KR101880179B1 - 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 미카펀진이 EV71(enterovirus 71)(BrCr 타입, H 타입 및 1095 타입), CVB3(coxsackievirus B3) 및 HRV(human rhinovirus)(HRV-14, HRV-21, HRV-71)으로 감염시킨 세포의 생존률을 증가시키고, CVB3가 감염된 마우스의 몸무게 저하 및 췌장 병리를 개선하는 것을 확인하여, 항바이러스용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 약학적 조성물에 관한 것이다.
엔테로바이러스(enterovirus)는 인체나 포유류의 장(腸)에 감염을 일으키는 바이러스를 통칭하며, 새롭게 발견될 때마다 EV68, EV71, EV73 등으로 명명된다. 엔테로바이러스는 발병 시 손발과 입에 염증 및 발진 등이 일어나 수족구병(手足口病)을 일으키기도 하지만 일부 환자에게서는 무균성수막염, 바이러스성 폐렴, 뇌염 또는 급성이완성 마비현상 등을 동반한다. 면역체계가 아직 발달되지 못한 신생아의 경우 심하면 신경원성 폐부종으로 인해 사망할 수도 있다. 중국에서는 2008년 5월, EV71 감염병의 확산으로 큰 혼란을 겪은 바 있으며, 우리나라는 2010년 12월 30일부터 보건복지가족부 장관의 고시에 따라 엔테로바이러스 감염증과 수족구병을 감시활동을 필요로 하는 지정감염병으로 지정한 바 있다.
엔테로바이러스는 주로 하절기에 발병하며, 감염자의 면역학적 특성에 따라 중증감염을 초래하기도 한다. 특히 위생이 나쁜 환경에서 흔하게 전파되는 전염성 병원체로써 감염경로는 분변 또는 구강 등이며, 오염된 물과 토양을 통한 경구적인 전파로도 이어진다. 감염자에서 배출된 분변 속의 바이러스가 오수나 폐수를 통해 지하수, 하천, 해수로 흘러들어가 다시 사람에게로 전염되는데, 드물게는 호흡기 분비물을 통해서도 감염된다. 엔테로바이러스는 소화기를 통해 감염된 후 인후두 부위나 소장의 림프절에서 일차적으로 증식한 후 신체의 각 장기로 이동한다. 임상증상은 감기 등의 가벼운 증상부터 심각한 마비까지 매우 다양하다. 소아인 경우 비폴리오성 엔테로바이러스(enterovirus) 감염은 50%정도 불현성 감염으로 나타나며, 상기도감염이나, 소화기증상, 결막염, 중이염, 피부발진, 무균성수막염, 포진성구협염, 수족구병 및 고환염 등의 증상을 보인다. 드물게 심근염, 뇌염, Guillian-Barre syndrome, 실조증, 말단신경염, 횡단성척수염, 사지마비, 당뇨병 및 유행성 출혈성 각결막염 등 치명적이거나 합병증을 남기는 경우도 보고되어 있다. 엔테로바이러스에 의한 대표적인 증상은 무균성 수막염이고 주로 하절기에 발생하는 것으로 알려져 있으나 봄이나 늦가을, 그리고 겨울에도 산발적으로 발생하는 경우가 있어 일 년 내내 감염될 위험이 존재한다. 또한 알려져 있는 주된 발생 연령층은 영ㆍ유아이나, 경우에 따라 소아 및 노령층에서도 발생할 수 있다. EV71(enterovirus 71)의 경우 다른 엔테로바이러스보다 더 심각한 임상경과를 보이며, 특히 어린 아이에서 높은 비율로 신경계 합병증을 일으켜, 뇌간 뇌염, 신경인성 폐부종, 폐출혈, 쇼크 및 급속한 사망에 이를 수 있다.
엔테로바이러스는 분류학적으로 Picornaviridae과에 속하며, 현재까지 약 68여 종의 혈청형이 알려져 있다. 혈청형에 따라 크게 3가지 혈청형의 Poliovirus (PV: 1~3)와 23가지 혈청형의 Coxsackievirus A군(CVA: 1~22, 24), 6가지 혈청형의 Coxsackievirus B군(CVB: 1~6), 그리고 28가지 혈청형의 Echovirus군(ECV: 1~7, 9, 11~21, 24~27, 29~33) 및 기타 Human Enterovirus (EV: 68~116) 등으로 구성되어 있다.
엔테로바이러스는 엔벨로프(envelope)를 갖지 않는 27 내지 30 nm 크기의 바이러스로서 정이십면체의 형태를 가지며, 약 7.2 내지 7.5 kb 크기의 single stranded positive sense RNA를 유전물질로 함유하고 있다. 하나의 open reading frame (ORF)과 5´ 및 3´말단에 단백질로 발현되지 않는 non-coding region (NCR)으로 구성되어 있는데, ORF는 전체 유전자의 약 90%를 차지하고 하나의 polyprotein으로 발현되는데, 약 2,185개의 아미노산으로 이루어져 있다. 이 polyprotein은 바이러스의 단백질 분해효소에 의해서 여러 개의 다른 단백질로 나누어진다. 하나의 polyprotein은 P1, P2, P3로 구분되어 있는데, P1부분은 바이러스의 캡시드 단백질의 구성요소인 VP4, VP2, VP3, VP1을 순서대로 암호화 하고 있고, 캡시드는 32 mer의 capsomer로 구성되어 있다. P2부분은 2Apro 단백질분해효소와 현재까지 기능이 정확하게 알려지지 않은 단백질들을 암호화하고 있으며, P3부분은 VPg 단백질과 3Cpro단백질분해효소 및 RNA dependent RNA polymerase (RdRp)가 암호화되어있다. VPg 단백질은 primer로써 3´쪽에 작용하여, negative sense strand의 게놈 형성에 관여 한다. 5´NCR은 700~800 bp로 구성되어 있고, 매우 잘 보존된 복잡한 RNA 2차 구조를 형성한다. 이러한 RNA 2차 구조는 두 가지 기능을 갖는데, 첫 번째는 RdRp에 의해서 positive sense RNA가 합성될 때 RNA 합성에 필요한 시작점을 제공한다. 두 번째는 cap-independent 단백질 합성과정에서 숙주의 ribosome이 최초로 결합하는 internal ribosomal entry site(IRES)를 제공함으로써 바이러스 단백질을 합성할 수 있도록 한다. 3´NCR은 100-150 bp로 구성되어 있으며, 이것의 2차 구조는 RNA 게놈의 주형인 negative sense RNA가 합성될 때 primer의 기능에 관여한다고 알려져 있다.
항바이러스제(antiviral drug)의 개발은 내성 바이러스의 출현, 약제 부작용, 높은 생산비용 등을 극복하는 방식으로의 지속적인 요구를 가지고 있다. 장바이러스의 감염 증상은 EV71(enterovirus 71)을 제외하고는 대부분 치명적이지 않지만, 면역력이 약한 영유아에게 문제를 일으키고 돌연변이율이 높아 독성이 강한 신,변종의 출현이 예상되므로 이들에 대한 치료제나 예방 백신의 개발이 필요하다. 그럼에도 현재까지의 예방백신에 대한 연구는 EV71을 제외하고는 거의 없는 실정이고, 현재까지 장바이러스의 유일한 치료제로 개발되어 있는 플레코나릴(Pleconaril)은 치료효과가 비교적 뛰어난 편이나, 부작용이 심각한 수준이어서 FDA의 승인을 받지 못하고 위급한 상황에만 제한적으로 사용되고 있다. 또한 점차 치료물질에 내성을 보이는 바이러스가 계속 보고되고 있어, 새로운 작용기전으로 다양한 장바이러스에 폭넓게 작용할 수 있는 치료용 약물의 개발이 시급하게 요구되고 있다.
한편, 미카펀진(micafungin)은 정맥에 투여하는 에치노칸딘(echinocandin) 계열의 항진균제(antifungal drug)로서, 진균 세포벽의 필수 구성물질인 베타(beta)-1,3-글루칸(glucan)의 생성을 억제하는 메커니즘을 갖는, 부작용이 적고 선택적(selective) 독성이 높은 약물로 잘 알려져 있다. 그러나 미카펀진이 항바이러스 효과를 나타낸다는 연구결과는 아직까지 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 항바이러스 활성을 가진 신규한 조성물을 찾기 위해 노력하던 중, 미카펀진(micafungin)이 항바이러스 효능을 가짐을 확인하여 항바이러스용 약학적 조성물로써 유용하게 이용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 바이러스 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물은 EV71(enterovirus 71)(BrCr 타입, H 타입 및 1095 타입), CVB3(coxsackievirus B3)및 HRV(human rhinovirus)(HRV-14, HRV-21, HRV-71)로 감염시킨 세포의 생존률을 증가시키고, CVB3가 감염된 마우스의 몸무게 저하 및 췌장 병리를 개선하는 것을 확인하여, 항바이러스용 약학적 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 스크리닝 과정을 거쳐 EV71(enterovirus 71)에 항바이러스 효능을 나
나타내는 미카펀진(micafungin)을 발굴하는 과정을 나타낸 도이다:
A: 바이러스의 복제 활성을 루시퍼라아제(luciferase) 발현으로 측정할 수 있는 EV71 리플리콘(replicon) 시스템의 모식도;
B: Vero 세포에 EV71 리플리콘(replicon)을 도입한 뒤 FDA 승인 약물들로 스크리닝(screening)하여, DMSO 처리 대비 60% 이상 luciferase 활성을 감소시키는 것으로 나타난 21개의 약물들: Gem은 gemcitabine, Mica는 micafungin, Rup는 rupintrivir를 나타냄;
C: EV71(enterovirus 71)에 감염된 LLC-MK2 유도세포에 21개의 약물들을 처리한 후 MTT 어세이(assay)로 세포 생존율을 측정한 결과; 및
D: 미카펀진(micafungin)의 화학 구조.
도 2는 Vero 세포에 EV71(enterovirus 71) 리플리콘(replicon) RNA를 형질주
입(transfection)시킨 후, 루시퍼라아제(luciferase)의 활성을 시간 의존적으로(time-dependent) 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 미카펀진(micafungin)의 EV71(enterovirus 71) 리플리콘(replicon)의 복제 억제효과를 나타낸 도이다:
A: Vero 세포에 EV71(enterovirus 71) 리플리콘(replicon) RNA를 형질주입(transfection)시킨 후, 다양한 농도의 미카펀진(micafungin)을 처리하여 루시퍼라아제(luciferase)의 활성(activity)을 측정한 결과; 및
B : 다양한 농도의 미카펀진(micafungin)에서 세포의 독성을 평가한 결과.
도 4는 미카펀진(micafungin)의 CVB3(coxsackievirus B3) 리플리콘(replicon)의 복제 억제효과를 나타낸 도이다:
A: Vero 세포에 CVB3(coxsackievirus B3) 리플리콘(replicon) RNA를 형질주입(transfection)시킨 후, 다양한 농도의 미카펀진(micafungin)을 처리하여 루시퍼라아제(luciferase)의 활성(activity)을 측정한 결과; 및
B: 다양한 농도의 미카펀진(micafungin)에서 세포의 독성을 평가한 결과.
도 5는 미카펀진(micafungin)에 장시간 노출시 세포의 독성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
A: 24시간 동안 각 농도별 미카펀진(micafungin)의 처리 결과; 및
B: 48시간 동안 각 농도별 미카펀진(micafungin)의 처리 결과.
도 6은 EV71(enterovirus 71)를 감염시킨 LLC-MK2 유도세포에서 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 확인한 도이다:
A: EV71을 감염시킨 LLC-MK2 유도세포에서 미카펀진(micafungin)을 농도별로 4일 동안 처리 후, MTT 어세이(assay)를 통해 항바이러스 효과를 측정한 결과;
B: 동일 조건의 세포에서 미카펀진(micafungin)에 의한 세포의 독성을 측정한 결과;
C: 미카펀진(micafungin)의 처리 농도에 따른 3C 단백질의 발현 양상;
D: C의 세포로부터 분리한 바이러스 RNA(3BC 부위)의 양을 RT-PCR한 결과;
및
E: EV71(enterovirus 71)의 dsRNA를 항체로 염색(녹색)하고, 핵의 DNA는 DAPI로 염색한 사진(파란색).
도 7은 EV71(enterovirus 71)(H 및 1095 strain)에 대한 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 MTT 어세이(assay)를 통해 측정한 도이다.
도 8은 상기 도 6E의 EV71(enterovirus 71)이 감염된 LLC-MK2 유도세포에서 나타나는 dsRNA 형광신호를 정량적으로 분석하여 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 CVB3(coxsackievirus B3)에 대한 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 나타낸 도이다:
A: HeLa 세포에 CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시켜 농도별로 미카펀진 (micafungin)을 처리한 후, 항바이러스 효과를 MTT 어세이(assay)로 측정한 결과; 및
B: 동일 조건의 세포에서 세포의 독성을 측정한 결과.
도 10은 세 종류의 HRV(human rhinovirus)(HRV-14, HRV-21 및 HRV-71)에 대한 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 MTT 어세이(assay)로 측정한 결과:
A: HRV14;
B: HRV 21; 및
C: HRV 71.
도 11은 EV71(enterovirus 71)의 감염 전후 미카펀진(micafungin)의 처리 시간에 따른 항바이러스 효과를 나타낸 도이다.
도 12는 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과의 작용점을 추적하기 위해
수행한 일련의 실험들을 나타낸 도이다:
A: 미카펀진(micafungin)이 IRES(internal ribosomal entry site)의 활성을 억제하는지 여부를 확인한 실험결과;
B: 미카펀진(micafungin)이 3C 프로테아제(protease)를 억제하는지의 여부를 확인한 실험결과;
C: 미카펀진(micafungin)이 2C 또는 3A를 통해 항바이러스의 효과를 갖는지의 여부를 확인한 실험결과.
도 13은 CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시킨 마우스 모델에서 미카펀진(micafungin)의 체중저하 억제 효과를 나타낸 도이다:
A: Body weight(g); 및
B: Body weight(%).
도 14는 CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시킨 마우스의 췌장 조직에서 분리한 RNA를 이용하여 Real time-PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시킨 마우스의 췌장 조직에서 미카펀진(micafungin)에 의한 췌장 선포세포(acinar cell)의 손상 억제 효과를 H&E 염색(staining)으로 나타낸 도이다.
나타내는 미카펀진(micafungin)을 발굴하는 과정을 나타낸 도이다:
A: 바이러스의 복제 활성을 루시퍼라아제(luciferase) 발현으로 측정할 수 있는 EV71 리플리콘(replicon) 시스템의 모식도;
B: Vero 세포에 EV71 리플리콘(replicon)을 도입한 뒤 FDA 승인 약물들로 스크리닝(screening)하여, DMSO 처리 대비 60% 이상 luciferase 활성을 감소시키는 것으로 나타난 21개의 약물들: Gem은 gemcitabine, Mica는 micafungin, Rup는 rupintrivir를 나타냄;
C: EV71(enterovirus 71)에 감염된 LLC-MK2 유도세포에 21개의 약물들을 처리한 후 MTT 어세이(assay)로 세포 생존율을 측정한 결과; 및
D: 미카펀진(micafungin)의 화학 구조.
도 2는 Vero 세포에 EV71(enterovirus 71) 리플리콘(replicon) RNA를 형질주
입(transfection)시킨 후, 루시퍼라아제(luciferase)의 활성을 시간 의존적으로(time-dependent) 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 미카펀진(micafungin)의 EV71(enterovirus 71) 리플리콘(replicon)의 복제 억제효과를 나타낸 도이다:
A: Vero 세포에 EV71(enterovirus 71) 리플리콘(replicon) RNA를 형질주입(transfection)시킨 후, 다양한 농도의 미카펀진(micafungin)을 처리하여 루시퍼라아제(luciferase)의 활성(activity)을 측정한 결과; 및
B : 다양한 농도의 미카펀진(micafungin)에서 세포의 독성을 평가한 결과.
도 4는 미카펀진(micafungin)의 CVB3(coxsackievirus B3) 리플리콘(replicon)의 복제 억제효과를 나타낸 도이다:
A: Vero 세포에 CVB3(coxsackievirus B3) 리플리콘(replicon) RNA를 형질주입(transfection)시킨 후, 다양한 농도의 미카펀진(micafungin)을 처리하여 루시퍼라아제(luciferase)의 활성(activity)을 측정한 결과; 및
B: 다양한 농도의 미카펀진(micafungin)에서 세포의 독성을 평가한 결과.
도 5는 미카펀진(micafungin)에 장시간 노출시 세포의 독성을 평가한 결과를 나타낸 도이다.
A: 24시간 동안 각 농도별 미카펀진(micafungin)의 처리 결과; 및
B: 48시간 동안 각 농도별 미카펀진(micafungin)의 처리 결과.
도 6은 EV71(enterovirus 71)를 감염시킨 LLC-MK2 유도세포에서 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 확인한 도이다:
A: EV71을 감염시킨 LLC-MK2 유도세포에서 미카펀진(micafungin)을 농도별로 4일 동안 처리 후, MTT 어세이(assay)를 통해 항바이러스 효과를 측정한 결과;
B: 동일 조건의 세포에서 미카펀진(micafungin)에 의한 세포의 독성을 측정한 결과;
C: 미카펀진(micafungin)의 처리 농도에 따른 3C 단백질의 발현 양상;
D: C의 세포로부터 분리한 바이러스 RNA(3BC 부위)의 양을 RT-PCR한 결과;
및
E: EV71(enterovirus 71)의 dsRNA를 항체로 염색(녹색)하고, 핵의 DNA는 DAPI로 염색한 사진(파란색).
도 7은 EV71(enterovirus 71)(H 및 1095 strain)에 대한 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 MTT 어세이(assay)를 통해 측정한 도이다.
도 8은 상기 도 6E의 EV71(enterovirus 71)이 감염된 LLC-MK2 유도세포에서 나타나는 dsRNA 형광신호를 정량적으로 분석하여 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 나타낸 도이다.
도 9는 CVB3(coxsackievirus B3)에 대한 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 나타낸 도이다:
A: HeLa 세포에 CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시켜 농도별로 미카펀진 (micafungin)을 처리한 후, 항바이러스 효과를 MTT 어세이(assay)로 측정한 결과; 및
B: 동일 조건의 세포에서 세포의 독성을 측정한 결과.
도 10은 세 종류의 HRV(human rhinovirus)(HRV-14, HRV-21 및 HRV-71)에 대한 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 MTT 어세이(assay)로 측정한 결과:
A: HRV14;
B: HRV 21; 및
C: HRV 71.
도 11은 EV71(enterovirus 71)의 감염 전후 미카펀진(micafungin)의 처리 시간에 따른 항바이러스 효과를 나타낸 도이다.
도 12는 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과의 작용점을 추적하기 위해
수행한 일련의 실험들을 나타낸 도이다:
A: 미카펀진(micafungin)이 IRES(internal ribosomal entry site)의 활성을 억제하는지 여부를 확인한 실험결과;
B: 미카펀진(micafungin)이 3C 프로테아제(protease)를 억제하는지의 여부를 확인한 실험결과;
C: 미카펀진(micafungin)이 2C 또는 3A를 통해 항바이러스의 효과를 갖는지의 여부를 확인한 실험결과.
도 13은 CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시킨 마우스 모델에서 미카펀진(micafungin)의 체중저하 억제 효과를 나타낸 도이다:
A: Body weight(g); 및
B: Body weight(%).
도 14는 CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시킨 마우스의 췌장 조직에서 분리한 RNA를 이용하여 Real time-PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시킨 마우스의 췌장 조직에서 미카펀진(micafungin)에 의한 췌장 선포세포(acinar cell)의 손상 억제 효과를 H&E 염색(staining)으로 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 바이러스는 엔테로바이러스(enterovirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 바이러스는 라이노바이러스(rhinovirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 미카펀진은 EV71(enterovirus 71)의 3C 단백질의 발현과 바이러스 RNA의 발현을 억제하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 상기 미카펀진은 바이러스 감염에 의한 체중의 저하를 억제하는 것이 바람직하며, 췌장조직을 구성하고 있는 췌장 선포세포(acinar cell)의 손상을 억제하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예 및 실험예에서, FDA 승인 약물들 중 EV71(enterovirus 71)에 항바이러스 효과를 나타내는 유효물질을 발굴하기 위한 EV71(enterovirus 71) 리플리콘(replicon) 시스템을 활용하기 위해, 바이러스의 구조 유전자인 P1(VP4-VP1) 부분에 반딧불이 루시퍼라아제(firefly luciferase) 유전자를 대체하여 삽입함으로써 세포 내에서 바이러스 복제를 쉽고 정량적으로 측정해 낼 수 있는 시스템을 제작한 뒤(도 1), 968개의 FDA 승인 약물들을 EV71 리플리콘(replicon) RNA 형질주입(transfection)과 동시에 처리하여 8시간이 지난 후에 루시퍼라아제(luciferase)의 활성을 측정하여(도 2), 21개의 유효 약물을 도출하였고, 이들 중 미카펀진(micafungin)이 EV71 및 CVB3 리플리콘(replicon) 모두에서 미카펀진 농도 의존적으로 루시퍼라아제(luciferase)의 활성을 감소시키고(도 3 및 도 4), 세포에 독성이 없는 신규한 용도의 물질임을 확인하였다(도 5). 또한, 실제 EV71(enterovirus 71)(BrCr 타입)으로 감염시킨 세포에서 미카펀진이 상기와 유사한 항바이러스 효과가 있음을 MTT 어세이(assay), 웨스턴 블롯팅(western blotting), RT-PCR 및 dsRNA 항체 형광 실험 등을 통해 확인하였고(도 6 및 8), 다른 종류의 EV71(enterovirus 71)(H 타입 및 1095 타입)로 감염시킨 세포에서도 미카펀진이 항바이러스 활성이 있음을 확인하였으며(도 7), CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시킨 세포 및 HRV(human rhinovirus)(HRV-14, HRV-21, HRV-71)로 감염시킨 세포에서도 미카펀진에 의한 항바이러스 활성이 있음을 확인하였다(도 9 및 10). 또한, 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과의 작용점과 관련해서, 바이러스 감염 후 1시간 시점에 미카펀진을 처리한 경우에도 바이러스 감염 전(-1시간) 및 감염과 동시에 미카펀진의 처리가 이뤄진 경우와 비슷하게 강력한 항바이러스 효과가 나타남을 확인하였고(도 11), 보다 세부적으로는 바이러스의 세포내 프로세스 중IRES 의존적 번역, 3C 프로테아제(protease)에 의한 폴리단백질 프로세싱(polyprotein processing) 및 2C 또는 3A 등과는 상관없이 다른 방식으로 항바이러스 효과를 가짐을 확인하였다(도 12). 또한, CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시킨 마우스 그룹에서 나타나는 체중저하가 미카펀진에 의해 억제되며(도 13), CVB3의 RNA 발현량이 미카펀진에 의해서 감소하였음을 확인함과 동시에, CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시킨 마우스의 췌장조직 내의 선포세포(acinar cell)의 손상이 미카펀진에 의해 억제됨을 최종적으로 확인하였다(도 15).
따라서, 본 발명의 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 항바이러스의 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 미카펀진(micafungin) 뿐만 아니라, 이의 약학적으로 허용되는 염, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물, 라세이체 또는 입체이성질체를 모두 포함한다.
본 발명은 상기 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸이도에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트,니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 숙시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, 하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 상기 미카펀진(micafungin) 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동량의 상기 미카펀진 화합물, 및 산 수용액 또는 알코올을 가열하고, 이어서 이 혼합물을 증발시켜서 건조하거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능 한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약 상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.
경구 투여를 위한 고형제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 미카펀진 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 81, 카카오지, 타우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.1 mg 내지 100 mg, 바람직하게는 0.5 mg 내지 10 mg을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 바이러스 질환의 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 바이러스는 엔테로바이러스(enterovirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하며, 라이노바이러스(rhinovirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서의 "건강기능식품"이란 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (기능성 원료)을 사용하여 제조한 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품으로 식품의약품안전처장이 정한 것을 의미하나, 이에 한정되지 않으며 통상적인 의미의 건강식품을 배제하는 의미로 사용된 것이 아니다.
본 발명의 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취 시에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조성물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 수크로스 등; 및 다당류, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제{타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)} 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
바이러스 복제 정량시스템을 이용한 스크리닝
<1-1> 바이러스 복제 정량시스템의 도입
우선, 본 발명자들은 안정성 및 임상 적용 가능성이 높은 FDA 승인 약물들 중에서 EV71(enterovirus 71)에 항바이러스 효과를 나타내는 유효물질을 발굴하기 위한 EV71(enterovirus 71) 리플리콘(replicon) 시스템을 활용하기 위해, 바이러스의 구조 유전자인 P1(VP4-VP1) 부분에 반딧불이 루시퍼라아제(firefly luciferase) 유전자를 대체하여 삽입함으로써 세포 내에서 바이러스 복제를 쉽고 정량적으로 측정해 낼 수 있는 시스템을 Dr. Van Kuppeveld(University of Utrecht, 네덜란드)로부터 제공 받아 사용하였다(도 1의 A)
실험에 앞서서, EV71 리플리콘(replicon) RNA를 Vero 세포에 형질주입(transfection)시킨 후, 반딧불이 루시퍼라아제(firefly luciferase)의 활성을 시간 의존적으로(time-dependent) 측정하여 10시간째에 가장 높은 루시퍼라아제(luciferase) 활성을 보이는 것을 확인하여, 이후의 FDA 승인 약물의 실험은 EV71 리플리콘(replicon) RNA 형질주입(transfection)과 동시에 처리하여 8시간이 지난 후에 루시퍼라아제(luciferase)의 활성을 측정하기로 최종 결정하였다(도 2).
<1-2> 약물 스크리닝
다음으로, 본 발명자들은 EV71(enterovirus 71) 리플리콘(replicon) RNA를 Vero 세포에 형질주입(transfection)시킨 후, 동시에 968개의 각 FDA 승인 약물들을 10 μM 농도로 8시간 동안 처리하고 루시퍼라아제(luciferase)의 활성을 측정한 결과, 21개의 약물에서 DMSO 처리군 대비 60% 이상 루시퍼라아제(luciferase) 활성이 감소되는 것을 확인하였다(도 1의 B). 이때, 대조군의 약물로는 강력한 3C 프로테아제 억제제로 알려져 있는 rupintrivir를 사용하였다.
또한, 상기의 21개 약물이 EV71 리플리콘(replicon)뿐만 아니라 EV71(enterovirus 71)의 증식을 억제하는지 여부를 확인하고자, EV71를 감염시킨 LLC-MK2 유도세포를 이용하여 세포 생존율을 측정하는 방식으로 항바이러스(antivirus)의 효과를 측정하였다. EV71이 감염된 세포는 세포독성(cytotoxicity)이 나타나게 되는데 이때 약물에 의해 EV71의 증식이 억제된다면 세포 생존율이 증가할 것이라고 예상하였으므로 LLC-MK2 유도세포에 EV71을 감염시키고, 동시에 약물들을 2 및 10 μM 의 농도로 96 시간 동안 처리한 후 MTT 어세이(assay)를 통해 항바이러스 효과를 평가하였다.
그 결과, 21개의 약물들 중 미카펀진(Micafungin sodium, Selleckchem(S4287))이 가장 높은 항바이러스(antivirus) 효과를 보였고, DMSO 처리군 대비 60% 이상 향상된 세포 생존율을 확인하였다. 또한, 효능이 이미 검증되어 있는 젬시타빈(gemcitabine) 대비 우수한 효과를 확인하였다(도 1의 C).
<
실험예
1>
미카펀진
(
micafungin
)의 항바이러스 효과 확인
<1-1>
EV71
(
enterovirus
71) 및
CVB3
(
coxsackievirus
B3)에 대한 항바이러스 효과 확인
본 발명자들은 상기 <실시예 1>에서 EV71(enterovirus 71)의 억제능을 확인한 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 검증하고, 또한 다른 엔테로바이러스(enterovirus) 종류인 CVB3(coxsackievirus B3)에서의 항바이러스 효과를 검증하기 위해 다음과 같이 실험하였다.
EV71과 CVB3 리플리콘(replicon) RNA를 Vero 세포에 각각 형질주입(transcfection)한 후 동시에 미카펀진(Micafungin sodium, Selleckchem(S4287))을 0.08 μM 부터 50 μM까지 다양한 농도로 8시간 동안 처리한 후 결과를 평가하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에 나타내 바와 같이, EV71 및 CVB3 리플리콘(replicon) 모두에서 미카펀진(micafungin) 농도 의존적으로 루시퍼라아제(luciferase)의 활성이 감소하는 것을 확인하였다(도 3의 A 및 도 4의 A). 이때, EV71와 CVB3에 대한 IC50은 5 내지 8 μM로 비슷하게 나타났으며, 리플리콘(replicon) 형질주입(transcfection)을 하지 않은 세포에 동일한 농도 조건으로 미커펀진(micafungin)을 처리한 후 CellTiter-GloTM 기법을 사용하여 세포의 독성을 측정했을 때, 거의 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 3의 B 및 도 4의 B).
<1-2> 장시간 처리시 세포 독성(cell
cytotoxicity
) 여부 확인
본 발명자들은 미카펀진(micafungin)을 장시간 처리하였을 때 세포독성(cell cytotoxicity)의 여부를 알아보기 위해, Vero 세포에 미카펀진을 상기 실험예 <1-1>에서와 같은 농도조건으로 24시간 및 48시간 동안 처리하여 세포의 독성 여부를 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 미카펀진이 세포 독성을 거의 보이지 않음을 확인하였다(도 5의 A 및 B).
<
실험예
2> 바이러스 감염 세포에서의
미카펀진
(
micafungin
) 항바이러스 효과 확인
<2-1>
EV71
(
BrCr
타입) 감염 세포에서의
미카펀진
항바이러스 효과 확인
본 발명자들은 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 앞선 <실험예 1>에서와 같은 리플리콘(replicon)에서뿐만 아니라, 바이러스가 직접 감염된 세포 조건에서도 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다.
먼저, LLC-MK2 유도세포에 EV71(enterovirus 71)(BrCr 타입)을 감염시키고 동시에 미카펀진(micafungin)을 다양한 농도로 4일 동안 처리 후, MTT 어세이(assay)로 세포 생존율을 측정하여 항바이러스의 효과를 평가하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, EC50가 5 μM 정도로 측정되어 리플리콘(replicon)에서 확인했던 항바이러스 효과와 비슷한 수준의 효과를 보임을 확인하였으며(도 6의 A), 앞서 미카펀진(micafungin)을 Vero 세포에서 24 및 48시간 동안 처리하였을 때 세포 독성을 거의 보이지 않았던 상기 실험예 <1-2>에서의 결과와는 달리(도 5), 미카펀진 50μM의 농도에서 96시간 동안 처리한 조건에서는 약간의 세포 독성을 확인하였다(도 6의 B).
<2-2>
EV71
(H 타입 및 1095 타입) 감염 세포에서의
미카펀진
항바이러스 효과 확인
다음으로, 본 발명자들은 미카펀진(micafungin)이 EV71(BrCr 타입)외에 다른 타입의 바이러스에서도 유사한 항바이러스 효과를 보이는지 확인하기 위해, EV71(H 타입)과 EV71(1095 타입)이 감염된 LLC-MK2 유도세포에서 상기 <실험예 2-1>와 같은 조건에서 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 미카펀진이 EV71(H 타입) 또는 EV71(1095 타입)이 감염된 LLC-MK2 유도세포에서도 기존 타입(BrCr 타입) 대비 유사한 항바이러스 효과를 보이지만, EV71(BrCr 타입)에서의 최대 효능보다는 낮은 수준으로 나타나는 것을 확인하였다(도 7의 A 및 B).
<2-3>
웨스턴
블롯팅
(western blotting)
본 발명자들은 미카펀진(micafungin)에 의한 항바이러스 효과를 확인해보기 위해 다음과 같이 웨스턴 블롯팅(western blotting) 실험을 수행하였다.
EV71(enterovirus 71)을 20시간 동안 감염시킨 LLC-MK2 유도세포에 미카펀진을 다양한 농도로 처리한 후 세포를 수확 및 용해(lysate)하여 얻은 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 다음, PVDF 막(membrane)으로 옮긴 후 (transfer), PVDF 막 위의 비특이적(non-specific) 단백질을 차단하기 위하여 1시간 동안 블로킹(blocking)처리하였고, 워싱(washing)처리하여 EV71 3C 일차 항체와 4℃에서 15시간 동안 반응시켰다. 다시 워싱(washing)처리 후, 일차 항체에 대한 이차 항체와 1 시간 동안 상온에서 반응시킨 다음, 각 반응 사이 TBST 솔루션(solution)으로 5분씩 3번 반복 세척한 후, 항체에 대한 단백질 밴드(band)를 확인하고자 ECL용액으로 반응시킨 후 감광하여 EV71 3C의 단백질 밴드를 확인하였다. 그리고 동일한 양의 단백질을 넣었는지 확인하기 위해 베타-액틴(beta actin) 항체를 이용하여 추가로 단백질 밴드를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, EV71(enterovirus 71)의 3C 단백질이 미카펀진(micafungin) 10 μM의 농도부터 거의 나타나지 않음으로써, 미카펀진에 의한 항바이러스 효과를 확인하였다(도 6의 C).
<2-4> RT-
PCR
또한, 본 발명자들은 미카펀진(micafungin)에 의한 항바이러스 효과를 확인해보기 위해 다음과 같이 RT-PCR 실험을 수행하였다.
EV71(enterovirus 71)을 20시간 동안 감염시킨 LLC-MK2 유도세포에 미카펀진을 다양한 농도로 처리한 후 RNeasy mini kit를 사용하여 세포의 RNA를 추출하였으며, random hexamer와 Superscript cDNA reverse transcription kit를 사용하여 cDNA를 만들고, 이를 주형(template)으로 하여 각각의 유전자를 증폭시킬 수 있는 3B-3C 부분에 해당되는 프라이머(primer)(표 1)와 함께 reverse transcriptase PCR 장비를 사용하여 cDNA의 증폭을 수행하였다.
| 서열번호 1 | 5’-TTGAACCTTAGTGGTAAGCCCAC-3’ |
| 서열번호 2 | 5’-GTGATTGATCCCTTCTATGAG-3’ |
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 미카펀진(micafungin) 10 μM의 농도부터 EV71(enterovirus 71)의 RNA 양(3BC)이 급격히 감소하는 것을 확인하였다(도 6의 D). 이러한 결과는 앞선 <실험예 1>의 EV71 리플리콘(replicon) 및 상기의 세포 감염 실험에서 확인된 항바이러스 효과와 매우 유사한 수준을 보여준다.
<2-5>
dsRNA
항체
형광법
다음으로, 본 발명자들은 미카펀진(micafungin)에 의한 항바이러스 효과를 확인해보기 위해, 상기의 실험예 <2-4>와 동일한 조건으로 처리 후 LLC-MK2 유도세포에서 dsRNA(double strand RNA)를 항체로 염색하여 분석하였다.
EV71(enterovirus 71)을 20시간 동안 감염시킨 LLC-MK2 유도세포에 미카펀진을 다양한 농도로 처리한 후 세포를 고정(fixing)하고 dsRNA에 대한 항체를 처리하여 1시간 동안 반응시켰다. 다음으로, 녹색 형광을 나타내는 이차 항체를 1시간 동안 반응시킨 후, 세포핵은 DAPI 용액을 이용하여 따로 염색하였다. 바이러스가 감염되었는지의 여부는 Operetta 형광 현미경을 사용하여 관찰하였고, 현미경에 설치된 프로그램을 이용하여 감염된 정도를 계산하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 바이러스가 감염되지 않은 세포에서는 염색이 거의 되지 않다가 EV71(enterovirus 71)을 감염시킨 세포에서 뚜렷한 녹색 형광의 신호가 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 미카펀진(micafungin)의 농도 의존적으로 녹색 형광의 신호가 감소함을 확인하여, 미카펀진에 의한 항바이러스 효과를 확인하였다(도 6의 E 및 도 8).
<
실험예
3>
CVB3
(
coxsackievirus
B3) 및
HRV
(human rhinovirus)에서의 미카펀진(
micafungin
) 항바이러스 효과 확인
본 발명자들은 미카펀진(micafungin)이 광범위한 항바이러스의 효능을 보이는지의 여부를 확인해 보기 위해 EV71과 매우 유사한 엔테로바이러스(enterovirus) 종류인 CVB3(coxsackievirus B3)와 HRV(human rhinovirus)를 사용하여 다음과 같이 실험을 수행하였다. CVB3(coxsackievirus B3)는 장바이러스들 중 가장 많은 연구가 이루어진 바이러스이며 바이러스성 뇌수막염, 심근염 및 췌장염의 주요 원인이 되는 것으로 잘 알려져 있다. 또한 HRV(human rhinovirus)는 감기의 주요 원인 바이러스 중 하나이다.
먼저, HeLa 세포에는 CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시키고, H1HeLa 세포에는 HRV(human rhinovirus)의 세 종류 바이러스(HRV 14, HRV 21 및 HRV 71)를 각각 감염시킨 후, 미카펀진을 0.08 μM 부터 50 μM까지 다양한 농도로 48시간 동안 처리 후 결과를 평가하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시킨 HeLa 세포에서 미카펀진(micafungin)은 항바이러스 효과를 보이지만, EV71(enterovirus 71)을 감염시킨 LLC-MK2 유도세포에서의 효과(도 6의 A) 대비 낮은 항바이러스 효과를 확인하였으며(도 9의 A), 미카펀진 50μM의 농도에서 48시간 동안 처리한 조건에서는 약간의 세포 독성을 확인하였다(도 9의 B).
또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 세 종류의 다른 HRV(human rhinovirus)(HRV-14, HRV-21 및 HRV-71)를 각각 감염시킨 H1HeLa 세포에서 미카펀진(micafungin)이 비교적 낮은 수준의 항바이러스 효과를 갖는 것을 확인하였다(도10의 A, B 및 C).
<
실험예
4>
미카펀진
(
micafungin
) 항바이러스 효과의 작용점 추적
<4-1> time of addition 실험
본 발명자들은 미카펀진(micafungin)이 바이러스 감염의 주기(cycle) 중 어떤 과정에서 항바이러스 효과를 나타내는지 확인하기 위해 우선, 바이러스 감염 전후의 다양한 시간(-1, 0, 1, 3, 5, 7, 9 및 20 시간)들에 미카펀진을 처리한 후 viral dsRNA의 항체 형광을 정량화하였다. 그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 바이러스 감염 후 1시간 시점에서도 바이러스 감염 전(-1시간) 및 감염과 미카펀진의 처리가 동시에 이뤄진 시점(0시간)과 동일하게 강력한 항바이러스 효과가 나타남을 확인하였다(도 11). 감염 후 9 시간째 까지도 미카펀진의 항바이러스 효과가 지속되는 것을 확인하였으며, 이러한 효과는 기존에 잘 알려진 3C 프로테아제 억제제인 rupintrivir와 유사한 경향성을 보여주는 것으로, 미카펀진이 바이러스 감염 초기의 엔트리(entry) 과정 이후 특정 과정을 표적화(targeting)하여 EV71(enterovirus 71)의 증식을 억제하는 것을 의미한다. 아울러, 상기의 실험예 <1-1>의 EV71(enterovirus 71) 리플리콘(replicon)을 이용한 실험에서의 항바이러스 효능(도 3)은, 미카펀진이 바이러스의 입자와는 상관없이 세포 내 과정(intracellular process)만을 통해 항바이러스 효능을 가짐을 나타낸다.
<4-2> 이중
루시퍼라아제
리포터 실험
다음으로, 본 발명자들은 미카펀진(micafungin) 항바이러스 효능의 작용 단계를 구체적으로 알아보기 위한 실험을 다음과 같이 수행하였다.
먼저, 미카펀진이 EV71(enterovirus 71) RNA의 5'NCR에서 번역 개시를 일으키는 internal ribosomal entry site(IRES)의 활성을 억제하는지의 여부를 확인하기 위해 이중 루시퍼라아제 리포터 시스템(dual luciferase reporter system)을 제작하였다. 이 리포터(reporter) DNA는 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase) 유전자와 반딧불이 루시퍼라아제(firefly luciferase) 유전자 사이에 EV71 IRES 서열을 넣은 것으로, 레닐라 루시퍼라아제(renilla luciferase) 발현은 cap 의존적 번역을, 반딧불이 루시퍼라아제(firefly luciferase)의 발현은 EV71 IRES의존적 단백질 발현을 나타내는 분석법(assay)이다. 이 이중 루시퍼라아제 리포터 DNA(dual luciferase reporter DNA)를 293T 세포에 발현시킨 후, 미카펀진을 다양한 농도로 24시간 동안 처리하여 각각의 루시퍼라아제(luciferase)의 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 12의 A에 나타낸 바와 같이, 미카펀진(micafungin)의 항(anti) EV71(enterovirus 71) 효과를 설명할 만한 억제효과는 나타나지 않았다(도 12의 A).
<4-3>
웨스턴
블롯팅
(western blotting)
다음으로, 미카펀진(micafungin)이 3C 프로테아제(protease)를 억제하는지의 여부를 확인하기 위해, 다음과 같이 웨스턴 블롯팅(western blotting) 실험을 수행하였다.
EV71(enterovirus 71)의 3C-3D 앞에 플래그 꼬리붙임(flag tagged) 형태로 293T 세포에 발현시키고, 9시간 동안 미카펀진을 처리한 후, 웨스턴 블롯팅의 결과를 통해 3C의 억제효과를 평가하고자 하였다. 3C가 억제될 경우에는 3CD precursor 형태의 단백질이 축적되어 잘려진 3C의 양이 감소하게 된다.
우선, 상기의 조건으로 미카펀진을 처리한 293T 세포의 추출물을 수확하여 SDS-PAGE로 분리한 다음, PVDF 막(membrane)으로 옮긴 후(transfer), PVDF 막 위의 비특이적(non-specific) 단백질을 차단하기 위하여 2시간 동안 블로킹(blocking)처리하였고, 워싱(washing)처리하여 플래그(flag)-3C 및 플래그(flag)-3CD에 대한 일차 항체인 항-플래그(anti-flag)와 2시간 동안 반응시켰다. 다시 워싱(washing)처리 후, 일차 항체에 대한 이차 항체와 1시간 동안 상온에서 반응시킨 다음, 각 반응 사이 TBST 솔루션(solution)으로 5분씩 4번 반복 세척한 후, 항체에 대한 단백질 밴드(band)를 확인하고자 ECL용액으로 반응시킨 후 감광하여 각각의 단백질 밴드를 확인하였다.
그 결과, 도 12의 B에 나타낸 바와 같이, 강력한 3C 프로테아제(protease) 저해제로 잘 알려진 rupintrivir를 처리한 경우에는 3C를 억제하여 플래그(flag)-3CD가 축적되고 플래그(flag)-3C가 감소하는 반면, 미카펀진(micafungin)을 처리한 경우에는 처리하지 않은 경우와 큰 차이를 나타내지 않음을 확인하였다(도 12의 B). 이는 미카펀진이 3C 프로테아제를 억제하지 않음을 의미한다.
<4-4> 돌연변이
리플리콘
(
replicon
) RNA의 형질주입(
transcfection
) 실험
아울러, 기존 항바이러스 효과를 갖는 약물들 중에서 2C나 3A를 표적화(targeting)하는 것으로 알려져 있는 약물들이 존재하므로, 본 발명자들은 다음의 실험을 통해 미카펀진(micafungin)도 2C나 3A를 통해 항바이러스의 효능을 나타내는지의 여부를 확인해 보았다.
미카펀진(micafungin)이 2C나 3A를 통해 항바이러스의 효능을 나타낸다면, 2C 또는 3A 돌연변이를 포함하는 리플리콘(replicon)에서 항바이러스의 효과를 보이지 않을 것이므로, 본 발명자들은 2C 또는 3A 돌연변이 리플리콘(replicon) RNA를 Vero 세포에 각각 형질주입(transcfection)한 후, 미카펀진을 농도별 처리하여 그 결과를 분석하였다.
그 결과, 미카펀진(micafungin)이 2C 또는 3A 돌연변이 리플리콘(replicon)에서도 정상적인 리플리콘(replicon)에서의 실험결과 대비 유사한 수준의 항바이러스 효과를 보임을 확인하였다(도 12의 C). 이는 미카펀진이 2C 또는 3A를 통해 항바이러스 효과를 갖는 것이 아님을 의미한다.
이러한 상기의 결과들은 미카펀진이 IRES 의존적 번역, 3C 프로테아제(protease)에 의한 폴리단백질 프로세싱(polyprotein processing) 및 2C 또는 3A 단백질의 세포 내 초기 처리 과정(intracellular process)등과는 상관없이 다른 방식으로 항바이러스 효과를 가짐을 보여준다.
<
실험예
5> 바이러스 감염 동물모델에서의
미카펀진
(
micafungin
) 항바이러스 효과 확인
<5-1>
엔테로바이러스
(
enterovirus
) 감염 동물 모델의 제작
본 발명자들은 마우스의 in vivo 실험을 위해, CVB3(coxsackievirus B3)를 1 x 107 TCID 50/100 ㎕의 농도로 복강에 투여(injection)하여 CVB3 감염 마우스 모델을 유도하였다.
<
5-2> 바이러스 감염 동물모델의 체중변화 확인
본 발명자들은, 미카펀진(micafungin)의 항바이러스 효과를 in vivo 에서 검증하기 위해, 상기 <실험예 5-1>에서 제작한 엔테로바이러스(enterovirus) 감염 마우스 모델에서 다음과 같이 실험하였다.
다양한 엔테로바이러스(enterovirus) 중에서도 마우스 감염에 매우 효과적인 것으로 알려져 있으면서, 미카펀진(micafungin)에 의한 항바이러스 효능을 이미 확인했었던 CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시켜 만든 마우스 동물 모델에 미카펀진을 2 mg/kg 및 10 mg/kg의 농도로 5일 동안 매일 복강에 투여(injection)하면서, 5일간의 마우스 체중(body weight)의 변화를 측정하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, CVB3(coxsackievirus B3)를 감염시킨 마우스 그룹에서 약 4% 정도의 체중저하가 나타나는 것을 확인하였으나, 2 mg/kg 의 미카펀진(micafungin)을 투여한 마우스 그룹에서는 CVB 감염에 의한 체중저하가 전혀 관찰되지 않았으며, 10 mg/kg의 미카펀진을 투여한 마우스 그룹에서는 약 1% 정도의 체중저하가 관찰되었다(도 13). 이는 미카펀진(micafungin)이 CVB3 감염에 의한 마우스의 체중저하를 억제함을 나타낸다(도 13의 A 및 B).
<
5-3> RT-
PCR
본 발명자들은 상기 <실험예 5-1>에서 바이러스 감염에 따른 마우스의 체중저하가 미카펀진(micafungin)에 의해 억제되는 현상이, 미카펀진의 CVB3(coxsackievirus B3)의 억제 효과에 의한 것인지의 여부를 확인하기 위해서CVB3의 주요 감염 조직인 췌장(pancreas)에서의 CVB3 RNA의 양을 Real time-PCR을 이용하여 다음과 같이 측정하였다.
상기 <실험예 5-2>에서의 마우스 동물 모델을 CO2 처리하여 췌장을 각각 분리한 후, TRI 용액을 사용하여 세포의 RNA를 추출하였으며, cDNA reverse transcription kit를 사용하여 cDNA를 만들고, 이를 주형(template)으로 하는 프라이머(primer)(표 2)와 함께 reverse transcriptase PCR 장비를 사용하여 cDNA의 증폭을 수행하였다. 그리고 그 결과를 GAPDH RNA 양으로 정규화(nomalization)하여 비교하였다.
| 서열번호 3 | 5`-CCG GCC CCT GAA TGC GG-3` |
| 서열번호 4 | 5`-ATT CTT TAA TTG TCA CCA TAA GCA GCC A-3` |
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 10 mg/kg의 미카펀진(micafungin)을 투여한 마우스 그룹에서는 CVB3(coxsackievirus B3)의 RNA 발현량이 CVB3 감염 마우스 그룹(대조군)과 비교하여 크게 감소함을 확인하였다(도 14).
<
5-4> 조직병리학적 변화 확인
다음으로, 본 발명자들은 마우스 동물 모델에서 미카펀진(micafungin)에 의한 췌장의 조직병리학적 변화를 육안으로 관찰하기 위해, 다음과 같이 실험하였다.
상기 <실험예 5-2>에서의 마우스 동물 모델들의 췌장조직 일부를 얻어, 4% 파라포름 알데히드(paraformaldehyde)로 상온에서 1시간 동안 고정한 뒤, 파라핀 블록을 제작하여 표준 H/E 염색(staining)을 수행하였다. 염색한 조직의 사진은 디지털 사진기가 장착된 현미경 장비를 이용하여 얻었다.
그 결과, 도 15에 나타낸 바와 같이, CVB3(coxsackievirus B3) 감염 마우스그룹(대조군)에서는 췌장조직을 구성하고 있는 선포세포(acinar cell)가 손상되어 있는 것을 뚜렷하게 확인할 수 있었으나, 2 mg/kg 및 10 mg/kg의 미카펀진( micafungin)을 투여한 마우스 그룹에서는 췌장 선포세포(acinar cell)의 손상이 현저하게 완화되어 있는 것을 확인하였다(도 15).
이러한 결과들은 미카펀진(micafungin)이 CVB3(coxsackievirus B3)감염 마우스 모델에서도 항바이러스 효과를 보이고, 그 결과, 췌장조직의 괴사 또한 억제함을 보여준다.
<110> Korea research institute of bioscience and biotechnology
Korea research institute of chemical technology
Kangwon national university university -industry cooperation foundation
<120> Composition for treating antivirus containing micafungin or
pharmaceutically acceptable salts thereof as an active ingredient
<130> 2016P-09-051
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3B-3C F
<400> 1
ttgaacctta gtggtaagcc cac 23
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3B-3C R
<400> 2
gtgattgatc ccttctatga g 21
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CVB3 F
<400> 3
ccggcccctg aatgcgg 17
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CVB3 R
<400> 4
attctttaat tgtcaccata agcagcca 28
Claims (10)
- 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 약학적 조성물로서,
상기 바이러스는 엔테로바이러스(enterovirus) 속 또는 라이노바이러스(rhinovirus) 속 바이러스인 항바이러스용 약학적 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 엔테로바이러스(enterovirus) 속은 폴리오바이러스(poliovirus), 콕사키바이러스(coxsackievirus) 및 에코바이러스(echovirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 미카펀진은 EV71(enterovirus 71)의 3C 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항바이러스용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 미카펀진은 바이러스 RNA의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 항바이러스용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 미카펀진은 바이러스 감염에 의한 체중의 저하를 억제하는 것을 특징으로 하는 항바이러스용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 미카펀진은 바이러스 감염에 의한 췌장 선포세포(acinar cell)의 손상을 억제하는 것을 특징으로 하는 항바이러스용 약학적 조성물.
- 미카펀진(micafungin) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항바이러스용 건강기능식품으로서,
상기 바이러스는 엔테로바이러스(enterovirus) 속 또는 라이노바이러스(rhinovirus) 속 바이러스인 항바이러스용 건강기능식품.
- 삭제
- 제 8항에 있어서, 상기 엔테로바이러스(enterovirus) 속은 폴리오바이러스(poliovirus), 콕사키바이러스(coxsackievirus) 및 에코바이러스(echovirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항바이러스용 건강기능식품.
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