JP6909511B2 - カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物に関する。より具体的には、本発明は、カキを用いて機能性発酵物を製造し、前記機能性発酵物によって骨形成の促進、骨粗しょう症の予防及び治療効果に優れた、カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物に関する。

骨組織は、骨量（ｂｏｎｅ ｍａｓｓ）及び骨格の恒常性（ｓｋｅｌｅｔａｌ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）を維持するために、吸収と形成とが絶えず起こる動的な組織である。このような骨の再形成（ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）には、２つの特殊な機能を呈する細胞が関与する。

破骨細胞は骨を吸収するのに対し、造骨細胞は骨基質を合成して充填する役割を担う。よって、骨量はこのような細胞の相対的な機能に依存する。正常な成人は、骨吸収量と骨形成量との間で常に均衡が保たれている。

骨改造は、一定の周期を通じて起こり、局所的に狭い部位で起こることによって骨格系の構造が維持される。このような骨格系の構造と機能とは、全身的なホルモンと局所的な因子との間の複雑な相互作用によって調節される（Ｃａｎａｌｉｓ，Ｅ．，ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｔ．ａｎｄ Ｃｅｎｔｒｅｌｌａ，Ｍ．：Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８１：２７７−２８１（１９８８）、Ｒａｉｓｚ，Ｌ．Ｇ．：Ｈｏｒｍｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ Ｈａｒｄ Ｔｉｓｓｕｅ ＣＩＢＡ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ １３６，ｐｐ２２６−２３８，Ｗｉｌｅｙ，ＮＹ（１９８８））。

造骨細胞と破骨細胞との活性間の不均衡は、全体的な骨の減少（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）や増加（ｏｓｔｅｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）による骨格の異常として現れる。このような骨代謝の不均衡は、一次的に造骨細胞の機能の低下によるものであるのか、あるいは骨吸収の増加、すなわち、破骨細胞の活性度の強化によるものであるのか、という点については、様々な理論及び主張が提起されている。骨粗しょう症の要因としては、年齢の増加、栄養欠乏、運動不足、カルシウム摂取の不足、遺伝的要素、薬物服用、ホルモンの影響等が挙げられる（Ｒｙａｎ ＰＪ，Ｅｖａｎｓ Ｐ，Ｇｉｂｓｏｎ Ｔ，Ｆｏｇｅｌｍａｎ Ｉ．Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｂａｃｋ ｐａｉｎ：Ａ ｓｔｕｄｙ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ−ｐｈｏｔｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｂｏｎｅ ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．７：１４５５−１４６０（１９９２））。

骨代謝疾患のうち高齢社会で大きな問題として台頭している骨粗しょう症は、骨の化学的組成は大きく変化せずに、単位容積内の骨量が減少して、軽微な衝撃にも容易に骨折を起こす疾患である。老人、特に閉経後の女性の場合、エストロゲン（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）の分泌不足によりその発生頻度が最も高く現れることが知られている（Ｊｉｌｋａ ＲＬ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ｂｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ。Ｂｏｎｅ ２３：７５−８１（１９９８））。しかし、男性であっても老化によって骨質量が減少する傾向が現れる（Ｓｔｅｉｎ ＧＳ，Ｌｉａｎ ＪＢ，ｖａｎ Ｗｉｊｎｅｎ ＡＪ，Ｍｏｎｔｅｃｈｉｎｏ Ｍ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｗ．７６：５９３−６２９（１９９６））。

最近の２０年間、小学生及び中学生の骨折率は２倍以上増加しているのが実情である。骨代謝の不均衡による骨疾患の予防又は治療の側面で、若い頃から骨質量を高めることが非常に重要であり、このように骨の健康を維持することは、性別や年齢を問わず重要な問題である。

現在骨粗しょう症の予防及び治療に用いられている薬剤は、大半が骨吸収を抑制する作用を呈するため、既に進行した骨消失を完全に回復することができず、よって究極的な目標である骨粗しょう症の発生を完全に予防できないのが現状である。そこで、骨粗しょう症の予防と治療のための骨形成の増加に関する研究が最近注目されており、骨組織の再生能力に及ぼす影響等に対する科学的な接近が必要とされているのが実情である（Ｃｈｏ ＳＨ，Ｋｉｍ ＫＧ，Ｋｉｍ ＳＲ，Ｌｅｅ ＪＡ， Ｍｏｏｎ Ｈ，Ｈｗａｎｇ ＹＹ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ １７−ｅｓｔｒａｄｉｏｌ，ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ ａｎｄ ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ． Ｋｏｒｅａｎ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ．３９：１４９７−１５０６（１９９６），Ｂｏｏｎｅｎ Ａ，Ｂｒｏｏｓ Ｐ，Ｄｅｑｅｋｅｒ Ｊ．Ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｌｄｅｒｌｙ ｂｙ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｔｈｅｒａｐｙ（ｒｈＩＧＦ−Ｉ ｏｒ ｒｈＲＧＦ−）：ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｊ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２４２：２８５−２９０（１９９７））。

したがって、破骨細胞の活性抑制、造骨細胞の活性化を通じた骨形成促進効果に優れて、骨粗しょう症の発生を予防して抑制できる、骨健康の改善用組成物の開発が必要な実情である。

大韓民国公開特許第１０−２０１７−０１１６４０２号公報

本発明の目的は、カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、カキからの多量のタウリン及びビタミンと、海藻類からの天然ＧＡＢＡ（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）及び海藻オリゴ糖とを含有した、機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物を提供することにある。

本発明のさらなる他の目的は、破骨細胞の活性は抑制し、造骨細胞の活性は促進して骨形成効果を奏することができる、カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物を提供することにある。

本発明のさらなる他の目的は、骨粗しょう症の発生の予防及び抑制効果に優れた、カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物を提供することにある。

前記目的を達成するために、本発明の一実施例による、カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物は、カキ及び海藻類を発酵させた、カキ及び海藻類の発酵物から抽出してなる発酵抽出物を含み、前記発酵抽出物は、破骨細胞の活性は抑制し、造骨細胞の活性は促進して骨形成を促進することができる。

前記発酵抽出物は、タウリン及びＧＡＢＡ（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）を含む。

前記カキは、生のカキ、カキの加水分解液、カキの抽出濃縮液、及びこれらの混合物からなる群より選択されてもよい。

前記海藻類は、昆布、ヒジキ、ワカメ、茎ワカメ、天草、青海苔、布海苔、もずく、カプサアオノリ、及びこれらの混合物からなる群より選択されてもよい。

前記カキ及び海藻類の発酵物は、発酵微生物を用いて発酵させたものであり、前記発酵微生物は、乳酸菌、酵母、及びこれらの混合物からなる群より選択されてもよい。

本発明の他の一実施例による、カキを用いた機能性発酵物を含む薬学組成物は、前記骨健康の改善用組成物を含んでもよい。

本発明のさらなる他の一実施例による、カキを用いた機能性発酵物を含む食品組成物は、前記骨健康の改善用組成物を含んでもよい。

本発明によれば、カキからの多量のタウリン及びビタミンを含有し、海藻類からの天然ＧＡＢＡ（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）及び海藻オリゴ糖を含有する、カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物を提供することができる。

また、本発明によれば、破骨細胞の活性は抑制し、造骨細胞の活性は促進して骨形成を促進することができ、骨粗しょう症の発生の予防及び抑制効果に優れた、カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物を提供することができる。

本発明の一実施例による骨健康の改善用組成物が、破骨細胞の分化に及ぼす影響についての結果である。 本発明の一実施例による骨健康の改善用組成物が、破骨細胞の分化と関連したタンパク質の発現に及ぼす影響についての結果である。 本発明の一実施例による骨健康の改善用組成物が、破骨細胞の分化過程で生成される酸化的ストレスに及ぼす影響についての結果である。 本発明の一実施例による骨健康の改善用組成物による活性酸素（ＲＯＳ）の生成抑制に基づく、破骨細胞に関連したタンパク質の発現変化についての結果である。 本発明の一実施例による骨健康の改善用組成物が、造骨細胞に及ぼす影響（ＭＴＴアッセイ）についての結果である。 本発明の一実施例による骨健康の改善用組成物が、造骨細胞の形成に必要な必須遺伝子の発現に及ぼす影響についての結果である。 本発明の一実施例による骨健康の改善用組成物が、造骨細胞の形成に必要な必須遺伝子の発現に及ぼす影響についての結果である。 本発明の一実施例による骨健康の改善用組成物による、Ａｌｐ活性化についての結果である。 本発明の一実施例による骨健康の改善用組成物による、ゼブラフィッシュ発生ステップにおける骨形成の促進についての結果である。 本発明の一実施例による骨健康の改善用組成物による、ゼブラフィッシュ発生ステップにおける骨形成の促進についての結果である。 本発明の一実施例による骨健康の改善用組成物についての、Ｍｉｃｒｏ−ＣＴを用いて得られた３次元画像イメージの結果である。 本発明の一実施例による骨健康の改善用組成物についての、脛骨の骨形質変数に対する効果の結果である。

以下、本発明についてより詳細に説明する。

本発明の一実施例によるカキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物は、カキ及び海藻類を発酵させた、カキ及び海藻類の発酵物から抽出した発酵抽出物を含み、前記発酵抽出物は、破骨細胞の活性は抑制し、造骨細胞の活性は促進して骨形成を促進することができる。

前記カキ及び海藻類を発酵させた発酵物を用い、発酵抽出物を製造して骨健康の改善のための用途として用いることができる。

より具体的には、カキからタウリン（ｔａｕｒｉｎｅ）を抽出し、海藻類から海藻オリゴ糖及び天然ＧＡＢＡを抽出して、前記タウリン、海藻オリゴ糖、及び天然ＧＡＢＡを主成分として含む骨健康の改善用組成物に関するものである。

また、本発明の骨健康の改善用組成物は、発酵工程により、海藻臭さ及び生臭さが除去され、食用時の味及び香りが卓越した組成物である。

前記カキ（Ｏｙｅｓｔｅｒ）は、グリコーゲン、ビタミン、タンパク質等の各種栄養素が含まれており、チロシン、グルタミン酸等の１８種以上のアミノ酸及びタウリン等の機能性物質だけでなく、鉄分、ヨード等の必須無機質等が豊富な完全食品として認識されており、世界１０大水産物として広く用いられてきた。韓国トンヨンをはじめとする南海岸で大量に養殖されているカキは、１９６０〜７０年代の経済開発の初期に主な輸出品であったが、最近では中国産カキが世界市場を急速に占めており、冷凍又は単純加工品の形態で流通している。

前記海藻類は、その機能性と共に需要が拡大しており、特に豊富なミネラル及び機能性多糖類により、抗菌、抗酸化、抗ウイルス、抗癌活性をはじめとして、動脈硬化、心筋梗塞、高血圧、狭心症、脳卒中等の生活習慣病の予防に効果的であるという報告と共にその潜在的な可能性が浮び上がってきている。その中でも、昆布は、カキと共にＧＡＢＡの前駆物質であるグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）を多量に含有した天然原料であり、高濃度の天然ＧＡＢＡを生産するための従来の生産方法に用いられるＭＳＧ（化学的合成品）を人為的に添加することなく、発酵工法によって昆布由来の高濃度の天然ＧＡＢＡを生産することができる。

それと共に、微生物による発酵過程でフコイダン（Ｆｕｃｏｉｄａｎ）等の高分子機能性海藻多糖類の低分子化を通じて、褐藻類由来のフコース（Ｆｕｃｏｓｅ）等の単糖類と機能性低分子オリゴ糖とを同時に含有する。

それのみならず、海藻類は、アミノ酸（Ｇｌｕｔａｍｉｃ Ａｃｉｄ及びＡｓｐａｒｔｉｃ Ａｃｉｄ等）を多量に含有しており、高機能性の天然素材として脚光を浴びている海藻オリゴ糖（Ｆｕｃｏｉｄａｎ等）も豊富であって、理想的な天然食品として認識されているだけでなく、様々なミネラル、ビタミン等が豊富に含まれており、最近、海藻類の生理効用性に関する国内、国外の専門家の活発な研究の結果、海藻類がダイエット作用、整腸作用による便秘治療、重金属及び放射能物質の体外排出作用等に深く関与することが明らかになっている。そして、フコイダンと称される含硫黄多糖類の場合は、抗菌、抗酸化、抗ウイルス、抗癌活性をはじめとして、動脈硬化、心筋梗塞、高血圧、狭心症、脳卒中等の成人病の予防に効果的であると報告されている。

しかし、海藻類及びカキのような海洋資源の利用は、その大半が単純乾燥等の一次加工品や飼料として用いられることに留まっている。上記のように単純乾燥等の一次加工品や飼料としてのみ用いられる場合には、海藻類及びカキのような海洋資源に存在する各種の生理活性物質を最大限に利用することができないという問題があるだけでなく、豊富なビタミンや無機質等の天然成分をそのまま維持することができないという問題がある。

そこで、本発明においては、海藻類及びカキを発酵させ、カキ及び海藻類の発酵物から抽出した発酵抽出物を用いることにより、海藻類及びカキに存在する各種の生理活性物質を最大限に利用することができ、豊富なビタミンや無機質等の天然成分がそのまま維持され得る。

ＧＡＢＡ（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）は、分子量が１０３．２で、融点が約２０２℃と比較的熱に安定しており、Ｃ_４Ｈ_９ＮＯ_２の分子式を有し、水に対する高い溶解性を有する非タンパク質性アミノ酸の一種で、哺乳動物の脳や脊髄に存在する興奮抑制性神経伝達物質（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）である。ＧＡＢＡは、人体の多くの生理的なメカニズムの調節に関与して脳の血流を活発にし、酸素供給量を増加させて脳細胞の代謝機能を亢進させる作用を呈することが知られている。

また、ＧＡＢＡは、成長ホルモンの分泌調節にも関与し、血圧降下及び痛みの緩和、精神安定作用、肝臓、腎臓機能の改善作用、大腸癌の抑制作用等の様々な生理調節作用に関与することが知られており、薬理的に非常に注目される物質である。しかし、一般に食品等を通じて摂取されるタウリン及びＧＡＢＡの量はそれほど多くはないため、薬理作用を発揮するための必要量を食品から摂取するのは容易ではない。

そこで、本発明では、自然摂取では量的制限を有したタウリン及びＧＡＢＡを、生理活性が期待される量まで高めて摂取することができるように、カキ及び海藻類内に存在するグルタミン酸をＧＡＢＡに大量転換しつつも、グルタミン酸以外のタウリンのような機能性物質には影響を与えない発酵菌株を用いて、発酵工法による人体に有用なフコイダン等の高分子海藻多糖類を低分子化し、カキ及び海藻類の抽出加工時に必然的に発生する海藻臭さ及び生臭さ等の異味、異臭を除去することにより、従来の機能性食品素材としての嗜好性を維持したまま、多量のタウリンと天然ＧＡＢＡ及び低分子海藻オリゴ糖をはじめとする海藻ミネラルとを含有する機能性発酵物を調製し、これを骨健康の改善用組成物として提供する。

本発明に用いられるカキ及び海藻類は、水洗、脱塩、粉砕の前処理工程が同一であり、カキとしては、生のカキ、カキの加水分解液、又はカキの抽出濃縮液を用いることができる。カキ、海藻類、又はこれらの混合物が３０％（ｖ／ｖ）を超過する場合には、カキ及び海藻類の塩分が最終組成物の味に影響を及ぼすため、カキ、海藻類、又はこれらの混合物は、１０％〜３０％（ｖ／ｖ）が好適である。

より詳しくは、カキ、カキの加水分解液、カキの抽出濃縮液、及び海藻類を発酵源として単独で用いる場合には、これらを全体重量の１０％〜３０％（ｖ／ｖ）となるように調整する。これらの混合物を発酵源として発酵する場合には、カキ、カキの加水分解液、又はカキの抽出濃縮液と海藻類とを選択的に混合して１０％〜３０％（ｖ／ｖ）で添加する際に、カキ、カキの加水分解液、又はカキの抽出濃縮液と海藻類との比率が１：２〜２：１の範囲となるように選択的に用いることが好ましい。

前記カキは、生のカキ、カキの加水分解液、カキの抽出濃縮液、及びこれらの混合物からなる群より選択することができる。

前記カキの加水分解液は、前処理されたカキに水を混合した後、５０℃〜７０℃で攪拌しながらアルカラーゼを添加して加水分解するステップ、前記加水分解されたカキの残渣を４０メッシュ〜２００メッシュの振動ふるいで除去し、カキの加水分解液を回収するステップ、及び前記回収されたカキの加水分解液を孔径（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）が０．０５μｍ〜０．１μｍのモジュールを有する外部循環式減圧型分離膜を用いて水溶性物質のみを精密濾過するステップを含む製造方法により製造できる。

前記精密濾過するステップの後、精密濾過された加水分解液を容易に添加することができるように包装するステップを追加することができる。

前記カキの抽出濃縮液は、カキを水洗、脱塩、粉砕の方法で前処理するステップ、前記前処理されたカキに水を混合して７０℃〜９０℃で２０分〜６０分間撹拌しながら抽出するステップ、前記抽出されたカキの残渣を４０メッシュ〜２００メッシュの振動ふるいで除去し、カキの抽出液を回収するステップ、前記抽出が完了したカキの抽出液を孔径（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）が０．０５μｍ〜０．１μｍのモジュールを有する外部循環式減圧型分離膜を用いて水溶性物質のみを精密濾過するステップ、及び前記精密濾過されたカキの抽出液を３０℃〜５０℃で減圧してｂｒｉｘが２０％〜４０％になるように濃縮するステップを含む製造方法により製造できる。

前記濃縮するステップの後、濃縮された濃縮液を容易に添加することができるように包装するステップを追加することができる。

カキの加水分解液及び抽出濃縮液は、精密濾過装置である「外部循環式減圧型分離膜装置」を用いて精密濾過工程を経ることによって、０．０５μｍ〜０．１μｍの水溶性物質のみが濾過されて発酵工程に用いられ、前記濾過システムでは濾過過程で外部の露出が防止されるので、濾過時に発生する香味の損失を最小化することができる。

また「外部循環式減圧型分離膜システム」は、外部の環境から隔離された膜分離工程として、既存の加圧式工程とは異なり、濾過液が出てくる部分に自吸式ポンプを付着して減圧式で７０ｍｍＨｇ〜４００ｍｍＨｇの間のマイルドな条件で運転することにより、圧力に応じた膜の負担を最小化させるだけでなく、濾過液放出部から自吸式ポンプで液を吸入して濾過するため、ポンプと濃縮液とが直接的に接触することがなく、常に低圧で運転し、別途の濃縮タンクが必要でなく、配管、バルブ、及びシステムの費用が最小化されて非常に経済的である。

また、各々のメンブレイン（モジュール）の下端から持続的に空気を放出して膜の外部表面に吸着される汚染物質を持続的に落下させるように設計することによって、濾過工程が進行するにつれて膜の汚染が加速されず、持続的に安定した透過性が付与されるという長所を有し、また濾過液を分画に分離して製造することができる。

本発明のカキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物は、
（１）カキ、カキの加水分解液、又はカキの抽出濃縮液、及び前処理された海藻類を、全体重量の１０％〜３０％（ｖ／ｖ）になるように水を混合して滅菌し、３０℃〜３７℃まで冷却して培地を準備するステップ、
（２）前記培地に発酵微生物として乳酸菌、酵母、又はこれらを混合して接種した後に、発酵させるステップ、
（３）発酵が終了した発酵液を高温加圧滅菌し、発酵期間中に対数的に増殖した発酵微生物を死滅させるステップ、及び
（４）滅菌された発酵液から、０．０５μｍ〜０．１μｍ以下のきれいで清潔な水溶性物質のみを精密濾過するステップ
を順に実施して製造することができる。

前記海藻類は、昆布、ヒジキ、ワカメ、茎ワカメ、天草、青海苔、布海苔、もずく、カプサアオノリ、及びこれらの混合物からなる群より選択することができる。

本発明の骨健康の改善用組成物は、前記生のカキ又は海藻類を、単独でもしくは混合して全体重量の１０％〜３０％（ｖ／ｖ）となるように添加し、１１５℃〜１２５℃にて１５分〜２０分間高温で加圧して滅菌した後、３０℃〜３７℃まで冷却し、さらに発酵微生物として乳酸菌及び酵母を、単独で又は混合して１％〜５％（ｖ／ｖ）となるように接種して２日〜７日間発酵することによって製造することができる。このようにして製造される改善用組成物は、多量のタウリンと、天然ＧＡＢＡ及び海藻オリゴ糖をはじめとするミネラル等とを含有する。

本発明の骨健康の改善用組成物は、前記カキ加水分解液又は海藻類を、単独でもしくは混合して全体重量の１０％〜３０％（ｖ／ｖ）となるように添加し、１１５℃〜１２５℃にて１５分〜２０分間高温で加圧して滅菌した後、３０℃〜３７℃まで冷却し、さらに発酵微生物として乳酸菌及び酵母を、単独で又は混合して１％〜５％（ｖ／ｖ）となるように接種して２日〜７日間発酵することによって製造することができる。このようにして製造される改善用組成物は、多量のタウリンと、天然ＧＡＢＡ及び海藻オリゴ糖をはじめとするミネラル等とを含有する。

本発明の骨健康の改善用組成物は、前記カキの抽出濃縮液又は海藻類を、単独でもしくは混合して全体重量の１０％〜３０％（ｖ／ｖ）となるように添加し、１１５℃〜１２５℃で１５分〜２０分間高温で加圧して滅菌した後、３０℃〜３７℃まで冷却し、さらに発酵微生物として乳酸菌及び酵母を、単独で又は混合して１％〜５％（ｖ／ｖ）となるように接種して２日〜７日間発酵することによって製造することができる。このようにして製造される改善用組成物は、多量のタウリンと、天然ＧＡＢＡ及び海藻オリゴ糖をはじめとするミネラル等とを含有する。

本発明のカキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物によれば、破骨細胞の大きさを減少させることができ、破骨細胞の数を濃度依存的に抑制することができる。破骨細胞は骨吸収過程の間骨格形成を行い、骨に付着をしつつ、一般的な細胞外空間を区分するために破骨細胞のアクチン（ａｃｔｉｎ）が１つの大きなリング（ｒｉｎｇ）に組織化されるため、アクチンリング（ａｃｔｉｎ ｒｉｎｇ）の形成は、破骨細胞の骨吸収能力に関する重要な標識である。分化した破骨細胞に対して、本発明の改善用組成物は、濃度依存的にアクチンリングの形成を抑制することができる。

また、本発明のカキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物によれば、破骨細胞の分化と関連したタンパク質の発現を抑制することができる。

本発明のカキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物によれば、造骨細胞の形成にとっての必須遺伝子であるＡｌｐ、ＲＵＮＸ_２、Ｃｏｌ１ａ１、ＯＳＸ、Ｂｇｌａｐ、ＢＭＰ_２、ＢＭＰの発現が強力に増加する。また、骨形成にとっての核心因子であるＡｌｐ活性が増加する。

それのみならず、本発明のカキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物によれば、骨密度減少の抑制効果に優れており、骨破壊を防止することができる。また、骨のミネラル含量（ＢＭＤ、ｂｏｎｅ ｍｉｎｅｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）、相対的な骨量（ＢＶ／ＴＶ、ｂｏｎｅ ｖｏｌｕｍｅ／ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｖｏｌｕｍｅ）、骨梁幅（Ｔｂ．Ｔｈ（ｍｍ）、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）、骨梁数（Ｔｂ．Ｎ（１／ｍｍ）、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｎｕｍｂｅｒ）、及び骨梁中心距離（Ｔｂ．Ｓｐ（ｍｍ）、ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｓｐａｃｉｎｇ）に対する数値が向上する。

前記発酵ステップで用いられる乳酸菌及び酵母の一例として、ラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＢＪ２０（菌株寄託番号：ＫＣＴＣ １１３７７ＢＰ）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＢＰ−２７を挙げることができる。

前記菌株の場合、海藻臭さ等の異味、異臭の除去に優れた効果を示すことの確認が可能で、抗酸化及び抗高血圧効果に優れた機能性発酵物の製造に優れた効果を示す。

ただし、前記乳酸菌及び酵母を用いて発酵物を製造する場合、抗酸化及び抗高血圧に優れた効果があることが確認されたものの、骨健康に影響を及ぼす破骨細胞の活性を抑制し、造骨細胞の活性を促進して骨形成を促進する点については大きな効果を示さないことが実験によって確認された。

そこで、本発明においては、乳酸菌及び酵母として、ラクトバチラス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＪＳ（菌株寄託番号：ＫＣＣＭ １０４９９）及びアスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｕｓａｍｉｉ）を用いることができる。

前記菌株の場合、海藻臭さ等の異味、異臭の除去に優れた効果を示すことの確認が可能で、骨健康に影響を及ぼす破骨細胞の活性を抑制し、造骨細胞の活性を促進して骨形成を促進する点についても大きな効果を示すことが確認された。

本発明の他の一実施例による薬学組成物は、前記カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物を含むことができる。

本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容可能な担体を含む組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、及び坐剤からなる群より選択される、経口又は非経口の様々な剤形であってもよい。

製剤化する場合には、通常用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤、及び／又は賦形剤を用いて調製される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は、少なくとも１つの化合物に、少なくとも１つの賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース又はラクトース、ゼラチン等を混合して調製される。

また、単なる賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の潤滑剤も用いることができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当し、多用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に、様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等を含めることができる。

非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、坐剤等が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイル等の植物性オイル、オレイン酸エチル等の注射可能なエステル等を用いることができる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチン等を用いることができる。

本発明のさらなる他の一実施例による食品組成物は、前記カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物を含むことができる。

本発明に係る骨健康の改善用組成物は、人体に対する毒性が全くないため、長期的に摂取可能であり、健康機能食品として用いることもできる。健康機能食品として製造する場合、飲料、スナック及び製菓、製パン類、おかゆ、並びにスープ類に含まれた形態が可能であるが、これらに限定されるものではない。

すなわち、本発明に係る骨健康の改善用組成物を、通常の甘味剤、ビタミン類、アミノ酸類、ミネラル類、有機酸類、芳香剤、及び／又は防腐剤等と共に溶解させて、水溶液、水懸濁液、又は通常の服用形態の剤形に製造すれば、脳細胞の代謝促進及び血流促進と共に、不足した栄養素を補充できる優れた健康食品を製造することができる。

したがって、前記海藻抽出発酵液又は海藻発酵粉末を主成分として含有し、必要に応じて生薬エキス、ビタミン類、アミノ酸類、甘味剤、ミネラル類、有機酸類、芳香剤、果汁及び防腐剤等から選択される１種以上の補助成分を添加し、これに水を適当量で加えて滅菌するか、又は通常の服用形態の剤形として、新規な食品を提供することができる。

本発明で使用できる補助成分は、通常当業者が使用可能な成分を意味し、これらに限定されるものではない。

好ましくは、本発明の食品組成物は、嗜好度を高めるために、ネムノキ抽出物及び甘草抽出物をさらに含むことができる。

前記ネムノキ抽出物及び甘草抽出物をさらに含む場合、ネムノキ抽出物及び甘草抽出物により、微細に残存する海藻臭さ等の異味、異臭を除去することができる。また、甘草の甘みにより、嗜好性の高い食品組成物を提供することができる。ただし、甘草のみを用いる場合に比べて、ネムノキ抽出物を混合して用いる場合には、甘草固有の甘みを上昇させることができる。

前記ネムノキは、夫婦の相性を象徴する木であって、ネブノキ、カウカギ、コウカ、ネブタノキとも言われる。このことから、山や野原に生息する樹木を、庭木として多く植えてきた。手斧の取手を作るのに用いられる木であったために手斧木とも呼ばれ、牛がよく食べるので牛米と呼ぶ所もある。

また、樹幹は曲がるか又は若干横向きになる。高さ３ｍ〜５ｍであり、大きい枝がまばらに広がり、小さい枝には稜線がある。冬芽の芽鱗（冬芽を包んでいる固い鱗片）は２個〜３個あるが、ほぼ見当たらないほど小さい。葉は互生し、２回羽状複葉である。小さい葉は鎌のように曲がり、左右同一でない長い楕円形であり、エッジがのっぺりとしている。小さい葉の長さは６ｍｍ〜１５ｍｍ程度、幅は２．５ｍｍ〜４．０ｍｍ程度であり、両面に毛がないか又は裏面の脈上に毛がある。

花は薄いピンク色で６月又は７月に咲き、小さい枝の端に１５個〜２０個ずつ傘形についている。萼と花冠は浅く５個に分かれ、緑色を帯びる。雄蕊は２５個程度であって、長く外に出て上部が紅色である。花が紅色に見えるのは雄蕊の色のためである。実は９月末から１０月初めに熟し、扁平な鞘であり、長さが１５ｃｍ前後で５個又は６個の種子が入っている。特異な点は、センシティブプラントやミモザは外部の刺激によって葉が互いにくっついてしまうが、ネムノキは日が暮れると広げられた葉が互いに向き合って折り畳まれる。

甘草は、豆科植物に属する多年生草本であって、アジア系で漢方薬として多用される薬用植物として知られている。甘草の主成分としては、ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉｎが知られており、ｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ及びｉｓｏｌｉｑｕｉｒｉｔｉｎ等のフラボノイド配糖体、そしてイソフラボノイドであるｌｉｃｏｒｉｃｉｄｉｎ等が報告されている。甘草は、抗酸化、免疫増強、及び抗菌効果等を発現すると報告されている。

より好ましくは、本発明の食品組成物は機能性食品組成物であって、前記カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物を含み、前記骨健康の改善用組成物１００重量部に対して、ネムノキ抽出物５重量部〜１０重量部及び甘草抽出物５重量部〜１０重量部を含むことができる。前記範囲内に調整することにより、微細に残存する海藻臭さ等の異味、異臭を除去することができる。また、甘草の甘みにより、嗜好性の高い食品組成物を提供することができる。ただし、甘草のみを用いる場合に比べて、ネムノキ抽出物を混合して用いる場合には、甘草固有の甘みを上昇させることができる。

以下、本発明が属する技術分野で通常の知識を有した者が容易に実施できるように、本発明の実施例について詳細に説明する。ただし、本発明は種々の互いに異なる形態として実現できるものであって、ここで説明する実施例に限定されるものではない。

［製造例１：骨健康の改善用組成物の製造］
１．生のカキ及びヒジキを用いた骨健康の改善用組成物（以下、ＦＯと記載する）の製造
生のカキ及びヒジキに対して水洗並びに脱塩を行い、不純物及び塩を除去した。その後乾燥し、粉砕して、カキ及びヒジキの混合粉砕物を製造した。

前記カキ及びヒジキの混合粉砕物を、全体重量の１０％〜３０％（ｖ／ｖ）となるように水と混合した後、１２１℃で１５分間滅菌して雑菌を除去した。これを、発酵適正温度である３０℃〜３７℃まで冷却した。

発酵菌株としてラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＢＪ２０（寄託番号：ＫＣＴＣ １１３７７ＢＰ）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＢＰ−２７を混合して接種し、３０℃〜３７℃で発酵させた。このとき、発酵微生物を全体重量の１％〜５％（ｖ／ｖ）となるように接種し、発酵微生物による発酵が充分に行われるように２日〜７日間発酵させた。発酵が終了した発酵液を、１２１℃で１５分〜２０分間に亘って高温加圧滅菌し、発酵期間中に対数的に増殖した発酵微生物を死滅させた。滅菌された発酵液から、０．０５μｍ〜０．１μｍ以下の水溶性物質のみを精密濾過し、きれいで清潔な発酵液のみを分取した。精密濾過された発酵液を、噴霧乾燥又は凍結乾燥等の方法で乾燥した後に粉砕し、粉末化した。

２．カキの加水分解液及びヒジキを用いた骨健康の改善用組成物の製造
２−１．カキの加水分解液の製造工程
使用するカキを水洗、脱塩、及び粉砕し、酵素によって容易に加水分解するように準備した。前処理されたカキと水とを１：１で混合し、５０℃〜７０℃で２０分〜６０分間撹拌しながら、０．２％（ｖ／ｖ）のアルカラーゼを添加して加水分解した。加水分解されたカキの残渣を４０メッシュ〜２００メッシュの振動ふるいで除去し、カキの加水分解液を回収した。回収されたカキの加水分解液から、孔径（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）が０．０５μｍ〜０．１μｍのモジュールを有する外部循環式減圧型分離膜を用いて水溶性物質のみを精密濾過した。

２−２．骨健康の改善用組成物の製造
ヒジキに対して水洗及び脱塩を行い、不純物及び塩を除去した。その後乾燥し、粉砕して、ヒジキの粉砕物を製造した。このヒジキの粉砕物と前記２−１．のカキの加水分解液とを混合した。

前記カキの加水分解液とヒジキの粉砕物との混合物を、全体重量の１０％〜３０％（ｖ／ｖ）となるように水と混合した後、１２１℃で１５分間滅菌して雑菌を除去した。これを、発酵適正温度である３０℃〜３７℃まで冷却した。

発酵菌株としてラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＢＪ２０（寄託番号：ＫＣＴＣ １１３７７ＢＰ）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＢＰ−２７を混合して接種し、３０℃〜３７℃で発酵させた。このとき、発酵微生物は全体重量の１％〜５％（ｖ／ｖ）となるように接種し、発酵微生物による発酵が充分に行われるように２日〜７日間発酵させた。発酵が終了した発酵液を、１２１℃で１５分〜２０分間に亘って高温加圧滅菌し、発酵期間中に対数的に増殖した発酵微生物を死滅させた。滅菌された発酵液から、０．０５μｍ〜０．１μｍ以下の水溶性物質のみを精密濾過し、きれいで清潔な発酵液のみを分取した。精密濾過された発酵液を、噴霧乾燥又は凍結乾燥等の方法で乾燥した後に粉砕し、粉末化した。

３．カキの抽出濃縮液及びヒジキを用いた骨健康の改善用組成物の製造
３−１．カキの抽出濃縮液の製造工程
使用するカキを水洗、脱塩、及び粉砕し、容易に抽出するように準備した。前処理されたカキに１０倍〜２０倍量の水を混合し、７０℃〜９０℃で２０分〜６０分間撹拌しながら抽出した。抽出されたカキの残渣を４０メッシュ〜２００メッシュの振動ふるいで除去し、カキの抽出液を回収した。回収されたカキの抽出液から、孔径（ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）が０．０５μｍ〜０．１μｍのモジュールを有する外部循環式減圧型分離膜を用いて水溶性物質のみを精密濾過した。精密濾過されたカキの抽出液を３０℃〜５０℃で減圧し、ｂｒｉｘが２０％〜４０％となるように濃縮した。

３−２．骨健康の改善用組成物の製造
ヒジキに対して水洗及び脱塩を行い、不純物及び塩を除去した。その後乾燥し、粉砕して、ヒジキの粉砕物を製造した。このヒジキの粉砕物と前記３−１．のカキの抽出濃縮液とを混合した。

前記カキの抽出濃縮液とヒジキの粉砕物との混合物を、全体重量の１０％〜３０％（ｖ／ｖ）となるように水と混合した後、１２１℃で１５分間滅菌して雑菌を除去した。これを、発酵適正温度である３０℃〜３７℃まで冷却した。

発酵菌株としてラクトバチラス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）ＢＪ２０（寄託番号：ＫＣＴＣ １１３７７ＢＰ）及びサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＢＰ−２７を混合して接種し、３０℃〜３７℃で発酵させた。このとき、発酵微生物を全体重量の１％〜５％（ｖ／ｖ）となるように接種し、発酵微生物による発酵が充分に行われるように２日〜７日間発酵させた。発酵が終了した発酵液を、１２１℃で１５分〜２０分間に亘って高温加圧滅菌し、発酵期間中に対数的に増殖した発酵微生物を死滅させた。滅菌された発酵液から、０．０５μｍ〜０．１μｍ以下の水溶性物質のみを精密濾過し、きれいで清潔な発酵液のみを分取した。精密濾過された発酵液を、噴霧乾燥又は凍結乾燥等の方法で乾燥した後に粉砕し、粉末化した。

［実験例１：破骨細胞の活性抑制］
１．破骨細胞の培養及び分化
本研究に用いられたマウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞を、細胞培養のために、１０％ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）と１％ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎとを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉａ（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて、ＣＯ_２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ（３７℃、５％ ＣＯ_２）で培養した。

ＲＡＷ２６４．７を破骨前駆細胞にして、１０％ ＦＢＳが添加されたα−ＭＥＭ培地に、分化因子であるＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）に生のカキ及びヒジキを用いた骨健康の改善用組成物（ＦＯ）を０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬの濃度となるように混合した培養液を、分株して２日ごとに培地を交換しながら５日間培養した。

２．破骨細胞の生成の測定
ＲＡＷ２６４．７細胞をＤＭＥＭに２４時間安定化させた後、α−ＭＥＭに、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）とＦＯを０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬの濃度別に添加して分株した。５日目に、ＴＲＡＰ溶液で染色してＴＲＡＰ陽性細胞を破骨細胞と認めた。染色された破骨細胞のうち３個以上の核を含有する細胞の個数を統計に利用した。

３．Ａｃｔｉｎ Ｒｉｎｇの形成の測定
ＲＡＷ２６４．７細胞にＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）を処理して破骨細胞に分化させた後、α−ＭＥＭに培養しつつＦＯを０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬの濃度別に処理した。成熟した破骨細胞をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８が結合されたｐｈａｌｌｏｉｄｉｎで染色させた後、３０分間に亘ってＤＡＰＩで染色した。Ａｃｔｉｎ ｒｉｎｇとＤＡＰＩ染色は蛍光顕微鏡で観察した。

４．ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）分析
ＲＡＮＫＬによるシグナル伝達過程を観察するために、ＲＡＷ２６４．７細胞をｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ｔｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｆｌｕｏｒｉｄｅ、１ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｖａｎａｄａｔｅ、１％ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、及びｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）で溶解した。全体溶解物を遠心分離（１４０００ｒｐｍ、３０分間）して上清を得た。定量後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離してＰＶＤＦ膜に移した後、特定抗体を用いて反応させ、タンパク質の発現量を、ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｚｅｒを用いて確認した。

５．細胞内ＲＯＳの生成の測定
ＲＡＷ２６４．７細胞を５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに分株して２４時間安定化させた後、ＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）により分化誘導して、ＦＯ濃度別に処理した。これを５日間培養した後、１０μＭ ＤＣＦ−ＤＡを処理して３７℃で３０分間染色した後、Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを用いて測定した。

６．ＦＯが、ＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞の分化に及ぼす影響（図１）
ＲＡＷ２６４．７細胞にＲＡＮＫＬを処理して破骨細胞への分化を誘導させ、様々な濃度（０μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ、４００μｇ／ｍＬ、６００μｇ／ｍＬ）のＦＯを処理して、破骨細胞の分化及び生成におけるＦＯの効果を測定した。破骨細胞をＴＲＡＰ染色して顕微鏡で観察した結果、ＦＯの濃度が増加するほど、ＴＲＡＰ陽性細胞の大きさが減少するのを確認することができた（図１の（ａ））。そして、ＴＲＡＰ陽性細胞数を測定した結果、同様に濃度依存的に抑制されるのが観察された（図１の（ｂ）及び（ｃ））。破骨細胞は、骨吸収過程の間骨格形成を行い、骨に付着をしつつ、一般的な細胞外空間を区分するために破骨細胞のａｃｔｉｎが１つの大きなｒｉｎｇに組織化されるため、ａｃｔｉｎ ｒｉｎｇの形成は、破骨細胞の骨吸収能力に関する重要な標識である。分化した破骨細胞にＦＯを濃度別に処理してａｃｔｉｎ ｒｉｎｇの形成を観察した結果、濃度依存的に形成が抑制されるのが確認された（図１の（ｄ））。

７．ＦＯが、破骨細胞の分化と関連したタンパク質の発現に及ぼす影響（図２）
ＲＡＷ２６４．７細胞にＲＡＮＫＬ（１００ｎｇ／ｍＬ）を用いて破骨細胞の形成を誘導した後、ＦＯによる分化関連のタンパク質の発現を比較した。ＲＡＮＫＬによるシグナル伝達体系において重要なシグナル伝達因子であるＴＲＡＦ６及びｃ−Ｓｒｃの発現がＦＯ濃度依存的に減少し、また、ＰＩ３Ｋのリン酸化が調節されることが分かった。そして、破骨細胞の分化過程で、ＲＡＮＫＬがＩκＢ−αの発現を増加させ、ｐ６５の核移行（ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）を促進させる反面、ＦＯ処理群では抑制されるのが確認された。ＦＯが、破骨細胞の分化過程での必須転写因子であるＮＦ−ｋＢ ｐａｔｈｗａｙを抑制させることが分かる。

８．ＦＯが、破骨細胞の分化過程で生成される酸化的ストレスに及ぼす影響（図３）
ＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞の分化過程で、細胞内酸化的ストレスが発生することが知られている。よって、ＲＡＮＫＬ誘導ＲＯＳの生成に及ぼすＦＯの影響を、ＤＣＦ−ＤＡ染色を通じて確認した。ＲＡＮＫＬ処理された破骨細胞において増加したＲＯＳが、ＦＯ処理群では顕著に減少した。このような現象は、抗酸化剤であるＮＡＣにおいても同様に観察されるのを、顕微鏡を用いて確認した。

９．ＦＯによるＲＯＳの生成抑制に基づく、破骨細胞に関連したタンパク質の発現変化（図４）
ＮＡＤＰＨ ＯｘｉｄａｓｅはＲＯＳの主な要素の１つであり、ＮＯＸｓ構成員のうちの破骨細胞の生成に関与するＮＯＸ１と、調節タンパク質であるＲａｃ１との発現が、ＦＯ濃度依存的に減少した。破骨細胞の分化にＦＯが及ぼす影響におけるＮＯＸ１の役割を確認するために、ＮＯＸ１をサイレンシングして破骨細胞の分化関連のタンパク質の発現を分析した。その結果、ＲＡＮＫＬにより誘導されたＴＲＡＦ６、ｃ−Ｓｒｃ、ｐ−ＰＩ３ＫシグナルがＦＯ処理群では減少し、ＮＯＸ１ ｓｉ ＲＮＡとＦＯ群では相当に抑制されたのを確認した。したがって、ＦＯは、ＲＡＮＫＬにより誘導されたＮＯＸ１依存的にＲＯＳの生成を阻害することによって、破骨細胞の分化シグナル伝達メカニズムを抑制することができる。

［実験例２：造骨細胞の活性化の誘導］
１．造骨細胞の培養及び分譲
本実験に用いられたＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、ｍｏｕｓｅ ｃａｌｖａｒｉａ由来の造骨細胞としてＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入し、細胞培養に必要なα−ＭＥＭ（α−ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕ ｍ）培地、ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ等は、ＧＩＢＣＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、１０％ ＦＢＳと１％ 抗生剤（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）とが含まれたα−ＭＥＭ培地を用いて３７℃のＣＯ_２インキュベータで培養した。培地は、最初は２日後に交換し、その後は４日ごとに交換した。２日〜３日間の培養後、一次培養細胞が７０％〜８０％の密度に達したとき、０．０２５％ トリプシン溶液を用いて継代培養した。

２．ＭＴＴアッセイ
造骨細胞の増殖程度は、生きている細胞の生存率を求めるＭＴＴアッセイにより測定した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１００μＬずつ分株した後、２４時間に亘って３７℃のＣＯ_２インキュベータで培養した。その後、培地を除去し、ＦＢＳが添加されていない培地に様々な濃度（０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ）のＦＯを配分させて調製した新しい培養液を分株した。４８時間の培養後に培地を除去し、０．０５ｍｇ／ｍＬ濃度のＭＴＴ試薬（１０μＬ／ｗｅｌｌ）を分株した後、さらに４時間の培養後に培養液を除去した。沈殿物をＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶解させ、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて５７０ｎｍでの吸光度を測定した。試料を添加していない培地のみを入れて培養したものを対照群とし、対照群の吸光度を基準に細胞生存率を算出した。

３．造骨細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度で９６ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに接種して２４時間培養し、様々な濃度（０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２００μｇ／ｍＬ）のＦＯが含まれた培地に交換して４８時間培養した。培養液を除去し、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で細胞を溶解して超音波処理した。０．４ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ_２、及び４ｍＭ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＰＮＰＰ）を含む緩衝溶液５０μＬ／ｗｅｌｌを加えた後に３０分間反応させ、１５０μＬの１Ｎ ＮａＯＨを加えて反応を中止させた。その後、分解されたｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ（ＰＮＰ）について、ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定した。タンパク質量はｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔを用いて測定し、酵素活性は対照群に対する百分率で示した。

４．ゼブラフィッシュモデルにおける骨形成の促進の測定
ｉｎ ｖｉｖｏでのＦＯの骨形成の促進効果を確認するために、３５日間に亘って様々な濃度（０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）のＦＯを供給したゼブラフィッシュを、ｃａｌｃｅｉｎに露出させて染色した。

具体的には、様々な濃度（０μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）のＦＯを供給したゼブラフィッシュと、これを供給していないゼブラフィッシュとをｃａｌｃｅｉｎに露出させて染色し、適切に染色が行われたことを確認すると、溶液を捨て、ＰＢＳで洗浄した後に乾燥させた。次に、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡を用いてイメージを得て、このイメージ間で染色強度を測定して評価した。

５．ＦＯが、造骨細胞に及ぼす影響（図５）
ＦＯ処理群において３日目から細胞間にクランプを形成するのを確認することができ、ＭＴＴ活性化が３日目から急激に増加した。実際の総細胞数の変化と細胞の生存に及ぼす影響とを確認した結果、実験期間における総細胞の生存率は、薬物を処理していない群と同一に現れたが、５日目から総細胞数が著しく減少（造骨細胞への分化により総細胞数が減少）した。

６．ＦＯが、造骨細胞の形成に必要な必須遺伝子の発現に及ぼす影響（図６及び図７）
ＦＯ（１００μｇ／ｍＬ）が、造骨細胞の形成における必須遺伝子の発現に及ぼす影響を把握するために、７日間に亘って処理して、１日目、３日目、５日目、７日目に遺伝子の発現を確認した。その結果、Ａｌｐ、ＲＵＮＸ２、Ｃｏｌ１ａ１、ＯＳＸ、Ｂｇｌａｐ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４の発現が強力に増加した。

７．骨形成の核心因子であるＡｌｐ活性化（図８）
ＦＯ（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）をＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に投与して、骨の再形成及び再生が発生する部位において局所的リン酸イオン濃度を増加させるＡＬＰの合成を測定した。３日目には実験群と対照群との間の有意差はなかったが、５日目からは２つのＦＯ処理群においてＡＬＰ活性が有意に増加した。Ｄｅｘは陽性対照として用いた。

８．ゼブラフィッシュ発生ステップにおける骨形成の促進（図９及び図１０）
３日目から９日目までＦＯ（５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）を処理した後、ゼブラフィッシュにおいて骨形成を確認した。約９日後に脊椎骨の形成がＦＯ処理によって促進されるのを確認した。全体的に生成された脊椎骨の面積及び蛍光強度も増加するのを確認した。

［実験例３：卵巣摘出モデルにおける骨粗しょう症の治療効果］
１．骨粗しょう症の動物モデルの作製
生後８週になった雌ＩＣＲマウスを購入し、１週間順応させた後、８匹ずつ５群に分けて実験した。

各群は、
１）卵巣を切除せずに皮膚と筋肉層とを縫合した非卵巣切除の正常対照群（Ｓｈａｍ）、２）卵巣を切除して骨粗しょう症を誘発した対照群（ＯＶＸ）、
３）卵巣切除後、ＦＯを１００ｍｇ／ｋｇずつ毎日経口投与した実験群（ＯＶＸ＋ＦＯ １００ｍｇ／ｋｇ）、
４）卵巣切除後、ＦＯを２００ｍｇ／ｋｇずつ毎日経口投与した実験群（ＯＶＸ＋ＦＯ ２００ｍｇ／ｋｇ）、及び
５）卵巣切除後、１７−ｂｅｔａ−ｅｓｔｒａｄｉａｌ（Ｅ２）を毎日腹腔内投与した陽性対照群（ＯＶＸ＋Ｅ２）
に分類した。

ＩＣＲマウスは、Ａｖｅｒｔｉｎで麻酔後、背中の毛を除去し、微細な鋏で皮膚と筋肉層とを切開した後、両側の卵巣を完全に切除し、縫合糸で縫合した。

２．Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ分析
卵巣を切除してから４週間後、実験動物を犠牲にし、脛骨を切り取って固定した後、Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ（Ｓｋｙｓｃａｎ １２７２、Ｂｒｕｋｅｒ、Ｋｏｎｔｉｃｈ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて３次元画像イメージを再建し、様々な骨指標（ＢＭＤ、ＢＶ／ＴＶ、Ｔｂ．Ｎ、Ｔｂ．Ｔｈ、Ｔｂ．Ｓｐ）を分析した。

３．骨粗しょう症の治療効果（図１１及び図１２）
Ｍｉｃｒｏ−ＣＴを用いて得られた３次元画像イメージを通じて、非卵巣切除の正常対照群に比べて、骨粗しょう症を誘発した対照群は、骨損失が深刻化しており、このような骨損失は、ＦＯを１００ｍｇ／ｋｇ又は２００ｍｇ／ｋｇで口腔投与した全ての群において抑制されたことが確認された。

ＦＯ投与により、骨密度（ＢＭＤ）及び骨体積（ＢＶ／ＴＶ（％））に有意な改善効果があることが明らかになった。また、骨梁数（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｎｕｍｂｅｒ）、骨梁間隔（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）、及び骨梁幅（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）も有意に回復したことが確認された。

したがって、ＦＯは骨粗しょう症の改善に有効な効果を示すと判断される。

［実験例４：骨健康の改善用組成物の骨健康の改善効果の比較］
１．生のカキ及びヒジキを用いた骨健康の改善用組成物（以下、ＦＯ’と記載する）の製造
生のカキ及びヒジキに対して水洗並びに脱塩を行い、不純物及び塩を除去した。その後乾燥し、粉砕して、カキ及びヒジキの混合粉砕物を製造した。その後、発酵菌株としてラクトバチラス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＪＳ及びアスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｕｓａｍｉｉ）を用いたことを除いては、製造例１と同様にして骨健康の改善用組成物（ＦＯ’）を製造した。

２．骨健康の改善用組成物（ＦＭ１）の製造
ＦＯ及びＦＯ’を１：０．５の重量比で混合し、骨健康の改善用組成物（ＦＭ１）を製造した。

３．骨健康の改善用組成物（ＦＭ２）の製造
ＦＯ及びＦＯ’を１：１の重量比で混合し、骨健康の改善用組成物（ＦＭ２）を製造した。

４．骨健康の改善用組成物（ＦＭ３）の製造
ＦＯ及びＦＯ’を１：２の重量比で混合し、骨健康の改善用組成物（ＦＭ３）を製造した。

５．破骨細胞の形成抑制効果の比較
ＦＯ、ＦＯ’、ＦＭ１、ＦＭ２、及びＦＭ３について、破骨細胞の形成抑制効果を比較して評価した。ＦＯについての破骨細胞の形成抑制効果を指数５に設定し、ＦＯ’、ＦＭ１、ＦＭ２、及びＦＭ３について、破骨細胞の形成抑制の程度を評価し、指数で示した。指数が高いほど効果に優れることを意味する。

表１によれば、発酵菌株の差に応じて、ＦＯよりもＦＯ’の方が破骨細胞の形成抑制効果に優れることが確認された。

より具体的には、ＦＯ及びＦＯ’を同一の濃度範囲で処理した後にａｃｔｉｎ ｒｉｎｇ形成を観察したが、ＦＯよりもＦＯ’の方がａｃｔｉｎ ｒｉｎｇの形成を抑制することが確認され、それに基づいて破骨細胞の分化を抑制することが確認された。

それのみならず、シグナル伝達因子であるＴＲＡＦ６及びｃ−Ｓｒｃの発現が、ＦＯよりもＦＯ’の方が減少し、ＰＩ３Ｋのリン酸化が調節された。また、ＦＯよりもＦＯ’の方がＮＦ−ｋＢ ｐａｔｈｗａｙの抑制効果に優れることが確認された。

ＲＡＮＫＬ処理された破骨細胞における増加したＲＯＳが、ＦＯよりもＦＯ’の方が顕著に減少し、ＲＡＮＫＬにより誘導されたＴＲＡＦ６、ｃ−Ｓｒｃ、及びｐ−ＰＩ３Ｋシグナルが、ＦＯ’処理群ではさらに減少することが確認され、総合的にＦＯよりもＦＯ’の方が、破骨細胞の形成抑制効果に優れることが分かる。

また、ＦＯ及びＦＯ’を混合したＦＭ１〜３の場合、ＦＯ及びＦＯ’の混合比率に応じて破骨細胞の形成抑制効果に差が生じており、この中でもＦＭ２が最も優れた効果を示すことが確認された。

６．造骨細胞の活性化誘導効果の比較
ＦＯ及びＦＯ’について、造骨細胞の活性化誘導効果を比較して評価した。ＦＯについての造骨細胞の活性化誘導効果を指数５に設定し、ＦＯ’、ＦＭ１、ＦＭ２、及びＦＭ３について、造骨細胞の活性化誘導の程度を評価し、指数で示した。指数が高いほど効果に優れることを意味する。

表２によれば、発酵菌株の差に応じて、ＦＯよりもＦＯ’の方が造骨細胞の活性化誘導効果に優れることが確認された。

より具体的には、造骨細胞の分化により、総細胞数の減少が、ＦＯよりもＦＯ’の方が明確であり、必須遺伝子の発現も、ＦＯよりもＦＯ’の方が増加したことが実験から確認された。

また、骨形成における核心因子であるＡｌｐ活性も、ＦＯよりもＦＯ’の方が増加し、ゼブラフィッシュ発生ステップにおける脊椎骨の面積及び蛍光強度も、相当に増加したことが確認された。

また、ＦＯ及びＦＯ’を混合したＦＭ１〜３の場合、ＦＯ及びＦＯ’の混合比率に応じて造骨細胞の活性化誘導効果に差が生じており、この中でもＦＭ２が最も優れた効果を示すことが確認された。

以上、本発明の好ましい実施例について詳しく説明したが、本発明の権利範囲はこれらに限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲で定義している本発明の基本概念を用いた、当業者の様々な変形及び改良の形態も、本発明の権利範囲に属するものである。

Claims (5)

1. カキ及び海藻類を発酵させた、カキ及び海藻類の発酵物から抽出してなる発酵抽出物を含み、
   前記カキ及び海藻類は、カキ及びヒジキであり、
   前記発酵物は、ラクトバチラス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＪＳ（菌株寄託番号：ＫＣＣＭ １０４９９）及びアスペルギルス・ウサミ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｕｓａｍｉｉ）の混合物を用いて発酵させたものであり、
   前記発酵抽出物は、破骨細胞の活性は抑制し、造骨細胞の活性は促進して骨形成を促進する、カキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物。
2. 前記発酵抽出物は、タウリン及びＧＡＢＡ（ｇａｍｍａ−ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）を含む、請求項１に記載のカキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物。
3. 前記カキは、生のカキ、カキの加水分解液、カキの抽出濃縮液、及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項１に記載のカキを用いた機能性発酵物を含む骨健康の改善用組成物。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨健康の改善用組成物を含む、カキを用いた機能性発酵物を含む薬学組成物。
5. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨健康の改善用組成物を含む、カキを用いた機能性発酵物を含む食品組成物。

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