KR101713026B1 - 크리신 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 크리신 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 상기 크리신 유도체 화합물들을 대상으로 한 Vero 세포를 이용한 시험관 내 (in vitro) 시험 및 생체내 (in vivo) 시험에서, CVB3-유도(induced) 세포병변 억제 효과실험 및 세포독성 실험에서 CVB3에 대한 억제활성을 확인하고 혈청 케모카인(chemokine) 수준에 대한 억제활성을 확인하여, 본 발명의 시료들이 CVB3 유도 세포병변에 대하여 강력한 억제 효과를 나타내고 CVB3 바이러스 세포감염에 대하여 낮은 세포독성을 유지하면서 강력한 항 바이러스 활성을 나타냄을 확인함으로써, 상기 조성물을 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하다.

Description

크리신 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 {A composition comprising chrysin derivatives for preventing and treating Coxsackie virus involved diseases}
본 발명은 크리신 유도체 화합물을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
[1] T. Yajima, K.U. Knowlton, Viral myocarditis: from the perspective of the virus, Circulation, 119 (2009) 2615-2624.
[2] A.I. Ramsingh, Coxsackieviruses and pancreatitis, Front Biosci. 2 (1997) e53-62.
[3] S. Tracy, K. Hofling, S. Pirruccello, et al., Group B coxsackievirus myocarditis and pancreatitis: connection between viral virulence phenotypes in mice, J Med Virol. 62 (2000) 70-81.
[4] P. Schnitzler, A. Neuner, S. Nolkemper, et al., Antiviral activity and mode of action of propolis extracts and selected compounds, Phytother Res. 24 Suppl 1 (2010) S20-28.
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[11] J. Song, S.G. Yeo, E.H. Hong, et al., Antiviral Activity of Hederasaponin B from Hedera helix against Enterovirus 71 Subgenotypes C3 and C4a, Biomol Ther (Seoul). 22 (2014) 41-46.
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[14] J.H. Park, D.S. Kim, Y.J. Cho, et al., Attenuation of coxsackievirus B3 by VP2 mutation and its application as a vaccine against virus-induced myocarditis and pancreatitis, Vaccine. 27 (2009) 1974-1983.
[15] E. Jaeckel, M. Manns, M. Von Herrath, Viruses and diabetes, Ann N Y Acad Sci. 958 (2002) 7-25.
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[19] M. Lundgren, P.O. Darnerud, J. Blomberg, et al., Sequential changes in serum cytokines reflect viral RNA kinetics in target organs of a coxsackievirus B infection in mice, J Clin Immunol. 29 (2009) 611-619.
[20] L.D. Wood, A.A. Farmer, A. Richmond, HMGI(Y) and Sp1 in addition to NF-kappa B regulate transcription of the MGSA/GRO alpha gene, Nucleic Acids Res. 23 (1995) 4210-4219.
[21] Y.H. Lee, S.H. Kim, Y. Kim, et al., Inhibitory effect of the antidepressant imipramine on NF-kappaB-dependent CXCL1 expression in TNFalpha-exposed astrocytes, Int Immunopharmacol. 12 (2012) 547-555.
[22] S.J. Burke, D. Lu, T.E. Sparer, et al., NF-kappaB and STAT1 control CXCL1 and CXCL2 gene transcription, Am J Physiol Endocrinol Metab. 306 (2014) E131-149.
[23] C. Zaragoza, M. Saura, E.Y. Padalko, et al., Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis, Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (2006) 19051-19056.
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[25] S. Tracy, K. HoS. Pirruccello, et al., Group B coxsackievirus myocarditis and pancreatitis: connection between viral virulence phenotypes in mice, J Med Virol. 62 (2000) 70-81.
콕사키 바이러스 (Coxsackie virus B3; CVB3) 는 엔테로바이러스(enterovirus), 폴리오바이러스 (poliovirus), 및 에코바이러스(echovirus)와 함께, 엔테로바이러스 속(Enterovirus,)에 속하며 급성 심부전증(acute heart failure) 및 확장성 심근병증(dilated cardiomyopathy)을 유발할 수 있는 바이러스성 심근염(viral myocarditis)을 포함한 인체 질환의 원인균이다 [1.T. Yajima, K.U. Knowlton, Viral myocarditis: from the perspective of the virus, Circulation, 119 (2009) 2615-2624.]. 현재까지 CVB3에 의하여 유발되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 효과적인 항바이러스 치료법이 승인된 바가 없다.
CVB3으로 감염된 마우스의 주요 증상은 급성 및 만성 심근염임에도 불구하고 CVB3 감염 후 인체 질환 증상이기도 한, 급성 췌장염(acute pancreatic inflammation)도 보고된 바가 있다 [2. A.I. Ramsingh, Coxsackieviruses and pancreatitis, Front Biosci. 2 (1997) e53-62; ].
결국, CVB3-유도 췌장염 유발 마우스는 급성 인체 바이러스성 췌장염(acute human viral pancreatitis)의 설치류 실험 모델로 작용가능하다. 흥미롭게도, CVB3-유도 췌장염은 심근염 진행으로 잘 걸리게 하는 인자로 작용하고 CVB3-유도 심근염은 후속하여 췌장염만을 유발시킨다 [[3] S. Tracy, K. Hofling, S. Pirruccello, et al., Group B coxsackievirus myocarditis and pancreatitis: connection between viral virulence phenotypes in mice, J Med Virol. 62 (2000) 70-81., 3]. 따라서, CVB3-유도된 췌장염을 예방하는 능력이 CVB3 감염에 대한 항바이러스 약물 후보의 유효성을 평가하는데 필수적일 것이다.
크리신(Chrysin; 5,7-dihydroxyflavone)은 식물에 존재하는 천연 플라보노이드(flavonoid)이다. 이는 벌꿀 및 프로폴리스(propolis)에 존재하는 다량 발견된다 [4. P. Schnitzler, A. Neuner, S. Nolkemper, et al., Antiviral activity and mode of action of propolis extracts and selected compounds, Phytother Res. 24 Suppl 1 (2010) S20-28.]. 플라보노이드들은 항암, 항균, 항진균, 등의 다양한 범위의 약물학적 및 생물학적 활성을 나타낸다 [5S. Kumar, A.K. Pandey, Chemistry and biological activities of flavonoids: an overview, Scientific World Journal, 2013 (2013) 162750.].
인체중 CVB3 감염은 심장-근육 감염증(heart-muscle infection)을 유발하고 마우스에서는 급성 췌장염(acute pancreatitis) 및 바이러스성 심근염(viral myocarditis)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 최근에는 CVB3 감염에 수반하는 1형 당뇨병(type 1 diabetes)도 알려져 있어, 췌장에서의 CVB3 감염증의 생리학적 중요성이 부각되고 있다 ([13] M. Alirezaei, C.T. Flynn, M.R. Wood, et al., Pancreatic acinar cell-specific autophagy disruption reduces coxsackievirus replication and pathogenesis in vivo, Cell host & microbe. 11 (2012) 298-305; [14] J.H. Park, D.S. Kim, Y.J. Cho, et al., Attenuation of coxsackievirus B3 by VP2 mutation and its application as a vaccine against virus-induced myocarditis and pancreatitis, Vaccine. 27 (2009) 1974-1983; [15] E. Jaeckel, M. Manns, M. Von Herrath, Viruses and diabetes, Ann N Y Acad Sci. 958 (2002) 7-25.].
최근연구에서 CVB3의 바이러스 프로데아제(viral protease) 3Cpro 가 kappaB (IkBa)의 저해제 (inhibitor)를 절단하고 감염 세포의 세포사멸을 유도하기 충분하다고 알려져 있다 [[23] C. Zaragoza, M. Saura, E.Y. Padalko, et al., Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis, Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (2006) 19051-19056.].
또한, CVB3 감염 중 몇몇 혈청 시토킨(cytokines) 및 케모카인 (chemokines) 수준이 증가됨이 보고되었으며 [[19] M. Lundgren, P.O. Darnerud, J. Blomberg, et al., Sequential changes in serum cytokines reflect viral RNA kinetics in target organs of a coxsackievirus B infection in mice, J Clin Immunol. 29 (2009) 611-619]; 이중 본 발명자들은 CXCL1 수준이 CVB3-감염 마우스에서 현저하게 증가됨을 확인한 바 있으며. CXCL1 유전자의 전사가 프로모터 영역 (promoter region) 내에서 (NF-κB(nuclear factor kappa B)- 결합 요소(binding elements)에 의하여 조절됨을 확인하였고 [[20] L.D. Wood, A.A. Farmer, A. Richmond, HMGI(Y) and Sp1 in addition to NF-kappa B regulate transcription of the MGSA/GRO alpha gene, Nucleic Acids Res. 23 (1995) 4210-4219.], 또한 CXCL1 발현은 기존 연구에서 제시된 could be NF-kB-의존적(dependent)일 수 있다 [[21] Y.H. Lee, S.H. Kim, Y. Kim, et al., Inhibitory effect of the antidepressant imipramine on NF-kappaB-dependent CXCL1 expression in TNFalpha-exposed astrocytes, Int Immunopharmacol. 12 (2012) 547-555., [22] S.J. Burke, D. Lu, T.E. Sparer, et al., NF-kappaB and STAT1 control CXCL1 and CXCL2 gene transcription, Am J Physiol Endocrinol Metab. 306 (2014) E131-149.].
그러나, 상기 문헌의 어디에도 크리신 유도체의 콕사키 바이러스 (Coxsackie virus B3; CVB3)에 대한 억제 활성에 대하여 개시되거나 교시된 바는 없다.
본 발명자들은 크리신 유도체를 합성하고 이 크리신 유도체 화합물들을 대상으로 한 Vero 세포를 이용한 시험관 내 (in vitro) 시험 및 생체내 (in vivo) 시험에서, CVB3-유도(induced) 세포병변 억제 효과실험 및 세포독성 실험에서 CVB3에 대한 억제활성을 확인하고 혈청 케모카인(chemokine) 수준에 대한 억제활성을 확인하여, 본 발명의 시료들이 CVB3 유도 세포병변에 대하여 강력한 억제 효과를 나타내고 CVB3 바이러스 세포감염에 대하여 낮은 세포독성을 유지하면서 강력한 항 바이러스 활성을 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 일반식 (I)로 표기되는 크리신 유도체 화합물, 이의 이성체, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 일반식 (I)로 표기되는 크리신 유도체 화합물, 이의 이성체, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112015092669620-pat00001
상기 식에서
R1, R2, R3, R4, R6는 각각 독립적으로, 수소원자, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, C1-C6 알콕시기, 및 할로겐기로부터 선택된 하나 이상의 치환기이다.
상기 일반식 (I) 화합물의 바람직한 화합물군으로는, R1, R2, R3, R4, R6는 각각 독립적으로, 수소원자, C1-C3 알킬기, C2-C4 알케닐기, C3-C4 알키닐기, C1-C3 알콕시기, 및 할로겐기로부터 선택된 하나 이상의 치환기인 화합물군, 보다 바람직한 화합물군으로는, R1, R2, R3, R4, R6는 각각 독립적으로, 수소원자, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, 및 할로겐기로부터 선택된 하나 이상의 치환기인 화합물군, 보다 더 바람직한 화합물군으로는, R1, R2, R3, R4, R6는 각각 독립적으로, 수소원자, 메틸기, 에틸기, 메톡시기, 에톡시기, F, Cl, Br 및 I 치환기로부터 선택된 하나 이상의 치환기인 화합물군이다.
가장 바람직하기로는 하기 화합물로부터 선택된 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다;
5-(벤질옥시)-7-히드록시-2-페닐-4H-크로멘-4-온 {5-(benzyloxy)-7-hydroxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one; 크리신 유도체 7}; 7-히드록시-5-((4-메톡시벤질)옥시)-2-페닐-4H-크로멘-4-온{ 7-hydroxy-5-((4-methoxybenzyl)oxy)-2-phenyl-4H-chromen-4-one, 크리신 유도체 8}; 5-((4-플루오로벤질)옥시)-7-히드록시-2-페닐-4H-크로멘-4-온 { (5-((4-fluorobenzyl)oxy)-7-hydroxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one, 크리신 유도체 9); 5-((4-클로로벤질)옥시)-7-히드록시-2-페닐-4H-크로멘-4-온{ (5-((4-chlorobenzyl)oxy)-7-hydroxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one, 크리신 유도체 10); 5-((4-브로모벤질)옥시)-7-히드록시-2-페닐-4H-크로멘-4-온{ 5-((4-bromobenzyl)oxy)-7-hydroxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one, 크리신 유도체 10).
또한, 본 발명은 상기 일반식 (I)로 표기되는 크리신 유도체 화합물, 이의 이성체, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물과 기존 항콕사키 바이러스제와의 조합을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 일반식 (I)로 표기되는 크리신 유도체 화합물, 이의 이성체, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물과 기존 항콕사키 바이러스제와의 조합을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본원에서 정의되는 기존 항콕사키 바이러스제는 플레코나릴(Pleconaril, Sigma). Oseltamivir (Tamiflu), Zanamivir (Relenza), Peramivir, Amantadine (Symmetrel) 및 Rimantadine, Rivaririn, Taribavirin 등이며, 바람직하게는 플레코나릴(Pleconaril, Sigma). Oseltamivir 또는 Amantadine을 포함한다.
본원에서 정의되는 콕사키 바이러스는 HEV-A, HEV-B, HEV-C, 또는 HEV-D의 혈청형, 바람직하게는 HEV-B계 혈청형, 보다 바람직하게는, CVB3형을 가짐을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 콕사키 바이러스에 의한 감염증은 수족구병, 무균성뇌수막염 외에 결막염, 중이염, 피부발진, 무균성수막염, 포진성구협염, 수족구병, 고환염, 심근염, 뇌염, Guillian-Barre syndrome, 실조증, 말단신경염, 횡단성척수염, 사지마비, 당뇨병, 유행성출혈성 각결막염 등을 포함한다.
본원에서 정의되는 상기 화합물들은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용가능한 염 및 이의 용매화물로 제조가능하다.
따라서, 본 발명은 상기 화합물들은 이의 이성체, 약학적으로 허용가능한 염, 또는 용매화물을 포함함을 특징으로 한다.
본 발명의 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올 (예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산 (lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
또한, 본 발명의 화합물은 비대칭 중심을 가지므로 상이한 거울상 이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 본 발명의 화합물의 모든 광학 이성질체 및 R 또는 S형 입체 이성질체 및 이들의 혼합물도 본 발명의 범주 내에 포함되는 것으로 한다. 본 발명은 라세미체, 하나 이상의 거울상 이성질체 형태, 하나 이상의 부분 입체 이성질체 형태 또는 이들의 혼합물의 용도를 포함하며, 당업계에서 알려진 이성질체의 분리 방법이나 제조과정을 포함한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 화합물들은 예를 들어, 하기와 같은 반응식 1의 제조방법으로 수득될 수 있다.
[반응식 1]
Figure 112015092669620-pat00002
상기 반응식에 기재된 바와 같이, 사용 구입가능한 크리신(chrysin) (1)을 기존 문헌에 기재된 합성법[[7] H. Park, T. T. Dao, H. P. Kim, Synthesis and inhibition of PGE2 production of 6,8-disubstituted chrysin derivatives, Eur. J. Med. Chem. 40 (2005) 943-948. [8] S. T. Caldwell, H. M. Petersson, L. J. Farrugia, et al., Isotopic labelling of quercetin 3-glucoside, Tetrahedron 62, (2006), 7257-7265. [9] C.-L. Wang, X. Zheng, W.-D. Meng, et al., Formation of the unexpected 3-alkylated flavonoids in the alkylation of B-ring substituted 5,7-dihydroxy flavones, Tetrahedron Lett. 46 (2005) 5399-5402. [10] J.-B. Daskiewicz, F. Depeint, L. Viornery, et al., Effects of Flavonoids on Cell Proliferation and Caspase Activation in a Human Colonic Cell Line HT29: An SAR Study, J. Med. Chem. 48, (2005), 2790-2804]에 따라 크리신 유도체(2-6)을 제조하고. C(5) 벤질(benzyl)- 및 4-치환 벤질기-보호(benzyl-protected) 크리신 유도체들을 기존에 알려진 (1)크리신의 MOM 보호반응(protection), (2) 벤질화 반응(benzylation) 및 MOM 치환기 탈보호 반응(deprotection)의 3단계의 기존에 공지된 합성법을 통하여 본 발명의 크리신 유도체(7-11) 화합물을 합성가능하다.
본 발명자들은 상기 제조방법으로 수득되는 크리신 유도체 화합물들을 대상으로 한 Vero 세포를 이용한 시험관 내 (in vitro) 시험 및 생체내 (in vivo) 시험에서, CVB3-유도(induced) 세포병변 억제 효과실험 및 세포독성 실험에서 CVB3에 대한 억제활성을 확인하고 혈청 케모카인(chemokine) 수준에 대한 억제활성을 확인하여, 본 발명의 시료들이 CVB3 유도 세포병변에 대하여 강력한 억제 효과를 나타내고CVB3 바이러스 세포감염에 대하여 낮은 세포독성을 유지하면서 강력한 항 바이러스 활성을 나타냄을 확인함으로써, 상기 조성물을 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용함을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 일반식 (I)로 표기되는 크리신 유도체 화합물, 이의 이성체, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 화합물들은 독성실험을 통하여 안전성이 확인되었으므로 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.
본 발명의 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량 %로 포함한다.
본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록 시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose) 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 및 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물 및 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리 에틸렌 글리콜 및 올리브 오일과 같은 식물성 기름 및 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지 및 글리 세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 0.0001 ~ 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 ~ 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 조성물에서 본 발명의 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 ~ 50 중량%의 함량으로 배합될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 마우스, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 및 뇌혈관내 (intracere broventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 일반식 (I)로 표기되는 크리신 유도체 화합물, 이의 이성체, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 개선용 건강기능 식품을 제공한다.
본 발명의 화합물은 목적 질환의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 및 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제 및 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
본 발명의 상기 화합물은 목적 질환의 예방 및 치료를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물 또는 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 30 g, 바람직하게는 0.3 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 폴리 사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량 부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 크리신 유도체 화합물들을 대상으로 한 Vero 세포를 이용한 시험관 내 (in vitro) 시험 및 생체내 (in vivo) 시험에서, CVB3-유도(induced) 세포병변 억제 효과실험 및 세포독성 실험에서 CVB3에 대한 억제활성을 확인하고 혈청 케모카인(chemokine) 수준에 대한 억제활성을 확인하여, 본 발명의 시료들이 CVB3 유도 세포병변에 대하여 강력한 억제 효과를 나타내고 CVB3 바이러스 세포감염에 대하여 낮은 세포독성을 유지하면서 강력한 항 바이러스 활성을 나타냄을 확인함으로써, 상기 조성물을 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하다.
도 1는 크리신 유도체의 합성과정을 나타낸 도이며;
도 2는 크리신의 CVB3에 대한 항바이러스 활성을 나타낸 도이며 ( 베로 세포에서 CVB3 에 대한 (A) 크리신의 세포 독성 (B) 크리신의 항바이러스 활성 및 (C) 화합물 7의 세포 독성 (B) 화합물 7의 항바이러스 활성을 나타냈으며, 데이터는 삼중치의 개개의 독립적 실험에서 얻은 데이터의 평균(means) ± S.D. 으로 표기함);
도 3는 4-치환 벤질 크리신 유도체들 8-11 의 CVB3에 대한 항바이러스 활성을 나타낸 도이며 (베로 세포에서 CVB3 에 대한 (A) 4-치환 벤질 크리신 유도체들 8-11 의 세포 독성 (B) 4-치환 벤질 크리신 유도체들 8-11 의 항바이러스 활성을 나타냈으며, 데이터는 삼중치의 개개의 독립적 실험에서 얻은 데이터의 평균(means) ± S.D. 으로 표기하고, (C)는 4-치환 벤질 크리신 유도체 7 처치후 CVB3-감염 베로 세포의 형태적 변화를 나타낸 도이며, (a)는 비 감염 세포 (Non-infected cells); (b) 화합물 9로 처치된 비감염 세포; (c) 화합물 10로 처치된 비감염 세포; (d) 화합물 11로 처치된 비감염 세포; (e) CVB3-감염 세포; (f) 화합물 9로 처치된 CVB3 감염 세포; (g) 화합물 10로 처치된 CVB3 감염 세포; (h) 화합물 11로 처치된 CVB3 감염 세포);
도 4는 췌장 손상 및 케모카인 수준에 미치는 화합물 9 및 10의 영향을 나타낸 도이다 ( A는 BALB/c 마우스의 화합물 9, 10, 및 대조군의 1×106 TCID50 CVB3로 감염시키고 체중 및 생존율을 측정한 도이며; B는 (A) 비감염, (B) CVB3 감염군 및 treated(C) 화합물 9 및 (D) 화합물 10 처치군에 대한 췌장 단편의 H&E 대표적 염색도이며 (Scale bar=20 mm); (C) 췌장의 H&E 이미지로 계산된 선방(acini) 수; (D) 화합물 9 및 10 처치된 혈청 케모카인 수준을 각각 나타내고, 혈청은 감염후 5일째 회수하고 키트(DuoSet Mouse ELISA Kit)로 복강내 투여후 5일째 CXCL1 수준을 측정한 데이타)를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 크리신 유도체의 제조
1-1. 공지 화합물 유도체(2-6)의 제조
크리신 (1, C80105, ALDRICH) 을 출발물질로 하여 문헌들에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 물성치를 갖는 공지 화합물 유도체(2-6)을 각각 수득하였다. ([7] H. Park, T. T. Dao, H. P. Kim, Synthesis and inhibition of PGE2 production of 6,8-disubstituted chrysin derivatives, Eur. J. Med. Chem. 40 (2005) 943-948. [8] S. T. Caldwell, H. M. Petersson, L. J. Farrugia, et al., Isotopic labelling of quercetin 3-glucoside, Tetrahedron 62, (2006), 7257-7265. [9] C.-L. Wang, X. Zheng, W.-D. Meng, et al., Formation of the unexpected 3-alkylated flavonoids in the alkylation of B-ring substituted 5,7-dihydroxy flavones, Tetrahedron Lett. 46 (2005) 5399-5402. [10] J.-B. Daskiewicz, F. Depeint, L. Viornery, et al., Effects of Flavonoids on Cell Proliferation and Caspase Activation in a Human Colonic Cell Line HT29: An SAR Study, J. Med. Chem. 48, (2005), 2790-2804]]
1-2. 공지 화합물 유도체(2-6)의 제조
크리신 (1, C80105, ALDRICH) 을 출발물질로 하여 기존에 알려진 (1) 크리신의 MOM 보호반응(protection), (2) 벤질화 반응(benzylation) 및 MOM 치환기 탈보호 반응(deprotection)의 3단계의 기존에 공지된 합성법을 통하여 하기와 같은 합성하여 C(5) 벤질(benzyl)- 및 4-치환 벤질기-보호(benzyl-protected) 크리신 유도체 (7-11) 화합물을 합성하였다 (반응식 1)
[반응식 1]
C(5) 벤질 (benzyl)- 및 4-치환 벤질기-보호(benzyl-protected) 크리신 유도체(7-11) 화합물의 합성
Figure 112015092669620-pat00003
(f) 크리신 유도체 7(5-( benzyloxy )-7- hydroxy -2-phenyl-4H- chromen -4-one)의 합성
크리신 (1, C80105, ALDRICH ) (3.42 g, 13.45 mmol) 과 Diisoprpylethylamine (4.69 mL, 26.9 mmol)의 CH2Cl2 용액에 MOMCl (1.02 mL, 13.45 mmol) 를 넣고 상온에서 4시간동안 교반하여 반응하였다. 그리고 그 후 포화 NaHCO3 용액을 가한 뒤, CH2Cl2를 이용하여 추출한 뒤, 무수 Na2SO4를 이용하여 건조하고 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 칼럼 크로마토그래피하여 MOM- 크리신 (3.58 g, 89%) 을 얻을 수 있었다. 이렇게 얻은 MOM- 크리신 (2.45 g, 8.21 mmol)의 DMF 용액 (50 mL)에 K2CO3 (3.40 g, 24.6 mmol)과 benzyl bromide (1.46 mL, 12.3 mmol)를 상온에서 가하고 40도에서 12시간동안 교반/반응하였다. 그 후 포화 NH4Cl 용액을 가한 뒤, EtOAc 를 이용하여 추출한 뒤, 무수 Na2SO4를 이용하여 건조하고 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 THF에 녹인 후, 5N HCl 20 mL를 가한 뒤 상온에서 10시간동안 교반/반응한 뒤 EtOAc 를 이용하여 추출한다. 그리고 무수 Na2SO4를 이용하여 건조하고 감압 농축하여 얻어진 잔사를 칼럼 크로마토그래피하여 하기 물성치를 나타내는 크리신 유도체 7 (2.08 g, 73%) 을 얻을 수 있었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.00 (dd, J = 7.2, 2.0 Hz, 2 H), 7.60 (d, J = 8.0 Hz, 2 H), 7.577.52 (m, 3 H), 7.40 (dd, J = 7.2, 7.2 Hz, 2 H), 7.31 (dd, J = 7.2, 7.2 Hz, 1 H), 6.69 (s, 1 H), 6.57 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.19 (s, 2 H)
(g) 크리신 유도체 8 (7-hydroxy-5-((4-methoxybenzyl)oxy)-2-phenyl-4H-chromen-4-one)의 합성
MOM- 크리신 (298.3 mg, 1.0 mmol)의 DMF 용액 (10 mL)에 K2CO3 (414.6 mg, 3.0 mmol)과 4-Methoxybenzyl bromide (1.5 mmol)를 상온에서 가하고 40도에서 12시간동안 교반/반응하였다. 그 후 포화 NH4Cl 용액을 가한 뒤, EtOAc 를 이용하여 추출한 뒤, 무수 Na2SO4를 이용하여 건조하고 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 THF에 녹인 후, 5N HCl 20 mL를 가한 뒤 상온에서 10시간동안 교반/반응한 뒤 EtOAc 를 이용하여 추출한다. 그리고 무수 Na2SO4를 이용하여 건조하고 감압 농축하여 얻어진 잔사를 칼럼 크로마토그래피하여 하기 물성치를 나타내는 크리신 유도체 8 (140.3 mg, 38%) 을 얻을 수 있었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.00 (dd, J = 8.0, 2.0 Hz, 2 H), 7.587.52 (m, 3 H), 7.49 (dd, J = 8.8 Hz, 2 H), 6.95 (d, J = 8.2 Hz, 2 H), 6.66 (s, 1 H), 6.54 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.44 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 5.10 (s, 2 H), 3.76 (s, 3 H)
(h) 크리신 유도체 9 (5-((4-fluorobenzyl)oxy)-7-hydroxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one) 의 합성
MOM- 크리신 (298.3 mg, 1.0 mmol)의 DMF 용액 (10 mL)에 K2CO3 (414.6 mg, 3.0 mmol)과 4-Fluorobenzyl bromide (1.5 mmol)를 상온에서 가하고 40도에서 12시간동안 교반/반응하였다. 그 후 포화 NH4Cl 용액을 가한 뒤, EtOAc 를 이용하여 추출한 뒤, 무수 Na2SO4를 이용하여 건조하고 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 THF에 녹인 후, 5N HCl 20 mL를 가한 뒤 상온에서 10시간동안 교반/반응한 뒤 EtOAc 를 이용하여 추출한다. 그리고 무수 Na2SO4를 이용하여 건조하고 감압 농축하여 얻어진 잔사를 칼럼 크로마토그래피하여 하기 물성치를 나타내는 크리신 유도체 9 (200.8 mg, 55%) 을 얻을 수 있었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.82 (s, 1 H), 8.00 (dd, J = 7.2, 1.6 Hz, 2 H), 7.66 (dd, J = 8.0, 5.2 Hz, 2 H), 7.577.53 (m, 3 H), 7.24 (dd, J = 8.8, 8.8 Hz, 2 H), 6.70 (s, 1 H), 6.59 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.47 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 5.18 (s, 2 H)
(i) 크리신 유도체 10 (5-((4-chlorobenzyl)oxy)-7-hydroxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one)의 합성
MOM- 크리신 (298.3 mg, 1.0 mmol)의 DMF 용액 (10 mL)에 K2CO3 (414.6 mg, 3.0 mmol)과 4-Chlorobenzyl bromide (1.5 mmol)를 상온에서 가하고 40도에서 12시간동안 교반/반응하였다. 그 후 포화 NH4Cl 용액을 가한 뒤, EtOAc 를 이용하여 추출한 뒤, 무수 Na2SO4를 이용하여 건조하고 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 THF에 녹인 후, 5N HCl 20 mL를 가한 뒤 상온에서 10시간동안 교반/반응한 뒤 EtOAc 를 이용하여 추출한다. 그리고 무수 Na2SO4를 이용하여 건조하고 감압 농축하여 얻어진 잔사를 칼럼 크로마토그래피하여 하기 물성치를 나타내는 크리신 유도체 10 (210.4 mg, 56%) 을 얻을 수 있었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.83 (s, 1 H), 8.00 (dd, J = 7.2, 1.6 Hz, 2 H), 7.65 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 7.577.53 (m, 3 H), 7.47 (d, J = 8.4 Hz, 2 H), 6.70 (s, 1 H), 6.59 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 5.19 (s, 2 H)
(j) 크리신 유도체 11 (5-((4-bromobenzyl)oxy)-7-hydroxy-2-phenyl-4H-chromen-4-one)의 합성
MOM- 크리신 (298.3 mg, 1.0 mmol)의 DMF 용액 (10 mL)에 K2CO3 (414.6 mg, 3.0 mmol)과 4-Bromobenzyl bromide (1.5 mmol)를 상온에서 가하고 40도에서 12시간동안 교반/반응하였다. 그 후 포화 NH4Cl 용액을 가한 뒤, EtOAc 를 이용하여 추출한 뒤, 무수 Na2SO4를 이용하여 건조하고 감압 농축하였다. 얻어진 잔사를 THF에 녹인 후, 5N HCl 20 mL를 가한 뒤 상온에서 10시간동안 교반/반응한 뒤 EtOAc 를 이용하여 추출한다. 그리고 무수 Na2SO4를 이용하여 건조하고 감압 농축하여 얻어진 잔사를 칼럼 크로마토그래피하여 하기 물성치를 나타내는 크리신 유도체 11 (195.3 mg, 46%) 을 얻을 수 있었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.83 (s, 1 H), 8.00 (dd, J = 7.2, 1.6 Hz, 2 H), 7.627.53 (m, 7 H), 6.70 (s, 1 H), 6.59 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.46 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 5.18 (s, 2 H)
참고예 1. 바이러스와 세포주
CVB3 virus (ATCC VR-30, Manassas, VA, USA) 바이러스는 질병관리본부 국립보건연구원 백신연구과(Korea Center Disease control and prevention; KCDC)에서 제공 받았으며 37℃에서 아프리카 원숭이 신장 상피세포(African green monkey kidney)에서 분리된 vero 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 37 °C 온도에서 증식시켰다. Vero 세포는 CVB3 감염이 쉬운 적절한 목표가 되도록 type I IFN 생성 (production)이 결핍되는, type I 부위(locus) 가 본질적으로 유전자 결실된 세포로서 CVB3 감염에 사용된다. Vero 세포는 MEM media(11095-080, Gibco사)에 10% FBS(16000-044, Gibco사)와 0.01% 항생제(15070-063, Gibco)를 첨가하여 유지하였다. 항생제(Antibiotic-antimycotic solution)와 trypsin-EDTA, FBS 그리고 MEM media는 Gibco사 제품(Gibco BRL; Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Germany)을 사용 하였다. Tissue culture plates는 Falcon사 제품 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)을 사용 하였고 sulforhodamine B (SRB)는 SigmaAldrich(S9012-25G)에서 구매 하였고 기타 모든 시약은 시약급을 사용하였다.
참고예 2. 실험 동물
야생형(Wild-type) 마우스(inbred BALB/c mice, 13 g 내지 15 g, 4주령 및 암컷)를 회사(Charles River Laboratories, Orient Bio Inc., Sungnam, Korea)에서 구입하였다. .마우스를 강원대학교 실험용 사육장에서 특정한 무균조건하에서 사육하였다. 본 실험은 강원대학교 동물실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use committees of Kangwon National University)하에서 수행하였다.
참고예 3. 통계
모든 실험 결과는 GraphPad Prism version 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 이용하여, 사용된 통계학적 유의성은 검정법(Tukey’s post hoc test)과 함께 일원배치분산분석법(ANOVA)을 사용하였다. p < 0.05 값들을 통계학적으로 유의성이 있는 것(95% confidence interval)으로 간주하였다.
실험예 1. 엔테로 바이러스에 대한 억제활성
1- 1. SRB in vitro assay
상기 실시예에서 얻은 시료들에 대한 항바이러스 활성과 세포독성의 측정은 바이러스에 의해 일어나는 세포 병변을 억제시키는 능력에 대하여 SRB assay로 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 ([11] J. Song, S.G. Yeo, E.H. Hong, et al., Antiviral Activity of Hederasaponin B from Hedera helix against Enterovirus 71 Subgenotypes C3 and C4a, Biomol Ther (Seoul). 22 (2014) 41-46.)
지시한 농도의 시료농도(0.4, 2, 10, 및 50 μ로 48시간 동안 처치한 후에 CVB3로 베로세포를 감염시켰다. 항 바이러스 효과는 CPE(cytopathic effect) 감소 어세이법(reduction assay)을 이용하여 조사하였다.
CCID50 (50% cell culture infective dose) CVB3 바이러스를 첨가한 후에 플레이트에 부착된 세포들 측정하여 개개 바이러스의 감염성(infectivity)을 측정하였다. 항바이러스 약물 후보물질들을 지정된 시간에 개개 웰에 첨가하였고 세포 병변효과(cytopathic effect)는 48 시간 감염후에 측정하였다. 세포 형태도 4x10 배율의 현미경 (AXIOVERT10, ZEISS, Germany)하에서 SRB 어세이 이후에도 측정하고 이미지를 촬영하였다. 개개 웰에서 흡광도를 판독기(VERSA max microplate reader, Molecular Devices, PaloAlto, CA, USA)를 이용하여 540nm 및 620nm(reference absorbance)에서 측정하였다. CVB3-감염 세포중 개개 시험 물질들의 항바이러스 활성은 비처치 감염 대조군 세포 (untreated infected control cells)로 정상화(normalization) 한 후에 상응하는 비감염 세포의 최대 생존율(corresponding maximum survival of non-infected cells)의 백분율로 계산하였다.
1-2. 생체내 엔테로 바이러스에 대한 억제활성
마우스를 4개 군으로 나누고 200 ml 베로 세포 용해물 (Vero cell lysate) 중 1 x 106 TCID50 의 CVB3을 감염 용량 (infectious dose) 50% (TCID50) 농도로 복강내 투여법으로 투여하였다. CVB3 감염이 없는 세포 용해물을 투여한 마우스를 대조군(control)으로 사용하였다. 에테르 마취 후에 모든 마우스들은 조직분석 분석을 위하여 감염후 5일째에 희생시켰고 혈청은 감염후 5일째에 회수하였다.
1-3. 조직분석(Histology)
상기 실시예에서 얻은 시료들에 대한 마우스 췌장에 미치는 영향을 문헌에 개시된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 ([25] S. Tracy, K. HoS. Pirruccello, et al., Group B coxsackievirus myocarditis and pancreatitis: connection between viral virulence phenotypes in mice, J Med Virol. 62 (2000) 70-81.)
마우스로부터 췌장을 분리하고 4% 포르알데히드(formaldehyde, F8775, Sigma-Aldrich )로 고정하기 전에 염수(phosphate-buffered saline, P4417, Sigma-Aldrich)로 세척하였다. 조직을 파라핀(제품번호 및 제조사)으로 함침하고 염색시약 (hematoxylin (HHS16, Sigma-Aldrich) and eosin (HT110316, Sigma-Aldrich))으로 염색하였다. 췌장내 선방 (acini)수를 맹검시험법 (blind test)을 이용하여 병리학자에 의하여 계수하였다.
실험 결과
본 발명자들은 크리신(chrysin)이 10 mM에서 CVB3에 대한 항바이러스 활성을 나타냈으나, 50 mM에서 미약한 세포독성(mild cellular cytotoxicity)을 나타냈다(도 1). 따라서, 본 발명자들은 항바이러스 활성을 보다 강력하고 낮은 세포독성을 갖는 크리신 유도체들을 대상으로 실험을 수행하였으며, C(5) 벤질기-보호 유도체 (benzyl-protected derivative 7)가 낮은 세포독성으로 가장 강력한 CVB3 항바이러스 활성을 나타냈다(도 1B).
또한 4-치환 벤질 유도체들, 911 이 50 mM에서 유의적인 항 바이러스 활성을 나타냈으며, 특히 화합물 9 는 세포독성이 없이 5 mM에서 강력한 항 바이러스 활성을 나타냈다 (도 3A 및 3B).
또한, 화합물 9-11 처치후, SRB 방법을 이용하여 CVB3 감염 베로 세포의 형상을 측정한 결과, CVB3로 감염된 베로세포의 부존재하에, 담체(vehicle) 또는 10mM 개개 화합물 처치 세포들은 정상적인 형상을 갖는 전형적인 분산형 형상(typical spread-out shapes)을 나타냈다 (도 3C). 약물 처치가 없는 CVB3 감염증은 심각한 CPE를 유발하였다 (도 3C). 반면에 CVB3 감염 베로세포에서의 화합물 9, 10, 및 11 첨가는 식별가능한 CPE 형성을 저해현상을 나타냈다 (도 3C).
결론적으로, 화합물 9-11 는 베로세포에서 세포독성이 없이 CVB3 에 대하여 강력한 항 바이러스 활성을 나타냄을 확인하였다.
화합물 9 및 10을 처치후 CVB3-감염 마우스 체중상의 변화를 측정한 결과, CVB3-감염 마우스는 미약한 체중 감소를 나타냈으나, 화합물 9 및 10 처치군은 CVB3 감염 후 체중 감소를 유의적으로 방지할 수 없음을 확인하였다 (도 4A). CVB3의 주요 목표 장기중 하나가 마우스의 췌장이므로 마우스의 CVB3-수반 췌장염 유도에 대한 영향을 측정하였다. [[12] C.C. Kemball, M. Alirezaei, C.T. Flynn, et al., Coxsackievirus infection induces autophagy-like vesicles and megaphagosomes in pancreatic acinar cells in vivo, J Virol. 84 (2010) 12110-12124.]. 병리학적 분석을 위하여, 감염 마우스의 췌장으로부터 조직을 분리하고 마우스의 비감염 췌장은 조직학적으로 정상이었으나, CVB3 감염 5일 후에, 선방 세포(acinar cells)의 감소 및 염증 세포의 침습 현상을 나타냈다. 그러나, CVB3-감염 마우스에서, 췌장의 대부분도 CVB3 감염으로 파괴되었음에도 부분적으로 선방세포를 확인할 수 있었다 (도 4B).
실험예 2. 혈청 케모카인 ( chemokine ) 수준에 대한 억제활성
상기 실시예에서 얻은 시료들의 항바이러스 기전을 확인하기 위하여 혈청 케모카인인 CXCL1 수준에 미치는 영향을 하기와 같이 실험을 수행하였다 .
NF-kB 활성화가 항 바이러스 효과를 나타내는지 여부를 알 수 없음에도 불구하고 크리신(chrysin)에 의한 CVB3 3Cpro 의 저해는 IkBa의 절단(cleavage)을 저해하고 NF-kB-매개성(mediated) CXCL1 전사(transcription)를 감소시키고 바이러스 단백질(viral proteins)의 절단을 저해한다고 알려져 있다. 따라서, 혈청 CXCL1의 감소된 수준은 바이러스 복제 감소 및 핵으로서의 NF-kB 전좌(translocation) 저해 결과일 수 있으며, 이는 마우스에서 CVB3 감염 후 크리신에 의한 췌장 세포의 세포사멸성 세포사의 감소의 결과이다.
본 발명자들은 CXCL1 의 증가된 수준은 NF-kB 신호체계(signaling)의 증가된 수준에 기인할 수 있으며, 이는 CVB3 감염에 의하여 유발되는 증가된 소포체(endoplasmic reticulum; ER) 스트레스(stress)에 기인한 것일 수 있다. 따라서, CVB3 감염 세포에서의 증가된 ER 스트레스가 보고되었으나, [[24] H.M. Zhang, X. Ye, Y. Su, et al., Coxsackievirus B3 infection activates the unfolded protein response and induces apoptosis through downregulation of p58IPK and activation of CHOP and SREBP1, J Virol. 84 (2010) 8446-8459.] ER 스트레스 반응의 조절에 크리신 및 본 발명의 크리신 유도체들의 역할을 규명할 추가 연구가 필요하다.
CXCL1(chemokine; C-X-C motif ligand 1) 수준은 키트(were measured by a DuoSet Mouse ELISA Kit, R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 세트(ELISA MAX standard sets, Biolegend, Inc., San Diego, CA)로 측정하고 모든 실험은 제조사 지시내용에 따라 수행하였다.
감염 5일 후에 혈청을 회수하고 CXCL1 혈청 수준을 측정하였다. CVB3 감염이 없는 경우에 CXCL1 혈청 수준은 검출 불가능하였고; CVB3 감염은 감염 5일 후에 급격하게 증가된 혈청 CXCL1 수준을 나타냈다. 놀랍게도, 5일간 연속일 동안 화합물 9의 일일 투여가 CXCL1 수준의 현격한 감소를 나타냈다. 따라서, 화합물 9는 CVB3에 대한 강력한 항 바이러스 활성을 나타내며 이는 감염 마우스 혈청에서의 CXCL1 수준의 감소 현상을 초래함을 확인하였다.
실험예 3 독성검정
식약청의 예규에 따라 ICR 마우스 (male, 6 weeks, 오리에트사로부터 구입)를 대상으로 급성독성을 검정하였다. 그 결과, 크리신 유도체 화합물 9-11들은 2 g/kg의 경구투여까지 급성독성을 보이지 않았다.
이상의 실험예의 결과 본 발명의 크리신 유도체 화합물 9-11는 안전하게 콕사키 바이러스 감염증에 사용할 수 있고, 특히 항바이러스제와 병용투여시 활성이 높았다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
화합물 9 ------------------------------------ 300 mg
유당수화물 ---------------------------------- 100 mg
탤크 ----------------------------------------- 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
화합물 10 ---------------------------------- 300 mg
옥수수전분 --------------------------------- 100 mg
유당수화물 --------------------------------- 100 mg
스테아르산 마그네슘 -------------------------- 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
화합물 11 ---------------------------------- 300 mg
미결정셀룰로오스 ----------------------------- 3 mg
유당수화물 -------------------------------- 14.8 mg
스테아르산 마그네슘 ------------------------ 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
화합물 9 ---------------------------------- 300 mg
디-만니톨 --------------------------------- 180 mg
주사용 멸균 증류수 ----------------------- 2974 mg
Na2HPO412H2O -------------------------------- 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
화합물 10 ---------------------------------- 300 mg
이성화당 ------------------------------------- 10 g
디-만니톨 ------------------------------------- 5 g
정제수 --------------------------------------- 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
화합물 11 -------------------------------- 1000 ㎎
비타민 혼합물 ------------------------------- 적량
비타민 A 아세테이트 ------------------------ 70 ㎍
비타민 E ---------------------------------- 1.0 ㎎
비타민 B1 --------------------------------- 0.13 ㎎
비타민B2 ---------------------------------- 0.15 ㎎
비타민B6 ----------------------------------- 0.5 ㎎
비타민B12 ---------------------------------- 0.2 ㎍
비타민 C ----------------------------------- 10 ㎎
비오틴 ------------------------------------- 10 ㎍
니코틴산아미드 ---------------------------- 1.7 ㎎
엽산 --------------------------------------- 50 ㎍
판토텐산 칼슘 ----------------------------- 0.5 ㎎
무기질 혼합물 ------------------------------- 적량
황산제1철 -------------------------------- 1.75 ㎎
산화아연 --------------------------------- 0.82 ㎎
탄산마그네슘 ----------------------------- 25.3 ㎎
제1인산칼륨 -------------------------------- 15 ㎎
제2인산칼슘 -------------------------------- 55 ㎎
구연산칼륨 --------------------------------- 90 ㎎
탄산칼슘 ---------------------------------- 100 ㎎
염화마그네슘 ----------------------------- 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
화합물 9 ---------------------------------- 300 ㎎
비타민 C ------------------------------------ 15 g
비타민 E(분말) ----------------------------- 100 g
젖산철 ----------------------------------- 19.75 g
산화아연 ----------------------------------- 3.5 g
니코틴산아미드 ----------------------------- 3.5 g
비타민 A ----------------------------------- 0.2 g
비타민 B1 --------------------------------- 0.25 g
비타민 B2 ---------------------------------- 0.3 g
물 ------------------------------------------ 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동 안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (14)

  1. 하기 일반식 (I)로 표기되는 크리신 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 치료용 약학조성물:
    Figure 112016096828396-pat00004

    상기 식에서
    R1, R2, R3, R4, R6는 각각 독립적으로, 수소원자, C1-C6 알킬기, C2-C6 알케닐기, C3-C6 알키닐기, C1-C6 알콕시기, 및 할로겐기로부터 선택된 하나 이상의 치환기이다.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 일반식 (I) 화합물의 화합물군은, R1, R2, R3, R4, R6는 각각 독립적으로, 수소원자, C1-C3 알킬기, C2-C4 알케닐기, C3-C4 알키닐기, C1-C3 알콕시기, 및 할로겐기로부터 선택된 하나 이상의 치환기인 화합물군인 약학 조성물.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 일반식 (I) 화합물의 화합물군은, R1, R2, R3, R4, R6는 각각 독립적으로, 수소원자, C1-C3 알킬기, C1-C3 알콕시기, 및 할로겐기로부터 선택된 하나 이상의 치환기인 화합물군인 약학 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 일반식 (I) 화합물의 화합물군은, R1, R2, R3, R4, R6는 각각 독립적으로, 수소원자, 메틸기, 에틸기, 메톡시기, 에톡시기, F, Cl, Br 및 I 치환기로부터 선택된 하나 이상의 치환기인 화합물군인 약학 조성물.
  5. 제 1항의 일반식 (I)로 표기되는 크리신 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물과 기존 항콕사키 바이러스제와의 조합을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 치료용 약학조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 기존 항콕사키 바이러스제는 플레코나릴(Pleconaril, Sigma), Oseltamivir (Tamiflu), Zanamivir (Relenza), Peramivir, Amantadine (Symmetrel), Rimantadine, Rivaririn 또는 Taribavirin 임을 특징으로 하는 약학조성물.
  7. 제 1항 또는 제 5항에 있어서,
    상기 콕사키 바이러스는 HEV-A, HEV-B, HEV-C, 또는 HEV-D의 혈청형임을 특징으로 하는 약학조성물.
  8. 제 1항 또는 제 5항에 있어서,
    상기 콕사키 바이러스에 의한 감염증은 수족구병, 무균성뇌수막염, 결막염, 중이염, 피부발진, 무균성수막염, 포진성구협염, 수족구병, 고환염, 심근염, 뇌염, Guillian-Barre syndrome, 실조증, 말단신경염, 횡단성척수염, 사지마비, 당뇨병, 또는 유행성출혈성 각결막염임을 특징으로 하는 약학조성물.
  9. 제 1항의 일반식 (I)로 표기되는 크리신 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  10. 제 1항의 일반식 (I)로 표기되는 크리신 유도체 화합물, 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물과 기존 항콕사키 바이러스제와의 조합을 유효성분으로 함유하는 콕사키 바이러스에 의한 감염증의 예방 및 개선용 건강기능식품.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 기존 항콕사키 바이러스제는 플레코나릴(Pleconaril, Sigma), Oseltamivir (Tamiflu), Zanamivir (Relenza), Peramivir, Amantadine (Symmetrel), Rimantadine, Rivaririn 또는 Taribavirin 임을 특징으로 하는 건강기능식품.
  12. 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
    상기 콕사키 바이러스는 HEV-A, HEV-B, HEV-C, 또는 HEV-D의 혈청형임을 특징으로 하는 건강기능식품.
  13. 제 9항 또는 제 10항에 있어서,
    상기 콕사키 바이러스에 의한 감염증은 수족구병, 무균성뇌수막염, 결막염, 중이염, 피부발진, 무균성수막염, 포진성구협염, 수족구병, 고환염, 심근염, 뇌염, Guillian-Barre syndrome, 실조증, 말단신경염, 횡단성척수염, 사지마비, 당뇨병, 또는 유행성출혈성 각결막염임을 특징으로 하는 건강기능식품.
  14. 제 9항 또는 제 10항에 있어서
    상기 건강기능식품은 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 또는 건강기능성 식품류 형태인 건강기능식품.
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BIOORGANIC AND MEDICINAL CHEMISTRY, 22(12), 3146-3158(2014.06.) *

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109943536A (zh) * 2019-03-26 2019-06-28 昆明理工大学 一种戊型肝炎病毒、培养方法及其灭活疫苗的制备方法
CN109943536B (zh) * 2019-03-26 2021-09-14 昆明理工大学 一种戊型肝炎病毒的培养方法及其灭活疫苗的制备方法

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