KR101659927B1 - 본초의 약효 증대방법, 면역증강용 발효 키토산의 제조방법 및 그 이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본초(本草)를 당과 혼합한 후, 유산균을 접종하여 발효시키고, 키토산에 발효식초를 교반하여 혼합하여 표면처리한 후 유산균 발효물과 혼합하는 면역증강용 발효 키토산의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 발효 키토산을 포함하는 약학 조성물 또는 건강기능식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 발효 키토산은 분자량이 크고, 수친화성이 거의 없어 생체 이용율이 낮은 키토산을 본초 유산균 발효 및 초산균 발효를 통한 본 발명의 방법으로 수미립분산성을 갖고 활성화시킴으로써 비장세포의 플라그 생성 및 비장세포를 증식시키고, 산화질소의 생성을 증가시키며, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인을 증가시키는 면역증강 활성을 나타내므로 면역기능 저하로 인한 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 면역증강용 건강기능식품으로 활용될 수 있다.

Description

본초의 약효 증대방법, 면역증강용 발효 키토산의 제조방법 및 그 이용{Enhancing method for pharmaceutical effect of herb, preparation method for fermented chitosan for immune stimulating and its use}

본 발명은 발효 키토산의 제조방법, 이를 이용한 의약 또는 건강기능식품에 관한 것이다.

키토산(Chitosan)은 화학명이 Poly (1→4) 2-amino-2-deoxy-β-D-Glucan으로 이미 알려진 대로 버섯, 새우, 게, 곤충 및 갑각류의 껍질에 키틴질로 존재하고 있다. 상기 키틴질은 용매가 없어 유효 이용율이 적어, 주로 키토산을 다른 유도체로 제조하여 제약, 의료, 식품, 화장품, 생활용품 등 상당히 다양한 범위에 활용하고 있다.

그러나 키토산 역시 몇몇 산(acid)외에는 용해가 안되므로 활용에 많은 제약과 한계를 갖고 있고, 분자량이 클 뿐만 아니라 수친화성이 약하여 체내흡수율, 전이율, 생체이용율이 저조하며, 생체의 다양한 조건에 의해 변화하기 쉬우므로 식품이나 약품, 첨가제 등으로 섭취 및 이용할 경우 체내 필요량에 미치지 못할 뿐만 아니라, 전달능력이 적고, 그 고유 특성과 활성을 잃게 되는 한계가 있다.

분자량이 수십만에 달하는 고분자인 키토산을 가수분해하기 위해서는 진한 염산 용액(약 33-37% 정도)에 키토산을 용해시켜 장시간 반응시켜서 가수분해하거나 주석산, 피루브산, 아스코르브산, 구연산, 젖산, 프로피온산, 초산 등의 유기산을 통해 가수분해하는 화학적 방법과, 다른 하나는 효소를 사용하여 키토산 고분자를 가수분해시키는 생물학적 방법,이 알려져 있다.

상기 종래 방법들에 이용되는 산이나 효소들은 반응 완료 후 제거되어야 하고, 이를 위해 추가적인 유기용매나 합성 화학 첨가물들이 사용되고 있다. 그러나 합성 화학 첨가물의 독물질이 피로, 기억력 감퇴, 우울증과 불면증, 알레르기 반응, 정신건강과 아이들의 생장에도 나쁜 영향을 줄 수밖에 없는 것은 사실이다. 건강한 사람들은 합성물에 들어 있는 독성물질을 소량 먹는다고 해서 심각한 부작용을 겪지 않는다. 하지만 오랫동안 계속 먹으면 충분히 위험해질 수 있으며, 이런 화학물질에 민감하게 반응하는 사람들은 전체 인구의 7%를 넘는 것으로 알려져 있다[자연치료 백과 (The Encyclopedia of Natural Healing)].

본 발명자들은 과학을 기본으로 하는 공학자, 의학자로서로서 오랜 기간 교육 현장에서 학술과 연구를 담당한 전문가들로 사람에게 있어 질환이나 신체의 불균형 및 부조화에서 오는 어려움과 질환적 요소나 장애적 요인의 완전한 퇴치의 방법으로서 기존의 시스템의 억제 기능이 강력한 제약도 중요하지만, 기존 본초제와 같이 인체에 완만하게 작용하면서 인체 시스템을 가동시키며 세포에 무리함이 없이 유효 작용하기에 무리가 거의 따르지 않는 기능식품으로서 및 식품첨가제로서의 방법에 중점을 더 두고 본 발명에 임하였다. 본래 인체의 질환적 요인도 감염 초부터 진행 과정까지 많은 시간의 진행과 변화를 겪으며 진행되기 때문에 인체 자체도 시간의 흐름에 따른 노화 현상과 맞물려 완전하게 없애는 방법에는 어떠한 방법으로도 상당한 무리가 있다는 것을 감지하고 오히려 천연재료의 자체 가공을 과학적으로 달리하고 이론적 정립을 바탕으로 하여 인류에 조금이나마 편리하고 안전하고 쉽게 도움이 될 수 있는 재료의 선별 조사 및 특성을 발휘할 수 있게 가공방법을 찾아 본 발명에 이르게 되었다.

1. 미국등록특허 제6,521,268호 2. 미국등록특허 제5,730,876호 3. 한국등록특허 제10-0382183호 4. 한국등록특허 제10-0413215호 5. 한국등록특허 제10-0450901호 6. 한국등록특허 제10-0296738호

1. Sang Bong Seo ; Doctoral Dissertation "A Study on the Development of Novel Water-Soluble Chitosan and Its Applications to Environment, Fine Chemicals and Medical Use" Tokyo Institute of Technology(2003) 2. Sang-Bong Seo et.al "Development of natural preservative system using the mixture of Chitosan-Inula helenium L. extracts." International Journal of Cosmetic Science, 24. 195-206, (2002) 3. Sang-Bong Seo et.al "Preparation of multifunctional low molecular weight chitosan and its application in cosmetics" SoFW Journal 128. Jahrgang 5 p.34-37 (2002) 4. Sang-Bong Seo et.al "Disodium cromoglycate inhibits production of immunoglobulin-E"Immunopharmacology and Immunotoxicology. 23(2)

본 발명은 본초를 유산균 발효시키고, 이를 발효식초로 표면처리한 키토산을 혼합하여 초산균 발효를 진행함으로써, 키토산을 저분자화시키는 동시에 본초의 활성을 극대화시킨 본초의 약효 증대방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 본초를 유산균 발효시키고, 이를 발효식초로 표면처리한 키토산을 혼합하여 초산균 발효를 진행함으로써, 키토산을 저분자화시키는 동시에 본초의 활성을 극대화시킨 면역증강용 발효 키토산의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 면역증강용 발효 키토산을 포함하는 면역기능 저하로 인한 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 면역증강용 발효 키토산을 포함하는 면역증강용 건강기능식품 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 본 발명은 솔잎, 하수오, 인삼, 숙지황, 백작약, 당귀, 천궁, 백출, 복령, 자감초, 창출, 반하, 후박, 진피, 감초, 생강 및 대조 중에서 선택되는 하나 이상의 본초를 당과 혼합한 후, 유산균을 접종하여 12 내지 60 시간 발효시키는 유산균 발효 단계; 키토산 100 중량부에 대하여 초산균을 함유한 발효식초를 1 내지 25 중량부를 교반하여 혼합하는 키토산 표면처리 단계; 및 상기 키토산 표면처리 단계에서 얻은 표면처리된 키토산 100 중량부에 상기 유산균 발효 단계에서 얻은 유산균 발효물 10 내지 200 중량부를 혼합하여 2 내지 6 개월 발효시키는 초산균 발효 단계;를 포함하는 본초의 약효 증대방법에 관한 것이다.

상기 키토산 표면처리 단계는 질소 분위기에서 키토산을 먼저 600 내지 3,000 rpm으로 교반하면서 초산균을 함유한 발효식초를 5 내지 20분 동안 분무하여 투입하고, 투입 후 1 내지 60 분 동안 교반하는 것일 수 있다.

본 발명은 인삼, 백출, 복령 및 자감초를 포함하는 사군자탕 재료를 당과 혼합한 후, 유산균을 접종하여 12 내지 60 시간 발효시키는 유산균 발효 단계; 키토산 100 중량부에 대하여 초산균을 함유한 발효식초를 1 내지 25 중량부를 교반하여 혼합하는 키토산 표면처리 단계; 및 상기 키토산 표면처리 단계에서 얻은 표면처리된 키토산 100 중량부에 상기 유산균 발효 단계에서 얻은 유산균 발효물 10 내지 200 중량부를 혼합하여 2 내지 6 개월 발효시키는 초산균 발효 단계;를 포함하는 면역증강용 발효 키토산의 제조방법에 관한 것이다.

상기 키토산 표면처리 단계는 질소 분위기에서 키토산을 먼저 600 내지 3,000 rpm으로 교반하면서 초산균을 함유한 발효식초를 5 내지 20분 동안 분무하여 투입하고, 투입 후 1 내지 60 분 동안 교반하는 것일 수 있다.

상기 유산균은 식물성 유산균일 수 있다.

상기 식물성 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)일 수 있다.

상기 초산균을 함유한 발효식초는 현미; 솔잎; 하수오; 산양삼; 당귀; 및 인삼, 백출, 복령 및 자감초를 포함하는 사군자탕 재료; 중에서 선택되는 본초를 당과 혼합한 후 10 내지 25 ℃에서 12 내지 36 개월 자연 발효시켜 제조된 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 면역증강용 발효 키토산을 유효성분으로 하는 면역기능 저하로 인한 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 면역증강용 발효 키토산을 유효성분으로 하는 면역증강용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 본초(本草)를 당과 혼합한 후, 유산균을 접종하여 발효시키고, 키토산에 발효식초를 교반하여 혼합하여 표면처리한 후 유산균 발효물과 혼합하는 본초의 약효 증대방법 또는 면역증강용 발효 키토산의 제조방법으로 제조된 본초 발효 키토산은 세포 독성이 없고, 생체내 안정성이 뛰어나며, 생체 이용율이 높고, 항균 활성을 나타내며, 또한 비장세포의 플라그 생성 및 비장세포를 증식시키고, 산화질소의 생성을 증가시키며, TNF-α와 같은 염증성 사이토카인을 증가시키는 면역증강 활성을 나타내므로 면역기능 저하로 인한 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 또는 면역증강용 건강기능식품으로 활용될 수 있다.

본 발명은 솔잎, 하수오, 인삼, 숙지황, 백작약, 당귀, 천궁, 백출, 복령, 자감초, 창출, 반하, 후박, 진피, 감초, 생강 및 대조 중에서 선택되는 하나 이상의 본초를 당과 혼합한 후, 유산균을 접종하여 12 내지 60 시간 발효시키는 유산균 발효 단계; 키토산 100 중량부에 대하여 초산균을 함유한 발효식초를 1 내지 25 중량부를 교반하여 혼합하는 키토산 표면처리 단계; 및 상기 키토산 표면처리 단계에서 얻은 표면처리된 키토산 100 중량부에 상기 유산균 발효 단계에서 얻은 유산균 발효물 10 내지 200 중량부를 혼합하여 2 내지 6 개월 발효시키는 초산균 발효 단계;를 포함하는 본초의 약효 증대방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 인삼, 백출, 복령 및 자감초를 포함하는 사군자탕 재료를 당과 혼합한 후, 유산균을 접종하여 12 내지 60 시간 발효시키는 유산균 발효 단계; 키토산 100 중량부에 대하여 초산균을 함유한 발효식초를 1 내지 25 중량부를 교반하여 혼합하는 키토산 표면처리 단계; 및 상기 키토산 표면처리 단계에서 얻은 표면처리된 키토산 100 중량부에 상기 유산균 발효 단계에서 얻은 유산균 발효물 10 내지 200 중량부를 혼합하여 2 내지 6 개월 발효시키는 초산균 발효 단계;를 포함하는 면역증강용 발효 키토산의 제조방법에 관한 것이다.

상기 본초는 솔잎, 하수오, 인삼, 숙지황, 백작약, 당귀, 천궁, 백출, 복령, 자감초, 창출, 반하, 후박, 진피, 감초, 생강 및 대조 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

또한 바람직하게 상기 본초는 솔잎; 하수오; 산양삼; 당귀; 숙지황, 백작약, 당귀 및 천궁을 포함하는 사물탕 재료; 인삼, 백출, 복령 및 자감초를 포함하는 사군자탕 재료; 및 창출, 반하, 후박, 진피, 적봉령, 감초, 생강 및 대조를 포함하는 평진탕 재료; 중에서 선택되는 것일 수 있다.

소나무(赤松 Pinus densiflora siebold & Zucc.)의 솔잎은 예로부터 신선들이 먹는 선인식(仙人食)으로, 숲 속의 불로초라 불리어지며 혈관을 깨끗하게 하고 혈류 흐름이 좋게 혈액을 맑게 정혈하는 기능이 있다. 솔잎에는 각종 아미노산과 탄닌 등이 작용하여 피를 맑게하고 혈액순환에 도움을 주어 동맥경화나 고혈압의 예방으로 뇌졸중의 위험도 줄일 수 있으며, 테르펜 계통의 독특한 방향물질이 풍부해서 사람들의 신경을 안정시키는 생리적인 역할도 있으며, 또한 체내 합성이 불가능한 8종류의 필수 아미노산(Essential Amino acid: 이소류신(Isoleucine), 류신(Leucine), 라이신(Lysine), 페닐알라닌(Phenylalanine), 메티오닌(Methionine), 트레오닌(Threonine), 트립토판(Trytophane), 발린(Valine)을 모두 포함하고 있는 우수한 단백질원이기도 하며, 엽록소(chlorophyll, 葉綠素)와 타닌(tannin) 성분이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.

하수오(Pleuropterus multiflorus)는 마디풀과의 다년생초로 뿌리를 활용하는데 동의보감에서 "원기회복(정력)에 좋아 오랫동안 먹으면 흰머리가 검게 되고 장수 한다"고 할 정도로 간과 신장의 강화 효능이 뛰어나다.

인삼, 그중에서도 산양삼( wood-cultivated ginseng)은 산간의 산림하에서 인위적으로 종자나 묘삼을 파종이식하여 재배한 인삼으로 산에서 기르는 삼[蔘]이라는 뜻으로, 우리 몸 모든 장기의 면역력과 방어력을 강화시킨다. 또한 간, 폐,신장, 심장, 위장, 대장, 비장의 기능을 개선하여 각종 질병에 대한 예방책으로써 활용하며, 진세노사이드[Ginsenoside]는 뇌 혈관에도 동일하게 작용하는데, 치매 예방에 특효약이라고도 알려져 있다.

사물탕 재료는 숙지황, 백작약, 당귀, 천궁을 구성 재료로 하는 대표적 보혈제로 혈허를 개선시키는 약으로 여성 처방약의 대표이다. 혈허라 함은 피가 모자라 생기는 병증을 말하는데 혈액의 양도 중요하지만 양보다는 혈액의 구성 질의 우열을 표현하는 것으로 즉, 피의 내용이나 기능이 모자란 것으로 몸 전체나 몸의 일부에 영양이 불량한 증세가 나타나며 동시에 내분비 조절 이상, 순환 불량, 자율신경계 및 신경계의 실조가 나타난다.

사군자탕 재료는 인삼, 백출, 복령, 자감초를 구성 재료로 하는 보기제로서 기(氣)를 올리고 비장(脾臟)을 보(補)하여 신진대사의 기능을 촉진하고, 면역기능을 증강시키며, 증혈작용, 소화 흡수 기능 강화, 몸을 보하는 것이 특징이며, 소화불량, 만성위장염, 빈혈증, 만성설사, 각종 면역질환 등에 응용될 수 있으며, 단독보다는 다른 약물을 배합하여 사용한다.

평진탕 재료는 평위산에 이진탕 재료가 혼합된 것으로 창출, 반하, 후박, 진피, 적복령, 감초, 생강, 대조로 구성되며 소화제, 다이어트 등에도 다양하게 응용 및 적용되고 있다.

본 발명은 상기 본초를 당과 혼합한 후, 유산균을 접종하여 12 내지 60 시간 발효시키는 유산균 발효 단계를 포함한다.

상기 당은 단당류, 이당류 또는 올리고당류 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 포도당 또는 자당을 사용한다.

상기 당의 첨가량은 본초 100 중량부에 대하여 50 내지 300 중량부, 바람직하게는 80 내지 160 중량부를 혼합한다.

상기 당과 본초의 혼합물에 필요에 따라 물을 더 첨가할 수 있고, 물이 첨가되었을 때의 당농도는 15 내지 30 브릭스 정도로 조정한다.

상기 당과 본초의 혼합물에 접종하는 유산균은 바람직하게는 식물성 유산균이고, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이며, 더더욱 바람직하게는 락토바실러스 플란타룸 KCCM11322이다.

유산균을 접종한 후 발효시간은 12 내지 60 시간, 바람직하게는 24 내지 48 시간이며, 발효온도는 30 내지 55 ℃, 바람직하게는 40 내지 50 ℃이다.

본 발명은 키토산 100 중량부에 대하여 초산균을 함유한 발효식초를 1 내지 25 중량부를 교반하여 혼합하는 키토산 표면처리 단계를 포함한다.

상기 키토산은 특별히 한정할 필요는 없으나, 수평균분자량 30만 내지 100만 정도인 수불용성의 고분자 키토산이 이용된다.

상기 초산균을 함유한 발효식초는 현미; 솔잎; 하수오; 산양삼; 당귀; 및 숙지황, 백작약, 당귀 및 천궁을 포함하는 사물탕 재료; 인삼, 백출, 복령 및 자감초를 포함하는 사군자탕 재료; 창출, 반하, 후박, 진피, 적봉령, 감초, 생강 및 대조를 포함하는 평진탕 재료; 중에서 선택되는 본초를 당과 혼합한 후 10 내지 25 ℃에서 12 내지 36 개월 자연 발효시켜 제조된 것이 바람직하다.

상기 초산균을 함유한 발효식초의 함량은 키토산 100 중량부에 대하여 1 내지 25 중량부, 바람직하게는 5 내지 23 중량부, 더욱 바람직하게는 10 내지 20 중량부이다. 발효식초의 함량이 상기 하한치 미만인 경우 키토산 표면에 고루 발효식초가 도포되어 표면처리가 균일하게 이루어지기 어렵고, 상기 상한치를 초과할 경우 이후 유산균 발효물과 혼합되었을 때 초산균에 의한 발효가 유산균 발효보다 우세하게 되어 본초의 활성화가 충분히 이루어지지 않을 수 있다.

상기 키토산 표면처리 단계는 질소 분위기에서 키토산을 먼저 600 내지 3,000 rpm으로 교반하면서 초산균을 함유한 발효식초를 5 내지 20분, 바람직하게는 10 내지 18분 동안 분무하여 투입하고, 투입 후 1 내지 60 분, 바람직하게는 5 내지 50 분 동안 교반하는 것일 수 있다. 질소 분위기에서 발효식초를 혼합함으로써 표면처리 단계에서 강한 호기성 균인 초산균의 증식은 억제되면서 초산 및 유기산이 키토산의 표면에 균일하게 혼합될 수 있도록 한다. 또한 교반속도가 하한치 미만 또는 상한치 초과이거나 발효식초를 한꺼번에 투입하는 등 발효식초의 투입을 5 분 미만으로 투입할 경우 발효식초가 키토산의 표면에 고루 발효식초가 결합되기 어렵다.

본 발명은 다음으로 상기 키토산 표면처리 단계에서 얻은 표면처리된 키토산 100 중량부에 상기 유산균 발효 단계에서 얻은 유산균 발효물 10 내지 200 중량부를 혼합하여 2 내지 6 개월 발효시키는 초산균 발효 단계를 포함한다.

상기 유산균 발효물이 하한치 미만인 경우에는 본초의 활성을 극대화하기 어렵고, 상한치를 초과하는 경우는 키토산의 저분자화를 통한 생체이용율 향상을 기대하기 어려워 본초 발효물과 저분자화된 키토산에 의한 상승효과를 기대하기 어렵다. 또한 초산균 발효 단계의 발효기간이 상기 하한치 미만인 경우에도 본초 발효물과 저분자화된 키토산에 의한 상승효과를 기대하기 어렵고, 상기 상한치를 초과하더라도 더 이상의 상승효과의 증대가 없을 수 있다.

상기 초산균 발효 단계는 10 내지 25 ℃의 실온에서 1 내지 7일에 1 내지 3회 교반을 실시하는 것이 바람직하다.

또한 본 발명의 상기 면역증강용 키토산 발효물을 유효성분으로 하는 면역기능 저하로 인한 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.

본 발명에서 "면역증강"은, 면역세포의 초기활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대해 면역반응을 촉진하는 기능, 또는 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 기능을 의미한다.

상기 면역기능 저하로 인한 질환은, 감기, 알러지 질환, 만성피로, 암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또한, 상기 알러지 질환의 예는 아토피, 천식, 알러지성 비염을 들 수 있다.

상기 약학 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있고, 단독으로 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합의 형태로 사용할 수 있다.

또한 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 저제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 면역증강용 발효 키토산을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

상기 건강기능식품 조성물에서, 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 본초 발효 키토산을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.

본 발명의 상기 면역증강용 발효 키토산은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 본초 발효 키토산의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

음료를 제조하는 경우 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 본초 발효 키토산을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 상기 면역증강용 발효 키토산 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

실시예 1

1) 유산균 발효 단계

솔잎 100 중량부, 자당 100 중량부 및 물 300 중량부를 혼합하여 당농도를 25 브릭스로 조정하고, 1 × 10⁷ CFU/g의 락토바실러스 플란타룸 KCCM11322를 5 중량부를 접종하여 45 ℃에서 교반없이 36 시간 유산균 발효를 실시하였다.

2) 발효식초 제조 공정

현미 100 중량부와 자당 80 중량부를 혼합한 후, 밀봉한 후 10 내지 25 ℃로 유지되는 음지에서 24 개월 자연 발효시켜 현미 발효식초를 제조하였다.

3) 키토산 표면처리 단계

질소 분위기에서 수평균분자량 40만 정도인 수불용성 키토산 100 중량부를 용기에 넣고 1,000 rpm으로 교반하면서 상기 현미 발효식초 15 중량부를 분무하면서 15분 동안 투입하고, 투입 완료 후 800 rpm으로 20분 동안 혼합하였다.

4) 초산균 발효 단계

상기 키토산 표면처리 단계의 표면처리된 키토산 100 중량부에 상기 유산균 발효단계의 유산균 발효물 150 중량부를 혼합하고, 10 내지 25 ℃로 유지되는 음지에서 1일 1회 교반을 실시하면서 4개월 동안 초산균 발효를 실시하여 실시예 1의 현미 발효 키토산을 제조하였다. 상기 실시예 1의 현미 발효 키토산의 수평균분자량은 16만이었다.

비교예 1

실시예 1과 1) 유산균 발효 단계, 2) 발효식초 제조 공정을 동일하게 실시한 후, 3) 키토산 표면처리 단계를 생략하고, 수불용성 키토산 87 중량부, 현미 발효식초 13 중량부 및 유산균 발효물 150 중량부를 혼합한 후, 10 내지 25 ℃로 유지되는 음지에서 1일 1회 교반을 실시하면서 4개월 동안 초산균 발효를 실시하여 비교예 1의 현미 발효 키토산을 제조하였다. 상기 비교예 1의 현미 발효 키토산의 수평균분자량은 17만이었다.

비교예 2

실시예 1과 1) 유산균 발효 단계, 2) 발효식초 제조 공정을 동일하게 실시한 후, 3) 키토산 표면처리 단계는 질소 분위기가 아닌 공기 중에서 실시하는 것만을 제외하고 실시예 1과 동일하게 실시하고, 실시예 1과 4) 초산균 발효 단계를 동일하게 실시하여 비교예 2의 현미 발효 키토산을 제조하였다. 상기 비교예 2의 현미 발효 키토산의 수평균분자량은 16만이었다.

비교예 3

실시예 1과 1) 유산균 발효 단계, 2) 발효식초 제조 공정을 동일하게 실시한 후, 3) 키토산 표면처리 단계는 질소 분위기에서 수평균분자량 40만 정도인 수불용성 키토산 100 중량부를 용기에 넣고 400 rpm으로 교반하면서 현미 발효식초 15 중량부를 3분 동안 전부 투입하고, 투입 완료 후 800 rpm으로 20분 동안 혼합하여 실시하고, 실시예 1과 4) 초산균 발효 단계를 동일하게 실시하여 비교예 3의 현미 발효 키토산을 제조하였다. 상기 비교예 3의 현미 발효 키토산의 수평균분자량은 16만이었다.

비교예 4

실시예 1과 달리 1) 유산균 발효 단계에 불용성 키토산을 투입하여, 키토산 270 중량부, 솔잎 100 중량부, 자당 100 중량부 및 물 300 중량부를 혼합하여 당농도를 25 브릭스로 조정하고, 1 × 10⁷ CFU/g의 락토바실러스 플란타룸 KCCM11322를 5 중량부를 접종하여 45 ℃에서 교반없이 36 시간 유산균 발효를 실시하였다.

2) 발효식초 제조 공정은 실시예 1과 동일하게 실시하고, 키토산 표면처리 단계를 생략하고, 상기 키토산 함유 유산균 발효물 237 중량부, 현미 발효식초 13 중량부를 혼합한 후, 10 내지 25 ℃로 유지되는 음지에서 1일 1회 교반을 실시하면서 4개월 동안 초산균 발효를 실시하여 비교예 4의 현미 발효 키토산을 제조하였다. 상기 비교예 4의 현미 발효 키토산의 수평균분자량은 25만이었다.

비교예 5

실시예 1과 1) 유산균 발효 단계, 2) 발효식초 제조 공정을 동일하게 실시한 후, 현미 발효식초 13 중량부 및 유산균 발효물 150 중량부를 혼합한 후, 10 내지 25 ℃로 유지되는 음지에서 1일 1회 교반을 실시하면서 4개월 동안 초산균 발효를 실시하여 현미 초산 발효물을 얻고, 상기 현미 초산 발효물 163 중량부에 염산에 의한 가수분해를 통해 제조된 수평균분자량 15만 정도인 수용성 키토산 87 중량부를 혼합하여 비교예 5의 키토산 및 현미 발효물의 혼합물을 제조하였다.

실시예 2

실시예 1의 1) 유산균 발효 단계에 현미 대신 하수오를 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시예 2의 하수오 발효 키토산을 제조하였다. 상기 실시예 2의 하수오 발효 키토산의 수평균분자량은 16만이었다.

실시예 3

실시예 1의 1) 유산균 발효 단계에 현미 대신 산양삼을 첨가하는 것과 2) 발효식초의 제조 공정에 현미 대신 산양삼을 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시예 3의 산양삼 발효 키토산을 제조하였다. 상기 실시예 3의 산양삼 발효 키토산의 수평균분자량은 16만이었다.

실시예 4

실시예 1의 1) 유산균 발효 단계에 현미 대신 숙지황, 백작약, 당귀 및 천궁을 포함하는 사물탕 재료의 1:1:1:1 중량비 혼합물을 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시예 4의 사물탕 재료 발효 키토산을 제조하였다. 상기 실시예 4의 사물탕 재료 발효 키토산의 수평균분자량은 16만이었다.

실시예 5

실시예 1의 1) 유산균 발효 단계에 현미 대신 인삼, 백출, 복령 및 자감초를 포함하는 사군자탕 재료의 1:1:1:1 중량비 혼합물을 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시예 5의 사군자탕 재료 발효 키토산을 제조하였다. 상기 실시예 5의 사군자탕 재료 발효 키토산의 수평균분자량은 16만이었다.

실시예 6

실시예 1의 1) 유산균 발효 단계에 현미 대신 창출, 반하, 후박, 진피, 적봉령, 감초, 생강 및 대조를 포함하는 평진탕 재료의 1:1:1:1:1:1:1:1 중량비 혼합물을 첨가하는 것을 제외하고는 실시예 1과 동일하게 실시예 6의 평진탕 재료 발효 키토산을 제조하였다. 상기 실시예 6의 평진탕 재료 발효 키토산의 수평균분자량은 16만이었다.

실험예 1: 세포 독성 실험

상기 실시예 1 내지 6 및 비교예 1 내지 5의 발효 키토산을 각각 동결건조한 분말 시료로 PC-12 세포주를 사용하여 그 세포독성을 MTS assay로 측정하였다.

양성대조물로는 아지드화나트륨(NaN₃,sodiumazide)을 사용하여 37℃, 5% CO₂조건에서 48시간 배양하였다. 상기 시료를 각각 0.1, 0.05, 0.001, 0.005 중량% 에 각각 아지드화나트륨을 0.2 ml씩 가하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

실시예 1 내지 5 및 비교예 1 내지 4는 어느 농도에서도 세포독성이 없었으나, 비교예 5의 시료는 0.1 중량% 농도에서 세포생존율이 85 %로 약한 세포독성이 있음을 확인하였다.

실험예 2: 생체내 안전성 실험

상기 실시예 1 및 비교예 5의 발효 키토산을 각각 동결건조한 분말 시료를 선택하여 급성독성시험, 피내반응시험, 용혈성시험, 발열성시험, 조직이식시험을 실시하였다.

급성독성시험은 제조시료 1%용액(검액)으로 17∼23g의 숫 흰쥐를 10마리씩 시험 체중의 체중kg 당 50ml 씩을 주사하여 5일 후에 관찰하여 이상 유무를 확인하였다.

피내반응시험은 검액별로 대조군과 비교하며, 체중 2.5kg 의 숫 토끼의 척추를 기준으로 한쪽에만 피내주사를 하여 국소에 홍반, 부종, 출혈, 괴사 등의 이상 반응을 확인하였다. 용혈성 시험은 체중 2.5kg 숫토끼에 제조한 액을 검액으로 10ml에 원심분리로 혈액의 섬유질을 제거한 탈섬유혈액 0.1ml를 넣고 37℃에서 24시간 방치후 용혈 생성 유무로 판정하였다. 조직이식시험은 대조 플라스틱과 제조한 액의 순 원료로 길이 10mm, 폭 1mm의 주사기를 이용 펠렛형의 검체 8개를 만들어 중성세제, 물로 잘 씻고 멸균을 하여 시험동물 2.5kg이상의 숫토끼 2마리를 사용 멸균한 게이지 주사침 속에 검체를 미리 넣어 시험동물 척추로부터 약3.5cm 의 거리 간격을 두고 2.5cm의 간격으로 주사바늘의 스타일렛을 써서 이식하여 72시간 경과 후 동물을 마취사시키고, 탈혈시킨 후 이식부위의 근육조직을 채취하여 헤마토실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin)으로 염색하여 광학현미경으로 관찰 조직이식부위의 피포형성과 출혈 등의 생물학적 판단 기준으로 확인하였다.

구분	급성독성시험	피내반응시험	용혈성시험	조직이식시험
	이상유무	홍반,부종,출혈,괴사 유무	용혈생성유무	이상증세 개소
실시예1	없음	없음	없음	0.3개소
비교예5	없음	없음	없음	0.8개소

실시예 1 및 비교예 5의 시료는 급성독성시험, 피내반응시험, 용혈성시험에서 안전한 것으로 확인되었다. 다만 조직이식시험에서 실시예 1의 시료는 시험동물 1마리의 이식부위 중 0.3개소에서 피포형성이나 출혈 등의 이상이 나타났으나, 비교예 5의 시료는 0.8개소에서 이상이 나타났다. 이는 비교예 5의 가수분해된 키토산의 제조에 사용된 합성 화합물의 사용에 의한 것으로 추정할 수 있다.

실험예 3: 생체 이용율 실험

상기 실시예 1 내지 6 및 비교예 1 내지 5의 발효 키토산에 형광 표적물질인 FITC를 부착시키고 각각 동결건조한 분말 시료를 1 중량% 용액으로 제조한 후, 실험동물 200g의 정상 쥐의 꼬리 정맥에 주사 후 쥐의 간, 혈액 및 뇨에서 48시간 뒤의 생체 이용율을 비교하여 표 2에 나타내었다. 생체 이용율은 각 시간에 배출된 FITC의 질량을 투입된 FITC의 질량으로 나눈 백분율로 계산하였다.

구분	간	혈액	뇨
실시예1	84.4%	96.1%	95.2%
비교예1	74.3%	84.5%	84.2%
비교예2	80.5%	87.8%	88.2%
비교예3	80.1%	87.5%	89.4%
비교예4	72.3%	81.4%	81.0%
비교예5	70.1%	80.3%	79.3%
실시예2	84.6%	96.1%	95.7%
실시예3	84.6%	96.2%	95.5%
실시예4	84.5%	96.3%	95.5%
실시예5	84.2%	96.0%	95.1%
실시예6	84.7%	96.3%	95.4%

실시예 1 내지 6의 시료는 본초 발효 식초에 의한 표면처리와 본초 유산균 발효물과 혼합되어 초산균 발효 과정에서 키토산 표면이 활성화되어 48 시간째에 84% 이상 간에 흡수되었으며, 95% 이상 혈액을 통해 뇨로 배출되었다.

그러나 키토산 표면처리 단계를 생략한 비교예 1의 시료는 48시간째 뇨로 배출되는 비율이 실시예들에 비해 10% 이상 낮았고, 키토산 표면처리 단계에서 질소 분위기를 실시하지 않거나 발효식초를 한꺼번에 투입한 비교예 2 및 3에서도 비교예 1보다는 높지만 실시예들에 비해 4 내지 5 % 정도 낮은 생체이용율을 나타내었다. 또한 불용성 키토산을 유산균 발효 단계에 투입한 비교예 4에서도 비교예 1과 마찬가지로 생체이용율이 낮았고, 본초 유산균 발효 및 초산균 발효와 별개로 저분자화된 키토산을 혼합한 비교예 5에서도 생체이용율이 현저히 낮았다.

실험예 4: 항균활성 실험

상기 실시예 1 및 비교예 1 내지 5의 발효 키토산을 각각 동결건조한 분말 시료를 희석하여 Streptococcus mutans 및 Escherichia coli ATCC8739에 대하여 MIC((minimal inhibitory concentration: 미생물의 생육을 저해하는데 필요한 최저 농도)를 측정하여 표 3에 나타내었다.

구분	Streptococcus mutans	Escherichia coli ATCC8739
실시예1	12.5 μM	12.5 μM
비교예1	25 μM	50 μM
비교예2	25 μM	50 μM
비교예3	25 μM	25 μM
비교예4	50 μM	100 μM
비교예5	100 μM	250 μM

상기 실험결과 실시예 1은 비교예 1 내지 5에 비하여 스트렙토코커스 뮤탄스에 대한 MIC가 1/2 내지 1/8에 불과하고, 대장균에 대한 MIC가 1/2 내지 1/10에 불과하여 항균 활성이 현저히 우수한 것으로 확인되었다.

실험예 5: 비장세포의 플라그 생성 확인 실험

상기 실시예 1 내지 6 및 비교예 1 내지 5의 발효 키토산을 각각 동결건조한 분말 시료를 BALB/c 마우스에 2주간 0, 10, 40mg/kg의 용량으로 경구투여하고 항원으로 부검 4일전 T세포의존형 면양 적혈구를 감작시켰다. 이를 부검하여 간, 비장, 흉선의 면역 관련 장기들의 중량을 측정하고 0 mg/kg을 투여했을 때를 기준으로, 1x 10⁶ 비장세포당 플라그 생성 상대비율을 표 4에 나타내었다.

구분	0 mg/kg	10 mg/kg	40 mg/kg
실시예1	100%	102%	118%
비교예1	-	101%	105%
비교예2	-	102%	109%
비교예3	-	102%	108%
비교예4	-	100%	104%
비교예5	-	101%	105%
실시예2	-	103%	115%
실시예3	-	108%	122%
실시예4	-	111%	121%
실시예5	-	113%	127%
실시예6	-	103%	112%

10 mg/kg 농도에서는 실시예 4의 사물탕 재료, 실시예 5의 사군자탕 재료 발효 키토산 시료에서는 비장세포당 플라그 생성이 10% 이상 증대되었고, 40 mg/kg 농도에서는 실시예 모두에서 15 % 이상의 증대 효과를 나타내었다. 그러나 비교예 1 내지 5에서는 40 mg/kg 농도에서도 4 내지 9% 정도의 증대 효과만을 나타내어 면역력 증대 효과가 크지 않음을 확인하였다.

실험예 6: 비장세포 증식 확인 실험

상기 실험예 5에서 비장세포의 플라그 생성 증대효가가 가장 높았던 실시예 5의 사군자탕 재료 발효 키토산의 동결건조 분말을 시료로 산화질소(NO) 생성량을 확인하였다.

BALB/c 수컷 마우스에서 적출한 비장을 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)로 세척하고 비장세포를 분리한 후 RBC lysing buffer로 적혈구를 제거한 후 10% FBS와 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 RPMI 1640 배지에 부유시켜 5% 이산화탄소, 37℃에서 배양하였다.

상기 비장세포를 96-웰 플레이트에 5 ×10⁵ cells/well로 분주하고 상기 시료를 PBS에 용해하여 농도별로 첨가하였다. 양성대조군으로 LPS를 이용하였다. 48시간 배양한 후 테트라졸륨 염인 CCK-8 kit (Cell Counting Kit-8, Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan) 용액을 첨가하여 4시간 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 무처리군(실시예 5, 0 ㎍/ml)에 대한 상대비율로 표 5에 나타내었다.

시료	농도	산화질소 생성량(nM)
LPS	0.1 ㎍/ml	135%
LPS	1 ㎍/ml	212%
실시예 5	0 ㎍/ml	100%
실시예 5	1 ㎍/ml	116%
실시예 5	10 ㎍/ml	142%
실시예 5	50 ㎍/ml	185%

양성대조군으로 사용한 LPS 처리시 0.1 및 1.0 ㎍/ml에서 농도의존적으로 세포증식이 유발되었고, 상기 실시예 5의 시료도 농도의존적으로 비장세포의 증식을 유도하였다.

실험예 7: 산화질소 생성 확인 실험

상기 실시예 5의 사군자탕 재료 발효 키토산의 동결건조 분말을 시료로 산화질소(NO) 생성량을 확인하였다.

Raw 264.7 대식세포를 배양배지로 10% 우태아혈청배지, 항생제로 페니실린-스트렙토마이신 혼합제를 포함하는 Dulbecco's modified Eagle Medium을 사용하였으며 37 ℃, 5 % 이산화탄소 환경에서 배양하면서 주 2 내지 3회 배양배지를 교환하였으며 세포가 활성화되지 않은 상태를 유지하도록 배양플라스크에 부착된 세포들은 스크랩퍼를 사용하여 분리하고 주 1회 계대배양 하였다.

상기 대식세포를 2.5×10⁵ cells/well로 48 웰에 분주하여 이산화탄소 배양기에서 배양기내에서 24시간 배양하여 안정화 시킨 후 실시예 5의 시료를 농도별로 처리하였다. 양성 대조군으로 LPS를 농도별로 처리하였으며 18 시간 배양 후 상층액을 분리하고 NO 생성량을 Griess reagent를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정 후 농도를 계산하였다.

실시예 5의 시료를 0, 1, 10, 50 ㎍/ml로 처리하여, 양성대조군으로 LPS 0.25 ㎍/ml와 비교하여 NO 생성량을 표 6에 나타내었다.

시료	농도	산화질소 생성량(nM)
LPS	0.25 ㎍/ml	42.3
실시예 5	0 ㎍/ml	0.5
실시예 5	1 ㎍/ml	7.5
실시예 5	10 ㎍/ml	25.3
실시예 5	50 ㎍/ml	48.6

실시예 5의 발효 키토산은 무처리 군에 비해서 1 ㎍/ml에서 15배 정도 산화질소 생성량이 증가하였고, 50 ㎍/ml에서는 LPS와 동등한 수준의 산화질소 생성량을 증대시켜 대식세포의 활성화 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다.

실험예 8: TNF -α 생성 확인 실험

상기 실시예 5의 사군자탕 재료 발효 키토산의 동결건조 분말을 시료로 TNF-α 생성 증가 효과를 확인하였다.

대식세포 RAW264.7(3 ×10⁵cells/well)를 RPMI-1640 배지에 각각 인터페론 감마(rIFN-γ), 실시예 5의 동결건조 분말 시료, LPS를 첨가하거나 무첨가한 후 28시간동안 배양하고, TNF-α의 생성량을 405 nm 파장에서 분석하여 측정하여 표 7에 나타내었다. 분석에 전에 Tween-20을 0.05% 포함하는 PBS(phosphate-buffered saline)를 몇 방울 떨어뜨려 세척하였고, 모든 시료는 37 ℃에서 2시간 동안 배양하였다. 재조합 murine TNF-α는 희석시켜 기준으로 삼았으며, 분석판을 ABTS(Azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 기질 수용액[biotylate murine TNF-α, avidine peroxide, 30% H₂O₂함유]에 노출시켰다.

rIFN-γ (1 ㎍/ml)	LPS (1 ㎍/ml)	실시예5 (1 ㎍/ml)	TNF-α (ng/㎖)
무첨가	무첨가	첨가	0.81
첨가	무첨가	무첨가	0.76
첨가	무첨가	첨가	1.34
첨가	첨가	무첨가	2.80
첨가	첨가	첨가	2.92

대식세포 RAW264.7를 RPMI-1640 배지에서 조성제 자체로만 28시간동안 배양하면 적은 양의 TNF-α가 발현되고, rIFN-γ와 상기 실시예 5의 시료를 함께 처리하면 많은 양의 TNF-α가 생성됨을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

1. 솔잎, 하수오, 인삼, 숙지황, 백작약, 당귀, 천궁, 백출, 복령, 자감초, 창출, 반하, 후박, 진피, 감초, 생강 및 대조 중에서 선택되는 하나 이상의 본초를 당과 혼합한 후, 유산균을 접종하여 12 내지 60 시간 발효시키는 유산균 발효 단계;
   키토산 100 중량부에 대하여 초산균을 함유한 발효식초를 1 내지 25 중량부를 교반하여 혼합하는 키토산 표면처리 단계; 및
   상기 키토산 표면처리 단계에서 얻은 표면처리된 키토산 100 중량부에 상기 유산균 발효 단계에서 얻은 유산균 발효물 10 내지 200 중량부를 혼합하여 2 내지 6 개월 발효시키는 초산균 발효 단계;를 포함하는 본초의 약효 증대방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 키토산 표면처리 단계는 질소 분위기에서 키토산을 먼저 600 내지 3,000 rpm으로 교반하면서 초산균을 함유한 발효식초를 5 내지 20분 동안 분무하여 투입하고, 투입 후 1 내지 60 분 동안 교반하는 것을 특징으로 하는 본초의 약효 증대방법.
3. 인삼, 백출, 복령 및 자감초를 포함하는 사군자탕 재료를 당과 혼합한 후, 유산균을 접종하여 12 내지 60 시간 발효시키는 유산균 발효 단계;
   키토산 100 중량부에 대하여 초산균을 함유한 발효식초를 1 내지 25 중량부를 교반하여 혼합하는 키토산 표면처리 단계; 및
   상기 키토산 표면처리 단계에서 얻은 표면처리된 키토산 100 중량부에 상기 유산균 발효 단계에서 얻은 유산균 발효물 10 내지 200 중량부를 혼합하여 2 내지 6 개월 발효시키는 초산균 발효 단계;를 포함하는 면역증강용 발효 키토산의 제조방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 키토산 표면처리 단계는 질소 분위기에서 키토산을 먼저 600 내지 3,000 rpm으로 교반하면서 초산균을 함유한 발효식초를 5 내지 20분 동안 분무하여 투입하고, 투입 후 1 내지 60 분 동안 교반하는 것을 특징으로 하는 면역증강용 발효 키토산의 제조방법.
5. 제 3 항에 있어서, 상기 유산균은 식물성 유산균인 것을 특징으로 하는 면역증강용 발효 키토산의 제조방법.
6. 제 5 항에 있어서, 상기 식물성 유산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 인 것을 특징으로 하는 면역증강용 발효 키토산의 제조방법.
7. 제 3 항에 있어서, 상기 초산균을 함유한 발효식초는 현미; 솔잎; 하수오; 산양삼; 당귀; 및 인삼, 백출, 복령 및 자감초를 포함하는 사군자탕 재료; 중에서 선택되는 본초를 당과 혼합한 후 10 내지 25 ℃에서 12 내지 36 개월 자연 발효시켜 제조된 것을 특징으로 하는 면역증강용 발효 키토산의 제조방법.
8. 삭제
9. 삭제