KR100569244B1 - 함초로부터 분리된 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일퀴닉산을 함유하는 통풍 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산을 함유하는 통풍 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 함초(Salicornia herbacea)로부터 분리ㆍ정제된 클로로겐산(chlorogenic acid) 계열의 카페오일(Caffeoyl) 화합물의 일종인, 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(3-caffeoyl-4-dihydrocaffeoyl quinic acid, 이하 "CDCQ"라 함)이 요산의 형성에 중요한 효소인 크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase)를 저해하여 통풍성 관절염 환자에서 많이 발현되는 젤라틴나제 B의 발현을 억제하는 것을 확인함으로써 상기 CDCQ을 유효성분으로 함유하는 통풍 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산, 크산틴 옥시다제, 통풍

Description

함초로부터 분리된 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산을 함유하는 통풍 예방 및 치료용 조성물{Composition for anti-gout comprising 3-caffeoyl-4-dihydrocaffeoyl quinic acid isolated from Salicornia herbacea}

도 1은 CDCQ(3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산)의 농도별 처리 후 젤라틴나제 B 발현을 자이모그래피에 의하여 확인한 결과이다

도 2는 CDCQ 처리 후 랫트에서 혈중요산 감소를 나타낸 결과이다.

본 발명은 함초로부터 분리된 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산을 함유하는 통풍 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 함초(Salicornia herbacea)로부터 분리ㆍ정제된 클로로겐산(chlorogenic acid) 계열의 카페오일(Caffeoyl) 화합물의 일종인, 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(3-caffeoyl-4-dihydrocaffeoyl quinic acid, 이하 "CDCQ"라 함)이 요산의 형성에 중요한 효소인 크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase)를 저해하여 통풍성 관절염 환자 에서 많이 발현되는 젤라틴나제 B의 발현을 억제하는 것을 확인함으로써 상기 CDCQ을 유효성분으로 함유하는 통풍 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

함초(Salicornia herbacea)는 흔히 염초 또는 퉁퉁마디라고도 불리며, 축농증 신장염 관절염 등 염증으로 인한 수종 등의 민간요법 치료제로 널리 사용되어 왔다. 이러한 함초(鹹草)는 우리나라 서해안 개펄에 자라는 한해살이 풀로 우리말로는 퉁퉁마디라고 부르며, 전체 모양이 산호를 닮았다하여 산호초라고도 한다. 중국 최고의 의학책인 신농본초경에는 "함초"로, 일본의 대화본초에는 "신초(神草)" 또는 "복초(福草)", "염초(鹽草)"로 기록되어 있는 이 풀은 몸 안에 쌓인 독소와 숙변을 없애고, 암, 자궁근종, 축농증, 고혈압, 저혈압, 요통, 당뇨병, 기관지 천식, 갑상선 기능저하, 갑상선 기능항진, 피부병, 관절염 등 갖가지 질환에 탁월한 치료 효과를 지니고 있는 놀라운 약초라 알려져 있다. 함초는 숙변을 제거하고 비만증을 치료하는 효과가 탁월하며, 고혈압, 저혈압을 치료한다. 또한, 혈액순환을 좋게 하고 피를 맑게 하고 혈관을 튼튼하게 하므로 고혈압·저혈압을 동시에 치료하며 축농증·신장염·관절염 등에 효과가 있다. 함초에는 화농성 염증을 치료하고 갖가지 균을 죽이는 작용이 있으므로 염증과 관절염으로 인한 수종 등의 치료에 이용되며, 먹는 화장품이라고 할 만큼 피부미용에 효과가 탁월하다.

통풍(Gout)이란 사람에게서만 발견되는 다양한 질병군을 나타내는 용어로 혈청 요산 농도의 증가(hyperuricemia), 급성 관절염이 재발하는 증상이 있으면서 활액 백혈구(synovial fluid leukocyte)에서 모노소디움 요산염 결정(monosodium urate crystal)이 존재하고 주로 관절 안과 그 주위에 모노소디움 요산염 결정의 덩어리(tophi)가 침착되어 때때로 관절의 기형과 불구를 유발하고 신장질환을 동반하며 증상들을 나타내는 질환으로 서로 다른 조합으로 나타날 수 있다.

고요산증(Hyperuricemia)란 혈액에 요산의 농도가 증가되어 있다는 말이다. 이는 혈청에서 모노소디움 요산염의 농도가 제한된 용해도의 한계를 넘을 때 발생된다. 37 ℃에서 혈장의 요산 포화도는 약 7mg/㎗이다. 그러므로 이 농도를 넘으면 물리화학적으로 과포화 상태가 된다. 혈청 요산 농도는 정상인의 평균 혈청 요산 농도보다 +2 SD를 초과한 경우에 상대적으로 높은 것으로 알려져 있다. 대부분의 역학 조사에서 남자의 상위 한계는 7 mg/㎗, 여자는 6 mg/이다. 이러한 이유 때문에 고요산증의 실질적인 상위 한계수준은 7.0 mg/㎗ 이상인 경우로 정의되고 있다. 통풍은 "질병의 왕" 그리고 "왕들의 질병"이라 불리고 있고 나이가 들수록 많이 발생하는 질환이며 엄지발가락부위 요산 결정에 의하여 발생된 염증성 반응에 의하여 굉장한 통증을 수반하는 질환으로 알로퓨리놀(allopurinol) 같은 만만치 않은 부작용을 갖는 약물이 치료제로서 사용되고 있어 안전하고 부작용이 없으면서 모노소디움 요산 결정에 의하여 야기되어 조직파괴에 관여하는 단백질분해효소인 젤라틴나제 B의 발현을 억제하는 물질의 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 안전하고 독성이 없는 천연물로부터 젤라틴나제 B의 발현을 억제하는 물질을 찾던 중 함초(Salicornia herbacea) 추출물을 분리 정제하여 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(CDCQ)을 확보하고, 그 통풍의 주요원인 물질인 혈중요산을 저감시키면서 요산 결정에 의하여 유도되는 단백분해효소인 젤라틴나제 B의 발현을 저해하는 이중 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 크산틴 옥시다제를 저해함으로써 혈중의 요산의 농도를 감소시키는 작용이 있으며 요산의 결정에 의하여 유도되는 젤리틴나제의 발현을 억제하는 작용이 있는, 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(3-caffeoyl-4-dihydrocaffeoyl quinic acid, CDCQ)을 통풍의 예방 및 치료할 수 있는 소재로서 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 포함하는 통풍 예방 및 치료용 조성물을 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 함초(Salicornia herbacea)로부터 분리ㆍ정제된 클로로겐산(chlorogenic acid) 계열의 카페오일(Caffeoyl) 화합물의 일종인, 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(CDCQ)이 요산의 형성에 중요한 효소인 크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase)를 저해하여 통풍성 관절염 환자에서 많이 발현되는 젤라틴나제 B의 발현을 억제하는 것을 확인함으로써 상기 CDCQ을 유효성분으로 함유하는 통풍 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 CDCQ는 화학적으로 합성하거나 다음과 같이 함초로부터 분리하여 수득할 수 있다.

1) 건조된 함초를 메탄올로 추출하고 여과한 후 그 여액을 감압농축하여 메탄올 추출물을 얻는 단계;

2) 상기 메탄올 추출물을 증류수에 현탁하고 에틸아세테이트로 진탕 추출하 여 버린 후 그 물층을 얻는 단계;

3) 상기 물층을 흡착 크로마토그래피를 수행하여 메탄올 수용액으로 탈착하여 활성분획을 얻는 단계;

4) 상기 활성분획을 감압 건조하여 산성조건에서 아세토나이트릴 수용액으로 로 고속액체크로마토그래피를 수행하여 정제함으로써 CDCQ를 얻는다.

상기 CDCQ은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 상기 CDCQ은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 형용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 CDCQ가 크산틴 옥시다제 저해 활성을 가지고, 마우스 대식세포주에서 젤라티나제 B의 발현이 억제되고 혈중 요산 강하 효과를 나타냄을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 CDCQ 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 통풍 예방 및 치료용 조성물을 포함한다.

상기 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 및 기능성식품의 형태로 사용될 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.

상기 유효성분의 유효투입량은 환자의 나이, 신체적 조건, 몸무게 등에 의해 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1 내지 100 ㎎/㎏(몸무게)/1일 범위 내에서 투여된다. 그리고, 1일 유효투입량 범위 내에서 하루에 한번 또는 하루에 여러 번 나누어 투입한다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 함초로부터 CDCQ 분리

서해안 갯벌에서 채취한 퉁퉁마디 건조물 1.5 kg를 쇄절하고 100% 메탄올로 3일 동안 추출하여 감압여과한 후, 그 여액을 60 ℃의 수조에서 감압농축하여 농축된 메탄올 농축액을 1 L의 증류수에 현탁하였다. 증류수에 현탁시킨 메탄올 추출물은 분액여두에서 2 L의 에틸아세테이트로서 진탕 추출하여 물층을 얻은 다음 다시 물층을 60 ℃의 수조에서 감압농축하여 물층에 존재하는 에틸아세테이트를 제거하였다. 에틸아세테이트가 제거된 상기의 물층을 증류수에 평형화된 다이아이온 에이치피 20 칼럼 크로마토그래피(Diaion HP-20 column chromatography)에 흡착시켜 물로 세척한 후에 메탄올 30% 용액으로 활성물질을 추출하여 활성분획을 얻었다. 얻어진 활성분획을 감압농축하여 소량의 메탄올에 녹여 메탄올에 평형화된 세파덱스 엘에이치 20 칼럼(Sephadex LH-20 gel column chromatography)에서 전개시켜 활성분획을 얻고 그 분획을 YMC 젤 ODS 칼럼 크로마토그래피(YMC gel ODS column chromatography)에서 산성조건에서 20% 아세토나이트릴 수용액을 용매로 사용하여 고속액체크로마토그래피를 행하여 분리하였고, 기기분석의 결과 다음 화학식 1과 같은 구조의 화합물, 3-카페오일-4-다이하이드로카페오닐 퀴닉산(CDCQ)을 얻었다.

[화학식 1]

실시예 2 : 크산틴 옥시다제(Xanthine oxidase)의 CDCQ에 의한 저해

크산틴을 기질로 하고 크산틴 산화효소를 효소로 하여 효소-기질 반응 실험을 하였다.

50 mM 인산완충용액(pH 7.5), 시료(CDCQ를 최종농도가 1, 3, 10, 30, 100 μM), 크산틴 산화효소(0.5 unit/ml)를 혼합하여 25 ℃에서 15분간 반응하여 효소와 기질이 결합하는 반응을 시킨 후, 15 μM의 잔틴을 넣어 25 ℃에서 30분 반응시킨 후 1N 염산용액을 넣어 반응을 멈추고 290 nm에서 흡광도를 측정하였다. 크산틴 산화효소 저해활성은 수학식 1에 의해 50% 저해값을 계산하였다. 크산틴 옥시다제를 50% 저해하는 CDCQ의 농도는 21.3 μM이였다.

[수학식 1]

실시예 3 : 요산염에 의해 유도되는 젤라틴나제 B 발현의 CDCQ에 의한 저해

CDCQ의 젤라틴나제 B 생성량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 마우스 대식세포주인 RAW264.7을 48 웰 플레이트(well plate)에 계대 배양 후 각 농도별 시료를 처리하고 24시간 후에 젤라틴나제 B 발현량의 변화를 확인하였다.

본 발명의 CDCQ를 처리하기 전에 10% 혈청배지에서 1% 혈청배지로 바꾸어 준 다음 시료 처리 3시간 후에 2 mg/㎖의 모노소디움 요산염을 처리하고 17시간을 배양하였다. 배양 후 세포의 모양과 세포독성을 확인하고 배양액만을 취하여 글리세롤과 발색시약이 함유된 충진 완충용액과 각각 섞어 전기영동하였고 대조구와 비교하여 젤라티나제 B 발현 억제활성을 확인하였다. 대조구는 모노소디움 요산염을 대식세포의 젤라티나제 B의 발현을 활성화시켜주는 유도제로 사용하였는데 처리구와 비처리구로 나누어 유도되는 양상을 육안으로 확인하였고 시료를 첨가한 배양액에서 젤라티나제 B의 발현양상을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었으며 대식세포에서 젤라티나제 B 발현 유발물질인 모노소디움 요산염을 처리하면 24 시간 후에 젤라티나제 B의 발현이 크게 증가하였으나, 모노소디움 요산염과 CDCQ를 동시에 처리하였을 때 CDCQ의 처리농도에 비례하여 젤라티나제 B 발현이 0.3 ㎍/ml에서 50% 저해됨을 확인하였다.

실시예 4 : 실험 동물 및 처리

공시동물로서는 16주령의 위스타 랫트(Wistar rat)를 사용하였다. 그리 고 각 그룹 당 4마리를 체중 범위에 따른 무작위법에 의하여 군(group) 분리를 실시하여 실험에 사용하였다. 사육환경은 온도 21 ± 2 ℃, 습도 55 ± 5%, 환기 횟수 15 ∼ 17회/Hour, 조도 150 ∼ 300 Lux, 그리고 조명은 12시간 명암(점등: 06:00, 소등: 18:00)으로 조정하여 실험 기간동안 일정하게 SPF(specific pathogen free) 상태로 유지하였다. 고형사료(미국, Halan)와 물(Autoclaved water)은 자유 급이ㆍ급수시켰으며 부검 및 샘플링 전 12시간 절식시켰다. 군(group)당 4마리 수컷(male)과 암컷(female)을 공시하였으며, CDCQ(800 ㎍/day/0.4 ml/rat)의 복용량으로 경구 투여하였다. 대조군은 0.4 ml의 멸균수를 경구투여 하였으며, 물질실험군은 각각의 그룹별 체중에 상응하게 물질을 0.4 ml에 희석하여 경구투여 하였다.

그 결과, 함초로부터 분리된 화합물인 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(CDCQ)은 통풍과 관련 있는 혈중뇨산의 농도를 대조군에 비하여 64% 저해하는 것으로 나타났으며[도 2], 통풍을 예방 치료하는 기능성 식품 및 의약품의 소재로서 유용하게 사용할 수 있다.

실시예 6 : 독성시험

본 발명의 화합물에 대하여 독성실험을 다음과 같이 수행하였다.

CDCQ을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 마우스(군당 10마리)에 각각 100 ㎎/㎏을 투여한 다음 7일간 관찰하였으나 사망하는 쥐는 없었다.

제제예 1: 시럽제의 제조

본 발명에 따른 CDCQ 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분 2%(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

CDCQ의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.

제제예 2: 정제의 제조

유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.

CDCQ 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 3: 캅셀제의 제조

CDCQ 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염 500 ㎎을 경질 젤라틴 캅셀에 충전하여 캅셀제를 제조하였다.

제제예 4 : 주사제의 제조

CDCQ 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염 200 ㎎을 1의 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200 ㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.

제제예 5: 음료 제조

CDCQ 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염 500 ㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다. 이때 타우린이나 마이오 이노시톨, 엽산, 판토텐산 등을 단독으로 혹은 함께 첨가할 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(CDCQ)은 동물실험에서 혈중요산의 농도를 낮추어 주는 효과를 나타내며 대식세포에서 요산에 의하여 생성되는 젤라티나제 B의 발현을 저해하는 것으로 나타나 통풍을 예방하고 치료하는 기능성 식품 및 의약품의 소재로서 유용하게 사용될 수 있어 이는 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (1)

1. 다음 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 통풍 예방 및 치료용 조성물.

   [화학식 1]

   

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