KR101045368B1

KR101045368B1 - 베타닌을 유효성분으로 포함하는 위장질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101045368B1
Application number: KR1020110017553A
Authority: KR
Inventors: 전병주; 김태일; 이희경; 심기성; 김대현; 박진호; 김태범
Original assignee: 주식회사 엘컴사이언스
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2011-02-28
Publication date: 2011-06-30

Abstract

본 발명은 베타닌(betanin) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 위염, 위궤양 및 십이지장 궤양과 같은 위장관 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 스트레스, 알코올 및 비스테로이드성 항염증제에 의해 유발된 위손상을 억제하고 프로스타글란딘의 생성을 증가시킴으로써 위점막에 대한 보호 활성을 나타내므로, 위장관계 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 용도로 광범위하게 응용될 수 있다.

Description

베타닌을 유효성분으로 포함하는 위장질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising betanin as active ingredient for preventing or treating gastrointestinal disorders}

본 발명은 베타닌(betanin) 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 위염, 위궤양 및 십이지장 궤양의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 스트레스, 알코올 및 비스테로이드성 항염증제에 의해 유발된 위손상을 억제하고 프로스타글란딘의 생성을 증가시켜 위점막에 대한 보호 효능을 가지므로, 상기 질환을 포함한 위장관계 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 용도로 광범위하게 응용될 수 있다.

위장질환의 원인은 다양하며, 이는 크게 위점막층의 손상을 야기하는 물리적 및 화학적 공격인자와 이들로부터 위점막 보호층을 방어하고 위 기능의 항상성을 유지하도록 작용하는 생체내 방어인자의 불균형에 기인한다. 대표적인 공격인자로는 스트레스, 알코올, 위산, 담배, 아스피린과 같은 진통소염제, 스테로이드 제제, 자극적인 음식, 영양결핍, 헬리코박터 파이로리의 감염 등이 있으며, 방어기전으로는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 증가에 대한 항산화력의 약화, 위점막을 보호하는 점액, 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생성 저하 및 조직 재생능력, 혈행 개선능력의 감소가 병인과 밀접하게 관련된다. 상기 요인으로 인해 위점막층이 손상되었을 때 미란, 발적, 출혈, 부종을 동반한 염증이 발생하게 되며, 손상이 심하여 위점막을 뚫고 점막 하단 및 근육층까지 손상이 확대된 경우 위궤양으로 발전하게 된다. 또한 상기 요인에 의해 십이지장 점막이 손상되어 가장 표면에 있는 점막층보다 깊이 패이면서 점막근층 이상으로 손상이 진행되면 십이지장 궤양이 발생한다.

위염 또는 위궤양을 유발하는 인자들 중 특히 육체적 및 정신적 스트레스에 의한 위점막의 급성 손상은 주로 시상 하부에 변화를 일으켜 위점막의 미세순환 장애(microcirculary disturbance), 혈류량 감소 및 그로 인한 저혈압을 야기함으로써 유발된다. 허혈 부위에 혈액이 재공급되는 허혈성 재관류(ischemia reperfusion)에 의한 손상 및 이에 동반한 호중구의 침윤은 위 점막 조직 및 호중구 내에서 활성 산소종의 생성 및 잔틴-잔틴 옥시다아제(xanthine-xanthine oxidase) 시스템을 유도한다(Microcirc. Endothelium Lymphatics, 1991. 7:133-158). 결과적으로, 다량으로 생성된 활성산소 및 히드록시 활성기가 위조직내 산소 장해를 일으킴으로써 위점막의 방어체계를 약화시키고, 위 상피세포에 침윤된 호중구가 위 조직에 미란, 궤양 등을 유발하는 위험인자로 작용한다.

아스피린 등과 같은 비스테로이드성 항염증제 또한 위점막에 산화적 스트레스를 지속적으로 가하거나 생체내 대사에 의해 산화적 라디칼을 형성하여 위궤양, 위염 및 위출혈을 유발시킨다. 또한, 생체실험에서 알코올에 의한 위점막 세포의 손상은 산화적 스트레스가 주범이며(Hiraishi 등, 1991), 위 상피세포 내의 항산화 효소가 알코올에 의한 점막세포의 손상을 억제한다는 것이 보고된 바 있다 (Hiraishi 등, 1999). 헬리코박터 파리로리 균에 기인한 위궤양의 경우에도, 세균의 점착에 대한 반응으로 분비된 인터루킨-8이 호중구를 활성화시켜 활성 산소 및 탈과립을 유발함으로써 활성 산소에 의한 점막 장애가 유발된다. 이와 같이, 다양한 공격 인자에 의한 위점막 손상이 산화성 스트레스와 관련되며, 위 점막 세포의 항산화능 증대는 이러한 손상에 대한 주된 방어 기전으로 작용한다.

위점막 조직을 구성하는 프로스타글란딘은 COX(cyclooxygenase) 효소 인자에 의해 합성되는 물질로서, 위산 분비를 억제하고 위 점액 분비와 위장 점막 세포의 성장을 촉진함으로써 위장의 항상성을 유지하는 역할을 한다. 스트레스나 알코올, 아스피린과 같은 비스테로이드성 소염제(NSAIDs)에 의한 프로스타글란딘의 합성 또는 분비의 감소는 위 점액질의 분비를 감소시키고, 상피세포의 재생을 둔화시키는 등 점막의 항염증 기능을 약화시킴으로써 위장관 내 독성을 유발하는 기전 중 하나로 알려져 있다 (J. Physiol. Pharmacol. 2005. 56 Suppl 5:33-55).

현재 대표적인 위염 및 위궤양 치료제로 위산 분비 억제의 효능을 지닌 H₂ 안타고니스트 및 프로톤 펌프 저해제(proton pump inhibitor)가 있으며, 이들은 임상에서 우수한 항궤양 효과가 입증되었다. 하지만 이러한 속효성의 위산분비 억제제들은 투약 종료 후 높은 재발율이 문제시되며 [Drug Intell Clin Pharm 21: 493, 1987, Gut 30: 449, 1989 Yale J Biol Med 65: 649, 1992], 무기물질 투여에 의한 변비, 설사, 대사성 알칼로시스, 요로결석증과 같은 부작용이 보고되고 있다. 따라서 위염 유발 인자의 재공격에 저항할 수 있도록 점막 조직의 기능을 정상화하고 재생을 촉진하는 효능을 지닌 점막보호제는 위염 치료제의 중요한 부분이다. 이와 같은 위점막의 보호는 상기 언급한 바와 같이 위장관내 허혈성 스트레스에 대한 저항능력의 향상 및 프로스타글란딘 생성 증가와 같은 방어인자의 강화를 통해 달성될 수 있다. 현재 위점막 보호제로서 레바미파이드(rebamipide), 소팔콘(sofalcone) 등의 약물이 개발되어 사용되고 있으나, 일반적으로 속효성이 적고 복용량이 많으며, 비교적 장기간 복용해야 하는 단점이 있어 개선된 약물 개발이 필요하다.

베타닌(betanin)(5-O-β-D-글루코피라노실베타니딘, C₂₄H₂₆O₁₃N₂, 분자량 550.48)은 베타레인(betalain) 계열의 75-90%를 차지하는 적자색의 염기성 식물 색소로 패랭이꽃과를 제외한 중심자류의 식물에 주로 분포한다. 베타닌을 포함한 베타레인계 색소는 디히드록시페닐알라닌이 산화하여 생성하는 베타람산에 디히드록시페닐알라닌이나 프롤린 등의 아미노산이 축합하여 생성되는 유도체로 알려져 있으며, 안토시안이나 카로티노이드와는 달리 분자 내에 질소를 포함하는 것을 특징으로 한다. pH에 따라 색이 변화하여 산성에서는 적색, 알칼리성에서는 자색 또는 청색을 띠며, pH 4-5에서 가장 안정하고 안전하여 식품에 첨가할 수 있다. 이와 같이 베타닌은 색상 및 기호도 증진을 위한 식용 색소, 천연 착색료로서 음료 및 식품 산업에 활용되어 왔을 뿐, 의약 용도로는 전혀 사용된 바 없다. 이들의 기능적 활성으로 LDL(low-density lipoprotein)에서 지질 과산화물의 생성 억제, 라디칼 소거 기능과 같은 항산화능이 보고된 바 있으나 [Tesoriere L 등, "Increased resistance to oxidation of betalain-enriched guman low density lipoproteins" (Free Radical Res 2003; 37:689-696)], 위장관 조직의 손상 및 위점막 보호 활성과 관련한 연구는 수행된 바 없다. 또한 베타닌을 다량으로 함유하는 식물인 비트 레드, 백년초, 가시비름, 적근대 등의 경우에도 생체 활성을 나타내는 성분으로는 폴리페놀성 화합물 또는 비타민 C 등만이 보고되었으며, 베타닌은 약리 활성을 갖는 성분으로 인식되지 않았다.

본 발명의 목적은, 안전하고 효과적인 위염 또는 위궤양 및 기타 관련 위장관 질환의 예방 또는 치료 방법 및 이를 위한 조성물을 제공하는 것이다. 이를 위하여 스트레스, 알코올, NSAIDs 약물 등 각종 공격인자에 의한 위의 산화적 손상을 억제하고 프로스타글란딘, 위점액질과 같은 위보호 기능을 갖는 물질의 생성을 증가시켜 위점막 조직의 방어 기능을 근본적으로 개선시킬 수 있는 조성물을 제공하고자 하였다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식으로 표시되는 베타닌 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 위점막 보호용 약학 조성물 및 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 상기 베타닌 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 위장관 질환의 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물 및 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명자들은, 생체에 안전하고 독성이 적은 의약 개발을 위해 천연물을 대상으로 연구를 수행하던 중, 통상적으로 색소 성분으로만 알려진 베타닌이 스트레스, 알코올 및 비스테로이드성 항염증제에 의한 위점막 손상에 대해 유의한 보호 및 치료 활성을 나타낸다는 사실을 발견하여, 위염 또는 위궤양 등의 위장관 질환의 치료제로 개발될 수 있는 후보 물질을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에 따른 조성물은 베타닌 또는 그의 염을 일정 함량 이상 포함함으로써, 위장관에서의 산화적 스트레스에 의한 손상 억제 및 프로스타글란딘 생성 증가에 의한 위점막의 보호 활성을 나타낸다. 또한 천연 색소로서 장기간 동안 식용으로 사용되어 왔으므로 통상의 복용량에서 인체에 대한 부작용이 없고 무독성이라는 것이 입증되어 안전하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 위염, 위궤양, 또는 십이지장 궤양과 같은 위장관 질환에 있어 일시적인 증상 완화가 아닌, 위점막 방어 기전의 증진에 의한 예방, 개선 및 치료 용도로 사용가능한 의약품 또는 건강기능식품의 제조를 위하여 이용될 수 있다.

도 1은 AGS 인간 위점막 세포계를 이용한 에탄올-독성 유발 모델에서 베타닌에 의한 세포 생장율의 증가를 나타낸 그래프이다 (###p, ***p < 0.001).
도 2는 AGS 인간 위점막 세포계를 이용한 아스피린-독성 유발 모델에서 베타닌에 의한 세포 생장율의 증가를 나타낸 그래프이다 (###p, ***p < 0.001).
도 3은 AGS 인간 위점막 세포계를 이용한 아스피린-독성 유발 모델에서 베타닌에 의한 PGE2 생합성 증가를 나타낸 그래프이다 (*p < 0.05).
도 4는 랫트의 수침구속 위염 모델에서 베타닌 투여시 스트레스에 의한 위손상면적(mm²)에 미치는 효과를 도시한 그래프이다 (*p < 0.05, **p < 0.01, ###p < 0.001).
도 5는 랫트의 수침구속 위염 모델에서 베타닌 투여시 랫트의 위손상 양상을나타낸 사진이다.
도 6은 랫트의 수침구속 위염 모델에서 베타닌 투여시 위점액량에 미치는 효과를 도시한 그래프이다 (###p, ***p < 0.001).
도 7은 랫트의 수침구속 위염 모델에서 베타닌 투여시 MPO 활성에 미치는 효과를 도시한 그래프이다 (**p < 0.01, ###p < 0.001).

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 베타닌을 함유하는 위장관 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 베타닌 및 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 위장관 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 또는 음료 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물은 하기 화학식으로 표시되는 베타닌(Betanin, C₂₄H₂₆O₁₃N₂; MW 550.48) 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 함유한다.

베타닌은 합성적으로 제조되거나 또는 이를 다량으로 함유하는 식물로부터 추출 및 분리함으로써 수득될 수 있으며, 시중에서 용이하게 구입할 수 있다.

식물로부터 분리하여 얻는 경우, 베타닌의 소스(source)로서의 식물은 바람직하게는 비트(Beta vulgaris L.), 근대(Beta vulgaris var. cicla L.), 백년초(Opuntia ficus indica), 가시비름(Amaranthus spinosus L.), 순무(Brassica rapa L.) 및 뵈르하비아 에렉타(Boerhavia erecta L.)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 베타닌은 당업자에게 알려진 통상의 방법에 의해 상기 식물들로부터 분리될 수 있으며, 그 예로써 Stintzing FC 등에 의한 "Identification of betalains from yellow beet (Beta vulgaris L.) and cactus pear [Opuntia ficus-indica(L.) Mill.] by HPLC-electrospray ionization mass spectroscopy"에 개시된 방법을 참조한다.

본 발명의 한 양태에서, 베타닌을 함유하는 조성물은 상기 언급된 식물들 중 어느 하나의 추출물 또는 착즙 형태일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 베타닌을 함유하는 조성물은 백년초로부터 착즙한 과즙 또는 추출물일 수 있다. 본 명세서에서, 백년초 추출물은 특히 백년초 열매로부터 추출하여 얻은 물질을 의미하며, 특히 red fruit 및 red juice가 베타닌을 고함량으로 함유하므로 바람직하다 (Betera et al., 2002). 다른 구체예에서, 상기 베타닌을 함유하는 조성물은 비트 추출물이다. 레드 비트로 흔히 알려진 비트는 비름과의 식물로서 베타닌을 약 300-600 mg/kg의 양으로 함유하여 (Kanner et al., 2000) 가장 높은 함량의 베타닌을 포함한다. 또다른 구체예에서, 상기 베타닌을 함유하는 조성물은 근대 추출물일 수 있다. 근대는 명아주과에 속하는 비트의 한 변종으로 Swiss chard라고도 불리며, 비트와 달리 주로 잎부분을 식용으로 이용한다. 또다른 구체예에서, 뵈르하비아 에렉타 추출물 또한 약 560 mg/kg의 베타닌을 함유하여 (Stingzing et al., 2004) 본 발명에 적합한 조성물로서 사용될 수 있다. 상기 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출 용매, 예를 들면 물, 친수성 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매에 의해 추출된 것일 수 있다. 상기 친수성 유기 용매는 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, n-프로판올, 이소프로판올 및 n-부탄올 등), 아세톤, 에틸 아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 디에틸에테르 또는 부틸 아세테이트 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물 또는 저급 알코올, 보다 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 용매로 하여 얻어진 것이다.

상기 베타닌을 포함하는 조성물은 알코올, 비스테로이드성 항염증 약물에 의해 유발되는 급성 위염 및 궤양으로부터 위점막을 보호하며, 스트레스에 의해 과다분비되는 위산 및 허혈성 재관류에 의한 산화적 손상로부터 위조직을 보호한다. 이러한 위점막 보호 활성은 베타닌의 항산화 작용, 프로스타글란딘 생합성 촉진, 호중구 침윤(MPO 활성) 감소 및 점액분비 촉진 활성 등을 포함한 복합적인 메커니즘에 기인한 것으로 판단된다. 따라서 본 발명의 베타닌을 함유하는 조성물은 위염, 위궤양과 같은 위장관 질환의 예방 및 치료의 용도로 사용될 수 있다.

상세하게는, 베타닌은 인간의 AGS 위점막 세포계를 이용한 에탄올-독성 유발 염증모델에서, 베타닌을 투여하지 않은 세포에 비해 위점막 세포의 세포 생장율을 유의하게 증가시켰다 (도 1). 또한 AGS 위점막 세포계를 이용한 아스피린-독성 유발 염증모델에서, 실험 농도범위 내 최소치인 1 μM의 베타닌 투여만으로 위점막 세포의 생장율이 정상군과 동등한 수준으로 개선되어(도 2), 비스테로이드성 항염증제에 의한 위손상에 대한 보호 효과를 갖는다는 것을 확인하였다. 동일한 실험 모델에서, 베타닌은 내인성 세포보호물질인 프로스타글란딘 E2의 생합성을 증가시키는 것으로 나타났다 (도 3). 따라서 프로스타글란딘에 의한 위산분비 억제, 점액 분비 및 세포성장 촉진 활성이 베타닌의 위보호 효과에 기여할 것으로 판단된다.

랫트를 이용한 수침구속 스트레스 위염 모델에서, 베타닌(280 mg/kg)을 투여한 경우 비히클을 투여한 대조군에 비해 스트레스에 의한 위 손상 면적이 약 42.5% 감소하였으며, 사진촬영에 의한 육안 결과로도 베타닌 투여시 위점막의 손상 정도가 감소하였음을 확인할 수 있었다 (도 4 및 5). 또한 스트레스에 의해 염증을 유발한 군에서는 위점액 분비가 현저하게 감소하였으나, 베타닌을 투여한 경우 점액 분비량은 정상군보다도 높은 수준으로 회복되었다 (도 6). 베타닌은 또한, 호중구 침윤의 지표가 되는 MPO 활성을 유의하게 감소시켰으며 (도 7), 이는 수침구속에 의한 스트레스로 야기되는 미세순환 장애, 허혈성 재관류와 같은 환경에서 활성 산소종의 생성을 억제할 수 있음을 나타낸다. 이와 같은 점액분비의 증가 및 호중구 침윤의 감소 효과는 양성대조약물인 스틸렌을 투여한 경우에 비해 베타닌을 투여한 경우 더욱 우수한 것으로 나타났다.

상기와 같은 실험 결과에 근거하여, 베타닌을 함유한 조성물은 위조직에서 프로스타글란딘의 합성 및 위점액질의 분비를 증가시켜 점막조직의 방어 및 재생 기능을 강화시키고, 호중구의 침윤을 억제하는 등 산화성 스트레스에 의한 위손상을 억제하므로, 다양한 공격인자에 의한 위손상에 있어서 위점막 보호제로 기능할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 조성물은 위점막의 염증 및 손상을 동반하는 위장질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 약학 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물로서 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "위장관 질환"은 그 발생 원인 및 기전과 무관하게 위점막의 손상을 동반하거나, 손상을 야기할 가능성이 있는 모든 질환 및 병태를 포함하는 광범위한 의미로 사용된다. 상기 위장관 질환은 급성위염, 만성 활동성 위염, 만성 위축성 위염과 같은 만성위염, 위궤양, 십이지장궤양, 위천공, 위출혈, 비스테로이드성 항염증약물과 연관된 소화 장애, 비궤양성 소화불량증, 위식도 역류 질환, 급성 상부 위장 출혈, 스트레스 궤양화, 헬리코박터 파일로리 감염, 및 상기 질환들로 인한 위점막의 미란, 출혈, 발적 및 부종과 같은 증상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료되는 대상 질환은 급성 위염, 만성 뮈염, 위궤양, 위천공, 및 상기 질환으로 인한 위점막의 미란, 출혈, 발적 및 부종을 포함한다.

본 발명의 베타닌을 함유한 조성물의 효능은 위점막의 방어 체계를 강화하고 항산화 능력을 증강시키는 것에 기초하므로, 특정한 원인 또는 기전으로 인한 위장질환에 국한되지 않는다. 이에 따라 상기 질환은 예를 들면, 알코올, 육체적 및 정신적 스트레스, 산화적 스트레스, 위산, 비스테로이드성 항염증 약물, 스테로이드 제제, 담배, 자극적인 음식, 헬리코박터 파이로리의 감염을 포함한, 다양한 원인 및 기전에 의해 발병한 것일 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서, 유효성분으로서 베타닌의 약제학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 이용할 수 있다. 적합한 염에 대한 개론은 문헌 "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" (Stahl 및 Wermuth, Wiley-VCH, 독일 바인하임, 2002)을 참조한다.

이러한 염은 바람직하게는 유리산에 의해 형성된 산 부가염(이염 포함)일 수 있다. 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동일한 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 적합한 산 부가염은 비독성 염을 형성하는 산으로부터 제조되며, 예를 들면, 아세테이트, 아디페이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 사이클라메이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 히벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로아이오다이드/아이오다이드, 이세티온에이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말론에이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-납실레이트, 니코틴에이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/하이드로젠 포스페이트/다이하이드로젠 포스페이트, 피로글루탐에이트, 사카레이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 탄네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트 및 지노포에이트 염 등의 무기산 염 또는 유기산 염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

또한 염기를 사용하여 약제학적으로 허용가능한 금속염 또는 제4급 암모늄 염을 제조할 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비 용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염과 반응시켜 얻는다. 제4급 암모늄 염은 예를 들면, 메틸요오다이드, 메틸브로마이드, 에틸요오다이드, 에틸브로마이드 등의 저급 알킬할로게니드; 메틸메탄설포네이트, 에틸메탄설포네이트 등의 저급 알킬설포네이트; 메틸-p-톨루엔설포네이트 등의 저급 알킬아릴설포네이트가 사용될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

또한 베타닌 또는 그의 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염은 용매화물 또는 수화물로서 존재할 수 있으며, 본 발명의 치료제의 유효성분으로 이러한 용매화물 또는 수화물을 이용할 수 있다. 또한 포접 화합물, 즉 전술한 용매화물과는 달리 약물과 호스트 분자가 화학량론적 양 또는 비-화학량론적 양으로 존재하는 약물-호스트 분자 포함 착체와 같은 착체 또한 본 발명의 영역에 포함된다. 또한, 화학량론적 양으로 또는 비-화학량론적 양으로 존재할 수 있는 둘 이상의 유기 및/또는 무기 성분을 함유하는 약물의 착체도 포함된다. 이러한 착체에 대한 개론은 문헌 "J Pharm Science" (64(8), 1269-1288, Haleblian, 1975년 8월)을 참조한다.

또한 본 발명의 조성물은 베타닌을 단독으로 사용하거나 또는 다른 약학적 활성 화합물과의 결합체나 집합체의 형태로도 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 베타닌, 그의 약학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염, 또는 이들의 용매화물 또는 수화물은 이들 자체로서 단독으로 환자에 투여될 수 있을 뿐만 아니라, 다른 약학적 활성 화합물과의 결합체나 집합체의 형태로도 사용할 수 있다. 또한 베타닌을 포함한 유효성분 1종 또는 2종 이상을 포함하는 조성물을 조제하여 투여하거나, 다른 유용한 위장질환치료 약물과 혼합된 복합제제 형태로 제형화하여 투여할 수 있다.

본 발명의 베타닌을 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰오로스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테라에리트 및 광물유를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물은 경구 투여용 제제, 점막적용제제, 주사제, 흡입제, 외용제로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 경구 투여용 제제는 경질 및 연질 캅셀제, 정제, 현탁제, 시럽제 또는 산제, 서방형제제, 장용성 제제, 과립제, 유당제, 세립제, 환제, 엑기스제, 액제, 방향수제, 유제, 시럽제, 엘릭실제, 유동엑시스제, 침전제, 틴크제, 주정제, 약유제 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 점막적용제에는 트로키제, 구강정, 설하정, 좌제, 비강분무제를 포함되나 이에 제한되지 않는다. 주사제에는 피하주사, 근육주사, 정맥주사, 이식정 등이 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 외용제에는 경비제, 점안제, 점이제, 안연고제, 파스타제, 카타플라스마제, 리니멘트제, 로오션제, 도포제, 산포제, 외용액제 등이 포함되며 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 액제, 현탁제, 시럽, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형으로 제제화된다.

일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여를 위한 고형 제제로서, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 형태일 수 있다. 이러한 고형 제제는 상기 조각자 추출물에 적어도 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예를 들면, 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제를 포함할 수 있다. 구체적으로, 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 젤라틴, 칼슘카보네이트, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 사용될 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 경구를 위한 액상 제제로서, 현탁제, 내용 액제, 유제, 시럽제 등의 형태일 수 있다. 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

또다른 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여를 위한 제제일 수 있으며 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 주사제의 경우는 이에 한정되는 것은 아니나, 한크액(Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 생리식염완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액을 사용하여 제조할 수 있다. 또한 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 안정제, 분산제 등을 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 분말 형태로 제조되어, 사용 전에 멸균수와 같은 적당한 담체와 함께 사용될 수 있다. 좌제로 제제화되는 경우, 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 베타닌을 함유하는 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 내, 또는 정맥 내, 비강 내, 복강 내, 피하 또는 국소 투여 등이 가능하다. 상기 조성물은 또한 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다른 방법 (예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에 기재된 방법들)을 사용할 수도 있다.

본 발명에 따른 용도를 위한 베타닌의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 연령, 체중, 질병 진행 정도, 발병 시기, 배설 속도 및 반응감응성, 건강상태, 합병증, 투여경로 및 기간 등의 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당업자가 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 적절하게 선택할 수 있다. 일반적으로는 성인기준으로 100 mg 내지 5 g, 바람직하게는 200 mg 내지 2800 mg, 더욱 바람직하게는 1일 280 내지 1400 mg을 투여할 수 있다. 그러나 병증의 정도가 심한 환자나 합병증이 있는 경우에는 치료효율성을 증진시키기 위하여 본 발명의 약물을 상기 범위를 벗어나는 대용량까지 증량하여 투여할 수 있다. 1일 투여량은 1회 1-2회 또는 1-3회 나누어 투여할 수 있다. 예를 들어, 베타닌 200 내지 500 mg을 함유하는 단위 투여체 1-2개를 1일 1회 내지 2회 경구투여할 수 있으며, 상황에 따라 적절히 조절할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "건강 기능성 식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"은 인체의 구조 및 기능에 대해 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물이 건강기능성 식품 조성물일 경우, 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 베타닌은 식품 또는 음료 등의 제조시에 원료에 대하여 각각 0.0001 내지 90 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 주어진 범위 이하일 수 있으나, 유효 성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 자명하다.

이러한 건강 기능성 식품은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능성 식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강 기능성 조성물은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 보조첨가제로는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 상기 외에 본 발명의 조각자 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 착색제 및 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 필수 성분으로서 상기 베타닌을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어 글루코오스, 프럭토오스 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토오스, 수크로오스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등; 당알코올, 예를 들면 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등을 포함한다. 향미제로서, 천연 향미제, 예를 들어 타우마린, 스테비아 추출물(레바우디오시드A, 글리시르히진 등); 및 합성 향미제, 예를 들어 사카린, 아스파르탐 등을 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술 용어는 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 균등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

이하, 본 발명을 하기 제조예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

제조예 1: 백년초 착즙의 제조

수확 후 48 내지 72시간 이내의 백년초 열매를 세척하여 재료의 표면에 존재하는 이물질 등을 제거하고, 열매의 특성상 brushing 작업으로 열매의 겉부분의 가시를 제거한다. 껍질을 제거하고 알맹이를 모은 후, 기계를 이용해 착즙 과정을 거치고 이를 필터링하여 씨가 걸러진 과즙을 얻고, 이를 85 ℃에서 20분간 스팀살균 처리하여 안정적인 백년초 착즙을 얻는다.

제조예 2: 백년초 추출물의 제조

수확 후 48 내지 72시간 이내의 백년초 열매를 세척하여 재료의 표면에 존재하는 이물질 등을 제거하고, brushing 작업으로 열매의 겉부분의 가시를 제거한다. 2 cm x 2 cm x 1 cm 크기로 조각낸 후 껍질을 제거하고 펄프(pulp)를 분리하여 중량을 측정한다. 펄프 2 Kg을 메탄올 2 L로 균질화하고, 이를 4 ℃에서 1시간 동안 방치한 후 원심분리한다(3000 g, 10분). 유기층을 회수하여 동일 부피의 메탄올로 반복 추출한다. 추출물을 모아서 로터리 증류기에서 용매를 제거하여 41 g의 백년초 추출물을 황색 분말 형태로 수득하였다.

참고예 1: 실험재료 및 시약

본 연구에 사용된 베타닌(Tokyo Kasei Kogyo Co.,Ltd., 일본)은 적근대로부터 분리되었으며, 덱스트린을 이용하여 분말화된 것을 사용하였다. 양성대조약물인 스틸렌(㈜동아제약, 한국)은 막자사발로 분말화하여 0.5% 카르복시메틸셀룰로즈(Junsei Chemical Co. Ltd., 일본) 용액에 용해하여 사용하였다.

위점막 세포를 이용한 인 비트로 실험에서, AGS 세포주는 서울대학교 위생약학 연구실에서 분양받은 것으로 사용하였으며, 세포 배양에 필요한 RPMI-1640 배지는 인비트로젠 (Invitrogen Co. Ltd., CA, 미국), 페니실린/스트렙토마이신, 소 태아 혈청 FBS(fetal bovine serum)는 시그마 사(St. Louis, 미국) 제품을 구입하여 사용하였다. 독성유도물질로 사용된 에탄올은 덕산 케미칼(대한민국)에서, 아스피린 표준품및 MTT 시약은 시그마 사(St. Louis, 미국) 제품을 사용하였다.

인 비보 실험에서, 실험동물은 스프라우그-도리(Sprague-Dawley)계 랫드로 수컷 7 주령을 이용하였다. 또한, 수침구속 스트레스를 유발시키기 위하여 아크릴로 특수 제작된 구속장치(Restraint cage)를 이용하여 수침구속 하였으며, 위 표면을 디지털카메라(익서스870IS, 캐논)로 촬영하였다. 알시안 블루(Alcian blue) 8GX 용액 및 도큐세이트 소듐염(Docusate sodium salt)은 시그마 사(Sigma-aldrich Co. Ltd., CA, 미국) 제품을 사용하였고, 수크로즈(Sucrose)는 암레스코(Amresco Co. Ltd., OH, 미국) 사의 제품을 사용하였다.

참고예 2: 통계학적 분석

모든 측정값은 각각의 실험군별 결과에 대한 평균±표준편차(standard deviation, SD) 또는 평균±표준오차(standard error of mean, SEM)의 값으로 나타내었다. 분산의 동질성을 비교하기 위해 ANOVA test(대조치로부터의 변동값 분석) 및 Dunnett's post-hoc test를 실시하였으며, P 값이 5 % 미만 (p<0.05)인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다 (정상군 대비 #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001; 음성대조군 대비 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001).

실험예 1: AGS 인간 위점막 세포계를 이용한 에탄올-독성 유발 모델에서의 효과

알코올에 의한 위점막의 손상은 알코올이 위점막을 직접적으로 자극하여 점막하근층에 부종을 유발하고, 일시적으로 국소적 허혈 상태를 발생시킴으로써 미세혈액순환이 정체되어 급성 위염을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 베타닌이 에탄올에 의한 위점막 세포의 손상을 억제하는 정도를 MTT 분석에 의해 측정하였다.

방법

AGS 인간 위점막 세포계를 축축한 배양기에서 5% CO₂와 함께 37℃에서 24시간 동안 96-웰 플레이트에 배양하였다. 각각의 플레이트에 베타닌을 농도별로 (1, 2, 5, 10, 50 μM) 1시간 동안 전처리한 후, 9%의 에탄올과 함께 30분 동안 배양하여 독성을 유발하였다. 대조군에는 비히클만을 처리한 후 에탄올과 함께 배양하였다.

MTT 분석을 통하여 세포 생장율을 측정함으로써 베타닌의 위장세포 보호 활성을 분석하였다. MTT 분석은 MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드; 티아졸릴 블루)가 살아있는 세포의 미토콘드리아 내 환원효소에 의해 포르마잔(formazan) 결정으로 전환되는 원리를 이용하여 생존 세포수를 분석한다. AGS 세포를 배양시킨 96-웰 플레이트에 MTT를 2㎎/㎖의 농도로 가하여 동일한 조건에서 4시간 더 배양한 후, 생성된 포르마잔을 DMSO로 녹여내었다. 마이크로플레이트 리더(Tecan, Zurich, Switzerland)로 540 nm에서의 흡광도를 측정한 다음 (Mosmann, T. J. Immuno. Methods 1983, 65, 55-61), 하기 식에 따라 세포의 생장율을 결정하였다. 군 당 8개의 웰에 대해 실험을 수행하였으며, 그 결과를 평균±SD의 값으로 나타내어 표 1 및 도 1에 제시하였다.

세포 생장율(cell viability)(%)

= (실험군의 흡광도/정상군의 흡광도) × 100

결과

세포 생장율 (%)	정상군	에탄올 투여군( 베타닌 처리 농도, μM)
세포 생장율 (%)	정상군	0	1	2	5	10	50
평균	100.0	57.84	72.20	84.36	78.24	80.09	87.61
SD	11.31	3.813	3.521	10.92	6.487	4.581	12.35

표 1에 나타난 바와 같이, 에탄올만을 처리한 군에서 AGS 세포의 생장율이 유의하게 감소한 반면(정상군의 약 58 %), 베타닌 투여군에서는 에탄올만을 처리한 군에 비해 모든 농도 범위에 걸쳐 생장율이 유의하게 증가하여(약 72 내지 88 %) 위점막 세포의 손상에 대한 보호 효과를 나타냈다. 이로부터, 베타닌은 알코올에 의해 유발된 위점막 손상에 대해 유의한 억제 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.

실험예 2: AGS 인간 위점막 세포계를 이용한 아스피린-독성 유발 모델에서의 효과

아스피린, 인도메타신과 같은 비스테로이드성 진통소염제(NSAID)는 위 조직 보호에 중요하게 작용하는 프로스타글란딘의 합성에 관여하는 사이클로옥시제나아제(cyclooxygenase) 등의 효소를 저해하여 위조직의 손상을 유발한다. 본 실시예에서는 베타닌이 아스피린에 의해 유발된 위점막 세포 손상에 미치는 영향을 평가하기 위해 MTT 분석에 의해 세포 생장율을 측정하고, 점막세포에 의한 PGE₂ 생합성량의 변화를 분석하였다.

2-1. 위점막 세포의 세포 생장율 측정

방법

AGS 인간 위점막 세포계를 축축한 배양기에서 5% CO₂와 함께 37℃에서 24시간 동안 96-웰 플레이트에 배양하였다. 각각의 플레이트에 베타닌을 농도별로(1, 2, 5, 10, 50 μM) 1시간 동안 전처리한 후, 4 mM의 아스피린과 함께 24시간 동안 배양하여 독성을 유발하였다. 대조군에는 비히클만을 처리한 후 아스피린과 함께 배양하였다.

세포 생장율을 구하기 위해 상대적인 MTT 값을 측정하여 베타닌의 위점막 세포 보호활성을 분석하였다. AGS 세포를 배양시킨 96-웰 플레이트에 MTT를 2㎎/㎖의 농도로 가하여 동일한 조건에서 4시간 더 배양한 후, 생성된 포르마잔을 DMSO로 녹여내었다. 마이크로플레이트 리더(Tecan, Zurich, Switzerland)로 540 nm에서의 흡광도를 측정한 다음 (Mosmann, T. J. Immuno. Methods 1983, 65, 55-61), 하기 식에 따라 세포의 생장율을 결정하였다. 군 당 8개의 웰에 대해 실험을 수행하여 평균±SD으로 나타내었으며, 그 결과를 표 2 및 도 2에 제시하였다.

세포 생장율(cell viability)(%)

= (실험군의 흡광도/정상군의 흡광도) × 100

결과

세포 생장율 (%)	정상군	아스피린 투여군( 베타닌 처리 농도, μM)
세포 생장율 (%)	정상군	0	1	2	5	10	50
평균	100.0	85.23	103.1	100.1	114.0	108.0	106.7
SD	5.248	6.065	11.26	7.649	14.89	8.242	10.03

표 2에 나타난 바와 같이, 아스피린만을 투여한 군에서 AGS 세포의 생장율이 약 85 %로 줄어든 반면, 베타닌을 투여한 군에서는 세포 생장율이 정상군(아스피린 미처리군)과 유사하거나 더 높은 것으로 나타나, 세포의 손상이 유의하게 억제된 것을 관찰하였다. 이로부터, 베타닌은 아스피린에 의해 유발된 위점막 손상에 대해 우수한 보호 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.

2-2. 위점막 세포에 의한 PGE ₂ 합성량 측정

방법

AGS 인간 위점막 세포계를 축축한 배양기에서 5% CO₂와 함께 37℃에서 24시간 동안 6-웰 플레이트에 배양하였다. 각각의 플레이트에 베타닌 5 μM로 1시간 동안 전처리한 후, 4 mM의 아스피린과 함께 24시간 동안 배양하여 독성을 유발하였다.

시중에서 사용되는 EIA 키트(R&D System, Abingdon, UK)를 사용하여 위점막 세포로부터 생성된 PGE₂ 수준을 정량하였다. AGS 세포를 배양시킨 6-웰 플레이트 각각의 웰에서 배지를 취한 후 3,000 x g, 15분 동안 원심분리하여 얻은 상징액을 사용하였다. 제조자가 추천한 과정에 의해 얻은 상징액 내의 PGE₂ 농도를 측정하였으며, 군 당 3개의 웰에 대해 실험을 수행하여 그 결과를 평균±SEM으로 나타내었다(표 3 및 도 3).

결과

PGE ₂ 농도( pg / mL )	정상군	아스피린 투여군
PGE ₂ 농도( pg / mL )	정상군	대조군	베타닌 처리군
평균	1461	839.7	1156
SEM	216.2	57.50	143.5

실험 결과, 아스피린을 투여한 경우 정상군에 비해 위점막 세포에 의해 합성되는 PGE₂의 양이 유의하게 감소하였으나(약 57.8%), 베타닌 5μM을 처리한 경우 PGE₂ 농도는 정상군의 약 79.1%로, 베타닌 미처리군에 비해 증가하였다. 이로부터 베타닌은 NSAID계 약물에 의한 위손상 기전인 프로스타글란딘의 합성 저해를 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 베타닌이 프로스타글란딘에 의한 점액질 분비, 세포 재생 등을 촉진하여 위점막 보호 기능을 강화시킬 수 있다는 것을 의미한다.

실험예 3: 랫트의 수침구속 스트레스 위염 모델에서의 효과

수침구속에 의해 유도된 스트레스 위염의 가장 중요한 메커니즘은 허혈성 재관류에 의한 위점막의 손상이며 (Gastroenterol. Jpn. 1990. 25:299-305), 그 외에 스트레스로 인한 위산분비의 증가, 프로스타글란딘 합성 감소 등에 기인한다. 수침구속에 의해 유도된 스트레스 모델은 마취, 수술적 방법에 의존함이 없이 위점막의 손상을 유도할 수 있다는 점에서 급성 위조직 손상 유도의 실험 모델로 널리 이용되어 왔다.

3-1. 위점막 손상 면적의 측정

방법

Takagi 등(Chem. Pharm. Bull(Tokyo) 12: 465-472, 1963)에 의한 방법을 응용하여 랫드를 18시간 절식시킨 후에 베타닌 및 양성대조약물인 스틸렌(동아제약, Sillen)을 각각 0.5% 카르복시메틸셀룰로즈(CMC) 액에 녹여 경구로 투여시켰다. 음성대조군의 경우 0.5% CMC 액만을 투여하였다. 30분 후에 랫트를 구속용 케이지(straint cage)에 넣고 수온이 20±2 ℃로 유지되는 물 속에 검상돌기가 잠기도록 하여 절수, 절식하에 6시간 동안 방치하였다. 그 다음, 에테르로 심마취하여 랫트를 치사시킨 다음, 십이지장과 식도 일부를 포함하여 위에 손상이 가지 않도록 조심스럽게 적출하여 대만부를 따라 절개하였다. 0.25 M 수크로즈 완충액 10 ml로 선위부의 점액부위를 깨끗하게 세척하였다. 위손상 양상을 확인하기 위해 핀으로 고정 후 디지털카메라로 사진촬영 하였으며 (도 5), 이미지J 프로그램을 이용하여 위손상 면적(mm²)을 측정하였다 (표 4 및 도 4). 군 당 8마리의 랫트에 대해 실험을 수행하였으며 측정값을 8회 실험 결과의 평균±SEM으로 나타내었다.

결과

위손상면적( mm ² )	정상군	스트레스 유도군
위손상면적( mm ² )	정상군	음성대조군	스틸렌 투여군 (350 mg / kg )	베타닌 투여군 (280 mg / kg )
평균	0	239.5	140.5	130.5
SEM	0	18.94	31.58	28.40

실험 결과, 수침구속을 통해 유발된 스트레스성 모델에서 정상군에 비해 음성대조군(스트레스 유도군)의 위저부에 확연한 손상이 나타났으며, 스틸렌 및 베타닌 투여군의 경우 그 손상 정도가 감소되는 것을 육안상 확인할 수 있었다 (도 5).

또한 표 4 및 도 4에 나타난 바와 같이, 수침구속을 통해 스트레스를 유발시킨 랫트의 위점막 손상 면적은 음성대조군에 비해 베타닌 및 스틸렌을 투여한 경우 각각 약 45.5% 및 41.3%에 해당하는 유의한 감소를 나타냈다. 이러한 결과로부터, 베타닌은 스트레스에 의해 유발된 위손상을 유의하게 억제하며, 본 실험의 투여량에서 양성대조약물인 스틸렌에 비해 더 우수한 위보호 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.

3-2. 위점액량의 측정

방법

위점액량의 측정은 Zanatta F 등(Chem Biol Interact. 2009. 180(2), 312-7.)의 방법을 참고하여 진행하였다. 실시예 3-1에서 사진 촬영이 완료된 위조직을 펼쳐놓은 후, 각 군당 손상이 심한 부위를 중심으로 직경 8-10 mm 정도의 선형 조직으로 절개하였다. 젖은 상태의 무게를 측정하여 위점액량 측정 샘플을 얻었다. 얻어진 샘플은 0.1% 알시안 블루(Alcian blue) 8GX 용액 2ml에 2시간 동안 담그고, 이후 0.25 M 수크로오스 용액(sucrose buffer) 10 ml로 2회 세척하여 (1회 15분, 2회 45분씩 세척) 과량의 염색약을 제거하였다. 그 다음, 위 점액과 결합된 시약을 추출하기 위하여, 위 조직을 30 % 도큐세이트 나트륨염(docusate sodium salt) 용액 2 ml에 2시간 동안 담근 후 2060 g에서 10분간 원심분리 하였으며, 얻어진 상징액에 대하여 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 군 당 6마리의 랫트에 대해 실험을 수행하였으며 그 결과를 평균±SEM으로 나타내었다 (표 5 및 도 6).

결과

위점액량 ( ug /g tissue )	정상군	스트레스 유도군
위점액량 ( ug /g tissue )	정상군	음성대조군	스틸렌 투여군 (350 mg / kg )	베타닌 투여군 (280 mg / kg )
평균	1613	260.3	1246	1654
SEM	177.1	40.99	86.42	105.6

위 점액량을 측정한 결과, 정상군에 비해 스트레스 유도군(음성대조군)에서 위점액량이 약 16.1%로 현저하게 감소하였으며, 베타닌 또는 스틸렌 투여군의 경우 각각 정상군 대비 102.5% 및 77.2%로 나타나 점액 분비가 대조군에 비해 유의하게 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 특히 베타닌을 투여한 경우 정상군과 유사한 수준의 위점액량을 나타내어, 스틸렌을 투여하는 경우에 비해 점액분비 촉진 효과가 우수한 것을 확인하였다.

3-3. MPO 활성의 측정

MPO(myeloperoxidase)는 호중구 또는 호산구의 과립 내에 존재하며 과산화수소에 의해 여러 기질들의 산화 반응에 촉매역할을 하는 효소로서, MPO의 활성은 조직 내로의 호중구의 유입을 표지하는 마커가 된다. 본 실시예에서는 베타닌 투여가 수침구속 스트레스에 의해 손상된 위조직의 MPO 활성수준에 미치는 효과를 측정하여 베타닌의 항산화 및 항염증 활성을 평가하였다.

방법

MPO의 활성 측정은 (HK105 data sheet, hycult biotech)의 방법을 참고하여 진행하였다. 실시예 3-1에서와 같이 적출된 위 조직을 일부 절단하여 무게를 측정한 후 10 mg당 200 μl의 용해 완충액(lysis buffer)을 가하고 균질기로 분쇄(homogenize)한 후, 이를 원심분리(3,000 x g, 15 분)하여 얻은 상징액을 사용하였다. 상징액 내의 MPO 활성을 제조사(Hycult Biotech, Uden, The Netherlands)에 의해 설명된 ELISA 측정법을 통해 측정하였다. 군 당 6마리의 랫트에 대해 실험을 수행하였으며 그 결과를 평균±SEM으로 나타내었다 (표 6 및 도 7).

결과

MPO 활성 ( ng / mg protein )	정상군	스트레스 유도군
MPO 활성 ( ng / mg protein )	정상군	음성대조군	스틸렌 투여군 (350 mg / kg )	베타닌 투여군 (280 mg / kg )
평균	58.72	106.0	84.52	72.69
SEM	4.316	8.866	6.116	5.942

실험 결과, 수침구속 스트레스를 받은 군에서 정상군에 비해 MPO 활성이 유의하게 증가하였으며, 이러한 MPO 활성은 베타닌의 투여에 의해 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 스틸렌 투여군의 경우 MPO 활성이 감소하였으나 유의적이지 않았다. 따라서, 본 발명의 베타닌을 함유하는 조성물은 스트레스에 의한 위염 발생 조직에서 호중구의 침윤을 감소시키는 것으로 나타났으며, 이러한 효과는 양성대조약물인 스틸렌에 비해 우수한 것으로 나타났다.

이하 본 발명의 베타닌을 포함하는 의약 또는 기능성 식품 조성물의 일부 제제예가 제시되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 좌제 및 멸균 주사 용액 등의 형태로, 가능한 가장 우수한 제제를 얻기 위하여 당해 기술분야에 알려진 모든 방식으로 제조될 수 있다.

제제예 1: 정제의 제조

베타닌 ..................................... 200 mg

유당 ........................................ 20 mg

카르복시메틸셀룰로오스칼슘 .................. 70 mg

포비돈 ...................................... 36 mg

전분 글리콜산나트륨 ......................... 24 mg

스테아린산 마그네슘 .......................... 6 mg

히드록시프로필메틸 셀룰로오스 2910........... 10 mg

폴리에틸렌글리콜 6000 ........................ 2 mg

산화티탄 ..................................... 2 mg

탈크 ......................................... 3 mg

모노올레인산소르비탄 ........................0.5 mg

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라 타정하고, 최종적으로 산화 티탄으로 피복한다. 1일 1 내지 3회, 1회 1정씩 복용한다.

제제예 2: 과립제의 제조

제조예 2의 백년초 추출물 ................ 400 mg

부형제 .....................................적량

미세결정 셀룰로오스 .......................65 mg

옥수수 전분 ............................ 15.5 mg

소르비톨 ............................... 2250 mg

폴리비닐피롤리돈 ........................47.5 mg

시트르산 ................................. 10 mg

아스파탐 ................................. 32 mg

향미제 .................................. 180 mg

백년초 추출물, 미세결정 셀룰로오즈 및 옥수수 전분을 혼합한다. 이 혼합물을 물과 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 결합제 용액을 사용하여 니딩(kneading)한다. 상기 혼합물이 습윤하게 되면, 2 mm 체를 통해 과립화한다. 과립을 건조시키고, 이를 강제로 0.8 mm 체를 통과하게 하여 사분한다. 얻어진 과립 분말을 소르비톨, 시트르산, 아스파탐 및 적당한 향미제와 혼합한다. 상기 과립을 사쉐(sachet)에 채운다.

제제예 3: 시럽제의 제조

베타닌 ..................................... 200 mg

전분 글리콜산나트륨 ......................... 1.4 g

히드록시프로필메틸셀룰로오스 2910 ........... 3.2 g

잔탄검 ...................................... 0.3 g

D-만니톨 ..................................... 50 g

정제백당 .................................... 142 g

구연산 ...................................... 0.3 g

구연산나트륨 ................................ 0.5 g

상기의 성분을 혼합하고 통상의 시럽제 제조방법에 따라서 제조한다.

제제예 4 : 주사제의 제조

베타닌 .................................... 200 mg

D-소르비톨 ................................. 50 mg

인산일수소나트륨 ............................ 6 mg

주사용수 .................................... 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 주사제의 제조방법에 따라서 제조하고 앰플에 충전한다. 최종 용액은 멸균 및 비발열성이어야 한다. 또는 상기 주사용 제제는 동결 건조된 분말 상태로 제조하여 사용 전에 주사용 매질에 용해시켜 투여될 수 있다.

제제예 5: 건강식품의 제조

베타닌.................................. 1000 ㎎

비타민 혼합물 ............................. 적량

(비타민 A 아세테이트 70 ㎍; 비타민 E 1.0 ㎎; 비타민 B1 0.13 ㎎; 비타민 B2 0.15 ㎎; 비타민 B6 0.5 ㎎; 비타민 B12 0.2 ㎍; 비타민 C 10 ㎎; 비오틴 10 ㎍; 니코틴산아미드 1.7 ㎎; 엽산 50 ㎍; 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎)

무기질 혼합물 ............................. 적량

(황산제1철 1.75 ㎎; 산화아연 0.82 ㎎; 탄산마그네슘 25.3 ㎎; 제1인산칼륨 15 ㎎; 제2인산칼슘 55 ㎎; 구연산칼륨 90 ㎎; 탄산칼슘 100 ㎎; 염화마그네슘 24.8 ㎎)

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 건강 식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다. 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음 과립을 제조하여 건강식품 조성물의 제조에 사용할 수 있다.

제제예 6: 건강음료의 제조

제조예 1의 백년초 과즙 ..................... 1 g

구연산 ..................................... 1 g

올리고당 ................................. 100 g

매실농축액 ................................. 2 g

타우린 ..................................... 1 g

정제수 ..................... 전체 900 ㎖까지 적량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한다. 제조된 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하고 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하여 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 본 제제예에서는 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 비율로서 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

베타닌 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 위점막 보호용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 급성위염, 만성위염, 위궤양, 위천공, 상기 질환으로 인한 위점막의 미란, 출혈, 발적 및 부종으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 병태를 예방 또는 치료하기 위한 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 베타닌은 비트(Beta vulgaris L.), 근대(Beta vulgaris var. cicla L.), 백년초(Opuntia ficus indica), 가시비름(Amaranthus spinosus L.), 순무(Brassica rapa L.) 및 뵈르하비아 에렉타(Boerhavia erecta L.)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 식물에서 유래한 것인 약학 조성물.
제3항에 있어서, 상기 식물의 추출물 또는 착즙 형태인 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 경구 투여 제제로 제형화하기 위한 것인 약학 조성물.
베타닌 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 포함하는 위점막 보호용 건강기능성 식품 조성물.