KR20050013785A

KR20050013785A - 해조류 유래 올리고당, 상기 올리고당의 제조방법 및사용방법

Info

Publication number: KR20050013785A
Application number: KR1020030052343A
Authority: KR
Inventors: 전병삼; 차재영; 김범규; 박정원; 신갑균; 조영수; 배동원; 김희규
Original assignee: 주식회사 바이오허브; 한국해양수산개발원
Priority date: 2003-07-29
Filing date: 2003-07-29
Publication date: 2005-02-05
Also published as: KR100517354B1

Abstract

본 발명은 올리고당 및 상기 올리고당 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 해조류 추출물에 미생물 유래의 당 전이 효소를 이용하여 해조류의 특유한 갯내음을 제거할 뿐만 아니라 탁월한 암 억제효과(항암효과)를 가진 해조류 유래 올리고당 조성물, 상기 조성물의 제조방법 및 사용방법에 관한 것이다.

Description

해조류 유래 올리고당, 상기 올리고당의 제조방법 및 사용방법{OLIGO SACCHARIDES INDUCED FROM SEAWEEDS, METHOD FOR PRODUCING THE OLIGO SACCHARIDES AND USE OF THE OLIGOSACCHARIDES}

생활수준의 향상과 생활 양식의 변화로 인해 과다한 고 칼로리 음식의 섭취로 인한 영양분의 과잉, 운동 부족에 의한 비만, 산업사회의 고도화에 따른 스트레스 및 의학 발달에 따른 고령화 현상 등으로 인해 질병양상도 점점 생활습관 위주로 서구화되고 있다. 특히 이러한 성인병 중 암 발생률은 세계적으로 매년 약 5% 이상 증가하고 있으며, 1997년 통계에 따르면 암을 원인으로 한 사망자가 600만 명으로 세계 사망률의 12%에 달하였다. 국내에서도 매년 10만 명의 암환자가 새롭게 발생하고 매년 5만 여명이 사망하고 있으며, 암 환자 증가율도 10%에 이르고 있다. 1999년 국립 암 센타의 통계에 따르면 암 환자는 12만 명으로 남자는 위암 (24%), 간암 (16%), 폐암 (16%), 대장암 (10%)의 순서이고, 여자는 위암 (16%), 자궁경부암 (12%), 유방암 (15%), 대장암 (10%)의 순으로 암 환자가 발생하여 최근 우리나라의 성인 남녀에서 위암이 가장 많이 걸리는 것으로 나타나 이에 대한 사회적 관심과 적절한 대처가 있어야 한다.

현재까지의 암의 치료법으로서는 외과적인 수술요법, 화학요법, 생물요법,방사선요법 등이 이용되고 있다. 화학요법은 핵산 알킬화제, 대사 길항제, 천연물, 호르몬제 등의 합성화학물질을 이용한 것이며, 생물요법은 우리 몸 자체의 면역 기능을 회복시키거나 증진 시켜 암세포의 활동력을 약화시킴으로서 암의 진행을 막는 것으로서, 사이토카인, 면역요법제, 유전자 치료제, 암백신, 신생혈관형성 억제제 등이 있다. 그러나 아직까지는 이러한 치료법으로는 여러 가지 부작용, 약제내성, 재발 등 완벽한 치료법이 없는 실정이다.

최근까지의 항암제 연구는 암세포처럼 세포 분열이 왕성한 조직에 대한 세포 독성을 근거로 하여 행하여지기 때문에 세포분열이 빠른 피부, 점막, 골수 같은 정상조직 세포에도 독성을 나타내게 됨으로서 항암제 치료에 따른 부작용이 가장 큰 문제점으로 지적되고 있다. 따라서 효과적인 항암제 개발을 위해서는 정상세포에 대해서는 독성이 적으면서 암세포에만 특이적으로 작용하는 항암 활성 물질의 개발이 필요하다. 현재 진행되고 있는 많은 항암물질에 대한 연구에서는 대부분이 미생물의 2차 대사산물을 정제하거나 몇 가지 생약재에서 추출된 물질에 관한 연구가 주를 이루고 있으며, 경제적으로 비싼 것이 큰 단점으로 지적되고 있다.

한편, 해조류는 영양분의 보고로서 특히 각종 아미노산, 비타민, 무기염류 등의 함량이 높아 건강 보조식품으로 각광을 받고 있다. 그러나, 국내에서의 해조류 이용은 주로 가공되지 않는 상태의 건조 해조가 대부분이며, 최근에는 건강식품용 과립, 추출물 농축액 등으로 가공되고 있는데,

예를 들어 한국공개특허번호 제 93-495호 및 제 93-17513호는 해조류를 원료로 하여 이들의 추출물에 첨가제를 혼합하는 해조류를 이용한 음료의 제조방법을개시하고 있으며,

한국공개특허번호 제1994-0019240호는 김, 미역, 다시마, 곤포, 파래, 톳 및 모자반 등 각종 식용 해조류를 90~100℃의 물에 담가 8시간동안 열탕으로 추출한 후 원심 분리하여 얻은 액에 95%에 에탄올로서 추출된 다당체를 침전시키고 이를 투석막에 넣어 투석시킨 후 동결 건조하여 분말, 정제 및 캡슐제제, 또는 부형제를 첨가하여 완제품을 만들거나, 음료수에 5~50% 범위로 첨가하여 만드는 해조류에서 추출한 다당체를 주로 하는 항암효과가 있는 건강보조식품의 제조방법을 개시하고 있고,

한국공개특허번호 제2001-0019225호는 80℃의 다시마 온수 추출물 0.2∼10중량부에 미역포자엽에서 분리·정제한 후코이단 0.1∼5.0중량부를 첨가하고, 여기에 아르기닌, 타우린, 티로신, 트립토판을 각각 0.01∼5.0중량부 첨가하며, 다시 죽순, 대두배아, 표고 추출분말 각각 0.01∼5.0중량부 첨가하고, 생강즙 0.05중량부, 구연사 0.07중량부, 솔비톨 각 0.5중량부와, 백설탕 2.5중량부와 과당을 4.5중량부를 첨가·혼합한 다음, 1,000×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 사용하여 전체 100ml되도록 조제하여 제조하는 것을 특징으로 하는 다시마와 후코이단을 함유한 스트레스 해소음료의 제법을 개시하고 있으며,

한국공개특허번호 제2003-0005438호는 추출물의 가용성 고형분 함량을 100Brix로 할 때, 다시마 유기산 추출물 8 내지 12 중량% 및 당귀 추출물0.5 내지 2 중량%를 함유하는, 다시마 올리고당 함유 음료를 개시하고 있는 등 그 응용범위가 점점 확대되어가고 있는 추세이다.

그러나, 상기 특허들 또한 해조류를 2차 가공하지 않고 그대로 이용하는데 그치고 있어, 그 생산량에 비해 이를 이용한 2차 가공 제품의 개발이 매우 저조하며, 그 소비 또한 아직 미미한 실정임을 알 수 있다. 즉 해조류에서 추출한 다당체가 항암효과가 있다는 사실은 알려져 있으나, 이제까지 알려진 것은 단순히 해조류 자체가 함유하고 있는 다당체를 정제한 것에 불과하였다.

따라서, 일반적인 생약 추출제 보다는 우리의 일상생활에서 흔히 섭취 할 수 있고, 손쉽게 구입이 가능하면서도 안전성이 입증된 천연의 식용작물 즉 해조류를 이용하는 항암효과 및 항산화효과를 가진 해조류 유래 신규물질에 대한 당업계의 요구가 다수 존재했다.

상술한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 저렴한 비용으로 손쉽게 구입이 가능하면서도 안전성이 입증된 해조류를 미생물 유래의 당 전이 효소로 처리하는 2차 가공을 통해 얻어지는 해조류 유래 올리고당 및 상기 올리고당의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 종래에 알려진 항암물질이 정상세포에 대하여 가지는 독성보다 약하면서도 동시에 항암효과를 갖는 해조류 유래 올리고당 및 상기 올리고당의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 항산화제로서 작용하는 해조류 유래 올리고당 및 상기 올리고당의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 특히 위암과 자궁암의 예방 및 치료에 효과를 가지는 해조류유래 올리고당 및 상기 올리고당의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 항암효과와 항산화효과를 갖는 해조류 유래 올리고당의 사용방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예로서 파래 추출물에 당 전이 효소를 처리하여 생성된 파래 유래 올리고당의 박층 크로마토그래피 결과.

도 2는 도1의 파래 유래 올리고당을 위암 및 자궁암 세포에 처리했을 때, 위암 및 자궁암 세포의 사멸을 나타내는 현미경 사진.

도 3은 도1의 파래 유래 올리고당 처리에 따른 위암 및 자궁암 세포의 사멸 정도를 표시한 그래프.

도 4는 도1의 파래 유래 올리고당 처리에 따른 위암 및 자궁암 세포의 증식 억제 효과를 나타낸 MTT 분석(assay)의 결과.

도 5는 도1의 파래 유래 올리고당 처리에 따른 위암 및 자궁암 세포의 DNA의 단편화 검출 결과.

도 6은 도1의 파래 유래 올리고당의 항산화 활성을 DPPH 법에 의해 측정하여 나타낸 그래프.

도 7은 도1의 파래 유래 올리고당을 정상세포인 NIH3T3, 위암세포 및 자궁암 세포에 처리한 후 지질과산화 농도를 측정하여 나타낸 그래프.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 먼저 해조류 추출물에 미생물 유래의 당 전이 효소를 처리하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 해조류 유래 올리고당을 제공한다.

여기서 상기 해조류 추출물은 홍조류, 갈조류, 녹조류에 속하는 식용하는 모든 해조류가 포함될 수 있으며, 특히 파래, 미역, 다시마, 톳의 추출물이 바람직하고, 추출방법은 공지된 어떤 방법을 사용하여도 무방하다.

또한 본 발명에서 사용하는 미생물 유래의 당 전이 효소는 무코르(Mucor)속(屬), 페니실리움(Penicillium)속, 사카로미세스 (Saccharomyces)속 등에 속하는 곰팡이나 효모 등을 비롯한 미생물을 영양배지에서 배양하여 얻어지는 배양물로 부터 유도된 α-글루코시다아제 ; 바실루스(Bacillus)속과 클렙시엘라(Klebsiella)속 등에 속하는 세균 배양물로부터 유도된 시클로말토덱스트린 글루카노 트랜스퍼라아제 ; 초고열성세균배양물로부터 유도된 4-α 글루카노트랜스퍼라아제 및 바실루스속과 아스페르길루스(Aspergillus)속에 속하는 세균과 진균 배양물로부터 유도된 α-아밀라아제를 포함하는 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

여기서 이러한 당 전이 효소는 반드시 정제하여 사용할 필요는 없으나, 필요하다면 종래의 방법으로 당 전이 효소를 정제하여 사용해도 되고 시판되고 있는 당전이 효소를 사용해도 된다. 당 전이 효소 사용량과 반응시간은 서로 밀접한 관계가 있는데, 경제성의 관점에서 약 1∼5 시간 내에 반응을 종료할 수 있도록 당 전이 효소 사용량을 선택하는 것이 바람직하므로, 본 발명에서는 상기 해조류 추출물에 상기 당 전이 효소를 0.5~5 mg/L 처리하였다.

또한 본 발명은 해조류로부터 추출액을 얻는 추출단계; 상기 추출단계를 거친 해조류 추출액에 미생물 유래의 당전이 효소를 처리하는 효소처리단계; 상기 효소처리단계를 거친 해조류 추출액을 멸균하는 멸균단계; 및 상기 멸균단계를 거친 해조류 추출액으로부터 올리고당을 수득하는 수득단계를 포함하는 해조류 유래 올리고당 제조방법을 제공한다.

여기서 상기 추출단계는 해조류로부터 염분을 제거하는 과정; 상기 염분이 제거된 해조류를 분쇄하는 과정; 상기 분쇄된 해조류를 추출하는 과정; 상기 추출물을 원심분리하는 과정; 및 상기 원심 분리된 상태에서 상등액만을 회수하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는데, 해조류로부터 염분을 제거하기 위해 준비된 해조류를 깨끗하게 수세하여 탈수시키며, 분쇄할 때는 전체 중량의 10%에 해당하는 물을 첨가하여 분쇄하고, 분쇄된 해조류로부터 추출액을 추출하기 위해서는 공지된 어떤 방법을 사용하는 것도 가능하나 본 발명에서는 열수 추출방법을 사용하였으며, 80-121℃에서 20-60분 동안 열수 추출하는 것이 바람직하였다.

상기 효소처리단계는 상기 추출단계를 거친 해조류 추출액에 미생물유래의 당 전이 효소를 0.5~5 mg/L 처리하는 과정; 및 상기 효소 처리된 해조류 추출액을 50~90℃에서 1~3시간 반응시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 여기서 상기 미생물 유래의 당 전이 효소가 해조류 추출액에 작용하여 올리고당이 생성된다.

상기 멸균단계는 당 전이 효소의 활성저해 및 살균을 위한 것으로 115-130℃에서 20-60분 동안 이루어지는데, 주지된 바와 같이 당질이 단순한 생체의 구조물이나 에너지원으로서 분류되는 시대는 갔으며 당쇄는 그 다양성이 갖는 방대한 화학적 정보량을 통하여 여러 가지 생리적인 역할을 담당하고 있음이 밝혀지고 있는 것처럼 효소처리 단계를 거친 해조류 추출액을 그대로 두면 계속해서 효소가 활성을 유지하게 되므로 항암효과 및 항산화효과를 가진 올리고당을 생성시킨 후 상기 올리고당이 다른 물질로 변경되지 않도록 멸균단계를 거치는 것이다.

한편, 상기 수득단계에서 얻어지는 올리고당을 박층 크로마토그래피법으로 분석한 결과 2 종류이상인 것이 확인되었으며 상기 생성된 신규 올리고당들의 상호작용으로 항암효과 및 항산화효과가 나타나는 것으로 예측되었다.

따라서, 본 발명은 상술한 해조류 유래 올리고당 또는 상술한 제조방법으로 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 포함하는 약학조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 상술한 해조류 유래 올리고당 또는 상술한 제조방법으로 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 포함하는 기능성식품을 제공할 수 있으며, 상술한 해조류 유래 올리고당 또는 상술한 제조방법으로 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 포함하는 화장료조성물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 상술한 해조류 유래 올리고당 또는 상술한 제조방법으로 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 항산화제로 사용하는 방법을 제공할 수 있으며, 상술한 해조류 유래 올리고당 또는 상술한 제조방법으로 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 암 예방 또는 치료제로 사용하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상술한 해조류 유래 올리고당 또는 상술한 제조방법으로 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 식품첨가제로 사용하는 방법을 제공한다.

이하 실시예를 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.

실시예

파래의 신규 올리고당 제조방법

먼저 파래를 준비하고, 준비된 파래를 수세하여 염분을 제거하여 탈수시킨 후, 물을 전체 중량에 대해 10% 첨가하여 마쇄 한다. 마쇄한 파래를 100℃에서 30분간 열수 추출하였다. 열수 추출한 액을 원심분리(8,000 rpm, 30분)하여 침전물을 제거하고, 용액 상태인 상등액만 회수하였다. 상기 상등액에 미생물 유래 당 전이효소 3 mg/L 를 첨가하여, 70℃에서 90분 동안 반응시켜 신규 올리고당을 생성시킨다. 이후, 상기 효소처리된 추출액을 121℃에서 30분간 멸균하였다. 멸균 후, 다시 원심분리 (8,000 rpm, 30분)에 의하여 침전물을 제거하고, 상등액을 회수하여 파래 유래 올리고당을 수득하였다.

실험예1

파래 유래 올리고당의 생성여부 확인

실시예에서 얻어진 파래 유래 올리고당의 생성여부를 확인하기 위하여 박층 크로마토그래피법을 사용하였다. 박층 크로마토그래피는 silica gel plate (25 DC-Alufolien Kieselgel 60, Merck 사)를 이용하였으며, 전개 용매로는 1-butanol/ethanol/water (5:5:3)를 사용하였으며, 발색은 methanol에 3% 황산을 첨가하여 산포 한 후, 100℃ 이상의 hot plate 위에 놓고 10분간 가열하였다.

도1은 파래 추출물에 당 전이 효소를 처리하여 생성된 파래 유래 올리고당의 박층 크로마토그래피 결과를 표시한 것인데, 도1에서 (-)는 효소 무처리, (+)는 효소처리, M은 표준 말토-올리고새카라이드[standard malto-oligosaccharides (G1-G7)]로서 G1, G2, G3, G4, G5, G6 및 G7은 각각 글루코스(glucose), 말토오즈(maltose), 말토트리오즈(maltotriose), 말토테트라오즈(maltotetraose), 말토펜타오즈(maltopentaose), 말토 헥사오즈(maltohexaose) 및 말토 헵타오즈 (maltoheptaose)이다.

도1로부터, 파래 추출물에 당 전이 효소 처리를 한 결과 저분자량의 신규 올리고당이 2개 이상 형성되는 것을 확인할 수 있었다.

실험예2

파래 유래 올리고당의 위암 및 자궁암 세포주에 대한 세포파괴 (cytotoxicity) 효과 및 정상세포에 대한 독성여부 확인

(1) 암세포 및 정상세포의 배양

인체 위암 세포주인 AGS와 자궁암 세포주인 HeLa 및 정상 세포주인 NIH3T3은 국립 경상대학교 의과대학 미생물학 연구실에서 분양 받아 계대배양 하면서 사용하였다. 세포 배양에는 DMEM (Dulbecc's modified Eagle's medium, Bio WhittakerCo, USA) 배지를 사용하였으며, 그 외 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.2), trypsin-EDTA (Grand Island Biological Co., USA) 등을 사용하였다.

암세포와 대조군으로 사용한 파이브로블래스트(fibroblast)는 DMEM 배지에 10% FBS (fetal bovine serum), penicillin G (100 units/ml), Streptomycin (100 μg/ml)을 첨가하여 37℃, 5% CO₂인큐베이터(incubator)에서 배양하였다.

(2) 세포파괴 실험(Cytotoxicity test)

AGS와 HeLa 및 NIH3T3 세포를 2 x 10⁶cells/ml 되도록 조절하여 100 mm 조직 배양 디쉬(tissue culture dish)에 분주하고 37℃, 5% CO₂인큐베이터 (incubator)에서 6 시간 동안 배양하여 세포를 디쉬(dish) 바닥에 부착시킨 후, 파래 유래 올리고당 250 μg/ml를 첨가하였다. 이를 4일간 배양하면서 시간대별 (24, 48, 72, 96 hrs)로 현미경 (inverted microscope) 관찰 및 세포수를 측정하였다. 이 때 모든 세포는 3회 반복 측정하였으며, 살아있는 세포수를 조사하기 위하여 trypan blue dye exclusion 법을 이용하여 염색되지 않은 세포의 수를 계산하였다. 배양세포에 1 ml의 0.05% Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 dish 바닥에서 부유시킨 후 10 ml의 PBS buffer로 씻어 원심분리하고 상층액을 제거한 후 PBS buffer에 재부유된 세포 50 μl를 0.4% trypan blue stain (Gibco, USA) 50 μl에 넣어 섞고, 1분후 haematometer로 세포수를 측정하였다.

또한 각각의 cell을 2 x 10⁶cells/ml 되도록 조절하여 100 mm 조직 배양 디쉬(tissue culture dish)에 분주하고 37℃, 5% CO₂인큐베이터(incubator)에서 6시간 동안 배양하여 세포를 디쉬(dish) 바닥에 부착시킨 후, 파래 유래 올리고당을 250 μg/ml 첨가하여 24시간 단위로 96시간 동안 세포의 형태 변화를 관찰하였다. 카메라 촬영은 위상차 현미경에 디지털 카메라를 장착하여 200배 배율로 확대하여 촬영하였다.

(3) MTT 분석(assay)

MTT (3-［4,5-dimethylthiazol-2-yl］-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)는 대사과정이 온전한 살아있는 세포의 미토콘드리아 내막에 존재하는 옥시도-리덕타제(oxido-reductase)의 효소 작용에 의해 환원되어 보라색의 불용성 포르마잔 (formazan)을 생성한다. 이렇게 생성된 포르마잔(fomazan)을 용해시켜 그 발색정도를 흡광도로 측정함으로 살아있는 세포의 농도를 계산할 수 있다. 본 실험에서는 2 x 10⁴cells/ml 농도가 되도록 조절한 세포를 96 well plate에 100 μl씩 분주하고 이것을 37℃, 5% CO₂인큐베이터(incubator)에서 6시간 배양하여 세포를 부착시킨 후 각각 100, 250 μg/ml 농도로 파래 유래 올리고당을 첨가하였다. 이것을 96시간동안 37℃, 5% CO₂인큐베이터에서 배양시킨 후, 5 mg/ml 농도로 PBS로 희석한 MTT (Sigma chemical Co., Louis, Mo., USA) 용액을 각 well당 10 μl씩 넣고 37℃, 5% CO₂인큐베이터(incubator)에서 4시간 동안 방치하였다. 생성된 MTT 포르마잔(formazan)을 용해하기 위해 가용성 용액 [solubility solution](0.04 N HCl in isopropanol)을 각 웰(well)당 100 μl씩 첨가하고, 다크 블루 크리스탈(dark blue crystal)을 피펫트만을 이용하여 용해시킨 후 ELISA-reader (Bio-Rad Model 550 Microplate Reader, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(4) DNA 단편화의 검출

세포사(apoptosis)의 생화학적인 측정법으로서 DNA의 누클로솜(nucleosome) 단위로의 단편화를 관찰하는 것이 일반적으로 알려져 있다. AGS와 HeLa 및 NIH3T3 세포를 2 x 10⁶cells/ml 농도가 되도록 조절하여 100 mm 조직 배양 디쉬(tissue culture dish)에 분주하고 37℃, 5% CO₂인큐베이터(incubator)에서 6 시간 동안 배양하여 세포를 dish 바닥에 부착시킨 후, 파래 유래 신규 올리고당 250 μg/ml 를 첨가하였다. 4일간 배양한 세포의 상층 배지를 제거하고, 배양세포에 1 ml의 0.05% 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 디쉬(dish) 바닥에서 부유시킨 후 10 ml의 PBS 버퍼로 씻어 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 20 배의 HMW-프로테이나제(proteinase) K (100 μg/ml) 버퍼(buffer)를 첨가하여 55℃에서 90분간 반응시켜 세포를 용해시켰다. 세포 용해액에 동량의 페놀(phenol)을 처리하여, 원심분리에 의하여 남아있는 세포막과 단백질 등을 제거하고, 2배의 에탄올을 가한 후 유리봉으로 DNA를 회수하였다. 70% 에탄올로 세척, 건조 후 TE 버퍼에 녹여서 OD 260 nm로 DNA 양을 측정하여 전기영동 하였다.

(5)실험결과

실시예에서 얻어진 파래 유래 올리고당이 AGS와 HeLa 및 NIH3T3의 세포 크기와 형태 변화에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 위상차 현미경 (Olympus CKX41, Japan)으로 관찰하고 사진을 촬영하여 도2에 나타내었는데, 도2를 통해 정상세포에는 거의 독성이 없지만 상기 파래 유래 올리고당 조성물을 위암 및 자궁암 세포에처리했을 때, 위암 및 자궁암 세포가 파괴되는 것을 알 수 있다. 여기서 a는 NIH3T3 대조구이고, b는 파래 유래 올리고당을 처리한 NIH3T3 세포이며, c는 HeLa 대조구이고, d는 파래 유래 올리고당을 처리한 HeLa 세포이며, e는 AGS 대조구이고 f는 파래 유래 올리고당을 처리한 AGS 세포이다.

도 3은 상기 파래 유래 올리고당 조성물 처리에 따른 위암 및 자궁암 세포의 사멸 정도를 표시한 그래프로서, 파래 유래 올리고당의 위암 세포주인 AGS 및 자궁암 세포주인 HeLa에 대한 세포 독성 효과를 알아보기 위하여 파래 유래 올리고당을 250 μg/ml의 농도로 첨가하고 24, 48, 72, 96시간 배양하면서 시간대별로 살아있는 세포 수를 계수하였는데, 시간의 증가에 따라 암세포가 파괴되어 그 수가 유의적으로 감소하였으며, 96시간에 HeLa와 AGS는 각각 70%, 82%가 감소되었다. 한편 정상 세포주인 NIH3T3은 96시간에 약 5% 정도의 감소로 정상 세포에는 독성이 거의 없는 것으로 나타났다.

도4는 상기 파래 유래 올리고당 조성물 처리에 따른 위암 및 자궁암 세포의 증식 억제 효과를 나타낸 MTT 분석(assay)의 결과를 나타낸 것인데, 위암 세포주인 AGS와 자궁암 세포주인 HeLa의 MTT 분석(assay) 결과, 도4의 사진으로부터 예측되듯이 파래 유래 올리고당을 100 μg/ml 농도로 첨가하였을 경우 대조군과 비교하였을 때 AGS 세포의 약 64%, HeLa 세포의 경우 약 45% 세포 증식 억제 효과를 나타내었고, 파래 유래 올리고당을 250 μg/ml 첨가하였을 경우는 NIH3T3, HeLa, AGS의 생존율은 각각 92%, 32%, 26%였다. 따라서 상기 파래 유래 올리고당은 정상세포에는 무해하면서, 암세포만을 사멸시킨다는 것을 알 수 있었다. 한편 암세포의 대조군으로 사용한 정상세포인 NIH3T3의 경우 신규 올리고당의 유의적인 증식 억제가 나타나지 않았으며, 위암 및 자궁암 세포주의 증식에 대해 가장 큰 억제 효과를 나타냈던 최고 농도인 250 μg/ml로 처리하여도 세포 생육에는 영향을 미치지 않아 위암 및 자궁암 세포만을 특이적으로 생육저해에 의한 항암 효과를 나타내었다.

도5는 상기 파래 유래 올리고당 조성물 처리에 따른 위암 및 자궁암 세포의 DNA의 단편화 검출 결과인데, DNA의 단편화를 조사는 세포사 (apoptosis)를 확인하기 위하여 하였다. 도5로부터 정상적인 NIH3T3 세포에는 파래 유래 올리고당 처리 전후에 별다른 변화가 없으나(레인 1, 2), 암세포인 HeLa와 AGS 세포에서는 파래 유래 올리고당을 처리한 결과 DNA가 분해되어 단편화되는 것이 확인되었다.(레인 4, 6). 여기서 레인(Lane)1은 NIH3T3 대조구 세포이고, 레인 2는 파래 유래 올리고당을 처리한 NIH3T3 세포이며, 레인 3은 HeLa 대조구 세포이고, 레인 4는 파래 유래 올리고당을 처리한 HeLa 세포이며, 레인 5는 AGS 대조구 세포이고, 레인 6은 파래 유래 올리고당을 처리한 AGS 세포이다.

실험예3

파래 유래 올리고당의 항산화 효과 확인

(1) DPPH법에 의한 항산화 활성 측정

DPPH 용액은 100 ml 에탄올에 DPPH 16 mg을 녹인 후 증류수 100 ml를 혼합하여 Whatman filter paper No. 2에 여과시켜 만들었다. 이 용액 5 ml에 파래 추출물(파래를 열수 추출한 것임) 및 파래 유래 올리고당을 각각 100, 300 및 600μl 함유한 용액 1 ml를 혼합하여 30분 후에 분광광도계를 사용하여 528 nm에서 흡광도를 측정하였다 이때 대조구는 합성 항산화제인 BHT (butylated hydroxytoluene)를 0.005% 사용하여 동일한 방법으로 측정하였다. 전자공여능 효과는 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.

(2) NIH3T3, HeLa, AGS 세포의 지질과산화 농도 측정

NIH3T3, HeLa, AGS 세포의 지질과산화에 미치는 파래 유래 올리고당의 영향을 검토하기 위하여 실험에 제공될 세포수가 될 때까지 DMEM 배지를 매주 2-3회 교환해 주면서 confluency가 되는 시점까지 계대 배양하였다. 활성화된 세포를 2×0⁵개씩 각 배양 용기에 접종하여 세포성장이 배양기 표면의 70-80% 정도 되었을 때 DMEM 배양액으로 2회 세척한 다음 파래추출물(파래를 열수 추출한 것임)과 파래 유래 올리고당을 각각 250 μg/ml 농도로 첨가하여 96시간 배양 후의 세포를 각각 회수하여 파쇄시켜 Wong의 방법으로 TBARS를 측정하였다. 지질 과산화물 함량은 말론디알데하이드(malondialdehyde)를 nmol/mg 프로테인(protein)으로 나타내었다.

(3) 실험결과

DPPH법은 토코페롤(tocopherol), 아스코르베이트(ascorbate), 플라보노이드 (flavonoid)화합물, 방향족 아민류, 마일라드(Maillard)형 갈변 생성물질, 펩타이드(peptide) 등의 항산화 활성을 나타내는 생리활성 물질에 의해 환원됨으로서 짙은 자색이 탈색되는 정도에 따라 전자 공여능으로 항산화 효과를 측정하는 방법으로 가장 일반적인 것으로 잘 알려져 있다. 이러한 DPPH법에 의해 파래 유래 올리고당의 항산화 효과를 측정한 결과, 도6에 나타난 바와 같이 전자공여능(EDA%)은 파래 추출물 및 파래 유래 올리고당 무첨가구와 첨가구의 흡광도 차를 백분율로 나타낼 때 파래 추출물 및 파래 유래 올리고당 첨가 농도 증가에 따라 약간씩 증가하는 경향을 나타내었으나 큰 차이는 없었다. 이때 대조구로 사용한 0.005% BHT의 EDA(Electron donating ability)%는 43%로 나타났다. 따라서 파래 유래 올리고당의 항산화 효과는 시판 항산화제 BHT의 0.0022% 농도에 해당하였다. 여기서 Ent는 파래 추출물(Enteromorphaextracts)이고, PS는 파래유래 올리고당이다.

세포막은 자유라디칼 반응에 의해 산화되기 쉬운 불포화지방산을 많이 함유하고 있는 관계로 생체에서 일어나는 지질과산화 반응의 인 비트로(in vitro)실험계로 널리 이용되고 있다. 이러한 생체막의 불포화지방산은 활성산소와 같은 자유라디칼에 의하여 산화 반응이 개시되면서 연쇄적으로 진행되므로 세포막의 투과성을 항진시킬 뿐만 아니라 전반적인 세포독성을 초래하여 노화현상과 이에 따른 여러 가지 병리현상을 유도하는 것으로 알려져 있다. 도 7은 파래 유래 올리고당을 정상세포인 NIH3T3, 위암세포 및 자궁암 세포에 처리한 후 지질과산화 농도를 측정하여 나타낸 그래프인데, 도 7로부터 NIH3T3 세포에서는 파래 추출물을 처리한 경우는 3.8%가 감소하였으나, 파래 유래 올리고당을 처리한 경우는 19.8% 감소하였으며, 자궁암 HeLa 세포에서는 파래 추출물 처리시는 8.6% 감소하였으나, 파래 유래 올리고당 처리시에는 15.1% 감소하였고, 위암 AGS 세포에서는 파래 추출물 처리에 의해 5.5% 증가하였으나, 파래 유래 올리고당 처리에 의해서는 26.7% 감소한 것을알 수 있다. 이상의 결과로 볼 때 각 세포주에서 과산화지질 억제를 나타내는 항산화 효과는 파래추출물 보다는 파래 유래 신규 올리고당 처리에 의해 현저하게 증가되는 것으로 나타났다.

구체적인 실시예로 나타내지는 않았으나, 미역, 다시마, 톳 등을 포함한 녹조, 갈조, 홍조를 포함하는 해조류 추출물에 당 전이 효소를 처리하여 얻어지는 해조류 유래 올리고당도 파래 유래 올리고당과 동일한 효과를 가지는 것을 알 수 있었다.

이와 같이 본 발명에 따라 해조류에 당전이 효소를 처리하여 얻어지는 해조류 유래 올리고당은 강력한 항암효과 특히 위암세포와 자궁암세포를 사멸시키는 효과 즉 위암 세포주인 AGS와 자궁암 세포주인 HeLa에 대하여 세포사멸을 유발하는 항암효과를 나타내어, 암의 예방 및 치료에 현저한 효과가 있는 것과 아울러 항산화 작용에 의한 항산화 효과를 나타내는 것을 확인하였을 뿐만 아니라, 식용으로 사용하는 천연재료로부터 유래하는 것으로 인체에 무해한 것이므로 본 발명에 따른 해조류 유래 올리고당은 의약조성물, 기능성 식품, 화장료 조성물의 원료로서 이용될 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 해조류 유래 올리고당은 암을 예방하고 치료하는 치료제로서, 항산화제로서, 식품첨가제 등으로서 다양하게 사용될 수 있다.

본 발명은 상술한 특정의 바람직한 실시예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 그와같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 해조류 유래 올리고당, 상기 올리고당의 제조방법 및 사용방법은 다음과 같은 효과를 갖는다.

먼저, 본 발명에 따르면 우리의 일상생활에서 흔히 섭취 할 수 있으며 손쉽게 구입이 가능하면서도 안전성이 입증된 천연의 식용작물이므로 저렴한 비용으로 손쉽게 구입이 가능하면서도 안전성이 입증된 해조류를 미생물 유래의 당 전이 효소로 처리하는 2차 가공을 통해 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 얻을 수 있다.

또한 본 발명에 의한 해조류 유래 올리고당은 종래에 알려진 항암물질이 정상세포에 대하여 가지는 독성보다 약하면서도 동시에 항암효과를 갖는다. 특히 위암과 자궁암의 예방 및 치료에 효과를 가진다.

또한 본 발명에 의한 해조류 유래 올리고당은 항산화제로서 작용한다.

따라서, 본 발명의 항암효과를 가지는 해조류 유래 올리고당은 우수한 항암효과 및 항산화효과를 가지므로 각종 기능성 식품, 음료, 의약품 등에 첨가하여 용이하게 섭취하게 할 수 있을 뿐만 아니라 상기 해조류 유래 올리고당을 항암제, 항암효과 및 항산화 효과를 가지는 기능성 식품, 식품 첨가물, 화장품 또는 의약품의 기초 원료로서 이용할 수 있는 우수한 효과를 가진다.

Claims

해조류 추출물에 미생물 유래의 당 전이 효소를 처리하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 해조류 유래 올리고당.
제1항에서, 상기 해조류 추출물은 파래, 미역, 다시마 및 톳으로 구성된 그룹에서 선택되는 하나 이상의 추출물인 것을 특징으로 하는 해조류 유래 올리고당.
제1항에서, 상기 미생물 유래의 당 전이 효소는 무코르(Mucor)속(屬), 페니실리움(Penicillium)속, 사카로미세스 (Saccharomyces)속 등에 속하는 곰팡이나 효모 등을 비롯한 미생물을 영양배지에서 배양하여 얻어지는 배양물로 부터 유도된 α-글루코시다아제 ; 바실루스(Bacillus)속과 클렙시엘라(Klebsiella)속 등에 속하는 세균 배양물로부터 유도된 시클로말토덱스트린 글루카노 트랜스퍼라아제 ; 초고열성세균배양물로부터 유도된 4-α 글루카노트랜스퍼라아제 및 바실루스속과 아스페르길루스(Aspergillus)속에 속하는 세균과 진균 배양물로부터 유도된 α-아밀라아제를 포함하는 그룹에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 해조류 유래 올리고당.
제1항에서, 상기 해조류 추출물에 상기 당 전이 효소를 0.5~5 mg/L 처리하는 것을 특징으로 하는 해조류 유래 올리고당.
해조류로부터 추출액을 얻는 추출단계;

상기 추출단계를 거친 해조류 추출액에 미생물 유래의 당 전이 효소를 처리하는 효소처리단계;

상기 효소처리단계를 거친 해조류 추출액을 멸균하는 멸균단계; 및

상기 멸균단계를 거친 해조류 추출액으로부터 올리고당을 수득하는 수득단계를 포함하는 해조류 유래 올리고당 제조방법.
제5항에서, 상기 추출단계는 해조류로부터 염분을 제거하는 과정; 상기 염분이 제거된 해조류를 분쇄하는 과정; 상기 분쇄된 해조류를 추출하는 과정; 상기 추출물을 원심분리하는 과정; 및 상기 원심 분리된 상태에서 상등액만을 회수하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 해조류 유래 올리고당 제조방법.
제5항에서, 상기 효소처리단계는 상기 추출단계를 거친 해조류 추출액에 미생물유래의 당전이 효소를 0.5~5 mg/L 처리하는 과정; 및 상기 효소처리된 해조류 추출액을 50~90℃에서 1~3시간 반응시키는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 해조류 유래 올리고당 제조방법.
제5항에서, 상기 멸균단계는 당 전이 효소의 활성저해 및 살균을 위한 것으로 115-130℃에서 20-60분동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 해조류 유래 올리고당 제조방법.
제5항에서, 상기 수득단계에서 얻어지는 올리고당은 2 종류이상인 것을 특징으로 하는 해조류 유래 올리고당 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 해조류 유래 올리고당 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 포함하는 약학조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 해조류 유래 올리고당 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 포함하는 기능성식품.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 해조류 유래 올리고당 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 포함하는 화장료조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 해조류 유래 올리고당 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 항산화제로 사용하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 해조류 유래 올리고당 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 암 예방 또는 치료제로 사용하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 해조류 유래 올리고당 또는 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법으로 얻어지는 해조류 유래 올리고당을 식품첨가제로 사용하는 방법.