KR102275715B1 - 먹물버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항암용 약학적 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항암용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 사용시 부작용이 없어 안전한 먹물버섯 추출물을 함유함으로써, 항산화 및 항암 작용이 효과적으로 적용될 수 있는 것에 특징이 있다.

Description

먹물버섯 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항암용 약학적 조성물 및 이의 제조방법{Pharmaceutical composition for anti-oxidant and anti-cancer comprising Coprinus comatus extract as effective material and manufacturing method for the same}

본 발명은 먹물버섯 추출물 및 먹물버섯을 제외한 버섯 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 항산화 및 항암용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 사용시 부작용이 없는 먹물버섯 추출물을 함유함으로써, 보다 안전하고, 항산화 및 항암 작용이 효과적으로 적용될 수 있는 것에 특징이 있다.

암은 우리나라에서 순환기 질환과 함께 가장 많이 발생하는 질환이다. 정상적으로 세포는 세포 내 조절기능에 의해 분열하며 성장하고 죽어 없어지기도 하며 세포수의 균형을 유지하며 살아간다. 이러한 세포가 손상을 받는 경우, 증식과 억제가 조절되지 않는 비정상적인 세포들이 되어 통제되지 못하고 과다하게 증식할 뿐만 아니라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴 형성 및 정상 조직의 파괴를 초래하는 경우가 있다. 이 상태를 암 또는 종양(cancer)이라 정의하고 있다. 종양에는 양성종양과 악성종양이 있으며, 양성종양은 비교적 서서히 성장하며 신체 여러 부위에 확산, 전이하지 않으며 제거하여 치유시킬 수 있는 종양을 말하고 특이한 경우를 제외하고 대개의 양성종양은 생명에 위협을 초래하지는 않는다. 이와 달리 악성종양은 빠른 성장과 침윤성(파고들거나 퍼져 나감) 성장 및 체내 각 부위에 확산 전이(원래 장소에서 떨어진 곳까지 이동함)하여 생명에 위험을 초래하는 종양을 말한다.

이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다.

이러한 항암제는 암세포의 대사경로에 개입하여 DNA와의 직접적인 상호작용에 의해 DNA의 복제, 전사, 번역과정을 차단하거나, 핵산 전구체의 합성을 방해하고, 세포의 분열을 저해함으로써 암세포에 대한 독성을 나타낸다. 그러나, 일반적으로 항암 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하고 정상세포에도 치명적인 손상을 주어 골수 파괴로 인한 백혈구, 혈소판, 적혈구 등의 혈구 감소증; 모낭세포 파괴로 인한 탈모증상; 난소와 고환에 대한 부작용으로 월경불순 및 남성불임의 원인; 소화기의 점막 세포 파괴로 인한 부작용으로 구내염, 오심구토 및 음식 연하장애와 소화 장애; 설사증상; 세뇨관 괴사에 의한 신장독성; 신경계 장애로 발생하는 말초 신경염과 쇠약감; 혈관 통증 및 발진 등의 혈관장애; 피부 및 손발톱 변색 등의 다양한 부작용이 나타난다. 따라서, 우수한 항암 효과와 더불어 이와 같은 항암제의 부작용을 최소화하면서 암세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 항암제의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

활성산소는 스트레스, 자외선, 방사선, 화학물질, 인스턴트식품, 흡연 및 기타 환경공해 등의 여러 가지 원인으로 인하여 체내에 들어온 산소 중 일부가 안정한 물로 환원되지 못하고 쌍을 이루지 않은 전자를 지닌 상태로 남게 되어 생기는 것으로, 상태가 불안정해 쌍을 이루지 않은 전자를 떼거나 주위로부터 전자 하나를 더 얻어 보다 안정된 상태로 나가려는 성질을 가지고 있어 주변조직들을 변화시키는 독성이 있고, 암의 유발, 뇌졸중, 동맥경화, 당뇨병, 관절 등의 질병뿐만 아니라 성인병, 남성불임에도 원인이 되고 있다.

즉, 활성산소 종이 특정 요인에 의하여 생체 내에서 필요 이상으로 생성될 경우, 사용되고 남은 활성산소종은 지질의 과산화작용, 단백질 변형 즉, 아미노산 측쇄의 산화, 단백질 교차 결합 형성, 단백질 단편화의 원인이 되는 폴리펩티드 기본 구조의 산화, 단일가닥 DNA의 절단을 유발함으로써 효소의 불활성 또는 변성, 세포막 분열, 저밀도 콜레스테롤로 인한 혈관 장애증가, 미토콘드리아의 역기능, 세포 사멸 등을 초래하고, 이로 인해 노화, 만성질병, 염증, 퇴행성 질병, 노인성 질병을 유발하게 된다.

이러한 산화적 스트레스에 기인한 질병을 예방하기 위한 천연 항산화제를 분리, 동정, 개발하려는 많은 연구가 진행되고 있다. 또한 식물 유래의 천연 화합물들은 자유라디칼, 그리고 활성 산소종의 소거제 혹은 환원제로서 산화과정을 지연시킨다고 한다.

이러한 활성산소의 작용을 중화시키는 성질을 가지고 있는 항산화제는 저분자 화합물로서 체내에서 고분자 항산화물(효소)의 작용을 돕거나 자체적으로 활성산소를 제거하기도 하는데, 베타카로틴, 비타민A, 비타민C(아스코르빈산), 비타민E(토코페롤)와 플라보노이드 등이 대표적인 항산화 성분들로서, 강력한 항산화력을 지니고 있으며, 현재 식물영양소(phytonutrients)들이 항산화 성분으로 주목받아 활발하게 연구되고 있다.

항산화제(anti-oxidant)로 부틸레이트하이드록시아니솔(butylated hydroxyanisole, BHA), 부틸레이트하이드록시톨루엔(butylated hydroxytoluene, BHT)과 같은 합성물질들이 개발되었으나, 이러한 항산화제는 인체에 대한 여러가지 부작용을 야기할 수 있다. 따라서, 우수한 항산화 효과와 더불어 이와 같은 항산화제의 부작용을 최소화할 수 있는 식물 유래의 천연 화합물 항산화제의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 또한, 식물 유래의 천연 화합물들은 자유 라디칼, 그리고 활성 산소종의 소거제 혹은 환원제로서 산화과정을 지연시키는 것으로 알려져 있다.

일상적으로 섭취하고 있는 식재료 중에서도 건강 증진 및 유지에 효과적인 생리활성 물질을 함유하고 있는데, 이 중 식용 및 약용으로 널리 이용되고 있는 버섯류가 생리활성 물질로서 큰 관심을 얻고 있다.

한편, 버섯은 베타글루칸 등의 다당체를 풍부하게 포함하여 면역력 강화, 항산화, 항종양, 콜레스테롤 저하, 혈당 강하, 항바이러스, 항혈전 및 비만 억제 작용 등 매우 다양하고 폭넓은 약리효과가 있는 것으로 잘 알려져 있는데, 그 중에서도 Coprinus 속에 속하는 버섯들은 항염, 항산화, 항종양, 항세균 및 항진균 활성뿐만 아니라 뇌 혈류 장애 개선 활성을 나타낸다는 등 다양한 유용성을 지니고 있음이 보고되었다.

특히 먹물버섯(Coprinus comatus)은, 주름버섯 목 먹물버섯 과에 속하며, 상기 Coprinus 속에 속하는 식용버섯으로써, 예로부터 건위작용 및 중추신경 자극의 약리 작용이 알려져 있으며 소화 촉진 및 치질 치료제 등으로 사용되기도 하였다. 또한 면역력증강, 항암 효과, 체지방 감소효과, 면역증강, 항동맥경화, 콜레스테롤 감소, 당뇨치료 및 골 대사 촉진 등의 생리 활성 효과를 가지고 있는 것으로 알려져 있다.

이에, 본 발명자들은 항산화 또는 항암 활성을 가지는 동시에 부작용이 적은 천연물 유래 소재를 개발하고자 예의 노력 연구한 결과, 먹물버섯 추출물이 자유 라디칼 제거 효과 및 암세포의 세포 주기 조절과 악성종양의 증식을 억제하는 효과를 나타내는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 배경이 되는 기술은 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0016387에 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 기존의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 먹물버섯 추출물 및 먹물버섯을 제외한 버섯(이하, 기타 버섯) 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 및 항암용 약학적 조성물을 제공하는데 목적이 있다.

또한, 상기 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 및 항암용 약학적 조성물의 제조방법을 제공하는 것에 그 목적이 있다.

전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본 발명의 일 측면은,

먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 및 항암용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 기타 버섯 추출물은 표고버섯 추출물 및 영지버섯 추출물을 포함하는 것 일 수 있다.

상기 기타 버섯 추출물은 송이버섯, 팽이버섯, 느타리버섯, 양송이버섯, 상황버섯, 해송이버섯, 꽃송이버섯, 차가버섯, 노루궁뎅이버섯 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 버섯의 추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 기타 버섯 추출물의 함량은 먹물버섯 추출물 100 중량부 대비 50 중량부 내지 150 중량부인 것일 수 있다.

상기 항산화 및 항암용 약학적 조성물은 부형제, 희석제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 방향제, 향미제, 보존제, 천연 탄수화물 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 첨가제를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 첨가제의 함량은 상기 약학적 조성물 총 중량에 대하여, 0.001 중량% 내지 99.999 중량%로 포함되는 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 암세포의 증식을 저해하는 것일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 T세포의 활성을 증가시키는 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 일 측면은,

먹물버섯 및 용매의 혼합물과 기타 버섯과 용매의 혼합물을 각각 추출기에 투입시켜 80℃ 내지 125℃의 온도에서 1차 추출하는 1차 추출 단계; 상기 1차 추출시킨 먹물버섯 혼합물 및 기타 버섯 혼합물을 각각 60℃ 내지 100℃의 온도에서 2차 추출시키는 2차 추출 단계; 상기 2차 추출시킨 먹물버섯 혼합물 및 기타 버섯 혼합물을 각각 40℃ 내지 80℃의 온도에서 3차 추출시켜 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 각각 제조하는 3차 추출 단계; 상기 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 각각 농축기에 투입시켜 80℃ 이하의 온도에서 농축 시키는 농축 단계; 및 상기 농축된 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 혼합 후 건조 시키는 건조 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 및 항암용 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 기타 버섯은 표고버섯 및 영지버섯을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항산화 및 항암용 약학적 조성물의 제조방법은, 상기 먹물버섯 추출물 및 상기 기타 버섯 추출물의 혼합물을 경구투여용 제제로 제제화 하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

상기와 같은 본 발명에 따른 약학적 조성물은 3차에 결쳐 추출한 먹물버섯 추출물을 포함함으로써, 풍부한 유효 성분을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여 방식을 통해서 투여하였을 때에도, 항산화 또는 항암 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 주사제 등을 사용한 경피주사 등의 투여 방법과 비교하여, 사용자의 고통을 경감할 수 있고, 보다 간편하게 항산화 및 항암 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 약학적 조성물은 암세포의 증식을 저해함으로 인해서 위암, 유방암, 자궁암, 대장암, 췌장암, 간암 등의 다양한 암을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

또한, 상기 본 발명의 약학적 조성물은, T세포의 활성을 증가시킴으로써, T 세포를 이용한 항암 치료에 이용할 수 있다. 환자 유래 T 세포를 이용하게 되면 세포 치료제의 가장 큰 부작용인 면역 반응의 유도가 적으며, 효과적이고 부작용이 없는 치료제로 사용할 수 있는 효과가 있다.

또한, 상기 본 발명의 약학적 조성물은 항산화 효능을 나타냄으로써, 노화 관련 질병을 예방할 수 있는 효과가 있고, 식품에 포함될 시, 식품의 산화를 억제할 수 있는 효과가 있다.

또한, 상기 본 발명의 약학적 조성물은, 부작용이 없어, 항산화 및 항암 효과를 얻기 위해 조성물을 사용할 시에, 보다 안전하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 항산화 및 항암용 약학적 조성물의 제조방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 다당체를 확인하기 위한 TLC의 측정 결과를 나타낸 사진이다.
도3은 본 발명의 일 구현예에 따른 실험동물의 체중 변동을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물의 DPPH법에 의한 항산화 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 세포 생존율을 Hemocytometer를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포 생존율을 MTT assay를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 종양세포주의 DNA 단편화를 전기영동을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 8 은 본 발명의 일 구현예에 따른 실험 동물의 체중 증가량을 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 실험 동물의 종양 크기의 변화량을 나타낸 그래프이다.

후술하는 본 발명에 대한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예에 관련하여 본 발명의 기술적 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 기술적 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다.

덧붙여, 본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.

따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다.

이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 참조하여 상세히 설명하기로 한다.

본원의 제 1 측면은,

먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 및 항암용 약학적 조성물(이하, 약학적 조성물로도 기재)을 제공하는 것일 수 있다.

이하, 본원의 제 1측면에 따른 항산화 및 항암용 약학적 조성물을 도 1 내지 도 9를 참조하여 상세히 설명한다.

우선, 본원의 일 구현예에 있어서, 항산화 및 항암용 약학적 조성물은 먹물버섯 추출물을 포함한다. 상기 약학적 조성물은 다양한 경로 및 방법을 통해 투여 될 수 있으며, 그에 따른 제형을 가질 수 있다. 다만, 본 발명의 명세서에서는 이해를 돕기 위해 상기 약학적 조성물이 경구 투여되는 경우를 예로 들어 설명하도록 한다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 먹물버섯 추출물은 하기 먹물 버섯을 이용하여 제조되는 것일 수 있다. 먹물버섯은 수분, 조회분, 조지방, 조단백질, 탄수화물 및 기타 미량의 성분으로 구성되는 것일 수 있다. 또한, 상기 먹물버섯은 칼륨(K), 칼슘(Ca), 나트륨(Na), 마그네슘(Mg), 철(Fe), 아연(Zn), 망간(Mn), 구리(Cu)등의 미네랄을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 먹물버섯은 비타민 B1, B2, B3(나이아신, Niacin), B6, C 등을 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 먹물버섯은 아스파르트산(Aspartic Acid), 트레오닌(Threonine), 세린(Serine), 글루탐산(Glutamic acid). 프롤린(Proline), 글리신(Glycine), 알라닌(Alanine), 발린(Valine), 이소류신(Isoleucine), 류신(Leucine), 티로신(Tyrosine), 페닐알라닌(Phenylalanine), 히스티딘(Histidine), 리신(Lysine), 아르기닌(Arginine), 시스틴(Cystine), 메티오닌(Methionine), 트립토판(Tryptophan) 등 필수 아미노산을 포함한 다양한 아미노산을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 먹물버섯은 버섯이 성숙되는 과정에서 자가소화(자가 분해)가 일어나 먹물이라고 불리는 검은 액체를 생성한다. 먹물버섯의 자실체를 완전히 성숙시켜, 먹물버섯의 자가소화를 유발할 수 있다. 자실체는 군생 또는 속생하며, 어린버섯일 때는 버섯갓이 원주형이고, 버섯대가 붙었을 때 닭다리 모양으로 생겨 닭다리 버섯이라고도 불린다.

또한, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 먹물버섯 추출물은 상기 먹물버섯 분쇄물에 용매를 가하여 추출해낸 것일 수 있다. 이때, 단순히 상온의 물에 담가두는 것 만으로 침출시키는 것도 가능하나, 빠른 시간 내에 최대한 많은 유효성분을 추출해내기 위한 추가적인 처리를 통해 제조하는 것일 수 있다.

한편, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 용매로는 정제수; 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 알코올; 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 혹시 추출물에 용매 성분이 잔류하여도, 투여 시에 문제가 되지 않도록, 바람직하게는 정제수, 또는 정제수와 에탄올의 혼합물일 수 있다. 더욱 바람직하게는 정제수일 수 있다.

또한, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 추가적인 처리로는, 유기 용매의 추가 사용, 가열, 초음파 및 교반 등의 처리를 가하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 유기 용매의 추가 사용시, 별도의 유기 용매 제거작업이 요구되지 않도록, 추출물에 용매 성분이 잔류하더라도 추출물을 투여 받은 개체의 안전에 위협이 되지 않는 성분을 사용하는 것일 수 있다. 상기 가열 처리 시, 얻고자 하는 먹물버섯의 유효성분이 파괴되지 않는 범위 내라면 가열 온도는 제한되지 않는 것일 수 있다. 바람직하게는, 121℃의 열수로 추출할 수 있고, 또는 가장 쉽게 구할 수 있는 용매인 물의 끓는 점인 100℃ 이하의 온도로 가열하는 것일 수 있다. 또한, 상기 먹물버섯 추출물을 추출할 때, 단순히 시료에 용매를 가하여 침출시키는 것이나, 열을 가하는 것 외에도, 물리적인 충격을 가하여 추출할 수 있다. 즉, 먹물버섯 재료와 용매가 함께 들어있는 용기 등에 초음파를 가하거나, 진탕 시키거나, 이를 교반시키는 등의 물리적인 충격을 가하는 것을 통해 보다 빠른 시간 내에 얻고자 하는 성분을 추출할 수 있는 것일 수 있다.

상기 먹물버섯 추출물의 독성과 관련하여, 먹물버섯 자실체는 식품 공전에 식물성 원료로 등록이 되어 있으며, 동물 실험을 통해 반복투여독성시험을 실시하여 독성이 없음을 확인하였다. 상기 반복투여독성시험은 식품의약품안전청의 독성시험기준에 준하여 실시하였다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 기타 버섯 추출물은 항산화 또는 항암 효과를 가지고 있거나, 이를 도울 수 있는 것이라면, 특별한 제한 없이 사용되는 것일 수 있다. 일반적으로 식용 버섯에는 아미노산, 마니트, 트레할로오스 등이 많이 있으며 그밖에 비타민 B2와 비타민 D의 전구체인 에르고스테린 같은 여러 비타민류와 효소도 들어 있다고 알려져 있다. 또한, 최근 버섯은 항암 효과, 항변이원성 효과, 혈청 지질저하 효과, 면역증강 효과 등 노화억제 및 성인병 예방과 치료에 효험이 있는 것으로 알려지면서 식용뿐만 아니라 약용으로도 그 이용성이 날로 증대하고 있는데, 이러한 생리활성이 기대되는 버섯류에는 영지, 표고, 새송이, 상황, 아가리쿠스, 목이, 말굽 및 석이 등의 식용 및 약용 버섯류가 알려져 있다.

한편, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 기타 버섯 추출물은 표고버섯 추출물 및 영지버섯 추출물을 포함하는 것일 수 있다. 식용으로 널리 이용되고 있는 표고버섯에는 항암작용, 콜레스테롤 저하작용, 강장, 이뇨, 고혈압, 신장염, 천식, 위궤양 등의 치료에도 효능이 있어 약용으로도 널리 이용되고 있으며, 표고버섯 열수 추출물은 혈청 및 간장의 지질 저하 작용 및 간손상 억제작용이 보고된 바 있다. 특히, 영지버섯의 약효성분으로 열수 추출액에 함유되어 있는 다당류와 단백질 복합체인 polysaccharide protein complex가 보고된 바 있으며, 암세포 생육 억제, 본태성 고혈압 치료, 과산화지질 생성 억제 효과 등이 보고된 바 있다. 또한, 새송이버섯의 다당류 추출물은 혈청 콜레스테롤 저하효과 및 사염화탄소 유발 간손상 억제작용과 새송이버섯 자실체 및 균사체 추출물의 항산화효과가 있는 것으로 보고된 바 있다.

한편, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 버섯 추출물은 표고버섯 추출물 및 영지버섯 추출물 외에, 새송이버섯, 팽이버섯, 느타리버섯, 양송이버섯, 상황버섯, 해송이버섯, 꽃송이버섯, 차가버섯, 노루궁뎅이버섯 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 버섯의 추출물을 더 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 표고버섯 및 새송이버섯의 추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 기타 버섯 추출물의 함량은 먹물버섯 추출물 100 중량부 대비 50 중량부 내지 150 중량부인 것일 수 있다. 상기 기타 버섯 추출물의 함량이 먹물버섯 추출물 100 중량부 대비 50 중량부 미만인 경우 기타 버섯의 유효성분의 함량이 적어, 기타 버섯의 유효성분의 효과가 충분히 발휘되지 않을 우려가 있고, 150 중량부를 초과할 경우 함량 증가에 따른 기타 버섯의 유효성분의 효과의 증대는 크지 않은 반면, 생산 비용이 증가되므로, 생산성 측면에서 바람직하지 않다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 상기 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물의 함량은 항산화 및 항암 효과를 나타낼 수 있는 범위 내라면 제한되지 않는 것일 수 있다. 상기 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물의 양은 상기 약학적 조성물 전체 중량의 0.01 내지 50중량%, 바람직하게는 0.1 내지 25 중량%, 더욱 바람직하게는 0.3 내지 15 중량%, 가장 바람직하게는 0.5 내지 10 중량%의 비율로 포함 될 수 있다. 상기 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물의 양이 상기 약학적 조성물 전체 중량의 0.01 중량% 미만이면, 상기 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물에 포함되어 있는 유효성분이 유효한 효과를 나타내기에는 충분하지 않아, 효과가 충분히 발휘되지 않을 우려가 있고, 50 중량%를 초과할 경우 함량 증가에 따른 상기 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물의 유효성분의 효과의 증대는 크지 않은 반면, 생산 비용이 증가되므로, 생산성 측면에서 바람직하지 않다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 부형제, 희석제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 방향제, 향미제, 보존제, 천연 탄수화물 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 첨가제를 더 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물이 음료의 형태로 사용될 경우에는, 통상의 감미제, 향미제, 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은, 본 발명의 약학적 조성물 100 ㎖ 당 바람직하게는 약 0.01 내지 0.04 g, 보다 바람직하게는 0.02 내지 0.03 g일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

한편, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 담체, 부형제, 희석제 등의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 활성 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 외에, 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

또한, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 첨가제의 함량은 상기 약학적 조성물 총 중량에 대하여, 0.001 중량% 내지 99.999 중량%, 바람직하게는 0.1중량% 내지 95 중량%, 더욱 바람직하게는 10 중량% 내지 90 중량%로 포함되는 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물 총 중량에 대하여, 상기 첨가제의 함량이 0.001 중량% 미만이면 상기 약학적 조성물에 첨가된 첨가제로부터 얻을 수 있는 효과가 없고, 상기 첨가제의 함량이 99.999%를 초과하면 상기 약학적 조성물이 약학적으로 유효한 양의 상기 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물을 포함할 수 없는 문제가 발생할 수 있다. 본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 항산화 또는 항암 효과를 나타낼 수 있는 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방, 개선 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체, 종류, 연령, 성별, 체중, 질병의 종류, 질병의 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 약물의 형태, 투여 경로, 투여 기간, 배출 비율, 동시 사용되는 약물, 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

또한, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 약학적 조성물은 개별치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 다른 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 요소들을 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명 화합물의 바람직한 투여량은, 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 0.001 내지 2,000 mg/kg, 바람직하게는 0.05 내지 400 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 200 mg/kg의 양을 하루 1회 내지 수 회 분할하여 투여할 수 있다. 예를 들면, 체중 60 kg인 성인 1일 1 mg 내지 1 g의 용량, 바람직하게는 30 mg 내지 120 mg의 용량으로 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 없으므로 예방, 개선 또는 치료 목적으로 장기간 복용할 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 항산화 또는 항암 효과를 얻는 것을 목적으로 하는 모든 개체에 적용될 수 있다. 이러한 개체의 예는, 인간뿐만 아니라, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비인간동물, 포유류 등을 포함한다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 암세포의 증식을 저해하는 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 정상세포에는 큰 영향을 미치지 않지만, 암세포의 증식은 억제하는 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 주사 등의 방법으로 암세포에 직접 투여되거나, 경구투여되는 것일 수 있으며, 어떠한 방법을 사용하더라도, 암세포의 증식을 억제하는 효과를 나타낼 수 있다. 상기 약학적 조성물은, 신호전달 또는 전사조절 등에 의해 암세포의 증식을 억제하는 효과를 나타내는 것일 수 있다. 또한, 상기 약학적 조성물은 암세포 증식을 억제하는 효과 및 항암 효과를 나타냄으로써, 종양의 크기가 감소하는 효과를 나타내는 것일 수 있다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 T세포의 활성을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은, 비장 세포 중, T세포를 증식시키는 인자인 Con A 또는 T 세포 자체의 활성을 증가시키는 것일 수 있다.

상기 T 세포(T cell)는, T 림프구(T lymphocyte)라고도 불리며, 세포성 면역을 담당하는 세포이다. 상기 T 세포는 항원 특이적인 적응 면역을 주관하는 림프구의 하나이며 사이토카인을 생산하는 것에 의하여 면역 반응을 제어하는 역할을 가지고 있다. 전체 림프구 중 약 4분의 3이 T 세포로 구성되어 있다고 알려져 있다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 항산화 활성을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물의 항산화 활성은 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있으나, 구체적으로는, Folin-Denis법을 이용한 폴리페놀 화합물의 함량 측정 또는 DPPH 법을 이용하여 측정할 수 있다.

본원의 제2측면은,

먹물버섯 및 용매의 혼합물과 기타 버섯과 용매의 혼합물을 각각 추출기에 투입시켜 80℃ 내지 125℃의 온도에서 1차 추출하는 1차 추출 단계;

상기 1차 추출시킨 먹물버섯 혼합물 및 기타 버섯 혼합물을 각각 60℃ 내지 100℃의 온도에서 2차 추출시키는 2차 추출 단계;

상기 2차 추출시킨 먹물버섯 혼합물 및 기타 버섯 혼합물을 각각 40℃ 내지 80℃의 온도에서 3차 추출시켜 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 각각 제조하는 3차 추출 단계;

상기 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 각각 농축기에 투입시켜 80℃ 이하의 온도에서 농축 시키는 농축 단계; 및

상기 농축된 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 혼합 후 건조 시키는 건조 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 및 항암용 약학적 조성물 제조방법을 제공하는 것일 수 있다.

본원의 제1측면과 중복되는 부분들에 대해서는 상세한 설명을 생략하였으나, 본원의 제1측면에 대한 내용은 제 2측면에서 그 설명이 생략되었더라도 동일하게 적용될 수 있다.

이하, 본원의 제 2측면에 따른 항산화 및 항암용 약학적 조성물의 제조방법을 도 1을 참조하여 상세히 설명한다. 이때, 상기 도 1은 상기 항산화 및 항암용 약학적 조성물의 제조방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.

우선, 본원 발명의 일 구체예에 있어서, 약학적 조성물의 제조 시에 상기 먹물버섯 추출물은 먹물버섯 및 기타 버섯이 1차 추출 단계 이전에, 즉, 먹물버섯과 기타 버섯을 용매와 혼합하기 전에 서로 혼합하거나, 먹물버섯 및 용매의 혼합물과 기타 버섯과 용매의 혼합물을 서로 혼합한 후 1 내지 3차 추출 단계를 거치고, 농축 및 건조되어 제조되는 것일 수 있다. 또한, 먹물버섯 및 용매의 혼합물과 기타 버섯과 용매의 혼합물을 각각 추출기에 투입시켜 1차 추출하는 1차 추출 단계 이후에, 또는 2차 추출 단계 이후에, 서로 혼합하여 다음 단계를 진행하여 먹물버섯 추출물을 제조하는 것일 수도 있다. 또한, 3차 추출 단계 이후에 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 혼합시킨 후 다음 단계를 진행하여 먹물버섯 추출물을 제조하는 것일 수도 있다. 또한, 농축 단계 이후에, 각각 농축된 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 혼합한 후 건조시켜 먹물버섯 추출물을 제조하는 것일 수도 있다. 또한, 농축된 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 각각 건조한 이후에, 건조된 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 서로 혼합하여 먹물버섯 추출물을 제조하는 것일 수도 있다. 다만, 본 발명의 명세서에서는 이해를 돕기 위해 상기 농축 단계 이후에, 상기 농축된 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 혼합 후 건조 시키는 경우를 예로 들어 설명하도록 한다.

우선, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 제조방법은 먹물버섯 및 용매의 혼합물과 기타 버섯과 용매의 혼합물을 각각 추출기에 투입시켜 80℃ 내지 125℃의 온도에서 1차 추출하는 1차 추출 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

한편, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 추출기는 일반적으로 추출을 수행하는 기기를 사용하는 것일 수 있으며, 상기 추출은 바람직하게 열수 추출인 것일 수 있고, 유기용매를 가하여 추출하는 것일 수 있고, 추출 시 일정 속도로 진탕 또는 교반하여 추출하는 것일 수 있다. 한편, 상기 1차 추출단계는 80℃ 내지 125℃의 온도에서 3 시간 내지 12 시간 동안 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 125℃에서 3내지 8시간, 더욱 바람직하게는 121℃의 온도에서 약 3 시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 또한, 상기 1차 추출을 수행한 후, 상기 혼합물을 1차 냉각시키는 것일 수 있으며, 이때 상기 냉각은 상온의 온도에서 약 1 시간 동안 방냉시킴으로써 수행되는 것일 수 있다.

또한, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 기타 버섯 추출물은 표고버섯 추출물 및 영지버섯 추출물을 포함하는 것일 수 있다. 식용으로 널리 이용되고 있는 표고버섯에는 항암작용, 콜레스테롤 저하작용, 강장, 이뇨, 고혈압, 신장염, 천식, 위궤양 등의 치료에도 효능이 있어 약용으로도 널리 이용되고 있으며, 표고버섯 열수 추출물은 혈청 및 간장의 지질 저하 작용 및 간손상 억제작용이 보고된 바 있다. 특히, 영지버섯의 약효성분으로 열수 추출액에 함유되어 있는 다당류와 단백질 복합체인 polysaccharide protein complex가 보고된 바 있으며, 암세포 생육 억제, 본태성 고혈압 치료, 과산화지질 생성 억제 효과 등이 보고된 바 있다. 또한, 새송이버섯의 다당류 추출물은 혈청 콜레스테롤 저하효과 및 사염화탄소 유발 간손상 억제작용과 새송이버섯 자실체 및 균사체 추출물의 항산화효과가 있는 것으로 보고된 바 있다.

한편, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 기타 버섯 추출물은 표고버섯 추출물 및 영지버섯 추출물 외에, 새송이버섯, 팽이버섯, 느타리버섯, 양송이버섯, 상황버섯, 해송이버섯, 꽃송이버섯, 차가버섯, 노루궁뎅이버섯 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 버섯의 추출물을 더 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게 표고버섯 및 새송이버섯의 추출물을 더 포함하는 것일 수 있다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 제조방법은 상기 1차 추출시킨 먹물버섯 혼합물 및 기타 버섯 혼합물을 각각 60℃ 내지 100℃의 온도에서 2차 추출시키는 2차 추출 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 2차 추출은 바람직하게 열수 추출인 것일 수 있고, 유기용매를 가하여 추출하는 것일 수 있고, 추출 시 일정 속도로 진탕 또는 교반하여 추출하는 것일 수 있으며, 상기 2차 추출단계는 60℃ 내지 100℃의 온도에서 3 시간 내지 12 시간, 바람직하게는 70℃ 내지 90℃의 온도에서 3 시간 내지 8 시간, 더욱 바람직하게는 약 80℃의 온도에서 약 3 시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 또한, 상기 2차 추출을 수행한 후, 상기 혼합물을 2차 냉각시키는 것일 수 있으며, 이때 상기 냉각은 상온의 온도에서 약 1 시간 동안 방냉시킴으로써 수행되는 것일 수 있다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 제조방법은 상기 2차 추출시킨 먹물버섯 혼합물 및 기타 버섯 혼합물을 각각 40℃ 내지 80℃의 온도에서 3차 추출시켜 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 각각 제조하는 3차 추출 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 3차 추출은 바람직하게 열수 추출인 것일 수 있고, 유기용매를 가하여 추출하는 것일 수 있고, 추출 시 일정 속도로 진탕 또는 교반하여 추출하는 것일 수 있으며, 상기 3차 추출단계는 40℃ 내지 80℃의 온도에서 3 시간 내지 12 시간 동안 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 50℃ 내지 70℃의 온도에서 3 시간 내지 8 시간, 더욱 바람직하게는 약 50℃의 온도에서 약 3 시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 또한, 상기 3차 추출을 수행한 후, 상기 혼합물을 3차 냉각시키는 것일 수 있으며, 이때 상기 냉각은 상온의 온도에서 약 15 시간 동안 방냉시킴으로써 수행되는 것일 수 있다.

한편, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 제조방법은 상기 1 내지 3차 추출 단계 이후에 각각 또는 3차 추출 단계 이후에, 불순물을 제거하는 불순물 제거 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 불순물을 제거하는 방법으로는 통상의 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 구체적으로는 필터 여과, 원심 분리 등의 방법을 사용할 수 있다.

한편, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 제조방법은 세균, 곰팡이 등의 병원체를 제거하기 위한 멸균 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 멸균 단계는, 상기 1차 추출단계 이전에 포함될 수도 있고, 상기 1 내지 3차 추출 단계 이후에 각각 포함 될 수도 있고, 상기 3차 추출 단계 이후에 포함될 수도 있고, 하기 농축 단계 이후에 포함되는 것일 수 있고, 하기 건조 단계 이후에 포함되는 것일 수도 있다. 상기 멸균 단계에서 사용되는 세균, 곰팡이 등의 병원체를 제거하기 위한 방법으로는 통상의 방법을 제한없이 사용할 수 있으나, 구체적으로는 오토클레이브 등을 이용한 가압멸균 등의 방법을 사용할 수 있다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 제조방법은 상기 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 각각 농축기에 투입시켜 80℃ 이하의 온도에서 농축 시키는 농축 단계를 포함하는 것일 수 있다.

한편, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 농축기는 일반적으로 농축을 수행하는 기기를 사용하는 것일 수 있으며, 상기 농축은 바람직하게는 진공증발 농축인 것일 수 있다. 상기 농축 단계는 80℃ 이하의 온도에서 수행하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 약 60℃ 이하의 온도에서 수행하는 것일 수 있다. 또한, 상기 농축을 수행한 후, 상기 농축물을 냉각시키는 것일 수 있으며, 이때 상기 냉각은 상온의 온도에서 약 15 시간 동안 방냉시킴으로써 수행되는 것일 수 있다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 제조방법은 상기 농축된 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 혼합 후 건조 시키는 건조 단계;를 포함하는 것일 수 있다.

한편, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 건조 단계는 상기 농축된 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 유효성분의 활성이 저하되지 않는 방법이라면, 제한 없이 사용할 수 있다. 바람직하게는 통상의 건조 방법 중 하나인 동결건조, 진공건조 등의 방법을 사용할 수 있다.

다음으로, 본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 제조방법은 상기 먹물버섯 추출물 및 상기 기타 버섯 추출물의 혼합물 또는 상기 약학적 조성물을 경구투여용 제제로 제제화 하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 먹물버섯 추출물 및 상기 기타 버섯 추출물의 혼합물 또는 상기 약학적 조성물을 일반적으로 알려져있는 종래의 방법을 이용하여, 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 고형 제제로 제제화 하는 것일 수 있으며, 또한, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등의 액상제제로 제제화 하는 것일 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[제조예 1] 먹물버섯 추출물의 제조

먹물버섯 추출물을 제조하기 위해, 먹물버섯 자실체 100g을 37℃에서 일주일간 완전히 성숙시켜, 자가소화를 유발한 후 10℃에서 일주일간 후숙 시킨다. 이후 4℃에서 2주간 정치시켜 먹물버섯의 세포벽을 분해시키고 남아있는 버섯을 믹서기로 분쇄하여 버섯 분쇄물을 얻었다. 먹물버섯의 분쇄물 50g과 121℃의 열수 500g을 혼합한 후 3시간 동안 121℃에서 열수 추출하여, 1차 추출을 수행하였다. 이후, 1차 추출을 수행한 상기 혼합물을 상온에서 1시간 냉각한 후, 다시 80℃가 되도록 열수를 가한 후, 3시간 동안 80℃에서 열수 추출하여, 2차 추출을 수행하였다. 이후, 2차 추출을 수행한 상기 혼합물을 상온에서 1시간 냉각한 후, 다시 50℃가 되도록 열수를 가한 후, 3시간 동안 50℃에서 열수 추출하여, 3차 추출을 수행하였다. 이후, 3차 추출을 수행한 상기 혼합물을 상온에서 15시간 냉각한 후, 3 m filter paper로 여과하여 불순물을 제거한 후, 8,000rpm으로 30분간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 상기 혼합물의 침전물을 제거한 뒤, 121℃에서 3시간동안 가압멸균하고 이를 모두 모아 회전식 진공증발 농축기로 60℃ 이하에서 농축하여 먹물버섯 추출물을 제조하였다.

[제조예 2] 기타 버섯 추출물의 제조

기타 버섯 추출물은 상기 제조예 1의 먹물버섯 분쇄물 대신 영지버섯 분쇄물 20 g, 표고버섯 분쇄물 20 g 및 새송이 버섯 분쇄물 10 g을 사용한 것을 제외하고는 동일하게 제조하였다

[제조예 3] 먹물버섯 추출물의 제조

상기 제조예 1 및 제조예 2에서 제조한 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 2:1의 중량비율로 혼합한 후, 이를 회전식 진공증발 농축기로 60℃ 이하에서 완전히 건조시켜 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물(이하, 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물)을 제조하였다. 제조된 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물은 -20℃에 보관하였다.

[실험예 1] 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 전당량 측정

먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 전당량은 phenol-sulfuric acid 법으로 측정하였다. 즉 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물과 표준용액을 1 ml 씩 각각 분주한 시험관에 5% 정제 페놀수를 1 ml 첨가하여 잘 혼합하고 진한 황산 5 ml을 첨가하여 발열반응에 의하여 발색시켜 30분 경과 후 470 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. 전당량을 정량하기 위해 표준물질인 glucose를 일정한 농도별로 조제하고 시료와 동일한 방법으로 실험하여 검량선을 작성하고 시료의 전당량을 측정하였다. 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 전당량은 13 mg/ml 로 확인되었다.

[실험예 2] 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 박층 크로마토그래피법을 통한 다당체 측정

먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 다당체를 확인하기 위하여 박층 크로마토그래피법(TLC 법)을 사용하였다. TLC는 silica gel plate (25DC-Alufolien Kieselgel 60, Merck Co., ltd.)를 사용하였으며, 전개용매로는 1-butanol/ethanol/water (5:5:3)을 이용하여 전개시켰다. 전개가 완료된 plate를 완전히 건조시킨 후, methanol에 3% 황산을 침가한 발색 용액을 도포한 후 l00℃ 이상의 hot plate 위에 놓고 10분 간 가열하여 발색하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었으며, 고분자 및 저분자량의 다당체가 혼재되어 있는 것이 확인되었다. 이때 사용한 표준물질은 standard malto-oligosaccharides (G1-G7) 로서 Gl, G2, G3, G4, G5, G6 및 G7은 각각 glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose 및 maltoheptaose 였다.

[실험예 3] 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 동물실험 안정성 검사

설치류인 mouse 는 효창사이언스로부터 BALB/c mouse 7 주령을 구입하여 사용하였다. 구입한 mouse 는 정상 식이를 공급하여 1 주일간 순화시킨 후, 군당 분배하여 케이지에 넣은 후 온도 22 ± 2℃, 습도 50 ± 5%, 명암주기 12시간 (명기: 07:00-19:00, 암기: 19:00-07:00) 으로 자동 제어되는 동물 사육실에서 스트레스를 받지 않도록 주의하면서 사육하였다. 1 주일간 순화 후 mouse (n=6) 에 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 1 ml을 사료에 혼합하여 3 주간 매일 섭이하였다.

Mouse 의 체중변동을 주 3 회 측정한 결과를 표 1 및 도 3에 나타내었다. 5 주 동안의 평균 체중 중가량은 수컷 대조군(control male, CM) 4.25 g, 암컷 대조군(control female, CF) 4.12 g, 수컷 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 처리군(C. comatus extracts and other mushroom extracts fed male, TM) 3.52 g, 암컷 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 처리군(C. comatus extracts and other mushroom extracts fed female, TF) 3.94 g 이었다. 또한 실험 기간 중에 사망한 동물은 없었다.

[실험예 4] 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 폴리페놀 함량 측정

먹물버섯 추출물 2ml 과 기타 버섯 추출물 1ml를 혼합하여, 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 3 ml을 제조하였다. 상기 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물에 Folin-ciocalteau's phenol reagent 0.2 ml를 첨가하여 잘 혼합하고 3분간 실온에서 방치하였다. 정확히 3분 반응 후 Na₂CO₃ 포화용액 0.4 ml을 가하여 혼합하고 증류수를 첨가하여 4 ml로 만든 후, 실온에서 1시간 방치하여 상층액을 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 폴리페놀 함량을 정량하기 위하여 표준물질인 tannic acid를 일정한 농도로 조제하고 시료와 동일한 방법으로 실험하여 검량선을 작성하여 시료의 폴리페놀 함량을 측정하였다. 측정된 총 폴리페놀 함량은 0.73%로 확인되었다.

[실험예 5] 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 DPPH 법에 의한 항산화 활성 측정

DPPH 시약 16 mg을 100 ml 에탄올에 녹인 후, 증류수 100 ml을 첨가하여 whatman paper로 필터한 용액 5 ml에, 농도별로 희석한 시료(sample)와 표준시약인 BHT (2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol, Sigma)를 각각 1 ml 씩 첨가하여 혼합한 후 30분간 상온에서 방치한 뒤, 528 nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 농도별로 희석한 시료는 0.004% 먹물버섯 추출물 및 0.002% 기타 버섯 추출물을 각각 50, 150, 300, 500 μl씩 취한 후 혼합하여 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 시료 100, 300, 600, 1000 μl을 제조하였으며, 각각의 시료에 증류수를 가해 최종 부피를 1ml로 맞춰, 농도별로 희석한 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 시료를 제조하였다. 또한, BHT용액 및 0.005% 비타민(Vitamin) C를 각각 100, 300, 600, 1000 μl 씩 취하여 증류수로 최종 부피를 1 ml로 맞춰 상기 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 시료의 항산화 활성 측정을 위해 농도별로 희석한 BHT 및 비타민 C 시료를 제조하였다. 추출물 무첨가구에는 시료 대신 증류수 1 ml을 첨가하여 동일하게 실험하고 추출물 첨가구에 대한 흡광도의 감소 비율을 아래의 식으로 전자공여능(EDA, electron donating ability)을 구하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

[식 1]

* EDA (electron donating ability, %) = (1-

) × 100

도 4에 나타낸 바와 같이, 농도의 차이는 있지만 천연물인 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 항산화 효과가 대표적인 합성 항산화제인 BHT와 vitamin C 보다 높은 것으로 확인되었다. 이 결과는 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 강력한 항산화 효과는 합성 항산화제의 독성, 저활성 및 용도의 한계성 등의 여러 가지 문제로 인한 사용제한을 해결할 수 있는 장점이라고 볼 수 있다.

[실험예 6] 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 Hemocytometer 를 이용한 세포 생존율 측정

AGS, HeLa, HCT-15 및 293 세포를 2 x 10⁵ cells/ml 농도가 되도록 조절하여 6 well culture dish 에 각각 0.5 ml씩 분주하고 배양배지 2.5 ml를 첨가하여 37℃, 5% CO₂incubator에서 6시간 동안 배양하여 세포를 plate 바닥에 부착시킨 후, 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 0.5 mg/well을 첨가하였다. 이를 4일간 배양하면서 시간대별 (24, 48, 72, 96 시간)로 세포수를 측정하였다. 이 때 모든 세포는 3회 반복 측정하였으며, 살아있는 세포수를 조사하기 위하여 trypan blue dye exclusion 법을 이용하여 염색되지 않은 세포를 계수하였다. 배양세포에 1 ml의 0.05% trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 dish 바닥에서 부유시킨 후 10 ml의 PBS buffer로 씻어 원심분리하고 상층액을 제거한 후 PBS buffer 50 μl를 첨가하여 세포를 현탁하고, 0.4% trypan blue stain (Gibco, USA) 50 μl에 넣어 섞고, 1분 후 hemocytometer로 세포수를 측정하였다. 이때 시료를 첨가하지 않는 대조군의 세포수를 100%로 정하고 시료 첨가군의 상대적인 증감률을 산출하여 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 세포독성을 평가하였다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 암세포인 AGS, HeLa, HCT-15 세포의 생존율은 각각 2%, 35%, 18%로 암세포 증식이 크게 억제되었으며, 정상 세포인 293 세포는 88%의 생존율을 나타내었다.

[실험예 7] 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 MTT assay를 이용한 세포 생존율

MTT (3-［4,5-dimethylthiazol-2-yl］-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma, USA)는 대사과정이 온전한 살아있는 세포의 미토콘드리아 내막에 존재하는 oxido-reductase의 효소 작용에 의해 환원되어 보라색의 불용성 formazan을 생성한다. 이렇게 생성된 formazan을 용해시켜 그 발색 정도를 흡광도로 측정함으로 살아있는 세포의 농도를 계산할 수 있다. 본 실험에서는 2 x 10⁵ cells/ml 농도가 되도록 조절한 세포를 96 well plate에 100 μl씩 분주하고 이것을 37℃, 5% CO₂incubator에서 6시간 배양하여 세포를 부착시킨 후 0, 10, 20, 30, 50, 100, 150 μg 농도로 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물을 첨가하였다. 4일간 37℃, 5% CO₂incubator에서 배양시킨 후, PBS buffer로 희석한 5 mg/ml 농도의 MTT 용액을 각 well 당 10 μl씩 넣고 37℃, 5% CO₂incubator에서 4시간 동안 방치하였다. 생성된 MTT formazan을 용해하기 위해 solubilization solution (0.04 N HCl in isopropanol)을 각 well 당 100 μl씩 첨가하고, dark blue crystal을 피펫트만을 이용하여 용해시킨 후 ELISA-reader (Bio-Rad Model 550 Microplate Reader, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 293, AGS, HeLa, HCT-15 세포의 생존율은 도 6 및 표 2에 나타내었다. 이러한 결과는 hemocytometer를 이용한 세포 생존율 실험 결과와 동일한 경향으로서 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 항암 효과를 재확인 할 수 있었다.

(μg)	0	10	20	30	50	100	150
	세포 생존률 (Cell viability) ( % )
293	100	98.04	92.24	85.12	72.36	69.57	45.91
AGS	100	91.35	49.27	14.18	7.19	4.28	3.91
HeLa	100	78.25	62.15	20.24	6.75	5.92	5.28
HCT-15	100	82.14	61.24	14.85	10.11	9.00	8.21

[실험예 8] 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 투여에 따른 종양세포주의 DNA 단편화

일반적으로 세포사(apoptosis)의 생화학적인 측정법으로서 알려져 있는, DNA의 nucleosome 단위로의 단편화를 관찰하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다. AGS, HeLa, HCT-15 및 293 세포를 2 x 10⁶ cells/ml 농도가 되도록 조절하여 100 mm tissue culture dish에 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 6 시간 동안 배양하여 세포를 plate 바닥에 부착시킨 후, 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 500 μg을 첨가하였다. 4 일간 배양한 세포의 상층 배지를 제거하고, 배양세포에 1 ml 의 0.05% trypsin-EDTA 를 처리하여 세포를 dish 바닥에서 부유시킨 후 10 ml 의 PBS buffer로 씻어 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 20 배의 HMW-proteinase K (10 mM Tris - HCI (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA (pH 8 .0), 0.1% SDS, 100 μg/ml proteinase K) buffer를 첨가하여 55℃에서 90분간 반응시켜 세포를 용해시켰다. 세포 용해액에 동량의 phenol을 처리하여, 원심분리에 의하여 남아있는 세포막과 단백질 등을 제거하고, 2 배의 에탄올을 가한 후 원심분리하여 (10,000 rpm, 10 min) DNA를 회수하였다. 70% 에탄올로 세척, 건조 후 TE buffer에 녹여서 일정량을 1.5% agarose gel 에서 90분 (50 V) 동안 전기 영동 한 다음 DNA 단편화 현상을 관찰하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 그 결과 정상세포(293)와 암세포인 AGS, HeLa, HCT-15에서 추출된 DNA는 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 처리 전·후의 차이가 없는 것으로 나타나 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 처리를 통해 나타난 세포 사멸은 apoptosis 기전에 의한 DNA 붕괴가 아닌 신호전달 또는 전사조절 등에 의해 유도되는 것으로 사료된다.

[실험예 9] 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물의 항종양 효과 측정

생후 6주령으로 체중 24 내지 27 g 내외의 BALB/c mouse (male) 20 마리를 효창사이언스로부터 분양받아 온도 22 ± 2℃, 습도 50 ± 5%, 명암주기 12 시간(명기: 07:00-19:00, 암기: 19:00-07:00)으로 자동 제어되는 동물 사육실에서 1주일간 순화시킨 후, mouse한 마리당 1 X 10⁸개의 배양 세포를 100 μl의 PBS에 현탁하여 mouse의 서혜부 피하에 주사하여 종양을 유발하였다. 종양 유발 mouse를 무작위로 2군 [Control; 종양세포 주입, CM; 종양세포 주입 후 종양 발생을 확인하고 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 식이(먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 처리군), 각 group (n=lO)]으로 분류하여 각각 다른 케이지에 넣고 사육하였다. 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 처리군은 종양이 발생한 것을 확인한 다음 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 1 ml을 사료에 혼합하여 5주간 매일 투여하였다.

종양세포 이식 후 12 시간까지 매 시간 동물의 활동성과 외부 반응을 관찰하고, 이식 다음 날부터 5주간 주 3회 mouse의 체중 변동과 종양의 성장 (tumor volume (mm³); 장경 × [단경]² × 1/2)을 측정하였다. 실험 기간 동안 육안적인 관찰에서 종양 발생 시 활동성이 떨어지는 것이 확인되었다. 5주간의 체중 변동을 측정한 결과에서 체중의 평균 증가량은, 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군(control male) 5.7 g, 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 처리군(TM) 4.6 g으로 각각 22.3%, 17.6%의 증가를 보여 대조군과 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 식이군 간의 체중 증가량은 별다른 차이를 보이지 않았다.

종양세포 이식 후 5주간 종양의 성장을 측정한 결과에서 대조군은 모두 종양을 가지고 있었으며 시간이 경과함에 따라 점차 종양의 크기가 증가하는 경향을 보인 반면, 먹물버섯 및 기타 버섯 혼합물 처리군 (TM)은 세포 이식 2∼3주 후에 4 마리에서 종양이 점점 작아지면서 사라지고 6마리에서만 종양이 관찰되었으며 이들 종양 또한 종양세포 이식 3주 후부터 종양의 크기가 대조군에 비해 통계적으로 유의있게 감소하는 것을 확인하였으며, 이와 같은 결과를 도 9에 나타내었다. 그러므로 먹물버섯 추출물은 종양 세포의 성장억제에 효과가 있음을 알 수 있었다.

이상, 도면을 참조하여 바람직한 실시예와 함께 본 발명에 대하여 상세하게 설명하였으나, 이러한 도면과 실시예로 본 발명의 기술적 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 다양한 변형예 또는 균등한 범위의 실시예가 존재할 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 기술적 사상의 권리범위는 청구범위에 의해 해석되어야 하고, 이와 동등하거나 균등한 범위 내의 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

1. 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물로서,
   상기 기타 버섯 추출물은 표고버섯 추출물, 영지버섯 추출물 및 새송이버섯 추출물을 포함하고,
   상기 약학적 조성물은 암세포의 증식을 저해하고,
   상기 약학적 조성물은 T세포의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서,
   상기 기타 버섯 추출물의 함량은 먹물버섯 추출물 100 중량부 대비 50 중량부 내지 150 중량부인 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 항암용 약학적 조성물은 부형제, 희석제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 방향제, 향미제, 보존제, 천연 탄수화물 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 첨가제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 첨가제의 함량은 상기 약학적 조성물 총 중량에 대하여, 0.001 중량% 내지 99.999 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물.
7. 삭제
8. 삭제
9. 먹물버섯 및 용매의 혼합물과 기타 버섯과 용매의 혼합물을 각각 추출기에 투입시켜 80℃ 내지 125℃의 온도에서 1차 추출하는 1차 추출 단계;
   상기 1차 추출시킨 먹물버섯 혼합물 및 기타 버섯 혼합물을 각각 60℃ 내지 100℃의 온도에서 2차 추출시키는 2차 추출 단계;
   상기 2차 추출시킨 먹물버섯 혼합물 및 기타 버섯 혼합물을 각각 40℃ 내지 80℃의 온도에서 3차 추출시켜 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 각각 제조하는 3차 추출 단계;
   상기 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 각각 농축기에 투입시켜 80℃ 이하의 온도에서 농축 시키는 농축 단계; 및
   상기 농축된 먹물버섯 추출물 및 기타 버섯 추출물을 혼합 후 건조 시키는 건조 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물의 제조방법으로서,
   상기 기타 버섯은 표고버섯, 영지버섯 및 새송이버섯을 포함하고,
   상기 약학적 조성물은 암세포의 증식을 저해하고,
   상기 약학적 조성물은 T세포의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물의 제조방법.
10. 삭제
11. 제9항에 있어서,
    상기 항암용 약학적 조성물의 제조방법은,
    상기 먹물버섯 추출물 및 상기 기타 버섯 추출물의 혼합물을 경구투여용 제제로 제제화 하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항암용 약학적 조성물의 제조방법.

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