KR20050087418A

KR20050087418A - 함초로부터 분리된 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일퀴닉산을 함유하는 항염증용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20050087418A
Application number: KR1020040013198A
Authority: KR
Inventors: 정혜광; 전효곤; 김지영; 고영희; 정영철; 양재영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2004-02-26
Filing date: 2004-02-26
Publication date: 2005-08-31

Abstract

본 발명은 함초(Salicornia herbacea)로부터 분리·정제된 클로로겐산 (chlorogenic acid) 계열의 카페오일(Caffeoyl) 화합물의 일종인, 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(3-caffeoyl-4-dihydrocaffeoyl quinic acid, 이하 "CDCQ"라 함)을 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.

더욱 구체적으로는, 본 발명은 전사인자(transcription factor)인 AP-1의 활성을 저해하여 사이클로옥시게나제 II (COX-2) 유전자의 발현을 선택적으로 저해함으로써 프로스타글란딘(Prostaglandin)의 생합성을 감소시켜 부작용 없이 항염증 작용을 나타내는 조성물의 유효성분으로서, 상기 CDCQ를 제공하는 것이다.

상기 CDCQ는 사이클로옥시게나제 II (COX-2)의 발현을 선택적으로 저해하므로, 부작용 없는 항염증 작용을 나타내는 기능성 식품 및 의약품의 소재로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

함초로부터 분리된 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산을 함유하는 항염증용 약학 조성물 {A pharmaceutical composition for anti-inflammation comprising 3-caffeoyl-4-dihydrocaffeoyl quinic acid isolated from Salicornia herbacea}

함초(Salicornia herbacea)는 흔히 염초 또는 퉁퉁마디라고도 불리우며, 축농증 신장염 관절염 등 염증으로 인한 수종 등의 민간요법 치료제로 널리 사용되어 왔다. 이러한 함초(鹹草)는 우리나라 서해안 개펄에 자라는 한해살이 풀로 우리말로는 퉁퉁마디라고 부르며, 전체 모양이 산호를 닮았다 하여 산호초라고도 한다. 중국 최고의 의학책인 신농본초경에는 "함초"로, 일본의 대화본초에는 "신초(神草)" 또는 "복초(福草)", "염초(鹽草)"로 기록되어 있는 이 풀은 몸 안에 쌓인 독소와 숙변을 없애고, 암·자궁근종·축농증·고혈압·저혈압·요통·당뇨병·기관지천식·갑상선 기능저하·갑상선 기능항진·피부병·관절염 등 갖가지 난치병에 탁월한 치료 효과를 지니고 있는 놀라운 약초라 알려져 있다. 함초는 숙변을 제거하고 비만증을 치료하는 효과가 탁월하며, 고혈압·저혈압을 치료한다. 또한, 혈액순환을 좋게 하고 피를 맑게 하고 혈관을 튼튼하게 하므로 고혈압·저혈압을 동시에 치료하며 축농증·신장염·관절염 등에 효과가 있다. 함초에는 화농성 염증을 치료하고 갖가지 균을 죽이는 작용이 있으므로 염증과 관절염으로 인한 수종 등의 치료에 이용되며, 먹는 화장품이라고 할 만큼 피부미용에 효과가 탁월하다. 이 밖에도 함초의 효능은 무궁무진하다.

프로스타글란딘 (Prostaglandin, PG) 합성의 주요 효소인 사이클로옥시게나제 (Cyclooxgenase, COX)는 아라키돈산(arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘의 생합성에 관여하는 효소(enzyme)로서, COX-1과 COX-2의 2가지 isoform이 존재한다. COX-1은 구성요소적 효소(constitutive enzyme)로서 위장(stomach)의 점막 상피(mucosal epithelium)의 보호·유지 등의 역할을 담당하는 protective PGs을 생성하여 정상적인 생리적 기능(physiological function)에 기여하며, COX-2는 유도성 효소(inducible enzyme)로서 염증과 발암 등을 유도한다(Vane et al., 1998; Dubois et al., 1998; Vane, 1994). COX-1과 COX-2를 모두 저해하면 생리기능에 필요한 PGs의 생성이 저해되어 위궤양과 같은 여러 부작용을 나타내게 되나 사이클로옥시게나제 II (COX-2)에 대한 선택적 저해제는 부작용이 적은 항염증 작용을 가질 수 있으므로 항염증제의 좋은 소재가 될 수 있다(Vane et al., 1998; Masferrer et al., 1994; Chan et al., 1995). 이러한 COX-1, 2의 작용기작을 선택적으로 조절하고 염증유도에 작용하는 주요 전사인자(transcription factor)인 AP-1, NF-kB, CEBP, CRE 등의 활성화를 억제할 수 있는 소재가 개발된다면 보다 적은 부작용으로 보다 효율적인 치료를 할 수 있는 치료제의 개발이 가능할 것으로 사료된다.

본 발명자들은 안전하고 독성이 없는 천연물로부터 항염증 및 항암효과를 갖는 제제를 찾던 중 함초(Salicornia herbacea) 추출물을 분리 정제하여 3-카페오일-4-다이하이드로카페오닐 퀴닉산(3-caffeoyl-4-dihydrocaffeoyl quinic acid, CDCQ)를 확보하고, 그 항염증 효과를 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은, 사이클로옥시게나제 II (COX-2)의 발현을 선택적으로 저해함으로써 부작용이 적은 항염증 작용을 나타내는 화합물, 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(3-caffeoyl-4-dihydrocaffeoyl quinic acid, CDCQ)을 항염증용 조성물의 소재로서 제공하는 것이다.

본 발명의 기술적 과제는, 천연물인 함초로부터 안전하고 독성이 없는 화합물의 일종인 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(CDCQ)을 분리·정제하고, 상기 CDCQ가 사이클로옥시게나제 II (COX-2)의 발현을 선택적으로 저해하여 프로스타글란딘(Prostaglandin)의 생합성을 억제하는 것을 실험을 통해 확인함으로써 달성하였다.

본 발명은 함초(Salicornia herbacea)의 메탄올 추출물을 분리·정제하여 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(CDCQ)을 얻는 단계; 마우스 대식세포주인 RAW264.7를 이용하여 생체외에서(in vitro) CDCQ에 의한 PGE₂ 생성량 변화를 측정하는 단계; 마우스 대식세포주인 RAW264.7를 이용하여 CDCQ에 의한 사이클로옥시게나제 II (COX-2)의 발현 변화를 측정하는 단계; CDCQ에 의한 사이클로옥시게나제 II (COX-2) 및 AP-1의 활성도 변화를 측정하는 단계; 생체내(In vivo) 동물실험을 통하여 CDCQ에 의한 PGE₂ 생성량 변화를 측정하는 단계; 및 생체내 동물실험을 통하여 CDCQ에 의한 사이클로옥시게나제 II (COX-2)의 발현 변화를 측정하는 단계로 이루어진다.

이하 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 함초로부터 CDCQ의 분리·정제

서해안 갯벌에서 채취한 퉁퉁마디 건조물 1.5 kg를 쇄절하고 100% 메탄올로 3일 동안 추출하여 감압여과한 후, 그 여액을 60 ℃의 수조에서 감압농축하여 농축된 메탄올 농축액을 1 L의 증류수에 현탁하였다. 증류수에 현탁시킨 메탄올 추출물은 분액여두에서 2 L의 에틸아세테이트로서 진탕 추출하여 물층을 얻은 다음 다시 물층을 60 ℃의 수조에서 감압농축하여 물층에 존재하는 에틸아세테이트를 제거하였다. 에틸아세테이트가 제거된 상기의 물층을 증류수에 평형화된 다이아이온 에이치피 20 칼럼 크로마토그래피(Diaion HP-20 column chromatography)에 흡착시켜 물로 세척한 후에 메탄올 30% 용액으로 활성물질을 추출하여 활성분획을 얻었다. 얻어진 활성분획을 감압농축하여 소량의 메탄올에 녹여 메탄올에 평형화된 세파덱스 엘에이치 20 칼럼(Sephadex LH-20 gel column chromatography)에서 전개시켜 활성분획을 얻고 그 분획을 YMC 젤 ODS 칼럼 크로마토그래피(YMC gel ODS column chromatography)에서 산성조건에서 20% 아세토나이트릴 수용액을 용매로 사용하여 고속액체크로마토그래피를 행하여 분리하였고, 기기분석의 결과 화학식 1과 같은 구조의 화합물, 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(CDCQ)을 얻었다.

실시예 2 : 실험 동물 및 처리

RAW264.7 세포주는 한국세포주은행에서 구입하였고, Matrigel, Hematoxylin, Eosin, Gelatin, EMEM 배양액, Trypsin, Fetal bovine serum은 시그마사 (Sigma chemical co.)에서 구입하였다.

시험동물은 생후 8주된 25∼30g의 실험용 마우스 (C57BL/6 mouse)를 사용하였고, 사료 (purina korea)와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였으며, 사육장의 온도는 21∼24℃, 상대습도는 40∼80%로 유지하였다. 또한 12 시간마다 낮과 밤이 반복되도록 사육장내 빛을 조절하였다.

실시예 3 : CDCQ에 의한 PGE ₂ 생성량 변화 측정

CDCQ의 PGE₂ 생성량을 조사하기 위하여 마우스 대식세포주인 RAW264.7을 48 웰 플레이트(well plate)에 계대 배양 후 각 농도별 시료를 처리하고 24시간 후에 PEG₂ 생성량의 변화를 확인하였다.

그 결과는 도 1에 나타내었으며, RAW 264.7 세포에 염증 유발물질로 잘 알려진 LPS를 처리하면 24 시간 후에 PGE₂생성이 크게 증가하였으나, LPS와 CDCQ를 동시에 처리하였을 때 CDCQ의 처리농도에 비례하여 PGE₂생성이 농도 의존적으로 저해됨을 확인하였다.

실시예 4 : CDCQ에 의한 사이클로옥시게나제 II (COX-2) 유전자의 발현 변화 측정

CDCQ에 의한, 사이클로옥시게나제 II (COX-2) 유전자의 발현 감소 효과를 조사하기 위하여, 마우스 대식세포주인 RAW264.7을 이용하여 염증 유발물질인 LPS와 CDCQ를 농도별로 처리한 다음 2시간 후 사이클로옥시게나제 II (COX-2)의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR법에 의하여 조사하였다.

그 결과는 도 2에 나타내었으며, CDCQ의 농도에 비례하여 사이클로옥시게나제 II (COX-2)의 발현이 감소함을 확인하였다. 한편, 사이클로옥시게나제 I (COX-1) 유전자의 발현은 변화가 없었다.

실시예 5 : CDCQ에 의한 사이클로옥시게나제 II (COX-2) 및 AP-1의 활성도 변화 측정

상기 실시예 4의 결과가, 염증관련인자들의 반응과 밀접한 관련이 있는 전사조절인자의 활성에 의한 것인지를 알아보기 위하여, COX-2와 AP-1의 DNA 결합부위에 해당하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 합성하여 SV40 프로모터(promoter)와 루시페라아제(luciferase)를 포함하는 벡터(pGL3-promoter)의 SV40 프로모터의 윗방향(upstream)에 삽입시켜 재조합 플라스미드를 만들고, 사이클로옥시게나제 II (COX-2) 및 AP-1 전사촉진제의 활성도에 의존적으로 루시페라아제(luciferase)가 발현되도록 하였다. 따라서, 세포에 LimphofectAMINE를 이용하여 pLUC(COX-2)₃과 pLUC(AP)₃를 형질전환 시킨 다음 염증 유발 물질인 TPA, LPS와 CDCQ를 각각 농도별로 처리하고 24시간동안 배양한 후, lysate를 만들어 상층액만 취하여 루시페라아제 활성도를 측정하였다.

그 결과는 각각 도 3, 도 4에 나타내었으며, CDCQ의 농도에 의존적으로 사이클로옥시게나제 II (COX-2)와 AP-1의 루시페라아제(luciferlase) 활성도가 감소함을 확인하였다.

실시예 6 : 생체내( In vivo ) 동물실험을 통한 CDCQ의 항염증 효과 측정

상기 실시예들과 같은 생체외(in vitro) 실험 결과의 유의성과 효율성을 검증하기 위하여, 생채내 기낭(in vivo air pouch) 모델을 도입하였다. 즉 실험동물의 등에 3ml의 air를 무균적으로 주입한 후, 3일 후 다시 1ml의 air를 추가 주입하여 기낭을 형성하였다. 실험동물의 복강에 1 g∼10 g의 CDCQ를 복강 투여하고 2시간 후 염증유발물질인 카라기난(carrageenan)을 기낭에 투여, 24시간 후 pouch fluid에서 PGE₂의 생성량을 측정하였다.

그 결과는 도 5에 나타내었으며, 염증유발 물질로 사용된 카라기난 (carrageenan)에 비해 CDCQ의 농도 의존적으로 PGE₂의 생성량이 감소함을 확인하였다.

실시예 7 : 생체내 기낭조직을 이용한 CDCQ에 의한 사이클로옥시게나제 II (COX-2) 유전자의 발현 변화 측정

상기 실시예 6의 결과가, 사이클로옥시게나제 II (COX-2) 유전자의 발현에 의한 것인지를 알아보기 위하여 낭 조직(Pouch tissue)을 이용하여 역전사 연쇄중합반응(RT-PCR)을 수행하였다. 실험동물에 기낭(air pouch)을 형성한 후, 실험동물의 복강에 1g∼10 g의 CDCQ를 복강 투여하고 2시간 후 염증유발물질인 카라기난(carrageenan)을 기낭에 투여, 24시간 후 낭 조직(pouch tissue)에서 사이클로옥시게나제 II (COX-2) 유전자 발현을 RT-PCR법에 의해 측정하였다.

그 결과는 도 6에 나타내었으며, 염증유발 물질로 사용된 카라기난 (carrageenan)에 비해 CDCQ의 농도에 의존적으로 사이클로옥시게나제 II (COX-2)의 발현이 감소함을 확인하였다.

상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이, 본 발명 함초에서 분리된 화합물인 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(CDCQ)은, 염증 관련 PGE₂ 및 사이클로옥시게나제 II (COX-2)의 발현을 선택적으로 저해함으로써 항염증 작용을 나타내므로, 기능성 식품 및 의약품의 소재로서 유용하게 사용할 수 있을 것이다.

상술한 바와 같이 함초에서 분리된 화합물인 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(CDCQ)은, 염증 관련 PGE₂ 및 사이클로옥시게나제 II (COX-2)의 발현을 선택적으로 저해하여 부작용 없는 항염증 작용을 나타내므로, 기능성 식품 및 의약품의 소재로서 유용하게 사용될 수 있어 이는 의약 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 CDCQ의 농도별 처리 후 PGE₂생성량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 2는 CDCQ의 농도별 처리 후 사이클로옥시게나제 II (COX-2)의 RT-PCR에 의한 발현 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 CDCQ의 농도별 처리 후 COX-2의 활성도 변화를 나타낸 그래프이다.

도 4는 CDCQ의 농도별 처리 후 전사인자 AP-1의 활성도 변화를 나타낸 그래프이다.

도 5는 CDCQ의 농도별 처리 후 생체내(in vivo)에서 PGE₂생성량의 변화를 나타낸 그래프이다.

도 6은 CDCQ의 농도별 처리 후 생체내(in vivo)에서 COX-2의 RT-PCR에 의한 발현 결과를 나타낸 것이다.

Claims

함초(Salicornia herbacea)로부터 분리된 3-카페오일-4-다이하이드로카페오일 퀴닉산(3-caffeoyl-4-dihydrocaffeoyl quinic acid)를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 사이클로옥시게나제 II (COX-2)의 발현을 선택적으로 저해하는 항염증용 조성물.