KR20040033959A

KR20040033959A - 함초추출물을 포함하는 마이엘로이드계 백혈병 치료 및면역증강용 조성물

Info

Publication number: KR20040033959A
Application number: KR1020020063261A
Authority: KR
Inventors: 이종길; 임선아; 김구한; 김재흥
Original assignee: 주식회사 좋은바이오
Priority date: 2002-10-16
Filing date: 2002-10-16
Publication date: 2004-04-28
Also published as: KR100510174B1

Abstract

본 발명은 함초추출물을 포함하는 마이엘로이드계 백혈병 치료 및 면역증강용 조성물에 관한 것으로서 골수세포에 대한 독성과 같은 근원적인 부작용이 없으면서 치료효과가 우수한 마이엘로이드계 백혈병 치료용 조성물 및 다양한 질병의 치료 및 예방에 활용될 수 있는 면역증강용 조성물을 제공할 수 있다.

Description

함초추출물을 포함하는 마이엘로이드계 백혈병 치료 및 면역증강용 조성물{Composition for treating myeloid leukemia and increasing immunity comprising Salicornia herbacea extracts.}

본 발명은 함초추출물을 포함하는 마이엘로이드계 백혈병 치료 및 면역증강용 조성물에 관한 것이다.

함초(퉁퉁마디, Salicornia herbacea L.)는 대한민국 서해안 갯벌에서 군락을 이루며 자생하는 염생식물이다. 함초는 화석식물의 성상을 갖으며, 일반식물은 살 수 없는 척박한 환경에서 잘 자란다. 함초는 각종 미네랄과 소금기가 많이 함유된 갯벌에서 자라기 때문에 맛이 짜다. 함초에 들어 있는 소금은 인간의 생명을 유지시키는 신진대사 작용에 매우 좋다. 또한 국립해양수산연구소에서 발표한 연구보고서에 의하면 함초에는 인체에 유용한 여러 종류의 유기물과 철, 칼슘, 마그네슘, 인 같은 무기물과 각종 미네랄이 많이 함유되어 있다. 함초는 장내숙변을 제거하여 장청소 효과가 우수하며 갖가지 염증 및 관절염으로 인해 붓는 것을 완화시켜준다. 함초는 요통, 당뇨, 갑상선염, 기관지염에도 우수한 약효를 나타낸다. 함초에는 탁월한 효능을 지닌 물질이 다양하게 함유되어 있다. 땀을 흘리고 피로할 때 함초를 씹어먹으면 즉시 생기가 나는 것을 느낄 수 있으며, 오래 전부터 식용으로 사용되어왔다.

사람 백혈병의 경우, 가장 발현 빈도가 높은 것은 마이엘로이드계 백혈병이며, 백혈병은 수술이 불가능하기 때문에 항암 화학요법제를 사용하여 치료하거나, 방사선 조사를 이용하여 치료하고 있다. 그러나, 항암 화학요법제는 골수 세포에 대한 근원적 독성을 갖고 있으며, 방사선 요법도 골수세포에 대한 독성을 피할 수 없다.

골수 근간세포는 모노블라스트(monoblast), 프로모노사이트(promonocyte), 모노사이트 (monocyte), 마크로파지의 순으로 분화된다고 알려져 있다. 마이엘로이드계 백혈병 세포는 골수 근간 세포(stem cell)가 마크로파지로 분화되는 중간의 어느 단계에서 암세포로 변이된 것이다. 마크로파지는 최종적으로 분화가 완료된 세포(end stage cell)이며, 더 이상 증식하지 못하는 특성을 갖고 있다. 따라서 마이엘로이드계 암세포를 마크로파지로 분화시킬 수 있는 약물이 개발된다면 이는 백혈병 치료의 새로운 약물로 활용도가 아주 높을 것으로 예상되나, 아직까지 그러한약물이 개발되어 임상에 사용되는 것은 없는 실정이다.

암의 치료에 있어서 면역반응의 증강은 항암 화학요법제나 방사선 치료법과 같은 다른 어떠한 치료법 못지 않게 아주 중요하다. 면역반응의 증강은 우리 자신이 갖고 있는 생체방어력을 증강시키는 것이기 때문에 골수세포에 대한 독성과 같은 근원적인 부작용이 없는 치료법으로 개발될 수 있을 것으로 예상될 뿐만이 아니라, 대부분의 암 환자에 있어서 면역기능이 저하되어 있으며 면역반응의 저하와 암의 발병 빈도가 역으로 비례한다는 사실은 생체방어력의 강화가 이들 질병의 예방 및 완치를 위하여 필수적으로 중요함을 보여주는 것이다.

마크로파지는 모든 생체 조직에 분포하며, 탐식작용이 강력하여 병원균 및 죽은 세포의 제거자(scavenger)로써 중요할 뿐만이 아니라, 항원제시세포로 작용하여 특이적 면역반응(specific immunity)을 유도하는데 필수적으로 관여하는 세포이다. 면역반응의 유도에 있어서 마크로파지의 중요성은 현재 개발된 대부분의 면역증강제가 일차적으로 마크로파지의 기능을 활성화하여 면역증강작용을 나타낸다는 것이 입증하고 있다.

따라서 백혈병 치료에 있어서 백혈병 암세포의 분화유도 효과와 마이크로파지의 기능을 활성화하는 효과를 갖는 약물은 골수세포에 대한 독성과 같은 근원적인 부작용이 없는 치료법으로서 매우 유용하게 활용될 수 있기 때문에 그러한 약물을 개발하는 것은 당업계에 주어진 중요한 과제라 할 수 있다.

본 발명자들은 함초추출물의 효능을 연구하던 중 함초추출물이 마이엘로이드계 백혈병 암세포의 분화유도 효과와 마이크로파지의 기능을 활성화하는 효과를 갖는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 골수세포에 대한 독성과 같은 근원적인 부작용이 없으면서 치료효과가 우수한 마이엘로이드계 백혈병 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 마이크로파지의 기능을 활성화하는 효과가 우수한 면역증강용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 함초즙에 의한 마이엘로이드계 암 세포의 분화 유도에 따른 형태학적 변화를 나타낸 것이다(함초즙 처리전(A) 및 처리후(B)).

도 2는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질에 의한 마이엘로이드계 암 세포의 분화 유도에 따른 형태학적 변화를 나타낸 것이다(고분자 당·단백질 처리전(A) 및 처리후(B)).

도 3은 함초즙에 의한 마이엘로이드계 암 세포의 분화 유도에 따른 증식억제효과를 나타낸 것이다.

도 4는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질에 의한 마이엘로이드계 암 세포의 분화 유도에 따른 증식억제효과를 나타낸 것이다.

도 5는 함초즙의 탐식력 증강 효과를 나타낸 것이다(함초즙 처리전(A) 및 처리후(B)).

도 6은 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질의 탐식력 증강 효과를 나타낸 것이다(고분자 당·단백질 처리전(A) 및 처리후(B)).

도 7은 함초즙의 IL-1β생산 촉진 효과를 나타낸 것이다.

도 8은 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질의 IL-1β생산 촉진 효과를 나타낸 것이다.

도 9는 함초즙의 TNF-α생산 촉진 효과를 나타낸 것이다.

도 10은 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질의 TNF-α생산 촉진 효과를 나타낸 것이다.

도 11은 함초즙의 NO 생산 촉진 효과를 나타낸 것이다.

도 12는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질의 NO 생산 촉진 효과를 나타낸 것이다.

도 13은 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질과 인터페론-감마 (interferon-γ)를 병용투여했을때 NO의 생산 증가를 나타낸 것이다.

본 발명의 조성물은 백혈병 치료용 조성물로서 단독으로 또는 다른 백혈병 치료용 의약품과 병용하여 투여될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 면역증강용 조성물로서 단독으로 또는 다른 약물과 함께 병용하여 다양한 질병의 치료 및 예방에 활용될 수 있다.

함초추출물은 사람의 백혈병에서 가장 발현 빈도가 높은 마이엘로이드계 암세포의 분화 유도와 마크로파지 기능을 활성화하는 효과를 갖는다. 마크로파지는 모든 생체 조직에 분포하며, 탐식작용이 강력하여 병원균 및 죽은 세포의제거자(scavenger)로써 중요할 뿐만이 아니라, 항원제시세포로 작용하여 특이적 면역반응(specific immunity)을 유도하는데 필수적으로 관여하는 세포이다.

본 발명에서 함초추출물은 함초즙 형태와 고분자 당·단백질의 형태로 추출된다.

먼저, 함초즙 형태의 추출물은 ⅰ) 함초를 음용수로 2∼3회 깨끗이 세척하여 초파기에 통과시키는 단계, ⅱ) 초파기를 통과하여 잘게 부숴진 함초액과 함초분쇄물을 삼베 보자기에 담아 고압중탕멸균기에 넣고 압력 없이 1~2시간 가열한 후, 1~2 기압 하에서 20분∼60분 정도 80∼110℃의 열을 가하여 중탕하는 단계, ⅲ) 중탕한 함초와 액즙을 프레스로 짠 후, 그 액즙만을 자동 롤포장기로 이송하여 포장하는 단계, ⅳ) 포장된 액즙을 100℃ 열수로 5∼30분 동안 소독하는 단계를 포함하여 얻는다.

착즙액을 포장하는 경우에는 그 과정에 거품이 상당히 많이 발생하므로 액즙이 용기에 담길 때 발생하는 거품의 양을 최소화할 수 있는 롤 포장기를 사용하는 것이 바람직하다. 거품이 없을수록 공기가 들어갈 확률이 떨어지므로 장기간 변질 없이 보관하는 것이 용이하게 된다.

착즙 과정에서 이용된 초파기는 티타늄합금으로 날을 엇갈리게 돌아가게 제작한 것으로서 심이 억세고 거친 7월말∼9월초에 수확한 함초를 효율적으로 분쇄할 수 있으며, 고농도의 염분에 장시간 지속적으로 노출되어도 인체에 전혀 무해한 재질로 제작된 것이다.

함초의 고분자 당·단백질 형태의 추출물은 ⅰ) 함초를 열풍 건조하여 건조분말을 얻는 단계, ⅱ) 건조분말 중량의 5~10배 되는 증류수를 가하여 90~100 ℃ 에서 3시간 가열한 후, 여과하여 수층을 분리한 다음, 35~45 ℃ 에서 진공 감압 농축하는 단계, ⅲ) 1~5배의 에탄올을 가하여 저온에 10~14시간 방치하여 고분자 침전물을 수득하는 단계, ⅳ) 원심분리에 의하여 침전물을 수확한 후, 동결건조 하는 단계를 포함하여 얻어진다.

이와 같은 방법으로 얻어진 면역증강활성 물질은 분자량이 30,000 달톤(dalton) 보다 큰 고분자 물질이고, 갈락토스(galactose)가 주요 단당류이며, 알라닌 (alanine)이 주요 아미노산이다.

본 발명의 조성물은 백혈병 치료용 조성물로서 단독으로 또는 이마티니브 (Imatinib), 트레티노인 (Tretinoin) 등의 다른 백혈병 치료용 의약품과 병용하여 투여하는 것이 가능하며, 이러한 경우 더욱더 효율적으로 백혈병을 치료할 수 있다.

본 발명의 조성물은 면역증강용 조성물로서 마크로파지의 기능을 활성화하는 기능을 하기 때문에 단독으로 또는 다른 형태의 의약품과 병용하여 다양한 질병의 치료 및 예방에 활용될 수 있다. 예컨데 인터페론 감마(interferon-γ)와 같이 투여되는 경우에 상승적인 면역증강 효과를 나타낸다.

본 발명의 백혈병 치료용 조성물 및 면역증강용 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 1일 1~4 회로 투여할 수 있으며, 함초추출물의 1회 투여량은 추출물의 형태에 따라 함초즙은 10~200ml, 고분자 당·단백질은 0.05~4.0g이 바람직하다.

본 발명의 백혈병 치료 및 면역증강용 조성물은 함초 추출물만으로 구성 될 수 있으며, 또한 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 및/또는 첨가제를 포함하는 경우에는 다양한 형태의 제형으로 제제화될 수 있다. 즉, 본 발명의 백혈병 치료 및 면역증강용 조성물은 락토오스, 전분 등의 부형제, 마그네슘 스테이레이트 등의 윤활제, 유화제, 현탁화제, 등장화제 및 안정제, 완충액등을 포함할 수 있으며, 경우에 따라 감미제, 장흡수촉진제 및/또는 향미제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 경구용 또는 비경구용 제형으로 제제화할 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 조성물은 통상의 정제, 캅셀제, 액제, 시럽제 등의 경구제형의 형태로 제제화될 수 있으며, 주사제 등의 비경구 제형의 형태로 제제화될 수 있다.

본 발명의 백혈병 치료 및 면역증강용 조성물은 음료 형태로 제조될 수 있다. 음료 형태의 조성물은 상기의 함초즙 또는 고분자 당·단백질의 1회 투여량에 해당하는 것을 증류수로 희석하여 10~80 부피%로 함유하는 것이 바람직하다. 첨가제로는 액상과당 및 구연산을 혼합하여 사용할 수 있다. 또한 액상과당 대신 설탕 또는 포도당을, 구연산 대신 초산 또는 사과산을 각각 사용하거나 또는 이들을 혼합하여 사용할 수 있다. 음료 형태의 본 발명의 조성물은 백혈병 예방, 치료 및 면역증강의 용도로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 음료 이외에도 다양한 식품류에도 이용될 수 있다. 함초추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예컨데, 차, 건강보조 식품류 등을 들 수 있다.

함초는 오래전부터 식용으로 사용되오던 것으로서 인체에 안전한 식물이기 때문에 세포독성 등의 부작용에 대한 염려는 없다.

이하 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 함초즙의 제조

함초를 음용수로 2~3회 깨끗이 세척한 다음, 초파기로 함초를 잘게 부순다. 이 과정에서 나온 함초액과 함초분쇄물을 삼베자루에 담아, 고압중탕멸균기에서 무압력으로 1시간 동안 가열한다. 압력을 1.5기압으로 하고 약 110 ℃ 로 25분간 추가로 가열한다. 이 과정을 통과한 내용물을 프레스에 넣고 압력을 가하여 액즙을 짜낸 다음, 짜낸 액즙을 자동포장기로 이송하여 포장한다. 포장된 즙액을 100℃ 열수에서 10분간 소독한다.

실시예 2: 함초로부터 고분자 당·단백질의 분리

함초를 열풍 건조하여 건조분말을 얻어, 건조분말 중량의 10배 되는 증류수를 첨가하여 100 ℃ 에서 3시간 가열한 후, 여과하여 수층을 분리한 다음, 45 ℃ 에서 진공 감압 농축한 후, 1~2배의 에탄올을 가하여 저온에 12시간 정도 방치하여 침전물을 얻었다. 원심분리에 의하여 침전물을 수확한 후, 동결건조 하였다.

제제예 1 : 정제

실시예 2의 함초추출물250.0 ㎎

락토오스 BP250.0 ㎎

전분 BP 30.0 ㎎

전젤라틴화 옥수수 전분 BP 15.0 ㎎

스테아르산 마그네슘 1.0 mg

실시예 2의 함초추출물을 체질하고, 락토오스, 전분 및 전젤라틴화 옥수수 전분과 혼합한 후, 적합한 용적의 정제수를 첨가하고 분말로 과립화시켰다. 과립을 건조시킨 후 스테아르산마그네슘과 혼합하고 압착하여 정제를 제조하였다.

제제예 2 : 캡슐제

실시예 2의 함초추출물250.0 ㎎

전분 1500100.0 ㎎

스테아르산마그네슘 BP 1.0 ㎎

실시예 2의 함초추출물을 체질하고 전분 및 스테아르산마그네슘과 혼합한후, 젤라틴 캡슐중에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 3 : 시럽제

실시예 2의 함초추출물100.0 g

백당 637.5 g

카르복시메칠셀룰로오스나트륨 2.0 g

메칠파라벤 0.28 g

프로필파라벤 0.12 g

에탄올 20 ml

정제수 500 ml에 백당을 용해시킨 용액에 카르복시메칠셀룰로오스나트륨를 정제수 400 ml에 용해시킨 용액을 가하여 혼합하였다. 여기에 메칠파라벤과 프로필파라벤을 가하여 용해시킨 후 에탄올을 가하고 정제수를 더 가하여 1000 ml로 하였다. 여기에 체질한 실시예 2의 함초추출물을 현탁시켜 시럽제를 제조하였다.

제제예 4 : 주사제

실시예 2의 함초추출물100.0 mg

묽은 수산화나트륨 pH 7.5 ~8.5

주사용 염화나트륨 BP 최대 2ml

실시예 2의 함초추출물을 적당한 용적의 묽은 수산화나트륨 용액에 용해하여 pH 7.5~8.5로 조절하고, 이어서 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고, 철저히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 2ml 타입 앰퓰 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부격자하에 봉입시키고 이어서 토클레이브에서 살균하여 주사제를 제조하였다.

제제예 5 : 음료

함초즙 10 ml를 증류수로 희석하여 80 ml로 한 후, 여기에 액상 과당을 7~10 중량 %, 구연산을 0.1~0.2 중량 % 가하여 100 ml의 혼합음료를 제조하였다.

제제예 6 : 음료

고분자 당·단백질 0.1g을 증류수로 희석하여 80 ml로 한 후, 여기에 액상 과당을 7~10 중량 %, 구연산을 0.1~0.2 중량 % 가하여 100 ml의 혼합음료를 제조하였다.

실험예 1: 함초로 부터 추출된 고분자 당·단백질의 이화학적 특성

실시예 2에서 추출된 고분자 당·단백질의 이화학적 특성을 조사하였다.

⑴ 분자량 추정

시료를 H₂O에 용해시켜 마이크로분할 시스템(micropartition system (MPS-1))으로 여과하여 활성물질의 분자량을 추정하였다. 이러한 결과, 이 물질은30,000보다 분자량이 큰 고분자 물질임을 알 수 있었다.

⑵ 당의 조성

시료에 함유된 단당류의 조성을 측정하기 위한 전처리 방법으로 아미노당(amino sugar)의 가수분해를 위하여 6N HCl로 100 ℃ 에서 4시간 동안 처리하였고, 중성당(neutral sugar)의 가수분해를 위하여 2M 트리플로오로 아세트산(trifluoroacetic acid)으로 100 ℃ 에서 다시 4시간 동안 처리하였다. 분석은 미국 디오넥스(Dionex) 사의 바이오-엘시 디엑스-300(Bio-LC DX-300)을 사용하였고, 컬럼은 카보팩 피에이원(Carbopac PA1, (4.5×50mm))사용하였고, 검출은 통합 암페어측정기가 부착된 피이디투(PED2 with integrated amperometry)로 하였다.하였다. 이러한 결과는 표 2에 요약하여 나타내었다.

시료에 함유된 단당류의 조성

당	nmole/95㎍	ng/95㎍
푸코세	0.88	144
갈락토사민	0.18	31
글루코사민	0.84	150
갈락토오스	16.75	3,018
글루코스	4.96	894
만노오스	3.41	614

⑶ 아미노산의 조성

시료에 함유된 아미노산의 조성은 피코-택(PICO-tag) 방법을 이용하여 가수분해 및 PITC 표지하여 분석하였다. 분석기기는 HPLC를 사용하였고 검출기는 워터스 996 배열광다이오드 검출기 (waters 996 photodiode array detector (PDA, 254nm))로 하였으며 컬럼은 워터스 피코-택 컬럼(waters Pico-tag column(3.9×300mm, 4 ㎛))을 사용하였다. 이러한 결과는 표 3에 요약하여 나타내었다.

시료에 함유된 유리 아미노산의 조성

아미노산	pmol/290㎍
시스테인	624.162
아스파르트산 + 아스파라긴	1910.181
글루탐산 + 글루타민	1792.619
세린	875.061
글리신	1548.964
히스티딘	320.133
아르기닌	336.355
트레오닌	351.626
알라닌	3399.850
프롤린	796.270
티로신	183.211
발린	863.826
메티오닌	197.784
시스틴	30.179
이솔루신	387.406
루신	507.424
페닐알라닌	157.971
트립토판	13.107
리신	372.305

실험예 2: 마이엘로이드계 암세포에 대한 분화 유도 효과

마이엘로이드계 암세포인 Raw 264.7에 대한 분화유도활성을 관찰하였다. 24-웰 배양 접시에 5×10⁵cells/well로 세포를 가한 다음, 실시예 1과 2의 추출물을 배양액 대비 각각 0.05 부피%, 10 ㎍/ml의 양으로 첨가하였다. 48시간 배양한 후, 광학현미경을 이용하여 검경하였다.

그 결과, 도 1의 함초즙의 처리전(A) 및 처리후(B) 및 도 2의 고분자 당·단백질의 처리전(A) 및 처리후(B)의 모습에서 마이엘로이드계 암세포는 함초즙 원액 또는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질(10㎍/ml)에 의하여 분화가 유도되어 그 모양이 섬유아세포(fibroblast) 유사 모양으로 변하고, 플라스틱 표면에 대한 부착성이 강력해지며, 많은 액포들이 생성되는 것을 관찰할 수 있었다.

마이엘로이계 암세포는 마크로파지로 분화되면 더 이상의 증식을 하지 못하게 된다.

실험예 3: 마이엘로이드계 암세포에 대한 증식 억제 효과

마이엘로이드계 암세포인 Raw 264.7에 대한 분화유도활성을 관찰하였다. 96-웰 마이크로티터 플레이트(well microtiter plate)에 2×10⁴cells/well로 세포를 가한 다음, 실시예 1의 추출물을 각각 1, 1/3, 1/9, 1/27, 1/81, 1/243 및 1/729 배로 희석하여 배양액 대비 0.05 부피%로 첨가하고, 실시예 2의 추출물을 각각 200, 70, 20, 7, 2.5, 0.8 및 0.3 ㎍/ml의 농도로 첨가하여 2 일간 배양하였다. 세포의 증식 정도는 [3H]-티미딘(thymidine)을 세포 배양액에 가한 다음, 6 시간 동안 더 배양한 후, 세포를 수확하여 세포 내로 유입된 [3H]-티미딘의 양을 마이크로베타카운터(microbetacounter)로 측정하였다.

그 결과, 도 3 및 도 4에 보인 바와 같이, 함초즙 또는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질은 농도 의존적으로 암 세포의 증식을 억제하였다. 따라서 본 발명에서 기술한 함초즙 또는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질은 마이엘로이드계 암세포인 Raw 264,7의 분화를 유도하여 증식을 억제함을 확인하였다.

실험예 4: 탐식력 촉진 효과

마이엘로이드계 암세포인 Raw 264.7를 2-웰 쳄버 슬라이드(well chamber slide)에 1×10⁵cell/ml로 가한 후, 실시예 1과 2의 추출물을 배양액 대비 각각 0.05 부피%, 10㎍/ml의 양으로 첨가하여 48시간 배양하여 마크로파지로 분화시켰다. 여기에 감작 면양적혈구(면양적혈구에 대한 항체를 1:256 농도로 희석하여 가하고, 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후, 생리식염수로 2회 세척한 다음, 생리식염수에 1%로 현탁시킨 것)를 50㎕ 첨가하여 37 ℃에서 1시간 배양한 후, ACK 리시스 완충용액(lysis buffer)으로 탐식되지 않은 면양적혈구를 제거하였으며, 라이트(Wright)와 김사(Giemsa) 용액으로 염색하여 탐식된 면양적혈구를 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 5의 함초즙의 처리전(A) 및 처리후(B), 및 도 6의 고분자 당·단백질의 처리전(A) 및 처리후(B)의 모습에서 함초즙 원액 또는 함초로부터 분리한고분자 당·단백질(10㎍/ml)에 의하여 면양적혈구에 대한 탐식력이 강력히 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에서 기술한 함초즙 또는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질은 마크로파지의 가장 대표적인 기능 중의 하나인 탐식력을 강력히 증강시키며, 면역반응의 유도를 촉진하여 항암효과를 나타낼 것으로 예상된다.

실험예 5: IL-1β 생산 촉진 효과

마이엘로이드계 암세포인 Raw 264.7에 시료를 첨가하고 48시간 배양하여 마크로파지로 분화시켰다. 즉, 24-웰 배양 플레이트에 5×10⁵cells/well로 세포를 가한 다음, 실시예 1의 추출물을 각각 1, 1/3, 1/9, 1/27 및 1/81 배로 희석하여 배양액 대비 0.05 부피%로 첨가하고, 실시예 2의 추출물을 각각 100, 33, 11, 3.7 및 1.2 ㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 48시간 배양한 후, 배양 여액을 수득하였다. 배양 여액에 함유되어 있는 IL-1β 의 함량은 R&D 사의 엘리사 키트(ELISA kit)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도 7 및 도 8에 보인 바와 같이, 함초즙 또는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질은 농도 의존적으로 IL-1β의 생성을 촉진하였다. 따라서 본 발명에서 기술한 함초즙 또는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질은 마크로파지로 하여금 IL-1β의 생산을 유도하여 항암효과를 나타낼 것으로 예상된다.

실험예 6: TNF-α 생산 촉진 효과

마이엘로이드계 암세포인 Raw 264.7에 시료를 첨가하고 48시간 배양하여 마크로파지로 분화시켰다. 즉, 24-웰 배양 플레이트에 5×10⁵cells/well로 세포를 가한 다음, 실시예 1의 추출물을 각각 1, 1/3, 1/9, 1/27, 1/81 및 1/243 배로 희석하여 배양액 대비 0.05 부피%로 첨가하고, 실시예 2의 추출물을 각각 100, 33, 11, 3.7, 1.2 및 0.4 ㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 48시간 배양한 후, 배양 여액을 수득하였다. 배양 여액에 함유되어 있는 TNF-α의 함량은 파미겐(Pharmingen) 사의 엘리사 키트(ELISA kit)를 이용하여 측정하였다.

그 결과, 도9 및 도10에 보인 바와 같이, 함초즙 또는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질은 농도 의존적으로 TNF-α의 생성을 촉진하였다. 따라서 본 발명에서 기술한 함초즙 또는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질은 마크로파지로 하여금 TNF-α의 생산을 유도하여 항암효과를 나타낼 것으로 예상된다.

실험예 7: NO 생산 촉진 효과

마이엘로이드계 암세포인 Raw 264.7에 시료를 첨가하고 48시간 배양하여 마크로파지로 분화시켰다. 즉, 24-웰 배양 플레이트에 5×10⁵cells/well로 세포를 가한 다음, 실시예 1의 추출물을 각각 1, 1/3, 1/9, 1/27, 1/81, 1/243 및 1/729 배로 희석하여 배양액 대비 0.05 부피%로 첨가하고, 실시예 2의 추출물을 각각 100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.4 및 0.14 ㎍/ml의 농도로 첨가하였다. 48시간 배양한 후, 배양 여액을 수득하였다. 배양 여액에 함유되어 있는 NO의 함량은 세포 배양액 50㎕ 와 동량의 그리이스 시약(Griess reagent)(2.5% H₃PO₄중 0.5 % 술퍼닐아미드, 0.05 %N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 디하이드로클로라이드)를 96-웰 마이크로티터 플레이트에 혼합하여 상온에서 5분간 반응시킨 후 엘리사 판독기(ELISA reader)를 이용하여 550nm에서 측정하였다.

그 결과, 도11 및 도12에 보인 바와 같이, 함초즙 또는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질 조성물은 농도 의존적으로 NO의 생성을 촉진하였다. 따라서 본 발명에서 기술한 함초즙 또는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질은 마크로파지로 하여금 NO의 생산을 유도하여 항암효과를 나타낼 것으로 예상된다.

실험예 8: 인터페론-감마(interferon-γ)와의 병용 효과

마이엘로이드계 암세포인 Raw 264.7 세포를 24-웰 배양 플레이트에 5×105 cells/well로 세포를 가한 다음, 실시예 2의 추출물을 배양액 대비 각각 100, 33, 11, 3.7, 1.2 및 0.4 ㎍/ml의 농도로 첨가하거나, 실시예 2의 추출물을 각각 100, 33, 11, 3.7, 1.2 및 0.4 ㎍/ml의 농도로 첨가한 것에 인터페론-감마를 10 units/ml로 더 첨가하였다. 48시간 배양한 후, 배양 여액을 수득하였다. 배양 여액에 함유되어 있는 NO의 함량은 세포 배양액 50㎕ 와 동량의 그리이스 시약(Griess reagent)(2.5% H₃PO₄중 0.5 % 술퍼닐아미드, 0.05 %N-(1-나프틸)-에틸렌디아민 디하이드로클로라이드)을 96-웰 마이크로티터 플레이트에 혼합하여 상온에서 5분간반응시킨 후 엘리사 판독기(ELISA reader)를 이용하여 550nm에서 측정하였다.

그 결과, 도13에 보인 바와 같이, 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질 조성물은 인터페론과의 병용에 의하여 NO의 생성을 촉진하였다. 인터페론-감마와의 병용에 의한 NO 생산 증강효과는 함초로부터 분리한 고분자 당·단백질 조성물의 농도가 아주 낮은 상황에서 더욱 분명하게 나타났다.

상기의 실험예로부터 알 수 있는 바와 같이, 함초추출물은 마이엘로이드계 암 세포의 분화 촉진 및 마크로파지 기능 활성화 효과를 갖는다. 따라서, 본 발명은 골수세포에 대한 독성과 같은 근원적인 부작용이 없으면서 치료효과가 우수한 마이엘로이드계 백혈병 치료용 조성물 및 다양한 질병의 치료 및 예방에 활용될 수 있는 면역증강용 조성물을 제공할 수 있다.

Claims

함초추출물을 포함하는 마이엘로이드계 백혈병 치료 및 면역증강용 조성물.
제1항에 있어서, 함초추출물이 ⅰ) 함초를 음용수로 2∼3회 깨끗이 세척하여 초파기에 통과시키는 단계, ⅱ) 초파기를 통과하여 잘게 부숴진 함초액과 함초분쇄물을 삼베 보자기에 담아 고압중탕멸균기에 넣고 압력 없이 1~2시간 가열한 후, 1~2 기압 하에서 20분∼60분 정도 80∼110 ℃의 열을 가하여 중탕하는 단계, ⅲ) 중탕한 함초와 액즙을 프레스로 짠 후, 그 액즙만을 자동 롤포장기로 이송하여 포장하는 단계, ⅳ) 포장된 액즙을 100 ℃ 열수로 5∼30분 동안 소독하는 단계를 포함하여 착즙된 것임을 특징으로 하는 마이엘로이드계 백혈병 치료 및 면역증강용 조성물
제1항에 있어서, 함초추출물이 ⅰ) 함초를 열풍 건조하여 건조분말을 얻는 단계, ⅱ) 건조분말 중량의 5~10배 되는 증류수를 가하여 90~100 ℃ 에서 3시간 가열한 후, 여과하여 수층을 분리한 다음, 35~45 ℃ 에서 진공 감압 농축하는 단계, ⅲ) 1~5배의 에탄올을 가하여 저온에 10~14시간 방치하여 고분자 침전물을 수득하는 단계, ⅳ) 원심분리에 의하여 침전물을 수확한 후, 동결건조 하는 단계를 포함하여 분리된 고분자 당·단백질 임을 특징으로 하는 마이엘로이드계 백혈병 치료 및 면역증강용 조성물
제1항 내지 제3항의 어느 한 항에 있어서, 음료의 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 백혈병 치료 및 면역증강용 조성물.