KR100839099B1

KR100839099B1 - 오배자 및 목단피 추출물을 함유하는 돼지 유행성 설사바이러스의 치료 및 예방용 조성물

Info

Publication number: KR100839099B1
Application number: KR1020070032784A
Authority: KR
Inventors: 박현; 윤용갑; 손동환; 김윤철; 김옥진; 김경민
Original assignee: 원광대학교산학협력단
Priority date: 2007-03-08
Filing date: 2007-04-03
Publication date: 2008-06-19

Abstract

본 발명은 항바이러스 활성을 갖는 조성물에 관한 것으로서, 상세하게는 오배자(Galla Rhois) 및 목단피(Moutan Cortex Radicis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 조성물은 돼지 유행성 설사바이러스에 대한 항바이러스 효과가 탁월하므로, 상기 바이러스의 감염으로 유발되는 질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용할 수 있다.

오배자, 목단피, 바이러스

Description

오배자 및 목단피 추출물을 함유하는 돼지 유행성 설사 바이러스의 치료 및 예방용 조성물{Composition comprising an extract of Galla Rhois and Moutan Cortex Radicis for preventing and treating the porcine epidemic diarrhea virus(PEDV)}

도 1은 돼지 유행성 설사바이러스에 대한 오배자 및 목단피 투여군 소장 상피세포의 병리조직검사결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 오배자 및 목단피 추출물을 함유하는 돼지 유행성 설사 바이러스의 치료 및 예방용 조성물에 관한 것이다.

코로나 바이러스는 국내, 외 돼지 사육 현장에서 발생하는 중요한 전염성 위장염, 일종의 설사병의 원인 바이러스로써, 포유 자돈의 80~90%, 자돈의 20%이상을 폐사시키며, 육성돈과 성돈에서는 식욕을 감퇴시켜서 성장을 저해시킨다. 이러한 질병은 양돈장 및 자연환경에 서식하는 코로나바이러스에 의해서 일어나며, 또한 이 바이러스는 전염성이 강하여 그 폐해가 더욱더 증가하고 있는 실정이다.

코로나 바이러스는 돼지 전염성위장염, 설사증 등의 증상을 통해 가축을 포함한 동물 및 사람 등에 영향을 미치므로, 항생제를 투여하더라도 코로나 바이러스에 대한 치료 효과를 볼 수 없으며 단지 2차 감염을 일으키는 미생물에 대한 치료 효과만 기대할 수 있다. 또한 돼지에서는 코로나 바이러스의 감염 예방을 위해 백신이 사용되고 있으나 백신 사용에 의한 부작용이 발생할 수 있다는 문제점이 제기되고 있다.

PEDV(Porcine epidemic diarrhea virus)는 돼지에 설사를 유발하는 코로나바이러스로서 연중 발생하여 국내 양돈 농가에 막대한 경제적 손실을 유발하는 돼지유행성설사병 (Porcine epidemic diarrhea, PED)이다. 1992년 국내에서 처음으로 PEDV가 분리, 보고되었으며, 주로 분변으로 바이러스를 방출하며 겨울에 많이 발생한다. 유사 질환인 전염성위장관염 역시 코로나바이러스인 transmissible gastroenteritis virus (TGEV)에 의하여 유발되지만 TGEV는 효과적인 백신이 개발되어 국내 양돈 농장에서 피해가 감소되고 있는 실정이다. PED는 어린 연령에 설사에 의한 폐사를 유발하며, 성돈의 경우에 설사에 의한 체중 감소로 경제적 손실과 전파원으로서 역할이 문제가 되고 있다. PEDV는 현재 여러 종류의 백신이 국내에 도입되고 있지만 PED에 의한 피해가 줄어들고 있지 않아 국내 양돈 산업에 막대한 경제적 손실을 유발하는 것으로 알려져 있다(강영배, 권창희, 권병준 등, 돼지 유행성 설사(porcine epidemic diarrhea): 발생피해, 병리잔단및 방역대책. 대한수의사회지, 31, pp 38-56, 1994)

PEDV는 1993년 국내에서 처음 발생이 보고된 이후 계절에 관계없이 연중 발생하고 있다. 근래에는 PED가 TGE 보다 월등히 많은 발생을 보이고 있어 양돈농가에 경제적인 피해를 유발하고 있다. 2003년 12월까지 한 해 동안 국립수의과학검역원에서 발표한 자료에 의하면 PED 발생건수는 79건, TGE는 2건으로 집계되고 있다.

이와 같은 설사병을 예방하기 위해 지금까지 생백신을 분만 전 모돈에 접종하여 형성된 항체를 초유를 통해 포유자돈에 전달하는 수동면역을 기초로 하고 있다. 국내백신생산회사에서 PED 생백신을 생산 판매하고 있으며, 국외백신으로는 일본의 PED 생백신 및 PED·TGE 혼합 생백신이 수입되고 있다. 그러나, 생백신인 경우 특히, PEDV에 대한 야외농장들에서 예방효능에 대한 불신감이 높아 예방접종 미실시로 인하여 매년 자돈의 설사 발생율이 증가하고 있는 추세에 있다. 이에 따라, 상기 질병들을 효율적으로 예방하기 위해서는 포유 중의 자돈에 충분한 방어항체를 초유를 통해서 전달해 줄 필요가 있다. 이를 위해서는 모돈에 효과적인 면역을 부여할 수 있으며, 안전하게 사용할 수 있는 효율적인 예방백신이 절실히 필요하다.

오배자는 옻나무과(Anacardiaceae)에 속하는 붉나무(Rhus javanica L.)의 잎에 오배자진딧물(Aphis chinensis J. Bell)이 자상(刺傷)을 주어생긴 벌레집을 말하는데, 우리나라 각지 에 분포한다. 오배자의 형태를 보면, 외면은 회갈색으로 연한 털이 있고, 길이는 3 ∼ 7cm, 폭 2 ∼ 5cm, 두께 2mm 정도이며 단단하면서도 쉽게 부숴 진다. 속은 대개 비어 있거나 회백색의 죽은 벌레와 분비물이 남아 있을 때도 있고, 역겨운 냄새가 나기도 한다. 채집한 오배자는 햇볕에 말리거나 삶거나 찐다. 주성분은 피로가롤 탄닌 (pyrogalloltannin)이 50 ~ 70% 함유되어 있으며, 몰식자산, 갈산(gallic acid) 등이 있다. 약효로는 수렴, 지사, 지혈제로 설사, 가래, 당뇨, 하혈, 빈혈 등에 이용한다(정보섭 외, 향약대사전, pp 380~384, 영림사, 1998)

목단피(Moutan Cortex Radicis)는 작약과(Paeoniaceae) 목단의 뿌리껍질을 말하는 것으로, 중국 서부 원산이며 신라시대 선덕여왕의 기록으로 미루어 중국에서 도입된 귀화식물로 추측된다. 내한성이 강하여 함경북도를 제외한 전국에 분포하지만, 충북 단양군, 제원군과 전남 화순군에서 많이 재배되고 있다. 생김새는 관상의 껍질조각으로 바깥 면은 어두운 갈색 또는 자색을 띤 갈색이며 가로로 길고 작은 타원형의 곁뿌리 자국과 세로주름이 있다. 안쪽 면은 엷은 회갈색이나 어두운 자색을 띠고 편평하며 꺾은 면은 거칠다. 안쪽 면 및 꺾은 면에는 때때로 흰색의 결정이 붙어 있다. 성분은 파에오노사이드(paeonoside), 파에오놀라이드(paeonolide)와 파에오놀(paeonol)을 함유하며, 파에오노사이드는 저장중에 분해되어 당과 파에오놀을 생성한다. 파에오니프로린(paeoniflorin), 옥시파에오니프로린(oxypaeoniflorin), 벤조일파에오니프로린(benzoylpaeoniflorin), 파에오놀라이드 탄닌(paeonolide tannin), 프로시아니딘 B1(procyanidin B1). 벤조일옥시파에오니프로린(benzoyloxypaeoniflorin), 파에오닌(paeonin), 아스트라갈린(astragalin), 페라고닌(pelargonin) 등의 성분이 함유되어 있다. 이러한 성분은 근피뿐만 아니라 목심부에도 존재함이 조직화학적으로 확인 되었다. 목단피는 혈열로 인한 생리불순, 생리통, 멍들었을 때, 토혈, 코피, 반점이 나타나는 증상, 허열로 인해 뼛골이 쑤시는 증상, 혈압상승, 어혈제거, 타박상, 소염진통, 종기치료, 맹장염초기 등에 사용하며 가슴답답증을 없애준다. 약리작용으로 진통, 진정, 해열, 항경련, 항염증, 항혈전, 항알레르기, 위액분비억제, 자궁점막충혈, 항균작용 등이 보고되었다(정보섭 외, 향약대사전, pp 521, 영림사, 1998).

이에 본 발명자들은 돼지유행성설사병의 원인균인 PEDV에 의한 설사 및 소장 손상을 감소시키는 천연물 유래 치료제를 개발하기 위해 연구 노력한 결과, 오배자 및 목단피 추출물의 폐사율, 체중 변화, 분변 상태, 병리조직 검사, 혈액생화학검사에서 유의성 있는 결과를 규명하였고 이어 코로나 바이러스 치료제 또는 인수 공통감염 모델에의 적용에도 활용할 수 있을 것임을 확인함으로서, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 오배자 및 목단피 추출물을 유효성분으로 함유하는 돼지 유행성 설사 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 오배자 및 목단피 추출물을 유효성분으로 함유하는 돼지 유행성 설사 바이러스로 인환 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 추출물은 오배자 및 목단피의 혼합 건조 중량비가 0.1 ~ 10 : 1, 바람직하게는 0.5~ 5 : 1 보다 바람직하게는 1~3 : 1 로 혼합된 것임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 추출물은 물, 탄소 수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물을 의미한다.

본원에서 정의되는 바이러스로 인한 질환은 돼지유행성설사병을 포함한다.

상기 질환은 사람을 포함한 포유동물에 발생하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 오배자 및 목단피 추출물을 유효성분으로 함유하는 돼지 유행성 설사 바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 ~ 50 중량% 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 오배자 및 목단피 추출물은, 건조된 오배자 및 모란 뿌리껍질인 목단피를 세절하여 건조 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 2 내지 6배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물로, 20 내지 150℃, 바람직하게는 70 내지 120℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 환류냉각 추출방법을 이용하여 수득한 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복 추출한 후 감압 농축하여 본 발명의 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 오배자 및 목단피 추출물을 유효성분으로 함유하는 돼지 유행성 설사바이러스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 오배자 및 목단피 추출물은 종류와는 상관없이 일정한 항바이러스 효과를 나타내었다.

본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 투여시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 공정에서 얻어지는 오배자 및 목단피 추출물을 유효성분으로 함유하는 돼지 유행성 설사 바이러스로 인한 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 돼지 유행성 설사 바이러스로 인한 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 오배자 및 목단피 추출물의 제조

1-1. 오배자 조추출물의 제조

익산시 대학한약국으로부터 구입한 건조된 오배자를 분쇄기를 이용하여 입자 의 크기가 30메시(mesh) 이하가 되도록 분쇄하여 오배자 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 오배자 분말(1 kg) 질량의 3배에 해당하는 증류수를 가하여 100℃에서 3시간동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 감압 농축하여 600 g의 오배자 조추출물을 수득하였다.

1-2. 목단피 조추출물의 제조

익산시 대학한약국에서 구입한 건조된 모란 뿌리껍질인 목단피를 분쇄기를 이용하여 입자의 크기가 30메시(mesh) 이하가 되도록 분쇄하여 목단피 분말을 수득한 후, 상기에서 수득한 건조된 목단피 분말(1 kg) 질량의 3배에 해당하는 증류수를 가하여 100℃에서 3시간동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 감압 농축하여 217 g의 목단피 조추출물을 수득하였다.

참고예 1. 실험준비

본 발명은 출생 1주령의 돼지를 전라축산(전북 익산시)에서 구입하여 사용하였고 PEDV 백신 미접종 모체 출산, 최근 바이러스성 설사증이 발생하지 않은 곳에서 구입하였다. 질병이 없고 외관상 건강한 돼지로 군 구성 시 체중 평균이 유사하게 분류하였고 먹이는 전라축산에서 제공한 신생자돈용 분유를 급여하였다. 또한 PED바이러스배양은 PEDV (서울대 수의대 제공 SNUVR-971496)를 베로 세포(Vero cell)로 배양하여 10⁵ TCID₅₀/ml의 역가로 3ml씩을 I, III, IV, V 군의 동물들에 경 구 접종하였고 II군의 동물에는 DMEM 배지를 3ml 경구 접종하였다.

시험군 구성

군	처 치		두수
군	PEDV	물 질	두수
I	0	용매	3
II	X	용매	3
III	0	오배자+목단피 (각 250mg)	3
IV	0	오배자+목단피 (각 500mg)	3
V	0	오배자+목단피 (각 1000mg)	3

상기 시험군에 따라, 체중변화, 폐사율, 관찰기간동안 육안 점수 및 분변의 상태, 소장 채취 후 병리조직 검사, 채혈 후 혈액생화학검사 등 5가지 항목을 평가 대상으로 실험을 실시하였다

실험예 1. 체중변화 및 폐사율 관찰

상기 참고에 1에 기재된 바와 같이 5개의 군에 대한 체중변화 및 폐사율을 관찰하였다.

실험결과, 도입시 군간 체중의 평균은 유사하였으나, PEDV 접종 후 I 군의 동물들은 체중 감소를 보이는 것을 알 수 있었다. PEDV 접종 후 2일 째 체중은 V 군의 체중 값이 I 군에 비교하여 유의하게 높았다(p<0.05).

실험동물의 체중

군	체중 평가시간(Weight evaluation time)
군	Day 0^a	1 d.p.i.^b	2 d.p.i	7 d.p.i
I	3.6±0.96^c	2.1±0.32	2.8±0.31	2.6±0.61
II	3.8±0.55	3.3±0.29*	3.6±0.10*	3.8±0.10*
III	3.3±0.44	2.3±0.21	3.0±0.44	3.08±0.14
IV	3.3±1.04	2.5±0.10	3.1±0.64	3.4±0.75
V	3.3±0.55	2.6±0.06	2.95±0.33*	3.45±0.18
a: PEDV 투여전 b: PEDV 투여후 c: 군±표준편차안에서의 3마리의 평균체중 *대조군과 비교하여 p<0.05에서 유의성있음

실험예 2. 육안상태 관찰

시험 진행 과정 동안에 매일 육안 상태를 관찰하고 각 개체의 육안점수를 기록하고 각군의 평균 및 표준편차를 구하였다. 육안 점수는 "3; 건강, 2; 운동상태 감소 및 피부상태 거침, 1; 침울 및 수척, 0; 폐사"로 하였다. PEDV 접종 후 각 군의 육안점수의 평균 및 표준편차는 표 3과 같았다. PEDV 접종 후 I군의 개체들은 설사와 운동감소, 침울 및 쇠약 등의 육안 소견이 관찰되었으며, 오배자 및 목단피 추출물 투여군인 III, IV, V 군의 동물들은 PEDV 접종 후 6일 (6 d.p.i.)에 I 군에 비교하여 유의하게 높았다 (p<0.05).

실험동물의 육안지수

군	평가시간(evaluation time)
군	1 d.p.i.^b	2 d.p.i.	3 d.p.i.	4 d.p.i.	5 d.p.i.	6 d.p.i.	7 d.p.i.
I	2.3±0.58^c	2.3±0.58	2.3±0.58	2.0±0	2.0±0	2.0±0	1.7±0.58
II	3.0±0*	3.0±0*	3.0±0*	3.0±0*	3.0±0*	3.0±0*	3.0±0
III	2.3±0.58	2.0±0	2.3±0.58	2.0±0	2.3±0.58	3.0±0*	2.6±0.58
IV	3.0±0*	2.7±0.58	3.0±0*	3.0±0*	2.3±0.58	3.0±0*	3.0±0*
V	2.3±0.58	3.0±0	2.6±0.58	2.3±0.58	2.3±0.58	3.0±0*	3.0±0*
a: PEDV 투여전 b: PEDV 투여후 c: 군±표준편차안에서의 3마리의 체중체중 *대조군과 비교하여 p<0.05에서 유의함

실험예 3. 분변상태 관찰

시험 진행 과정 동안에 매일 분변 상태를 관찰하고 각 개체의 분변점수를 기록하고 각군의 평균 및 표준편차를 구하였다. 분변 점수는 "3; 정상, 2; 연변, 1; 설사, 0; 폐사"로 하였다. PEDV 접종 후 각 군의 분변점수의 평균 및 표준편차는 표4 와 같았다. PEDV 접종 후 I군의 개체들은 심한 설사를 보였다. 반면 대조군으로 DMEM을 접종한 II 군의 동물들의 분변 상태는 접종 후 1일에 연변 정도의 상태를 보이며 시험 기간 동안 성돈에 비교하여 연변의 분변 상태를 보여 1주령 자돈에 분유 급여에 의한 정상 분변 상태가 성돈의 분변에 비해 연변에 가깝다는 것을 알 수 있었다. PEDV 접종 후 7일째 (1 d.p.i.) 오배자+목단피 추출물 투여군인 III, IV, V 군의 분변점수는 I 군에 비교하여 유의하게 높았다 (p<0.05). 따라서 본 발명의 오배자 및 목단피 추출물은 PEDV에 의한 설사를 경감시켜 주는 것을 확인할 수 있었다.

실험동물의 분변 지수

군	평가시간(evaluation time)
군	1 d.p.i.^b	2 d.p.i.	3 d.p.i.	4 d.p.i.	5 d.p.i.	6 d.p.i.	7 d.p.i
I	2.0±0^c	1.3±0.58	2.0±0	1.6±0.58	1.6±0.58	1.3±0.58	1.0±0
II	2.0±0	2.0±0	2.3±0.58	2.3±0.58	2.0±0	2.3±0.58	2.3±0.58*
III	2.0±0	1.6±0.58	2.3±0.58	2.0±0	2.0±0	2.3±0.58	2.3±0.58*
IV	2.0±0	1.6±0.58	2.0±0	2.3±0.58	2.3±0.58	2.3±0.58	2.3±0.58*
V	2.0±0	1.6±0.58	2.0±0	2.3±0.58	2.3±0.58	2.3±0.58	2.3±0.58*
a: PEDV 투여전 b: PEDV 투여후 c: 군±표준편차안에서의 3마리의 평균체중 *대조군과 비교하여 p<0.05에서 유의함

실험예 4. 병리조직 검사

각 개체들을 안락사한 후 부검하여 소장을 채취하여 절개한 후 10% 포르말린에 고정하고 병리조직 제작을 위한 통상적인 과정을 거쳐 각 조직의 헤마토실린 & 에오신(Hematoxylin & eosin) 염색 슬라이드를 가지고 병리조직검사를 수행하였다. 병리조직검사는 샘플 위치에 따른 변수를 줄이고자 한 개체 당 6개 소장 부위를 각각 제작하여 검사하였다. 병리조직검사결과 PEDV 접종 한 I군의 동물은 소장 상피의 위축과 상피세포에 공포변화를 보였다. 대조군으로 사용된 II 군의 동물은 소장에서 이러한 변화들이 관찰되지 않았으며 소장 융모도 I 군에 비교하여 현저하게 높은 것을 알 수 있었다. 소장융모의 위축 여부는 융모:선와의 비(vili : crypt ratio)를 구하여 비교하였으며 그 결과는 도 1과 같다. 오배자+목단피 추출물 투여군인 IV, V 군의 융모:선와의 비는 I 군에 비교하여 유의하게 높았다 (p<0.05)(도 1 참조). 따라서 본 발명의 오배자 및 목단피 추출물은 PEDV에 의한 소장 손상을 경감시켜 주는 것을 확인할 수 있엇다.

실험예 5. 혈액검사

PEDV 접종 후 1주되는 시점에서 각 군의 개체들을 자일라진(xylazin, 바이엘동물약품, 한국)으로 마취한 후 혈액을 채혈하여 혈구수를 측정하고 각군의 평균 및 표준편차를 구한 결과는 표 5와 같다. 실험결과 대조군인 I군과 비교하여, 오배자 및 목단비 추출물 투여군의 항바이러스 효능이 뛰어남을 관찰할 수 있었다.

실험동물의 혈액분석

군	혈액학적 지표(Hematological parameter)
군	WBC	RBC	HGB	HCT	MCV	MCH	MCHC	PLT
I	20.6±0.12	6.5±0.5	13.6±3.0	45.4±4.17	70.2±1.03	20.67±0.89	29.52±61.8	327±24.5
II	13.2±1.80	6.6±6.5	13.5±1.1	45.0±1.82	68.6±0.01	20.7±1.0	30.12±1.0	311.8±1.16
III	19.4±5.40	6.0±1.0	12.8±1.8	42.9±10.1	71.3±5.24	21.3±1.22	83.1±118.9*	443.8±29.51*
IV	14.0±1.02	6.2±1.12	13.1±0.58	43.4±1.92	69.5±2.67	20.9±0.59	30.1±0.47	357.6±56.52
V	15.2±0.92	6.4±0.08	13.4±0.60	44.6±1.06	69.6±2.79	20.9±0.85	30.0±0.09	460.5±73.4*
*대조군과 비교하여 p<0.05에서 유의함

실험예 6. 오배자 및 목단피 추출물의 플라크 억제효과 분석실험 (Plaque reduction assay)

6-1. 돼지 유행성 설사바이러스 감염 및 오배자 및 목단피 추출물처리

37℃에서 배양하여 80-90% 융합(confluent)한 베로 세포(Vero cell)를 바이러스배양배지(MEM, 0.3% tryptose phosphate broth [sigma], 10ug/ml 트립신(trypsin), 페니실린(penicillin)과 스트렙토마이신(streptomycin))로 한 번 씻어준 후, PEDV를 감염시켰다. 이 때 배합된 100, 200, 300, 또는 400ug/ml 오배자 및 목단피 추출물을 같이 처리하였으며 감염기간 동안 실험군별로 추출물농도를 유지하도록 하였다. 감염시킨 후 37℃에서 두 시간 동안 매 15분마다 rocking하면서 배양한 후 바이러스배양배지를 더 넣어주었다. 10시간이 더 지난 후에 바이러스배양배지로 방출된 바이러스를 얻었다. 오배자 및 목단피 추출물처리에 의해 바이러스방출이 감소되었는지를 플라크분석법으로 조사하였다.

6-2. 오배자 및 목단피 추출물 처리 후 PEDV 의 플라크분석법

베로 세포(Vero cell)를 24-웰 조직배양용 플레이트에 키워 24시간 후에 70% confluent가 되도록 세포를 접종하여 24시간 배양한 후에 세포를 바이러스배양배지로 두 번 씻어준다. 10배씩 희석 (serial dilution)한 PEDV를 각 웰에 200ul씩 넣어 감염시킨 후 37℃에서 2시간 배양한다. 2시간 후 바이러스를 제거한 후 바이러스배양배지로 씻어준다. 각 웰에 바이러스배양배지를 500ul씩 넣어준 후 37℃에서 4시간 더 배양한다. 4시간 후 트립신의 작용을 없애기 위해 4% FBS가 첨가된 바이러스배양배지 500ul를 넣어준다. 37℃에서 48시간 동안 배양한 후에 바이러스배양배지를 제거하지 않고 4% 포름알데히드(formaldehyde) 1ml을 24-웰 조직배양용 플레이트에 넣어준 뒤 1시간 동안 상온에서 고정시킨다. 배지 및 포름알데히드를 제거한 뒤 0.5% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 10분동안 염색한 후 플레이트(plate)를 씻어준 뒤에 건조시킨 후, 형성된 플라크의 개수를 현미경으로 센다. 오배자 및 목단피 추출물 100, 200, 300, 400ug/ml으로 처리한 실험군과 처리하지 않은 대조군의 플라크 수를 세어 비교한다. (PEDV 플라크측정법 : Veterinary Microbiology, 20, pp 131-142, 1989)

실험결과는 하기 표 6에 나타내었다.

투여군	플라크 형성단위(PFU, plaque forming unit)
PEDV control(no treatment)	2.0×10⁴ PFU/ml
오배자 및 목단피 혼합추출물(100ug/ml)	2.37×10³ PFU/ml
오배자 및 목단피 혼합추출물(200ug/ml)	2.25×10³ PFU/ml
오배자 및 목단피 혼합추출물(300ug/ml)	1.57×10³ PFU/ml
오배자 및 목단피 혼합추출물(400ug/ml)	2.45×10² PFU/ml

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 오배자 및 목단비 추출물을 3:1로 배합한 조성물은 300ug/ml 투여시 12.73배 감소, 400ug/ml 투여시 최대 82.63배 감소효과를 나타내어 돼지 유행성 설사바이러스에 대한 강력한 항 바이러스 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다.

제제예 1. 정제의 제조

오배자 및 목단피 추출물................................200㎎

유당...................................................100㎎

전분...................................................100㎎

스테아린산 마그네슘.....................................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 2. 캡슐제의 제조

오배자 및 목단피 추출물...................................100㎎

유당.......................................................50㎎

전분.......................................................50㎎

탈크........................................................2㎎

스테아린산 마그네슘........................................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 3. 액제의 제조

오배자 및 목단피 추출물......,..........................1000㎎

설탕.......................................................20g

이성화당...................................................20g

레몬향....................................................적량

정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 4. 건강 식품의 제조

오배자 및 목단피 추출물................................1000 ㎎

비타민 혼합물.............................................적량

비타민 A 아세테이트......................................70 ㎍

비타민 E.................................................1.0 ㎎

비타민 B1...............................................0.13 ㎎

비타민 B2...............................................0.15 ㎎

비타민 B6................................................0.5 ㎎

비타민 B12...............................................0.2 ㎍

비타민 C..................................................10 ㎎

비오틴....................................................10 ㎍

니코틴산아미드............................................1.7 ㎎

엽산......................................................50 ㎍

판토텐산 칼슘............................................0.5 ㎎

무기질 혼합물..............................................적량

황산제1철...............................................1.75 ㎎

산화아연................................................0.82 ㎎

탄산마그네슘............................................25.3 ㎎

제1인산칼륨...............................................15 ㎎

제2인산칼슘...............................................55 ㎎

구연산칼륨................................................90 ㎎

탄산칼슘.................................................100 ㎎

염화마그네슘............................................24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 5. 건강 음료의 제조

오배자 및 목단피 추출물..................................1000 ㎎

구연산...................................................1000 ㎎

올리고당..................................................100 g

매실농축액..................................................2 g

타우린......................................................1 g

정제수를 가하여 전체......................................900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 오배자 및 목단피 추출물은 돼지 유행성 설사 바이러스에 대하여 뛰어난 항바이러스효과를 나타내어 돼지 유행성 설사 바이러스 관련질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

오배자 및 목단피 추출물을 유효성분으로 함유하는 돼지 유행성 설사바이러스(PEDV)로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 오배자 및 목단피의 혼합 건조 중량비가 0.1~ 10 : 1 로 혼합된 것임을 특징으로 하는 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소 수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 돼지 유행성 설사바이러스로 인한 질환은 돼지 유행설사병인 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 질환은 사람을 포함한 포유동물에 발생하는 질환인 약학조성물.
오배자 및 목단피 추출물을 유효성분으로 함유하는 돼지 유행성 설사바이러스(PEDV)로 인한 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 6항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품.