(dual-luciferase) 리포터 DNA로 형질 감염시키고, 표시된 농도의 젬시타빈으로 처리한 결과를 나타낸 도이다. 상기 젬시타빈의 처리 24시간 후, 상기 세포의 반딧불이 및 레닐라 루시퍼라제 활성을 분석하였다. DMSO 처리된 세포의 루시퍼라제 활성을 100%인 것으로 고려하였다. 도 13의 C는 293T 세포는 플래그(flag)-3CD를 발현하는 플라스미드로 형질 감염 시키고, 10 μM 젬시타빈으로 처리한 결과를 나타낸 도이다. 상기 젬시타빈의 처리 9시간 후, 총 세포 추출물을 수득하여 항-플래그 항체로 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 루핀트리비르(10 μM)을 양성 대조군으로 포함하였다.
도 14는 젬시타빈의 항 EV71 효과는 IRES 의존적인 번역 및 다단백질 처리 (polyprotein processing)와 관련이 없는 것을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 14의 A는 293T 세포를 EV71 IRES-의존적인 번역을 측정하는 이중-루시퍼라제 리포터 DNA (dual-luciferase reporter DNA)로 형질 감염시키고 젬시타빈을 표시된 농도로 처리한 결과를 나타낸 도이다. 젬시타빈의 처리 24시간 후, 세포의 반딧불이 및 레닐라 루시퍼라제 활성을 분석하였다. 도 14의 B는 293T 세포를 flag-태그된 EV71 3CD를 발현하는 플라스미드로 형질 감염시키고 10 μM 젬시타빈으로 처리한 결과를 나타낸 도이다. 젬시타빈의 처리 9시간 후, 총 세포 추출물을 수득하여 항-플래그(anti-flag) 항체를 이용한 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 루핀트리비르 (10 μM)를 양성 대조군으로 사용하였다.
도 15는 GW5074 및 플루옥센틴 (fluoxetine)의 항바이러스 효과를 나타낸 도이다. 도 15의 A는 Vero 세포를 시험관 내 전사된 CVB3-wt, CVB3-2C mt, 또는 CVB3-3A mt 레플리콘 RNA로 형질 감염시키고, 동시에 GW5074를 표시된 농도로 처리한 결과를 나타낸 도이다. 처리 8시간 후, 상기 세포들의 루시퍼라제 활성을 확인하였다. 각 레플리콘 마다, DMSO 처리된 세포의 루시퍼라제 활성을 100%인 것으로 고려하였다. 도 15의 B는 동일한 실험을 플루옥센틴을 이용하여 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 16는 젬시타빈 및 리바비린(ribavirin)의 CVB3 억제 작용에 대한 시너지 효과를 나타낸 도이다. 도 16의 A는 Vero 세포를 시험관 내 전사된 CVB3 레플리콘 RNA로 형질 감염시키고, 동시에 0.08 μM 또는 0.4 μM의 젬시타빈이 존재 또는 존재하지 않는 조건에서 표시된 농도의 리바비린을 처리한 결과를 나타낸 도이다. 처리 8시간 후, 상기 세포의 루시퍼라제 활성을 분석하였다. DMSO 처리된 세포의 루시퍼라제 활성을 100%인 것으로 고려하였다. 세 번의 독립적인 실험으로부터 평균 및 표준 편차를 구하였다. 도 16의 B는 상기 A에서 사용된 세포의 생존률을 CellTiter-Glo 어세이를 이용해 분석한 결과를 나타낸 도이다. 도 16의 C는 Vero 세포를 시험관 내 전사된 CVB3 레플리콘 RNA로 형질 감염시키고 동시에 200 μM의 리바비린이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 표시된 농도의 젬시타비을 처리한 결과를 나타낸 도이다. 처리 8시간 후, 상기 세포의 루시퍼라제 활성을 분석하였다. 도 16의 D는 CellTiter-Glo 어세이를 이용하여 상기 C와 동일한 세포의 생존률을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 젬시타빈 및 리바비린의 CVB3에 대한 시너지 효과를 나타낸 도이다. 도 17의 A는 Vero 세포를 시험관 내 전사된 CVB3 레플리콘 RNA로 형질 감염시키는 동시에 0.08 또는 0.4 μM의 젬시타빈이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 리바비린을 처리한 결과를 나타낸 도이다. 처리 8시간 후, 세포의 루시퍼라제 활성을 분석하였다. DMSO 처리된 세포의 루시퍼라제 활성을 100%인 것으로 고려하였다. 세 번의 독립적인 실험에서 평균 및 표준 편차를 구하였다. 도 17의 B는 0.4 μM 젬시타빈, 증가하는 농도의 리바비린, 및 0.4 μM 젬시타빈과 리바비린을 병용 처리하는 경우의 항 바이러스 효과를 DMSO 처리된 대조군에 대한 상대적인 비율로 나타낸 도이다. CompuSyn 소프트웨어를 이용하여 각 병용 처리에 대한 CI 값을 계산하였다.
도 18은 젬시타빈과 리바비린의 EV71에 대한 시너지 효과를 확인한 도이다. 도 18의 A는 Vero 세포를 시험관 내 전사된 EV71 레플리콘 RNA로 형질 감염 시키는 동시에 0.4 μM의 젬시타빈이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 리바비린을 처리한 결과를 나타낸 도이다. 도 18의 B는 CellTiter-Glo 어세이를 이용하여 상기 A와 동일한 세포의 생존률을 분석한 결과를 나타낸 도이다. 도 18의 C는 Vero 세포를 시험관 내 전사된 EV71 레플리콘 RNA로 형질 전환 시키고 동시에 200 μM 리바비린이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 젬시타빈을 처리한 결과를 나타낸 도이다. 젬시타빈의 처리 8시간 후, 세포의 루시퍼라제 활성을 분석하였다. 도 18의 D는 CellTiter-Glo 어세이를 이용하여 상기 C에서와 동일한 세포의 생존률을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 젬시타빈 및 리바비린의 EV71에 대한 시너지 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 도 19의 A는 Vero 세포를 시험관 내 전사된 EV71 레플리콘 RNA로 형질 전환시키는 동시에 0.4 μM 젬시타빈이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 증가되는 농도의 리바비린을 처리한 결과를 나타낸 도이다. 처리 8시간 후, 세포의 루시퍼라제 활성을 분석하였다. 도 19의 B는 0.4 μM 젬시타빈, 증가하는 농도의 리바비린, 0.4 μM 젬시타빈을 리바비린과 병용 처리하는 경우의 항 바이러스 효과를 DMOS 처리된 대조군에 대한 상대적인 비율로 나타낸 도이다. CompuSyn 소프트웨어를 이용하여 각 병용 처리의 CI 값을 계산하였다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포, 바이러스 및 시약의 준비
본 발명에서 사용된 HeLa, 293T, 및 Vero 세포들은 5-10% 소태아혈청(GE Healthcare Life Sciences or Hyclone) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신과 함께 DMEM 배지에서 배양하였다.
아울러, LLC-MK2 유래 세포(LLC-MK2 Derivative Cell, ATCC CCL7.1)은 ATCC에서 구입하여 10% 소태아혈청으로 보충된 MEM에서 배양하였고, H1HeLa 세포(ATCC CRL-1958)은 ATCC에서 구입하여 10% 소태아혈청으로 보충된 MEM에서 배양하였다.
CVB3(Nancy; ATCC VR-30)은 ATCC에서 구입하여 HeLa 세포에서 증폭 (expand)시켰다. EV71 (BrCr; ATCC VR-1775)는 ATCC에서 구입하였으며 LLC-MK2 유래 세포(Derivative cells)에서 증폭(expand)시켰다. HRV 타입 14 (ATCC VR-284), 21(ATCC VR-496), 및 71(ATCC VR-1181)은 ATCC에서 구입하여 H1HeLa 세포에서 증폭(expand)시켰다. LOPAC 라이브러리는 항바이러스 물질을 스크리닝하기 위해 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다.
젬시타빈(gemcitabine, Sigma-Aldrich), 트라카졸레이트(tracazolate, Tocris Bioscience), 플루옥세틴(fluoxetine, Sigma-Aldrich), BNTX(Sigma-Aldrich), 루핀트리비르(rupintrivir, Santa Cruz), 및 리바비린(ribavirinn, Sigma-Aldrich)는 추가적인 분석을 위해 구입하였다.
실시예 2. 항체의 준비
항-플래그(anti-flag) 및 항-β-액틴(anti-β-actin) 마우스 항체는 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였다. 항-VP1 마우스 단일클론항체는 Leica(NCL-ENTERO)에서 구입하였다. 항-3C 래빗 다중클론 항체는 재조합 3C 단백질에 의한 면역법(immunization)으로 제작하였다.
웨스턴 블랏팅을 위한 효소 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)와 결합한 이차항체는 Thermo Fisher Scientific에서 구입하였다. Alexa Fluor 488와 결합한 이차항체는 Life Technologies에서 구입하였다.
실시예 3. 레플리콘 어세이 (replicon assay)
플라스미드 p53CB3-LUC, pRib-LUC-CB3/T7-wt (van Kuppeveld et al., 1995; van Ooij et al., 2006; Wessels et al., 2006), 및 CVB3 바이러스 게놈의 P1 캡시드-코딩 영역(capsid-coding region)이 반딧불이 (firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자로 대체된 pRib-LUC-CB3/T7-(2C-A224V, I227V, 2C-A229V 또는 3A-H57Y) 변이 클론 (Ulferts et al., 2013; Wessels et al., 2006)은 Frank J. M. van Kuppeveld (Utrecht University, 네덜란드)로부터 제공받았다.
EV71 바이러스 게놈의 P1 캡시드-코딩 영역 대신 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 pRibFluc-EV71 wt 역시 사용되었다.
CVB3 및 EV71 레플리콘 플라스미드는 또한 Ribomax 대량 (large-scale) RNA 생산 시스템(Promega)과 함께 시험관 내(in vitro) RNA 전사에도 사용되었다.
항 바이러스 활성을 가지는 물질 발굴을 위해, 본 발명자들은 1,280개의 생리활성 화학물질 (LOPAC, Sigma-Aldrich) 스크리닝을 수행하였고, 이를 위해, 6-웰 플레이트의 Vero 세포 (3 × 105 세포/웰)를 Lipofectamine 2000 (Promega)를 이용하여 0.4 μg CVB3 또는 EV71 레플리콘 RNA로 형질감염하였다. 상기 세포를 96-웰 플레이트에 분할(split)하고 (2 × 104 세포/웰), 동시에 10 μM 화학물질로 처리하였다.
상기 화학물질의 처리 후 8시간이 경과한 뒤에, 상기 세포들을 One-Glo Luciferase Assay System (Promega)을 이용하여 반딧불이 루시퍼라제 활성을 어세이 분석하였다. 세포 생존률은 CellTiter-Glo Luminescent 세포 생존 어세이 (Cell Viability assay) (Promega)를 이용하여 측정하였다.
실시예 4. 항 바이러스 활성 어세이
본 발명자들은 물질의 항 바이러스 활성을 시험하기 위해, 개질된 3-(4,5-디메틸티아졸-2-yl)-2,5-디페틸테트라졸리윰 브롬화물 (MTT; Sigma-Aldrich) 기반의 세포 용해 효과 (cytopathic effect, CPE) 환원 어세이(reduction assay)를 기존에 알려진 방법으로 수행하였다 (Kim et al., 2002).
간단히 설명하면, 어세이 수행 2일전에 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 2 × 104 개로 시딩하였고, 적절한 CPE를 유도하기 위해 동등한 용량의 바이러스(웰 당 100 세포반수감염용량(cell culture infected dose 50%, CCID50) 및 화합물 (두배 농축)을 첨가하여 5% 이산화탄소 하에서 37°C (CVB3 및 EV71) 또는 33°C에서 배양하였다(HRV).
MTT 어세이를 위해 상기 배양물 상층액을 제거하고, 50 ml MTT 용액 (2.5 mg/ml in PBS) 을 첨가한 후, 37°C 에서 1시간 동안 CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, 포르마잔 산물을 용해시키기 위해 100 μl 산성화된 이소프로판올/10% Triton X-100 용액을 첨가하였다.
그 후, 마이크로플레이트 리더(Synergy H1, BioTek)를 사용하여, 540nm에서의 흡광도 및 690 nm (대조군)에서의 흡광도를 측정하였다.
가-감염된(mock-infected), DMSO-처리된 세포들은 100%의 생존률을 나타내었고, 바이러스에 감염된, DMSO-처리된 세포들은 0%의 생존률을 나타내었다. 화합물의 항 바이러스 활성은 대조군에 대한 비율로 계산되었다.
실시예 5. 세포 독성 어세이
본 발명자들은 세포 독성은 MTT 어세이 또는 CellTiter-Glo Luminescent 세포 생존 어세이 키트(Cell Viability Assay Kit, Promega)를 이용하여 측정하였다. 모든 과정은 바이러스 대신에 배지를 첨가한 것 외에는 항 바이러스 활성 어세이에 사용된 것과 동일하다.
CellTiter-Glo Luminescent 어세이 키트는 제작자의 프로토콜에 의해 수행되었다. 루시퍼라제 활성은 루미노미터(luminometer, LB960 centro XS3, Berthold Technologies)를 이용하여 측정되었다. 세포 독성은 대조군에 대한 비율로 계산하였다.
실시예 6. 면역 형광법(Immunofluorescence microscopy)
본 발명자들은 세포를 CVB3 (5 MOI)으로 감염시키고 젬시타빈으로 처리한 다음, 세포는 감염 8시간 후 ice-cold 메탄올-아세톤 3:1 혼합물로 고정하고 투과성을 높였다(permeabilize).
상기 감염된 세포를 항-3C항체 및 Alexa Fluor 488에 결합한 항 래빗 이체항체로 염색하였으며, 4',6-디아미디노(diamidino)-2-페닐인돌(phenylindole) (DAPI; Product # 62248, Thermo Scientific)으로 대비 염색(conterstain)하였다.
이미지는 Operetta system (Perkin Elmer)를 이용하여 획득하였다. 바이러스 감염은 Operetta system의 하모니소프트웨어를 이용하여 감염된 세포의 수를 전체 핵의 숫자로 나누어 정량화 하였다. 감염은 대조군에 대한 비율로 계산하였다.
실시예 7. 웨스턴 블랏팅 및 RT-PCR
본 발명자들은 세포는 상술한 면역 형광법에서와 동일하게 감염시키고 젬시타빈으로 처리하여 웨스턴 블랏팅을 공지된 방법으로 수행하였다 (Kim et al., 2014).
바이러스 감염 8시간 후, 전체 세포 용해물을 회수하고 항-3C, 항-VP1, 및 항-β-액틴 항체를 이용하여 분석하였다.
본 발명자들은 RT-PCR은 기존에 공지된 방법으로 수행하였다 (Kang et al., 2014). 바이러스 RNA의 RT-PCR을 위해, 총 세포 RNA를 QIAGEN RNeasy Mini Kit를 이용하여, 제작자의 프로토콜에 따라 정제하였다. 역전사는 임의의 헥사머(hexamer)와 SuperScript III 역전사 효소(Invitrogen)를 이용하여 수행하였다.
CVB3 유전체의 2A 내지 3C에 이르는 영역을 Accupower PCR premix (Bioneer)을 이용하여 프라이머 csp54 (5'-CCGGAATGTACATGTTGGG-3', 서열번호 1) 및 csp57 (5'-GGCTCTGGCTTCACTAAC-3', 서열번호 2)를 이용하여 증폭하였다. 로딩 대조군으로 GAPDH mRNA를 분석하였다.
실시예 8. 시간에 따른 첨가 어세이(Time-of-addition assay)
본 발명자들은 HeLa 세포는 CVB3로 5MOI에서 감염시키고 동시에 50 μM 젬시타빈 또는 2 μM 루핀트리비르로 처리하였다(0 h). 1시간 간격으로, 젬시타빈 또는 루핀트리비르를 첨가하였다.
감염 8시간 후, 상기 세포들을 고정하고 상기 실시예 6의 면역형광법에서 설명한 바와 같이 항-3C 항체로 염색하였다. Operetta system의 하모니 소프트웨어를 이용하여 감염된 세포의 수를 전체 핵 수로 나눈 수로 바이러스 감염 정도를 정량화하였다. 감염은 대조군에 대한 비율로 계산되었다.
실시예 9. IRES 어세이
본 발명자들은 이중-루시퍼라제 리포터 플라스미드 pR/EV71(BrCr)/F-PEST 및 pR/CVB3/F-PEST를 제조하기 위해 전체 EV71 및 CVB3 5'NTR을 EV71-감염 세포 및 CVB3-감염 세포로부터 적합한 프라이머를 이용한 RT-PCR을 사용하여 수득하였다.
본 실험의 프라이머 서열은 하기와 같다; pR/EV71(BrCr)/FPEST:(forward, 5'- AGCCACCATGGTACCTTAAAACAGCCTGTGGGTTGCACC-3', 서열번호 3), (reverse, 5'-GTCCTCCATGGTACCCGCTTCGTGTTCAGCAGTATAATGTAATTG-3', 서열번호 4); pR/CVB3/F-PEST: (forward, 5'-AGCCACCATGGTACCTTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCC-3', 서열번호 5), (reverse, 5'- GTCCTCCATGGTACCCATTTTGCTGTATTCAACTTAACAATGAAT-3', 서열번호 6).
수득된 서열은 pR/HCV374/F-PEST의 Kpn I 제한 효소 자리에 삽입하였다(pR/HCV374/F-PEST는 대한민국의 국립암센터의 김종헌 박사로부터 제공받았다).
젬시타빈의 IRES 활성에 대한 영향을 측정하기 위해, 6-웰 플레이트에서 293T세포 (5 × 105 세포/웰)를 2μg 리포터 플라스미드로 X-tremeGENE DNA 형질감염 시약(Roche)을 이용하여 형질감염하였다.
형질 감염 24시간 후, 상기 형질감염된 세포를 96 웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 다양한 농도의 젬시타빈과 함께 배양하였다. 이 후, 반딧불이 및 레닐라 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
실시예 10. 3C 프로테아제 어세이
본 발명자들은 pcDNA3-flag-3CD 플라스미드를 구축하기 위해, CVB3 (전장(full-length) 3C 및 3D의 N-말단 (아미노산 1-196)) 및 EV71 (BrCr) (전장 3C 및 3D의 N-말단 (아미노산 1-218)) 을 RT-PCR에 의해 증폭하였고 pcDNA3-flag 벡터의 BamHI 제한효소 자리에 삽입하였다. 상기 플라스미드로 X-tremeGENE siRNA 형질감염 시약(Roche)을 이용하여 293T 세포에 형질 전환하였다.
상기 형질 전환된 세포를 15시간 동안 유지하였고, 10 mM 젬시타빈으로 9시간 동안 처리하였다. 이후, 항-플래그(anti-flag) 항체와 함께 웨스턴 블랏팅을 수행하였다.
상기 실시예 실험에 따른 결과는 하기 실험예와 같이 분석하였다.
실험예 1 : CVB3의 소분자 억제자 스크리닝의 결과
엔테로바이러스에 대한 항 바이러스 활성을 가진 화합물을 발굴하기 위해, 본 발명자들은 생리활성 화합물의 컬렉션인 LOPAC 라이브러리를 CVB3의 레플리콘 시스템을 이용하여 스크리닝하였다.
상기 레플리콘 시스템은 P1의 구조적 유전자(VP4-VP1)를 대신해 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 포함하고 있으며, 도 1의 A와 같은 세포 내 바이러스 복제의 쉽고 정량적인 측정을 가능하게 한다(van Kuppeveld et al., 1995; van Ooij et al., 2006).
본 발명자들의 예비 실험에서, 시험관 내 번역된 CVB3 레플리콘 RNA로 형질 감염된 Vero 세포에서의 루시퍼라제 활성이 시간 의존적으로 증가하였으며 형질감염 10시간 후에 최고점에 도달하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 세포에 화합물을 처리한지 8시간 후에 항바이러스 활성을 스크리닝하기로 결정하였다. 1,280개의 생리 활성 화합물 (10 μM)에 대한 기본적인 스크리닝으로, CVB3-레플리콘 RNA로 형질 감염된 Vero 세포에서 유의미하게 루시퍼라제 활성을 감소시킨 42개의 화합물을 발굴하였다(DMSO 처리된 대조군에 비하여 80% 이상 감소; 도 1의 B).
그 후, CellTiter-Glo 시약을 이용한 추가적인 분석으로 상기 42개 화합물 중 16개 (10 μM)는 Vero 세포에서 상당한 세포 독성 효과를 가지는 사실을 확인하였다(DMSO 처리된 대조군에 비해 20% 이상 감소).
결과적으로, 오직 26개 화합물 만이 수용 가능한 세포 독성 수준을 나타내었다 (DMSO 처리된 대조군에 비해 20% 이하 감소).
다음으로, 본 발명자들은 상기 화합물이 세포에서 CVB3의 증식을 억제하는지 여부를 평가하고자, CVB3-감염된 HeLa 세포에 상기 26개 화합물을 2 및 10 μM 농도로 48시간 동안 처리하였다. 이 후, 세포 생존률을 정량적으로 측정하기 위해 사용되는 MTT 어세이를 이용하여 세포 생존률을 분석하였다.
상기 MTT 어세이의 결과, CVB3 감염은 HeLa 세포에서 세포 변성의 효과(cytopathic effect, CPE)를 유도하였으며, 세포 생존률을 100% 가까이 감소시켰다. 또한, 어느 항바이러스 활성을 가지는 화합물이든 상대적으로 세포 생존률을 증가시키는 것을 확인하였다.
상기 26개 화합물 중에서 10개 화합물이 유의미하게 세포 생존률을 대조군에 비하여 20% 이상 증가시켰다 (도 1의 C).
동일한 조건에서, 이미 공지된 바와 같이 (Dragovich et al., 1999) 3C 억제제인 루핀트리비르는 낮은 세포 독성에도 불구하고, 강력한 항바이러스 활성을 나타내었다. 흥미롭게도, 효과적인 화합물 중 3개는 이미 엔테로바이러스의 2C 억제자로 알려진(Ulferts et al., 2013), 플루옥센틴 및 이의 아날로그(analogs)였다.
GW5074는 엔테로바이러스의 3A의 억제자로 잘 알려져 있으며 (Arita et al., 2009), 브레펠딘 A (Brefeldin A) 역시 Golgi-특이적 BFA 저항 인자 1의 억제를 통한 엔테로바이러스에 대한 억제 효과가 잘 알려져 있다 (Claude et al., 1999).
일부 물질은 상당한 항바이러스 효과에도 불구하고, CVB3 감염 없이 단독으로 처리되었을 때 심각한 세포 독성을 나타내었다 (도 2).
이에, 본 발명자들은 단백질 합성의 강력한 억제제인 에메틴(emetine), 저혈압 및 일부 부정맥 치료에 사용되는 강심성 배당체인 와베인(ouabain)을 이후의 분석에서 제외하였다.
아울러, 각 물질의 광범위한 농도에서의 추가적인 분석으로, 이미 공지된 억제제인 플루옥세틴, GW5074, 및 브레펠딘 A를 포함한 대부분의 물질이 높은 농도에서 심각한 세포 독성 효과를 가지는 것을 확인하였다 (10 또는 50 μM; 도 3).
오직 젬시타빈 만이 가장 높은 농도인 50 μM에서도 낮은 세포 독성 효과를 나타내면서 항 바이러스 활성이 높게 유지됨과 동시에 항 바이러스 효과가 용량 의존적인 사실을 확인하였다.
상기 젬시타빈의 강력한 억제 효과는 EV71 레플리콘을 포함하는 세포에서의 스크리닝에서도 확인하였다(도 4)
따라서, 이후의 추가 연구는 오직 젬시타빈 만으로 수행하였다 (도 1의 D).
실험예 2: 젬시타빈의 엔테로바이러스 증식 억제 확인
세포에서 젬시타빈이 얼마나 강력하게 CVB3의 복제를 억제하는지 확인하기 위해, Vero 세포들을 시험관 내 번역된 CVB3-레플리콘 RNA로 형질 감염하였다. 동시에, 다양한 농도의 젬시타빈을 8시간 동안 처리하였고, 이후, 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
그 결과, 젬시타빈이 CVB3 레플리콘의 복제를 용량 의존적으로 억제하며, 약 0.4 μM의 IC50 값을 가지는 것을 확인하였다.
다수의 실험에서 확인된 바와 같이, CellTiter-Glo 시약을 이용하여 Vero 세포의 생존률을 평가한 결과, 젬시타빈은 가장 높은 농도에서도 세포 생존률에 거의 영향을 미치지 않았다 (도 5의 B).
상기 CVB3 레플리콘에서의 억제 효과와는 다소 차이가 있었으나, EV71 레플리콘을 포함한 Vero 세포에서도 유사한 억제 효과가 관찰되었다(도 5의 C).
EV71 레플리콘의 복제를 억제하는 젬시타빈의 IC50 값은 약 1 μM임을 확인하였다. 젬시타빈은 EV71 레플리콘을 포함하는 Vero 세포에 대해서는 세포 독성 효과를 거의 나타내지 않았으며, 이와 같은 결과는 CVB3 레플리콘에 대하여도 동일하였다 (도 5의 D). 젬시타빈의 낮은 세포 독성은 24시간 지속되는 장기 처리 실험에서 추가적으로 확인하였다 (도 6).
젬시타빈의 항 바이러스 활성을 CVB3-감염된 HeLa 세포에서 추가적으로 분석하였다. HeLa 세포를 CVB3로 감염시키는 동시에 48시간 동안 젬시타빈을 다양한 농도로 처리하여, MTT 어세이로 세포 독성 효과를 분석하였다.
그 결과, 젬시타빈이 ~5 μM의 IC50 값을 가지며, 용량 의존적인 항바이러스 효과를 나타내는 것을 확인하였을 뿐만 아니라(도 7의 A), 세포 독성 효과를 거의 나타내지 않는 것을 확인하였다 (도 7의 B).
그러나, 이전에 보고된 바와 같이(Hernandez et al., 2001), 젬시타빈은 활발하게 성장중인 HeLa 세포에서는 약간의 세포 독성을 나타내었다(도 8).
유사한 항 바이러스 활성을 EV71 (BrCr 또는 H)-감염된 LLC-MK2 유래 세포(Derivative cell) 및 RD 세포에서 확인하였다(~0.2 - 1 μM의 IC50). 다만, CVB3와 비교하여, 효력(potency)은 높았고 최고 효능 (maximal efficacy)는 낮았다 (도 9).
또한, 본 발명자들은 강력한 항바이러스 활성을 다른 방식으로도 확인하였다. 구체적으로, CVB3-감염된 HeLa 세포를 3Cpro 단백질을 형광 염료와 결합한 항체로 염색하여 시각화하고, 상기 염색된 세포를 계수하여 정량화하였다.
그 결과, 3Cpro 단백질의 상기 형광 신호가 젬시타빈 처리에 의해 급격하게 감소하는 것을 확인하였다 ( ~1 - 2 μM의 IC50)(도 7의 C 및 도 10).
상기와 같은 결과로부터, 젬시타빈이 엔테로바이러스의 강력한 억제제라는 사실을 확인하였다.
실험예 3: 젬시타빈의 세포 내 바이러스 단백질 및 RNA 합성 억제 효과
엔테로바이러스-감염된 세포에서 젬시타빈의 항바이러스 활성을 확인하기 위해, 바이러스의 단백질 및 RNA를 분석하였다.
CVB3-감염된 HeLa 세포에 8시간 동안 증가하는 농도의 젬시타빈을 처리하였고, 총 세포 추출물 및 RNA를 항-VP1 및 항-3C 항체를 이용하여 웨스턴 블랏팅을 수행하였다. 이후, 각각 2A-3C 영역에 해당하는 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 상기 젬시타빈의 처리는 용량 의존적으로 VP1 및 3C 단백질의 양을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다 (도 7의 D). 각 단백질에 대한 효과적인 농도(EC50 = 0~2 μM)는 세포 생존률 및 3C 염색 어세이에서와 유사하게 나타났다 (EC50 = 0~1 - 5 μM).
유사한 항 바이러스 효과를 바이러스 RNA 분석에서도 확인하였다. CVB3 RNA의 양은 젬시타빈 처리에 의해 현저히 감소되었으며, EC50 은 약 2 μM이었고, 이는 VP1 및 3C 단백질 분석에서와 유사한 결과였다.
실험예 4: 다양한 엔테로바이러스에 대한 젬시타빈의 바이러스 억제 효과
젬시타빈이 다양한 엔테로바이러스를 억제할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, CVB3가 아닌 다른 엔테로바이러스, 예를 들어 인간 라이노바이러스(human rhinovirus, HRV)를 추가적으로 실험하였다. 상기 인간 라이노바이러스 역시 단일 가닥의, 양성 센스 엔테로바이러스이며 인간의 건강에 중요한 것으로 알려져 있다. 통상적인 감기의 주된 원인인 라이노바이러스는 CVB3 및 EV71을 포함하는 엔테로바이러스 속의 한 종류이다.
H1HeLa 세포를 3가지 다른 종류의 HRV (HRV-14, HRV-21, 및 HRV-71)로 감염시키고, 젬시타빈을 처리한 다음, 72시간 후에 MTT 어세이로 세포 생존률을 시험하였다.
CVB3-감염된 세포 또는 EV71-감염된 세포에서 나타나는 것처럼, 젬시타빈은 3가지 HRV에 대해 모두 강력한 억제 활성을 나타내었다 (1 - 5 μM의 IC50, 도 11).
상기와 같은 결과로부터 본 발명자들은 젬시타빈이 다양한 종류의 단일 가닥의 양성 센스 엔테로바이러스의 억제제가 될 수 있다는 사실을 확인하였다.
실험예 5: 젬시타빈의 타겟 과정 확인
젬시타빈의 억제 효과는 감염 사이클의 어디에나 영향을 미칠 수 있으므로, 어느 단계가 젬시타빈에 의해 억제되는지 확인하고자, 바이러스 감염 과정에서 다양한 시점(0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8 h)에 젬시타빈을 배지에 첨가하였다.
젬시타빈의 억제 효과는 3C 단백질의 형광 신호를 나타내는 감염된 세포를 정량화하는 것으로 평가하였다.
젬시타빈의 강력한 항바이러스 효과는 감염 1, 2, 3 시간이 경과한 후에도 나타났으며, 상기와 같은 효과는 바이러스 감염과 동시에 약물이 첨가된 때와 유사하였다 (0h; 도 12). 이러한 결과로부터 젬시타빈이 바이러스의 부착 및 유입(entry) 후 임의의 단계를 타겟으로 하여 바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인하였다.
상기와 같은 CVB3 레플리콘의 복제를 억제하는 젬시타빈의 효과는, 도 5에 나타나는 것처럼, 젬시타빈이 바이러스 입자와 독립적인 세포 내 과정(예를 들어, 번역, 다단백질(polyprotein) 프로세싱, 복제 또는 다른 과정)을 타겟으로 하는 사실을 강하게 뒷받침한다.
젬시타빈이 CVB3 감염에 있어서 어느 단계를 타겟으로 하는지 보다 구체적으로 특정하기 위해, 본 발명자들은 다양한 어세이법을 활용하여 CVB3 억제의 각 단계에 대한 젬시타빈의 관여를 실험하였다.
먼저, 본 발명자들은 젬시타빈이 CVB3 RNA의 5'NTR에서 내부 리보솜 유입점(internal ribosomal entry sites, IRES)에 의한 번역 개시에 관여하는지 여부를 확인하고자 하였다.
이를 위해, 반딧불이 및 레닐라 루시퍼라제의 발현 수준이 각각 CVB3 IRES-의존적인 번역 및 캡-의존적인 번역에 의해 조절되는 이중-루시퍼라제 (dual-luciferase) 리포터 시스템을 생성하였다.
상기 리포터 DNA는 레닐라 루시퍼라제 유전자와 반딧불이 루시퍼라제 유전자 사이에 CVB3 또는 EV71 IRES 서열을 삽입한 것으로, 레닐라 루시퍼라제 유전자의 발현은 캡-의존적인 번역을, 반딧불이 루시퍼라제의 발현은 CVB3 또는 EV71 IRES 의존적인 발현을 나타낸다.
293T 세포는 CVB3 IRES (pR/CVB3/FPEST)를 포함하는 이중 루시퍼라제 리포터 플라스미드로 형질 감염시켜 발현시키고, 젬시타빈을 표시된 농도로 처리하였다.
처리 24시간 후, 반딧불이 및 레닐라 루시퍼라제 활성 분석을 위해, 상기 세포들의 어세이를 수행하였다.
그 결과, 젬시타빈이 반딧불이 루시퍼라제 활성에 대해서는 거의 영향을 미치지 않았으며, 이로부터 젬시타빈이 CVB3 IRES-의존적 번역에 대해서는 효과를 거의 나타내지 않는 사실을 확인하였다 (도 13의 B).
유사하게, EV71 IRES 의존적 번역도 젬시타빈에 의해 전혀 영향을 받지 않았다 (도 14의 A).
다음으로, 2Apro에 의해 수행되는 것으로 추정되는 VP1-2Apro의 절단 과정 (cleavage processing)이 CVB3-감염된 HeLa 세포에서 젬시타빈 처리에 의해 변화하지 않는 사실을 확인함으로써 본 발명자들은 젬시타빈의 억제 효과와 2A 프로테아제와 관련성을 배제하였다(데이터는 나타내지 않음).
만약 젬시타빈이 2A 프로테아제를 타겟으로 하여 기능을 한다면, VP1-2Apro의 전구체 단백질의 축적이 개별적인 VP1 및 2Apro 단백질의 감소와 함께 관찰되었을 것이나, 그러한 결과는 확인되지 않았다.
유사하게, 본 발명자들은, 3C 프로테아제에 대한 젬시타빈의 억제 효과를 확인하기 위해 CVB3 및 EV71의 3C-3D를 플래그(flag)-태그된 형태로 293T 세포에서 발현하고, 젬시타빈을 처리하여 3C 억제 효과를 확인하였다. 3C가 억제될 경우, 3CD 전구체 형태의 단백질이 축적되고 절단된 3C의 양이 감소하게 된다.
3C 억제 효과를 평가한 결과, 293T 세포에서 외인성으로 과발현되는 3CD 전구체 단백질의 절단 패턴이 젬시타빈의 처리에 의해 영향을 받지 않는 사실을 확인함으로써, 본 발명자들은 3C 프로테아제와 젬시타빈의 억제 효과의 관련성을 배제할 수 있었다 (도 13의 C). 유사한 결과를 EV71 3CD에서도 확인하였다 (도 14의 B).
동일한 조건에서, 3Cpro의 강력한 억제제로 알려진 루핀트리비르의 처리에 의해, 3C 및 3D 수준은 감소하면서 3CD 전구체 단백질의 수준은 급격하게 증가하는 것을 확인하였다 (도 13의 C).
이에, 본 발명자들은 젬시타빈이 3C를 억제하지 않음을 확인할 수 있었다.
더 나아가, 본 발명자들은 2C나 3A를 통해 젬시타빈이 항 바이러스 효과를 나타내는 것인지 여부를 확인하고자 하였다.
젬시타빈이 2C나 3A를 타겟팅한다면, 2C나 3A 돌연변이를 포함하는 레플리콘에서 항바이러스 효과를 나타내지 않을 것이나, 젬시타빈은 상기 돌연변이를 포함하는 레플리콘에서도 비슷한 수준의 억제 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
즉, 2C 또는 3A 변이를 포함하는 것으로 잘 알려진 CVB3 레플리콘 복제에 있어서, 야생형 CVB3 레플리콘 복제와 유사한 정도로 젬시타빈에 의해 영향을 받는 것을 확인하여, 본 발명자들은 젬시타빈이 2C 및 3A를 타겟팅하지 않음을 확인할 수 있었다 (도 13의 A).
반면, 2C나 3A를 타겟팅하는 억제제로 알려진 플루옥센틴 및 GW5074에 대한 실험에서는, 이전에 공지된 바와 같이(Arita et al., 2009; Ulferts et al., 2013), 상기 억제제에 의해 2C 또는 3A 변이를 포함하는 CVB3 레플리콘에 대해 야생형 CVB3 레플리콘에 비해 낮은 항 바이러스 효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 15).
종합하면, 본 발명자들은 젬시타빈의 항 바이러스 효과가 IRES-의존적 번역 및 2Apro, 3Cpro, 2C, 및 3A를 포함하는 다단백질 처리(polyprotein processing)와 같은 세포 내 과정에 관련되지 않은 다른 방식으로 항바이러스 효과를 가지는 사실을 확인하였다.
이러한 결과는 젬시타빈이 바이러스 RNA 중합(polymerization)의 방해 및/또는 바이러스 변이의 생성을 통해 작용할 수 있음을 시사한다.
실험예 6: 젬시타빈 및 리바비린의 항 바이러스 작용에 대한 상승 효과
다음으로, 본 발명자들은 젬시타빈을 리바비린과 병용하는 경우의 억제 효과를 확인하고자 하였다.
리바비린은 뉴클레오시드-아날로그 항바이러스 약물로 현재 잘 알려져 있으며, HCV 및 호흡기세포융합바이러스 (Respiratory syncytial virus, RSV)를 포함한 다수 바이러스 감염에 대한 치료에 사용되고 있다 (Graci and Cameron, 2006; Yin et al., 2009).
리바비린은 또한 몇몇 배양 세포에서 엔테로바이러스 증식에 대해 억제 효과를 가지는 것으로 보고되었다 (Urbinati et al., 2008; Zhang et al., 2012).
그러나, 다른 세포에서는 상기와 같은 활성이 보여지지 않은 점을 고려할 때, 리바비린의 항 바이러스 활성은 세포의 종류 및 조건에 의존하는 것으로 보여진다 (Zhang et al., 2012).
실제로, 본 발명자들의 세포 기반 실험에서, 리바비린은 CVB3 레플리콘이나 CVB3 감염에 있어서, 중요한 효과를 나타내지 않았다.
그럼에도 불구하고, 본 발명자들은 젬시타빈이 리바비린과 병용하여 시너지 효과를 나타낼 수 있는지 여부를 확인하였다.
CVB3 레플리콘을 포함하는 Vero 세포에 증가하는 농도의 리바비린을 0.4 또는 0.08 μM의 젬시타빈이 존재하거나 존재하지 않는 조건에서 8시간 동안 처리하여, 루시퍼라제 활성을 분석하였다.
도 5의 A에 도시된 바와 같이, 0.08 및 0.4 μM 젬시타빈에서 약간의(moderate) 항 바이러스 효과(CVB3 레플리콘 복제가 20-50% 감소)를 확인하였다.
예상한 대로, 리바비린은 오직 가장 높은 농도에서만(400 μM) 단독으로 미미한 항 바이러스 효과를 나타내었고 (DMSO 처리된 대조군에 비해 약 ~10% 정도 감소), 0.4 μM의 젬시타빈이 단독으로 항 바이러스 효과를 보였다(~35% 감소) (도 16의 A, 도 17의 A).
리바비린이나 젬시타빈을 단독 처리하는 경우에 비해, 0.4 μM의 젬시타빈과 증가하는 농도의 리바비린을 병용 처리 하는 경우, CVB3 레플리콘의 복제를 80% 가까이 억제하였다 (도 16의 A, 도 17의 A). 이는 각 개별적인 물질의 항 바이러스 효과를 합한 것보다 더 우수한 효과였다 (리바비린의 최고 농도에서 ~45%).
이러한 시너지 효과는 CompuSyn 소프트웨어를 이용하여 항 바이러스 효과를 정량적으로 분석하여 확인하였다.
0.4 μM 젬시타빈 및 증가하는 농도의 리바비린의 조합 효과에 대한 조합 지수(combination index, CI)는 1보다 상당히 작았으며 (CIs < 0.28), 이는 자명한 젬시타빈과 리바비린의 병용에 의한 상승 작용을 나타낸다고 할 수 있다 (도 17의 B) (Chou, 2006).
CI 값은 정량적으로 상승 작용 (CI < 1), 및 상가적 효과(additive effect, CI=1)를 정의한다.
매우 낮은 농도의 리바비린 (25 μM 이하)도 젬시타빈과 병용하는 경우에는 항 바이러스 효능(efficacy)의 절반(half)을 유도하는데 충분함을 확인하였다.
젬시타빈과 리바비린의 시너지 효과는 또한 증가하는 농도의 젬시타빈이 고정된 농도의 리바비린(200 μM)과 병용 처리되었을 때도 나타났다 (도 16의 C).
리바비린과 병용되는 젬시타빈의 IC50 은 ~0.2 μM이며, 이는 젬시타빈을 단독으로 처리하는 경우(IC50 = ~1 μM) 보다 5배 이상의 효능을 나타냄을 알 수 있다.
특히 중요한 것은, 상기와 같은 병용 처리에 의한 유의미한 항 바이러스 효과에도 불구하고, 세포 독성은 거의 나타나지 않았다 (도 16의 B 및 D).
EV71 레플리콘의 복제에 있어서는 상기 병용에 의한 약간의 시너지 효과를 확인하였으며 (도 18), 이와 같은 효과는 작은 CI 값에 의해 정량적으로 확인하였다 (도 19).
종합하면, 이와 같은 결과는 리바비린과 병용되는 젬시타빈은 젬시타빈 또는 리바비린을 단독으로 사용하는 경우 보다 엔테로바이러스에 대한 항 바이러스 효과가 더 우수한 사실을 시사하는 것이라고 할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY/KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> ANTIVIRAL COMPOSITION FOR ENTEROVIRUS COMPRISING GEMCITABINE AS AN ACTIVE MATERIAL <130> KPA160079-KR <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer csp54 <400> 1 ccggaatgta catgttggg 19 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer csp57 <400> 2 ggctctggct tcactaac 18 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for pR/EV71(BrCr)/FPEST <400> 3 agccaccatg gtaccttaaa acagcctgtg ggttgcacc 39 <210> 4 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for pR/EV71(BrCr)/FPEST <400> 4 gtcctccatg gtacccgctt cgtgttcagc agtataatgt aattg 45 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for pR/CVB3/F-PEST <400> 5 agccaccatg gtaccttaaa acagcctgtg ggttgatccc 40 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for pR/CVB3/F-PEST <400> 6 gtcctccatg gtacccattt tgctgtattc aacttaacaa tgaat 45

Claims (19)

  1. 젬시타빈(gemcitabine)을 유효성분으로 포함하는 항 엔테로바이러스(enterovirus) 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 젬시타빈은 엔테로바이러스의 증식 또는 상기 바이러스의 레플리콘(replicon)의 증식을 억제하는 것인, 항엔테로바이러스 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 리바비린(ribavirin)을 추가적으로 포함하는 것인, 항엔테로바이러스 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 0.01 내지 50 μM의 젬시타빈 및 100 내지 500 μM의 리바비린을 포함하는 것인, 항엔테로바이러스 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 엔테로바이러스는 CVB3, EV71, 또는 인간 라이노바이러스(human rhinovirus)인, 항엔테로바이러스 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인간 라이노바이러스는 HRV-14, HRV-21, 또는 HRV-71인 것인, 항엔테로바이러스 조성물.
  7. 젬시타빈(gemcitabine)을 유효성분으로 포함하는 엔테로바이러스(enterovirus) 감염 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로서,
    상기 엔테로바이러스 감염 질환은 바이러스성 수막염, 심근염, 췌장염, 수족구병, 뇌염, 포진성 구협염 또는 소아마비양 마비인, 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 리바비린(ribavirin)을 추가적으로 포함하는 것인, 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 엔테로바이러스는 CVB3, EV71, 또는 인간 라이노바이러스(human rhinovirus)인, 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 인간 라이노바이러스는 HRV-14, HRV-21, 또는 HRV-71인 것인, 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  11. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 허용 담체를 추가로 포함하는 것인, 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  12. 삭제
  13. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 약학 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체 내 엔테로바이러스(enterovirus)의 증식을 억제하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 방법은 젬시타빈을 포함하는 약학 조성물과 리바비린을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것으로서, 상기 젬시타빈을 포함하는 약학 조성물과 상기 리바비린을 포함하는 약학 조성물은 순차적, 역순 또는 동시에 투여하는 것인, 엔테로바이러스의 증식을 억제하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 젬시타빈을 포함하는 약학 조성물의 농도는 0.01 내지 50 μM 이고, 상기 리바비린을 포함하는 약학 조성물의 농도는 100 내지 500 μM 인, 엔테로바이러스의 증식을 억제하는 방법.
  16. 젬시타빈(gemcitabine)을 유효성분으로 포함하는 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서,
    상기 엔테로바이러스 감염 질환은 바이러스성 수막염, 심근염, 췌장염, 수족구병, 뇌염, 포진성 구협염 또는 소아마비양 마비인, 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 리바비린을 추가적으로 포함하는 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  18. 젬시타빈(gemcitabine)을 유효성분으로 포함하는 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물로서,
    상기 엔테로바이러스 감염 질환은 바이러스성 수막염, 심근염, 췌장염, 수족구병, 뇌염, 포진성 구협염 또는 소아마비양 마비인, 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 리바비린을 추가적으로 포함하는 엔테로바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
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