KR101187310B1

KR101187310B1 - 진피 추출물을 포함하는 2형 당뇨 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101187310B1
Application number: KR1020100042574A
Authority: KR
Inventors: 성기준; 정희경; 정유석; 박치덕; 박창호; 홍주헌; 최명숙; 심상필; 정지은
Original assignee: 주식회사 푸드웰
Priority date: 2010-05-06
Filing date: 2010-05-06
Publication date: 2012-10-05
Also published as: KR20110123105A

Abstract

본 발명은 진피 추출물을 포함하는 2형 당료 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 진피 추출물은 산화적 스트레스로부터 췌장 세포의 회복을 통해 인슐린 분비를 증대시키는 항산화적 방어로 2형 당뇨의 β-세포 질량의 감소와 인슐린 저항성을 개선시킬 수 있는 효과가 있다.

Description

진피 추출물을 포함하는 2형 당뇨 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising Citrus peel extract for the prevention and treatment of Type 2 Diabetes}

본 발명은 진피 추출물을 포함하는 2형 당뇨 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 진피추출물의 산화적 스트레스로 손상된 췌장 세포의 항산화적 방어를 2형 당뇨의 β-세포 질량의 감소와 인슐린 저항성을 개선시킬 수 있는 조성물에 관한 것이다.

당뇨병은 비만과 함께 국민 보건 상 위협을 가하는 만성질환으로 매해 그 발병률이 증가되고 있다. 당뇨병은 1형 당뇨와 2형 당뇨로 두 가지로 나누어 볼 수 있으며, 인슐린 의존성인 1형 당뇨병은 어린이에게 일반적으로 나타나는 것으로 자가 면역 장애에 의해 선천적으로 베타세포에서 인슐린 생산을 할 수 없는 경우를 말한다. 반면, 주로 성인에서 나타나는 인슐린 비의존형 당뇨인 2형 당뇨는 인슐린에 대한 말초조직의 저항성이 증가에 의해 인슐린에 의한 포도당 이동이 감소된 것이다.

최근 버틀러(Butler) 등은 2형 당뇨에서 인슐린 분비의 감소는 β-세포의 복제나 아폽토시스 경로에 불균형이 야기되어 상대적으로 β-세포의 아폽토시스가 증가하여 일어나는 것으로 보고하고 있다. 또한 β-세포의 아폽토시스는 혈중 포도당 농도에 의해 촉진되는 것으로 알려져 있으며, 고농도 포도당에 β-세포의 장기간 노출은 인슐린 유전자 발현을 감소시켜 β-세포의 손상이 일어나도록 하는 포도당 독성(glucose toxicity) 현상을 일으킨다. 이 뿐만 아니라 사이토카인 자극 후 유도되는 반응성 산소종(reactive oxygen species; ROS)과 산화질소(NO)도 β-세포의 손상에 영향을 주는 것으로 알려지고 있는데 특히, ROS는 인슐린 합성을 억제하고 아폽토시스를 유도 시키는 것으로 알려져 있다. 즉, 2 형 당뇨에 있어 산화적 스트레스는 β-세포의 손상을 증가시킬 수 있다는 것으로 2형 당뇨 환자 혈청에서 조직의 산화적 스트레스 마커인 8-하이드록시-데오시구아니넴(8-hydroxy-deocyguaninem), 4 하이드록시-2-노네아날 단백질(4 hudroxy-2-noneanal protein), 8-에피드-프로스타글란딘(8-epid-prostaglandin) F2α 등이 증가되었다는 보고도 있다. 따라서 2형 당뇨환자에 있어 β-세포의 기능을 보존하여 인슐린 저항성을 개선의 한 방법으로 비타민 E나 리포산(lipolic acid)과 같은 항산화 섭취를 제안이 되기도 하였다.

종래 2형 당뇨의 치료와 관련하여 대한민국 특허출원 제10-2005-0097421호에 디벤조-p-디옥신(dibenzo-p-dioxine) 유도체를 유효성분으로 포함하며, NFkB의 활성을 억제하는 특성을 갖는 제 2형 당뇨 및 당뇨 합병증의 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 특허출원 제10-2009-7017062호에 스타틴과 병용하여, L-카르니틴 및/또는 알카노일 L-카르니틴의 2형 당뇨 및 그의 합병증의 치료용 조성물이 개시되어 있다. 또한 대한민국 특허출원 제10-2007-0036778호에 제2형 당뇨치료 효과가 있는 상황 버섯 균사체 유래의 항당뇨 활성 세포외다당체 및 그 제조방법이 개시되어 있다.

한편 동양에서 오래전부터 사용해 온 몇 가지 식물들은 질환 치료를 위해 이용되고 있다. 특히, 이러한 식물에는 플라보노이드나 폴리페놀 등의 생리 활성 물질(phytochemical)과 같은 기능성 물질을 가지고 있는데 이러한 물질은 항산화 활성이 아주 우수하다. 이러한 천연물로부터 항산화제를 찾으려는 많은 연구들이 진행되고 있으며, 최근 2형 당뇨 환자에서 산화적 스트레스에 의한 췌장 세포의 손상과 이로 인한 인슐린 분비 기능저하에 대해 항산화 활성을 가지는 식물자원을 이용하여 췌장 세포 보호하고자 하는 연구들이 진행되고 있다.

천연 소재 중 하나인 감귤 과피인 진피는 오래전부터 한약재로서 이용되어 왔으며, 페놀성 화합물과 플라보노이드 함량이 높으며, 이러한 식물성 생리활성물질에 의해 항산화 활성이 우수하다고 보고되고 있다. 또한 복 등의 연구에 따르면 진피는 혈중 콜레스테롤 및 간에서 콜레스테롤 합성을 저하에도 효과가 있는 것으로 나타났다. 국내에서 감귤은 2008년 63.6만톤으로 국내에서 생산량이 가장 높은 과일로 이에 따라 처리해야하는 감귤의 부산물인 감귤 과피, 즉 진피양도 많은 실정이다.

진피의 약리학적 용도와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-0732564호 “진피 추출물을 주요 활성 성분으로 함유하는 피부외용제 조성물”, 대한민국 등록특허 제10-0665503호 “진피 추출물을 포함하는 허혈성질환 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 조성물”, 대한민국 등록특허 제10-0720671호 “진교, 진피 및 황련 추출물을 함유하는 제Ⅳ형 알레르기 및 염증 치료용 조성물” 등이 공지되어 있으나, 아직까지 진피 추출물을 이용한 항당뇨에 관한 연구는 행하여진 바 없다.

이로부터 본 발명자들은 진피의 항산화 효과를 통해 췌장세포의 손상 회복하고 인슐린 분비를 개선 할 수 있는지를 조사하여, 2 형 당뇨에 있어 산화적 스트레스 저하를 통한 β-세포의 손상을 예방 할 수 있는 기능성 소재 이용 가능성을 조사하고 본 발명에 이르게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 진피 추출물을 유효성분으로 함유하는 2형 당뇨 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 진피 추출물을 유효성분으로 함유하는 2형 당뇨 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적은 진피로부터 주정 추출물을 제조하고, 상기 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량을 측정하여 항산화 활성을 확인하고, 이러한 진피 추출물을 통한 항산화적 방어가 알록산(alloxan)으로 산화적 스트레스를 유도한 췌장 세포에서 췌장 세포의 회복과 인슐린 분비능이 개선되어 2형 당뇨의 β-세포 질량의 감소와 인슐린 저항성이 개선시킬 수 있음을 확인함으로써 달성되었다.

본 발명은 진피 추출물을 유효성분으로 함유하는 2형 당뇨 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 진피 추출물을 유효성분으로 함유하는 2형 당뇨 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 유효성분이라 함은 내재된 약리작용에 의해 그 의약품의 효능효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군(약리학적 활성성분 등이 밝혀지지 않은 생약 등을 포함한다)으로서 주성분을 포함하는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 진피 추출물을 포함하는 약제학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 진피 추출물을 포함하는 약제학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 진피 추출물을 포함하는 약제학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 진피 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 진피 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 진피 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사 및 피부에 직접 투여될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 진피 추출물은 2형 당뇨의 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 진피 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등이 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 진피 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 진피 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 진피 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 진피 추출물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 진피 추출물은 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명에 따른 진피 추출물은 산화적 스트레스로부터 췌장 세포의 회복을 통해 인슐린 분비를 증대시키는 항산화적 방어로 2형 당뇨의 β-세포 질량의 감소와 인슐린 저항성을 개선시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 HIT-T15 세포에서 다양한 농도의 알록산에 의한 세포 생존력 효과를 나타낸 그래프이다. 각 데이터는 3회의 개별 실험으로 평균(bar) ± SD (error bar)로 나타내었다.
도 2는 HIT-T15 세포에서 진피 추출물에 의한 세포 생존력 효과를 나타낸 그래프이다. 각 데이터는 3회의 개별 실험으로 평균(bar) ± SD (error bar)로 나타내었다.
도 3은 알록산에 의해 손상된 HIT-T15 세포에서 진피 추출물에 의한 세포 생존력 효과를 나타낸 그래피이다. 각 데이터는 3회의 개별 실험으로 평균(bar) ± SD (error bar)로 나타내었다. 각 수치는 p<0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 여겼다. 정상군은 DMSO로 처리하였고, 대조군에는 DMSO 및 11 mM 알록산(IC₅₀)을 첨가하였다. HIT-T15 세포를 알록산으로 처리하기 전에 진피 추출물을 37℃에서 1시간 동안 전배양하였다.
도 4는 알록산에 의해 손상된 HIT-T15 세포에서 진피 추출물에 의한 인슐린 분비의 효과를 나타낸 그래프이다. 각 데이터는 3회의 개별 실험으로 평균(bar) ± SD (error bar)로 나타내었다. 각 수치는 p<0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 여겼다. 정상군은 DMSO로 처리하였고, 대조군에는 DMSO 및 11 mM 알록산(IC₅₀)을 첨가하였다. HIT-T15 세포를 알록산으로 처리하기 전에 진피 추출물을 37℃에서 1시간 동안 전배양하였다. 인슐린 분비는 HIT-T15 세포 배양액의 상등액으로 측정하였다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 진피 추출물의 제조

본 실시예에서는 진피로부터 추출물을 제조하였다. 사용된 진피는 옴니허브(경북)에서 구매하여 이용하였다, 실험 시료는 진피 83.75 g에 80% 주정을 1 L 첨가하고 24시간 동안 60℃에서 추출하고 이를 방냉 한 후 여과지(Whatman paper NO. 2)로 여과하였다. 이 여과액을 감압농축기(Rotary Vacuum Evaporator, N-1000, EYELA, Japan)로 농축하고 40℃에서 농축한 후 농축된 시료를 동결건조기(Freeze Dryer, PVTFD10R, Ilshin lab, Korea)로 -40℃에서 동결건조 하여 동결 건조한 분말을 DMSO에 용해하여 시험 시료로 이용하였다. 이 때 수율은 동결 건조 후 무게를 측정하여 원료량에 대한 백분율로 계산하였다. 그 결과 진피의 주정 추출 수율은 30.74%였다.

실시예 2 : 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량 분석

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 제조한 진피 추출물의 총 폴리페놀 함량을 폴린-치오칼(Folin-ciocal) 법을 이용하여 정하였다. 실험 시료는 증류수를 이용하여 3배 희석한 희석액을 이용하였으며, 희석액 1mL에 5 mL 1/10 폴리-치오칼 시약(Sigma., U.S.A) 첨가하고 상온에서 5분간 반응시킨 후 7.5% 탄산 나트륨(NaCO₃)를 4mL 첨가하였다. 그 후 상온에서 1시간 반응시킨 후 765nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이 때 각 추출액의 자체 흡광도도 측정하여 시료에 의한 흡광도 값을 제거하고 탄산(tannic acid)를 표준곡선을 이용하여 진피 동결건조 분말의 폴리페놀 함량을 정량하였다.

이어서 진피 추출물의 총 플라보이드 함량을 Jia(12)등의 방법을 변형하여 측정하였다. 각 시료 1ml에 5% 질산 나트륨 용액(NaNO₂) 150 uL를 넣어 상온에서 5분간 반응시켰으며 10% 염화 제3알루미늄 용액(AlCl₃) 300 uL를 첨가하여 상온에서 5분간 반응시킨 뒤 1M-수산화나트륨(NaOH)를 1 mL 넣어 혼합한 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 진피 동결건조 분말의 총 플라보노이드 함량은 루틴 (rutin)을 정량하여 작성한 표준 곡선으로 mg/g으로 나타내었다.

그 결과, 진피 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 각각 57.00±2.91 mg/g, 8.11±2.83 mg/g으로 나타났다.

진피 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량, 및 DPPH 라디칼 소거 활성

총 폴리페놀 함량(mg/g)	57.00±2.91
총 플라보노이드 함량(mg/g)	8.11±2.83
전자공여능(EDA, %)	14.82±2.04

실시예 2 : 항산화 활성 분석

본 실험예에서는 진피 추출물의 항산화능을 DPPH법(13)에 따라 전자공여능(electron donating activity, %)으로 나타내었다. DPPH 시약 5 mL에 각 시료를 0.5 mL 첨가한 후, 상온에서 15분간 반응 시킨 뒤 마이크로플레이트 리더기(microplate reader; UVM340, ASYS., AU)을 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 시료를 첨가하지 않은 대조구와 함께 측정하였으며, 시료구와 대조구의 흡광도 값을 가지고 다음 식을 이용하여 전자공여능을 백분율로 나타내었다.

EDA(%)=(1-A/B)ⅹ100 (A: 시료구 /B: 대조구)

그 결과 진피 추출물의 전자공여능에 의한 항산화 활성은 8.11±2.83으로 나타났다.

실험예

진피 추출물에 의한 산화적 스트레스에서 췌장세포와 인슐린 분비 회복을 측정하기 위해 햄스터 췌장 β-세포(Hamster pancreatic β-cell)인 HIT-T 15를 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하여 이용하였다. 상기 HIT-T15는 10% FBS 및 100 unit/mL 페니실린, 100 ng/mL 스트렙토마이신을 첨가한 RPMI-1640에 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다.

진피 동결건조 분말의 처리 농도 결정은 HIT-T15에 대한 세포 독성 검사를 MTT를 이용하여 측정하였다. 즉, 24 웰 플레이트에 웰 당 10⁴개의 세포를 분주한 다음 24시간 배양하고 진피 동결건조 분말을 DMSO에 용해시켜 첨가한 다음 24시간 추가하여 배양 시켰다. 그 다음 각 웰에 MTT(5 mg/mL)을 첨가하고 4시간 반응 후 상등액을 제거하고 DMSO 300 uL를 첨가하여 포르마잔을 충분히 용해시켜 마이크로플레이트 리더기(microplate reader; UVM340, ASYS., AU)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 무처리군을 100%로하여 세포성장 억제율을 측정하였다.

한편, 알록산에 의해 유도된 HIT-T15 손상으로부터 진피에 의한 췌장 세포 손상 억제에 대하여 조사하기 위해 HIT-T15를 24 웰 플레이트에 웰 당 10⁴개의 세포를 분주하고 DMSO에 용해한 진피 동결분말을 37℃에서 1시간동안 처리 한 후 다시 알록산을 첨가하여 1시간 동안 37℃에서 추가 반응 시킨 후 HIT-T15 세포에 대한 세포 생존율은 MTT 분석을 통해 측정하였다. 또한 이때 상등액에 분비된 인슐린의 양은 키트(Mercordia high range rat insulin ELISA; Mercodia AB, Sweden)을 사용하여 측정하였으며, 단백질의 량은 브래드포드 시약(Bradford reagent; Thermo, USA)를 이용하여 조사 한 후 최종적으로 단백질당 인슐린 분비량으로 나타내었다.

실험예 1 : 알록산 처리 농도에 따른 HIT - T15 의 세포독성 효과

알록산은 생체 내에서 다양한 환원물질에 의해 디알루르산(dialuric acid)으로 환원되나 디알루르산은 불안정하여 산소 존재 시 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical) 및 과산화수소(hydrogen peroxide) 등의 생성과 함께 다시 알록산으로 산화된다. 이에 본 실험예에서는 알록산으로 유도된 산화적 스트레스 아래에서 진피 추출물에 의해 HIT-T15 세포 손상에 보호 할 수 있는지를 조사하여 보았다.

HIT-T15의 2형 당뇨에서 산화적 손상을 유도하기 위해 도 1에 나타낸 바와 같이 알록산 농도 1-15 mM까지 HIT-T15에 처리한 결과, 알록산 처리 농도가 증가됨에 따라 HIT-T의 세포 세포 생존력은 감소하였으며, 알록산 11.58 mM에서 약 50%의 세포 독성효과가 일어남을 확인하였다.

실험예 2 : 진피 추출물에 의한 HIT - T15 세포 독성 효과

본 실험예에서는 알록산으로 산화적 손상이 유도된 HIT-T15세포에서 진피 추출물에 대한 조사하기 위해 진피 추출물 처리 농도를 결정하고자 진피 추출물을 다양한 농도로 HIT-T15 세포에 처리하고 MTT 환원반응을 가지고 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과, 진피 주정 추출물 0.125 ? 0.75 mg/mL을 농도에서 무처리구의 세포생존율의 100.90±1.51 ? 97.56±0.73%을 나타내어 진피 주정 추출물 0.75 mg/mL까지는 독성이 없는 것으로 나타났다. 따라서 HIT-T15 세포에 진피 처리 농도는 0.125 ? 0.75 mg/mL로 결정하였다.

실험예 3 : 진피 추출물의 산화적 손상된 HIT - T15 에 대한 영향

상기 결과를 기초로 하여 진피 주정 추출물을 0.125, 0.25, 0.5, 0.75 mg/mL 농도로 처리하고 HIT-T15의 산화적 손상 유도하여 50%의 세포 손상을 일으킬 수 있는 알록산 11 mM을 처리하여 세포 손상정도를 세포 생육으로 조사하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 IC₅₀ 농도인 알록산 11 mM을 처리한 대조구에서 52.41±5.73%의 세포 생육을 보였다. 그러나 0.125, 0.25, 0.5 mg/mL 농도의 진피 주정 추출물을 처리한 결과, 알록산에 의해 유도된 산화적 세포손상으로부터 보호되어 세포 생존율이 각각 80.52±3.29, 74.17±6.75, 67.53±5.8%로 유의성 있게 증가 되었다. 산화적 스트레스는 β-세포의 기능 파괴를 유도하여 포도당 독성(glucose toxicity)을 일으키는데 고혈당 상태에서 해당작용을 통해 포도당-6 포스페이트, 과당과 같은 환원당의 생산은 증가되며, 이들은 단백질 당화 반응을 촉진하면서 반응성 산소종을 생산되고 이런 것들이 또 다시 조직 손상을 일으킨다. 즉, 2형 당뇨에서 산화적 스트레스에 대한 보호 없이는 반복적인 β-세포 기능의 손상을 일으킬 뿐이다. 따라서 종래 칸네토(Kanneto) 등은 당뇨에서 항산화제 처리는 β-세포 질량 증가와 인슐린 분비 증가를 시킬 수 있다고 보고하였다. 따라서 진피 추출물 처리에 의해 산화적 손상된 HIT-T15의 생존율을 증가되었음은 진피 추출물이 산화적 손상으로부터 β-세포를 보호 수 있다는 것을 보여주며, 진피 추출물의 섭취가 산화적 스트레스가 반복되는 2형 당뇨에 효과에 대한 가능성을 확인하였다.

실험예 4 : 진피 추출물에 따른 인슐린 분비능에 미치는 영향

본 실험예에서는 진피 추출물 처리에 의해 산화적 손상을 회복한 HIT-T15 세포에서 인슐린 분비능의 변화를 조사하였다. 알록산으로 산화적 손상을 유도하지 않은 정상군에서는 126.95±1.30 /mg (protein)로 나타났으며, IC₅₀ 알록산 농도로 처리한 대조군에서는 79.19±4.86 /mg으로 약 40%의 인슐린 분비가 감소되었다. 반면 진피 추출물을 처리한 HIT-T15 세포에서는 산화적 손상에 대한 세포 생존율과는 다르게 0.125 mg/mL 농도에서만 119.31±2.14 /mg로 유의성 있게 인슐린 분비가 대조군과 비교 시 증가되었음을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 시앙(Xiang) 등의 연구에서도 보고되어진바 알록산에 의한 손상된 HIT-T15의 세포 회복능이 항상 인슐린 분비능까지 개선을 모두 나타내는 것을 아님을 본 연구를 통해서도 확인 할 수 있었으며, 기능성 물질에 의한 산화적 손상 췌장세포의 회복에 있어 인슐린 생산성 조사는 항산화 효과를 이용한 2형 당뇨 치료에 있어 필수적임을 알 수 있다. 그러나 알록산으로 유도된 HIT-T15에서 0.125 mg/mL 농도의 진피 주정 추출물은 세포 생존율뿐만 아니라 인슐린 분비능도 개선되는 것으로 보아 산화적 스트레스로부터 췌장세포의 회복을 통해 인슐린 분비가 증대된 것으로 사료된다. 이는 진피 주정 추출물에 의한 항산화적 방어로 2형 당뇨의 β-세포 질량의 감소와 인슐린 저항성에 대한 개선이 가능함을 제시하는 것이다.

Claims

감귤 진피에 주정을 첨가하여 60℃에서 추출한 후 방냉, 여과한 여액을 40℃에서 농축한 추출물을 유효성분으로 함유하는 2형 당뇨 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
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제1항 기재의 감귤 진피의 주정 추출물을 유효성분으로 함유하는 2형 당뇨 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물.