JP4327727B2 - アッケシソウ抽出物を含むミエロイド系白血病治療及び免疫増強用組成物 - Google Patents
アッケシソウ抽出物を含むミエロイド系白血病治療及び免疫増強用組成物 Download PDFInfo
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Description
下記の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲が実施例により限定されるものではない。
アッケシソウを飲料水で2〜3回きれいに洗った後、粉砕機でアッケシソウを細かく砕く。この過程で出たアッケシソウ液とアッケシソウ粉砕物を麻袋に入れ、高圧湯煎滅菌機にて無圧力で1時間加熱する。圧力を1.5気圧にし、約110℃で25分間さらに加熱する。この過程を経た内容物をプレスに入れて圧力を加え搾汁した後、搾った液汁を自動包装機に移送して包装する。包装された液汁を100℃の熱水で10分間消毒する。
アッケシソウを熱風乾燥して乾燥粉末を得、乾燥粉末の重量の10倍になる蒸留水を添加して100℃で3時間加熱した後、ろ過して水層を分離し、45℃で真空減圧濃縮した後、1〜2倍のエタノールを加えて低温に12時間程度放置して沈殿物を得た。遠心分離により沈殿物を収得した後、凍結乾燥した。
実施例2のアッケシソウ抽出物 250.0mg
ラクトースBP 250.0mg
澱粉BP 30.0mg
前ゼラチン化トウモロコシ澱粉BP 15.0mg
マグネシウムステアレート 1.0mg
実施例2のアッケシソウ抽出物を篩い、ラクトース、澱粉及び前ゼラチン化トウモロコシ澱粉と混合した後、適した容積の精製水を添加し粉末に顆粒化させた。顆粒を乾燥させた後、マグネシウムステアレートと混合し圧着して錠剤を製造した。
実施例2のアッケシソウ抽出物 250.0mg
澱粉1500 100.0mg
マグネシウムステアレートBP 1.0mg
実施例2のアッケシソウ抽出物を篩い、澱粉及びマグネシウムステアレートと混合した後、ゼラチンカプセル中に充填してカプセル剤を製造した。
実施例2のアッケシソウ抽出物 100.0g
白糖 637.5g
カルボキシメチルセルロースナトリウム 2.0g
メチルパラベン 0.28g
プロピルパラベン 0.12g
エタノール 20ml
精製水500mlに白糖を溶解させた溶液に、カルボキシメチルセルロースナトリウムを精製水400mlに溶解させた溶液を加えて混合した。ここにメチルパラベンとプロピルパラベンを加えて溶解させた後、エタノールを加え精製水をさらに加えて1000mlにした。ここに篩った実施例2のアッケシソウ抽出物を懸濁させてシロップ剤を製造した。
実施例2のアッケシソウ抽出物 100.0mg
薄い水酸化ナトリウム pH7.5〜8.5
注射用塩化ナトリウムBP 最大 2ml
実施例2のアッケシソウ抽出物を適当な容積の薄い水酸化ナトリウム溶液に溶解してpH7.5〜8.5に調節し、続いて注射用塩化ナトリウムBPを使用して容積を調節し、十分に混合した。溶液を透明ガラスからなる2mlタイプのアンプル中に充填させ、ガラスを溶融させることで空気の上部格子下に封入し、続いてオートクレーブで殺菌して注射剤を製造した。
アッケシソウ汁10mlを蒸留水で希釈して80mlにした後、ここに液状果糖を7〜10重量%、クエン酸を0.1〜0.2重量%加えて100mlの混合飲料を製造した。
高分子糖蛋白質0.1gを蒸留水で希釈して80mlにした後、ここに液状果糖を7〜10重量%、クエン酸を0.1〜0.2重量%加えて100mlの混合飲料を製造した。
実施例2で抽出された高分子糖蛋白質の理化学的特性を調査した。
(1)分子量の推定
試料をH2Oに溶解させてマイクロ分割システム(micropartition system(MPS-1))でろ過して活性物質の分子量を推定した。この結果、この活性物質は30,000ダルトンより分子量が大きい高分子物質であることが分かった。
試料に含有された単糖類の組成を測定するための前処理方法として、アミノ糖(amino sugar)の加水分解のために6N HClで100℃で4時間処理し、中性糖(neutral sugar)の加水分解のために2Mトリフルオロ酢酸(trifluoroacetic acid)で100℃でさらに4時間処理した。分析は、米国ダイオネクス(Dionex)社のバイオ−エルシー ディーエックス−300(Bio-LC DX-300)を使用し、カラムはカルボパックピーエイワン(Carbopac PA1,(4.5×50mm))を使用し、検出は統合アンペロメトリーが取り付けられたピーイーディーツー(PED2 with integrated amperometry)で行った。この結果は表1に取りまとめて示した。
試料に含有されたアミノ酸の組成は、ピコ−タグ(PICO-tag)方法を利用して加水分解及びPITC標識して分析した。分析機器はHPLCを使用し、検出機はウォータース996配列光ダイオード検出機(waters 996 photodiode array detector(PDA,254nm))にし、カラムはウォータースピコ−タグカラム(waters Pico-tag column(3.9×300mm,4μm))を使用した。この結果は表2に取りまとめて示した。
ミエロイド系癌細胞であるRaw264.7に対する分化誘導活性を観察した。24−ウェル培養皿に5×105cells/wellで細胞を加えた後、実施例1と2の抽出物を培養液と対比してそれぞれ0.05%(v/v)、10μg/mlの量で添加した。48時間培養した後、光学顕微鏡を利用して検鏡した。
ミエロイド系癌細胞であるRwa264.7に対する分化誘導活性を観察した。96−ウェルマイクロタイタープレート(well microtiter plate)に2×104cells/wellで細胞を加えた後、実施例1の抽出物をそれぞれ1,1/3,1/9,1/27,1/81,1/243及び1/729倍で希釈して培養液と対比して0.05%(v/v)で添加し、実施例2の抽出物をそれぞれ200,70,20,7,2.5,0.8及び0.3μg/mlの濃度で添加して2日間培養した。細胞の増殖程度は[3H]−チミジン(thymidine)を細胞培養液に加えた後、6時間さらに培養し、細胞を収得して細胞内に流入された[3H]−チミジンの量をマイクロベータカウンター(microbetacounter)で測定した。
ミエロイド系癌細胞であるRaw264.7を2−ウェルチャンバースライド(well chamber slide)に1×105cell/mlで加えた後、実施例1と2の抽出物を培養液と対比してそれぞれ0.05%(v/v)、10μg/mlの量で添加して48時間培養しマクロファージに分化させた。ここに感作綿羊赤血球(綿羊赤血球に対する抗体を1:256濃度に希釈して加え、37℃で30分間反応させた後、リン酸緩衝液(PBS)で2回洗浄し、リン酸緩衝液に1%で懸濁させたもの)を50μl添加して37℃で1時間培養した後、ACKライシス緩衝溶液(lysis buffer)で貪食されていない綿羊赤血球を除去し、ライト(Wright)とギムサ(Giemsa)溶液で染色して貪食された綿羊赤血球を顕微鏡で観察した。
ミエロイド系癌細胞であるRaw264.7に試料を添加し、48時間培養してマクロファージに分化させた。即ち、24−ウェル培養プレートに5×105cells/wellで細胞を加えた後、実施例1の抽出物をそれぞれ1,1/3,1/9,1/27及び1/81倍に希釈して培養液と対比して0.05%(v/v)で添加し、実施例2の抽出物をそれぞれ100,33,11,3.7及び1.2μg/mlの濃度で添加した。48時間培養した後、培養ろ液を収得した。培養ろ液に含有されているIL-1βの含量は、R&D社のエリサキット(ELISA kit)を利用して測定した。
ミエロイド系癌細胞であるRaw264.7に試料を添加し、48時間培養してマクロファージに分化させた。即ち、24−ウェル培養プレートに5×105cells/wellで細胞を加えた後、実施例1の抽出物をそれぞれ1,1/3,1/9,1/27,1/81及び1/243倍に希釈して培養液と対比して0.05%(v/v)で添加し、実施例2の抽出物をそれぞれ100,33,11,3.7,1.2及び0.4μg/mlの濃度で添加した。48時間培養した後、培養ろ液を収得した。培養ろ液に含有されているTNF−αの含量は、ファーミンジェン(Pharmingen)社のエリサキット(ELISA kit)を利用して測定した。
ミエロイド系癌細胞であるRaw264.7に試料を添加し、48時間培養してマクロファージに分化させた。即ち、24−ウェル培養プレートに5×105cells/wellで細胞を加えた後、実施例1の抽出物をそれぞれ1,1/3,1/9,1/27,1/81,1/243及び1/729倍に希釈して培養液と対比して0.05%(v/v)で添加し、実施例2の抽出物をそれぞれ100,33,11,3.7,1.2,0.4及び0.14μg/mlの濃度で添加した。48時間培養後、培養ろ液を収得した。培養ろ液に含有されているNOの含量は、細胞培養液50μlと同量のグリース試薬(Griess reagent)(2.5%H3PO4中、0.5%スルフォニルアミド、0.05%N−(1−ナフチル)−エチレンジアミンジヒドロクロリド)を96−ウェルマイクロタイタープレートに混合して常温で5分間反応させた後、エリサ判読機(ELISA reader)を利用して550nmで測定した。
ミエロイド系癌細胞であるRaw264.7細胞を24−ウェル培養プレートに5×105cells/wellで細胞を加えた後、実施例2の抽出物を培養液と対比してそれぞれ100,33,11,3.7,1.2及び0.4μg/mlの濃度で添加したり、実施例2の抽出物をそれぞれ100,33,11,3.7,1.2及び0.4μg/mlの濃度で添加したものに、インターフェロン−ガンマを10units/mlでさらに添加した。48時間培養後、培養ろ液を収得した。培養ろ液に含有されているNOの含量は、細胞培養液50μlと同量のグリース試薬(Griess reagent)(2.5%H3PO4中、0.5%スルフォニルアミド、0.05%N−(1−ナフチル)−エチレンジアミンジヒドロクロリド)を、96−ウェルマイクロタイタープレートに混合し常温で5分間反応させた後、エリサ判読機(ELISA reader)を利用して550nmで測定した。
Claims (4)
- アッケシソウ抽出物を含むミエロイド系白血病治療及び免疫増強用組成物。
- アッケシソウ抽出物が、i)アッケシソウを飲用水で2〜3回きれいに洗って粉砕機にかける段階、ii)粉砕機にかけて細かく砕かれたアッケシソウ液とアッケシソウ粉砕物を麻袋に入れて高圧湯煎滅菌機に入れ、圧力をかけず1〜2時間加熱した後、1〜2の気圧下で20〜60分程度80〜110℃の熱を加えて湯煎する段階、iii)湯煎したアッケシソウと液汁をプレスで搾った後、その液汁のみを自動ロール包装機に移送して包装する段階、iv)包装された液汁を100℃の熱水で5〜30分間消毒する段階を経て搾汁されたものであることを特徴とする請求項1記載のミエロイド系白血病治療及び免疫増強用組成物。
- アッケシソウ抽出物が、i)アッケシソウを熱風乾燥して乾燥粉末を得る段階、ii)乾燥粉末重量の5〜10倍になる蒸留水を加えて90〜100℃で3時間加熱した後、ろ過して水層を分離し、35〜45℃で真空減圧濃縮する段階、iii)1〜5倍のエタノールを加え低温に10〜14時間放置して高分子沈殿物を収得する段階、iv)遠心分離により沈殿物を収得した後、凍結乾燥する段階を経て分離された高分子糖蛋白質であることを特徴とする請求項1記載のミエロイド系白血病治療及び免疫増強用組成物。
- 医薬用液剤組成物であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の白血病治療及び免疫増強用組成物。
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