CN111529565A - 一种抗流感病毒的制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗流感病毒的制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗流感病毒的制剂及其制备方法和应用。本发明提供了一种抗病毒制剂,包括余甘子和金属盐。并基于该制剂开发了一种抗流感病毒的制剂,配方中各组分配伍合理,优化组合,能够有效地抑制流感病毒侵入、危害人体,显著地抑制流感病毒的复制;另外,本发明的抗流感病毒制剂的制备方法简单、成本低,且余甘子属于中药,具有天然、安全、药效温和等优点;有助于流感病毒感染患者的治疗和康复,提高生存质量,同时对于流感病毒感染引起的疾病的传播和危害具有很好的防控意义,也能作为正常人日常防护和预防流感病毒感染引起的疾病的有效方法。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域。更具体地,涉及一种抗流感病毒的制剂及其制备方法和应用。
背景技术
流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型,近年来才发现的牛流感病毒将归为丁(D)型。流感病毒可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病,是人流感、禽流感、猪流感、马流感等人与动物疫病的病原。这些疫病典型的临床症状是急性高热、全身疼痛、显著乏力和呼吸道症状。
流感病毒主要通过空气中的飞沫、易感者与感染者之间的接触或与被污染物品的接触而传播。一般秋冬季节是其高发期。人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的。甲型流感病毒经常发生抗原变异,可以进一步分为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等亚型(其中的H和N分别代表流感病毒两种表面糖蛋白)。流感病毒对外界抵抗力不强。动物流感病毒通常不感染人,人流感病毒通常不感染动物,但是猪比较例外。猪既可以感染人流感病毒,也可以感染禽流感病毒,但它们主要感染的还是猪流感病毒。少数动物流感病毒适应人后,可以引起人流感大流行。其中,甲型流感病毒抗原性易发生变异,多次引起世界性大流行;乙型流感病毒对人类致病性也比较强,但是人们还没有发现乙型流感病毒引起过世界性大流行;丙型流感病毒只引起人类不明显的或轻微的上呼吸道感染,很少造成流行。甲型流感病毒于1933年分离成功,乙型流感病毒于1940年获得,丙型流感病毒直到1949年才成功分离。
现有技术中公开了余甘子黄酮提取物在制备抗H1N1流感的药物中的应用(CN102836200B),但是,该余甘子黄酮提取物仅适用于预防或治疗H1N1流感感染引起的疾病,而由于流感病毒的多样性和不断进行变异的特点,使得其广泛推广应用于流感病毒受到了限制;而且余甘子黄酮提取物抗病毒效果仍有较大的改善空间。
因此,研发一种对流感病毒感染引起的疾病均有显著的治疗效果的药物,对于有效防控流感病毒大流行具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述现有技术的缺陷和不足,提供一种基于余甘子提取物和金属盐复配而成的抗流感病毒的组合,通过对余甘子提取物类型的限定以及金属盐的协同作用,抗流感病毒效果得到显著提升,而且对于不同类型的流感病毒均有较好的预防与治疗效果。
本发明的目的是提供一种抗流感病毒的制剂。
本发明另一目的是提供所述制剂的制备方法。
本发明又一目的是提供所述制剂在制备抗流感病毒药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
本发明提供了一种抗流感病毒的制剂,包括余甘子和金属盐。
优选地,所述余甘子为余甘子提取物。
更优选地,所述余甘子提取物为余甘子水提物或余甘子醇提物。
优选地,所述余甘子水提物的制备方法中起始料液比为质量比1:6~12。
更优选地,所述余甘子水提物的制备方法中起始料液比为质量比1:9~12。
更优选地,利用索氏提取法,将余甘子粉末加入去离子水中索氏提取3.5~4.5h,经回收、浓缩,即得余甘子水提取物。
更优选地,所述索氏提取的时间为4h。
更优选地,所述余甘子粉末与去离子水的质量比为1:11。
优选地,所述余甘子醇提物为乙醇提取物。
更优选地,所述余甘子醇提物的制备方法为:将余甘子粉末用80%~85%乙醇加热回流提取2~5次,减压回收溶剂得浸膏,将浸膏分散于蒸馏水中,用乙酸乙酯萃取4~6次,即得余甘子醇提物。
更优选地,所述乙醇的浓度为85%。
更优选地,所述回流提取的次数为3次。
更优选地,所述萃取的次数为5次。
优选地,所述金属盐为锌盐、铁盐、钙盐、镁盐、钨盐或铷盐等。
更进一步优选地,所述锌盐为硫酸锌或葡萄糖酸锌;所述铁盐为葡萄糖酸亚铁;所述钙盐为葡萄糖酸钙;所述镁盐为氧化镁;所述钨盐为钨酸钠;所述铷盐为碘化铷。
优选地,所述抗流感病毒的制剂还包括唾液酸。
优选地,余甘子提取物和唾液酸的质量比为1:(0.01~20)。
更优选地,余甘子提取物和唾液酸的质量比为1:(0.01~10)。
更优选地,所述唾液酸的来源可以为哺乳动物下颌提取物、燕窝、母乳、牛奶、鸡蛋或奶酪。
更进一步优选地,所述哺乳动物为猪或牛。
基于上述结果,所述抗病毒制剂可适当复配以合适的辅料以制成不同的药物剂型。
因此,所述制剂在制备抗流感病毒药物中的应用,也应在本发明的保护范围之内。
如需开发为口服液剂型时,辅料可以包括抗氧化剂,香精和甜味剂。
优选地,所述抗氧化剂为维生素C或迷迭香。
优选地,所述甜味剂为阿斯巴甜、甜菊糖、蔗糖、山梨糖甘露糖醇、麦芽糖醇、葡萄糖或AK糖。
具体优选地,所述口服液以重量份计,包括以下组分:余甘子提取物8~20份,唾液酸8~20份,金属盐2~20份,抗氧化剂2~50份,香精2~18份,甜味剂2~20份。
更优选地,所述口服液以重量份计,包括以下组分:余甘子提取物14~16份,唾液酸14~16份,金属盐4~9份,抗氧化剂4~6份,香精2~4份,甜味剂2~5份。
更进一步优选地,所述口服液以重量份计,包括以下组分:余甘子提取物15.4份,唾液酸15.4份,金属盐8.1份,维生素C 5.4份,香精2.8份,阿斯巴甜3.8份。
优选地,所述抗流感病毒的口服液的制备方法为:按照所述重量份将余甘子提取物、金属盐、抗氧化剂、香精和甜味剂充分溶解于纯化水中即得。
优选地,所述流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。
更优选地,所述甲型流感病毒为甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H5N1流感病毒或甲型H7N9流感病毒。
更优选地,所述乙型流感病毒为Yamagata系乙型流感病毒。
本发明要求保护的口服液在作为抗流感病毒的药物时,包括但不限于,使用本发明的口服液的有效量对患者给药来制备用于预防或治疗流感病毒引发的疾病,减轻流感病毒引发的疾病症状,或者延缓流感病毒引发的疾病的发展或发作的药品的用途。
本发明要求保护的口服液除了对人类治疗有益以外,还可应用于兽医治疗宠物、引进品种的动物和农场的动物,包括哺乳动物,啮齿类动物等。另外一些动物的实例包括马、狗和猫等。
本发明具有以下有益效果:
本发明提供了一种抗流感病毒的制剂,配方中的各个组分的配伍合理,优化组合,能够有效地抑制流感病毒侵入、危害人体,显著地抑制流感病毒的复制;该制剂配方中的余甘子属于中药,具有天然、安全、药效温和等优点;在抗流感病毒药物的开发方面具有很好的应用价值。
另外,该制剂的制备方法简单、成本低,有助于流感病毒感染患者的治疗和康复,提高生存质量,同时对于流感病毒感染引起的疾病的传播和危害具有很好的防控意义,也能作为正常人日常防护和预防流感病毒感染引起的疾病的有效方法。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明,以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明实施例中的抗病毒活性实验委托广东省疾病预防控制中心进行。
实施例1抗流感病毒的口服液1的制备
抗流感病毒的口服液1,以重量份计,包括以下组分:余甘子水提物15.4份,唾液酸15.4份,硫酸锌8.1份,维生素C 5.4份,香精2.8份,阿斯巴甜3.8份。
抗流感病毒的口服液1的制备方法为:将新鲜余甘子果实晒干碾碎,制成余甘子粉末,称取100g余甘子粉末,用滤纸包好后,放入索氏抽提器中,加入去离子水(余甘子粉末与去离子水的质量比为1:11)索氏提取4h,回收水提物,在水浴锅上浓缩并定容,得到余甘子水提物;
按照上述重量份将余甘子水提物、唾液酸、硫酸锌、维生素C、香精和阿斯巴甜充分溶解于纯化水,加蒸馏水稀释至全量,分装,即得抗流感病毒的口服液1。
实施例2抗流感病毒的口服液2的制备
抗流感病毒的口服液2,以重量份计,包括以下组分:余甘子水提物15.4份,唾液酸15.4份,葡萄糖酸钙8.4份,迷迭香4.9份,香精2.8份,甜菊糖3.8份。
抗流感病毒的口服液2的制备方法,按照上述重量份,除了余甘子粉末与去离子水的质量比为1:6,索氏提取的时间为3.5h,其余方法均与实施例1中抗流感病毒的口服液1的制备方法相同。
实施例3抗流感病毒的口服液3的制备
抗流感病毒的口服液3,以重量份计,包括以下组分:余甘子水提物15.4份,唾液酸15.4份,葡萄糖酸锌4.5份,维生素C 5.4份,香精2.8份,蔗糖3.8份。
抗流感病毒的口服液2的制备方法,按照上述重量份,除了余甘子粉末与去离子水的质量比为1:9,索氏提取的时间为4.5h,其余方法均与实施例1中抗流感病毒的口服液1的制备方法相同。
实施例4抗流感病毒的口服液4的制备
抗流感病毒的口服液4,以重量份计,包括以下组分:余甘子水提物8份,唾液酸8份,葡萄糖酸亚铁20份,维生素C 50份,香精2份,山梨糖甘露糖醇20份。
抗流感病毒的口服液4的制备方法,按照上述重量份,除了余甘子粉末与去离子水的质量比为1:12,索氏提取的时间为3.5h,其余方法均与实施例1中抗流感病毒的口服液1的制备方法相同。
实施例5抗流感病毒的口服液5的制备
抗流感病毒的口服液5,以重量份计,包括以下组分:余甘子乙醇提取物20份,唾液酸20份,氧化镁2份,迷迭香2份,香精18份,麦芽糖醇2份。
抗流感病毒的口服液5的制备方法为:将余甘子粉碎后,用85%乙醇加热回流提取3次,减压回收溶剂得浸膏,将浸膏分散于蒸馏水中,用乙酸乙酯萃取5次,得到余甘子乙醇提取物;
按照上述重量份将余甘子乙醇提取物、唾液酸、氧化镁、香精和麦芽糖醇充分溶解于纯化水,加蒸馏水稀释至全量,分装,即得抗流感病毒的口服液5。
实施例6抗流感病毒的口服液6的制备
抗流感病毒的口服液6,以重量份计,包括以下组分:余甘子乙醇提取物14份,唾液酸14份,钨酸钠9份,维生素C 6份,香精2份,葡萄糖5份。
抗流感病毒的口服液6的制备方法,按照上述重量份,除了乙醇的浓度为80%,回流提取的次数为5次,萃取的次数为6次外,其余方法均与实施例5中抗流感病毒的口服液5的制备方法相同。
实施例7抗流感病毒的口服液7的制备
抗流感病毒的口服液7,以重量份计,包括以下组分:余甘子醇提物16份,唾液酸16份,碘化铷4份,迷迭香4份,香精4份,AK糖2份。
抗流感病毒的口服液7的制备方法,按照上述重量份,除了乙醇的浓度为83%,回流提取的次数为2次,萃取的次数为4次外,其余方法均与实施例5中抗流感病毒的口服液5的制备方法相同。
对比例1
一种口服液a,除了不包括余甘子水提物和硫酸锌,其余组分与实施例1制备得到的抗流感病毒的口服液1相同。
口服液a的制备方法:与实施例1的制备方法相同。
对比例2
一种口服液b,除了不包括余甘子醇提物、氧化镁和唾液酸,其余组分与实施例5制备得到的抗流感病毒的口服液5相同。
口服液b的制备方法:与实施例5的制备方法相同。
对比例3
一种口服液c,除了余甘子水提取的重量份为2份(含量过低),其余组分与实施例1制备得到的抗流感病毒的毒口服液1相同。
口服液c的制备方法:与实施例1的制备方法相同。
对比例4
一种口服液d,除了余甘子醇提取的重量份为2份(含量过低)、唾液酸的重量份为2份(过低),其余组分与实施例5制备得到的抗流感病毒的口服液5相同。
口服液d的制备方法:与实施例5的制备方法相同。
以下以实施例1~3制备得到的抗流感病毒的口服液1、2和3,以及对比例1~4制备得到的口服液a、b、c和d为例,验证本发明制备得到的口服液的抗流感病毒活性,具体的实验方法和结果分别如下:
应用例1口服液的细胞毒性测试
1、实验方法
本应用例利用MTT法测试本发明实施例制备得到的抗流感病毒的口服液1、2和3对细胞的毒性实验,具体实验步骤如下:
(1)按1×105个/孔的浓度,将人胚胎肾细胞293(HEK293细胞)接种到96孔板,加入100μL DMEM培养基,37℃、5%CO2培养至单层细胞形成;
(2)弃培养液,PBS清洗2次,将本发明实施例制备得到的抗流感病毒的口服液1、2和3用DMEM进行浓度稀释,接种于细胞上,100μL/孔,每个浓度4个以上复孔,设相同浓度对照组,37℃5%CO2培养48h;
(3)每孔加入20μL MTT溶液(2.5mg/mL),37℃、5%CO2孵育4h;弃上清,加入120μLDMSO/孔,振荡20min;
(4)在多功能读数仪上测定各孔490nm波长的吸光值(optical density,OD),并用Reed-Muench法计算50%毒性浓度为药物半数有毒浓度(toxic concentration for 50%of the population,TC50)。
2、实验结果
利用MTT法测得本发明实施例制备得到的抗流感病毒的口服液1、2和3对HEK293细胞的TC50值分别是141.77μg/mL、137.93μg/mL和149.57μg/mL;说明本发明制备得到的口服液无细胞毒性(毒性很低可忽略)。
应用例2口服液的体外抗流感病毒的性能测试
1、实验方法
本应用例测试实施例制备得到的抗流感病毒的口服液1、2和3的体外抗流感病毒实验,具体实验步骤如下:
(1)将HEK293细胞按4.5×104个细胞/孔浓度加入96孔板,在含1%胎牛血清的DMEM的条件下,37℃5%CO2培养24h;
(2)弃上清,每孔分别加入100TCID50甲型H1N1流感病毒的病毒液,37℃5%CO2吸附2h;
(3)弃上清并用PBS洗涤细胞,将本发明实施例制备得到的抗流感病毒的口服液1、2和3用DMEM进行浓度稀释,空白对照组加入等量DMEM,37℃5%CO2孵育72h,收集病毒上清;
(4)将HEK293细胞按2×106个细胞/孔,接种到12孔板,37℃5%CO2培养24h;
(5)将步骤(3)收集的病毒上清进行10倍梯度稀释,接种至HEK293细胞,37℃5%CO2吸附2h;
(6)弃上清并用PBS洗涤细胞,加入2mL 1%(w/v)甲基纤维素-DMEM覆盖物,37℃5%CO2培养72h;
(7)除去甲基纤维素-DMEM覆盖物,PBS洗涤细胞2次,10%甲醛室温固定细胞30min;
(8)弃上清,PBS洗涤细胞2次,加入0.5%结晶紫室温染色5min,用去离子水洗2次,干燥后空斑计数,并用Reed-Muench法计算50%病毒被抑制的药物浓度为药物的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。
2、实验结果
本发明实施例1制备得到的抗流感病毒的口服液1对甲型H1N1流感病毒的体外抑制活性结果如表1所示,可以看出,当口服液1的浓度为6.25μg/mL时,能抑制甲型H1N1流感病毒在HEK293细胞的复制,降低4.90lg PFU/mL的平均病毒滴度;当口服液1的浓度达到50μg/mL时,可使平均病毒滴度下降6.50lgPFU/mL,治疗指数为9.52。
本发明实施例2制备得到的抗流感病毒的口服液2对甲型H1N1流感病毒的体外抑制活性结果如表2所示,可以看出,当口服液2浓度为6.25μg/mL时,能抑制甲型H1N1流感病毒在HEK293细胞的复制,降低4.46lg PFU/mL的平均病毒滴度;当口服液2的浓度达到50μg/mL时,可使平均病毒滴度下降6.43lgPFU/mL,治疗指数为7.95。
本发明实施例3制备得到的抗流感病毒的口服液3对甲型H1N1流感病毒的体外抑制活性结果如表3所示,可以看出,当口服液3浓度为6.25μg/mL时,能抑制甲型H1N1流感病毒在HEK293细胞的复制,降低5.12lg PFU/mL的平均病毒滴度;当口服液3的浓度达到50μg/mL时,可使平均病毒滴度下降6.78lgPFU/mL,治疗指数为7.79。
表1抗流感病毒的口服液1对甲型H1N1流感病毒的体外抑制活性结果
表2抗流感病毒的口服液2对甲型H1N1流感病毒的体外抑制活性结果
表3抗流感病毒的口服液3对甲型H1N1流感病毒的体外抑制活性结果
以上结果说明:本发明制备得到的抗流感病毒的口服液有很好的体外抗流感病毒的活性。
应用例3口服液的体内抗流感病毒性能测试
1、实验方法
本应用例测试本发明实施例制备得到的抗流感病毒的口服液1、2和3的体内抗流感病毒实验,具体实验步骤如下:
(1)将2.5×108PFU表达hCD26的重组腺病毒载体滴鼻转染BALB/c小鼠(购买于广东省实验动物监测所);
(2)转染后第4天用甲型H1N1流感病毒滴鼻感染表达hCD26小鼠,将小鼠随机分组,分别为空白对照组、抗流感病毒的口服液1组[90mg/(kg·d)]、抗流感病毒的口服液2组[90mg/(kg·d)]、抗流感病毒的口服液3组[90mg/(kg·d)]、口服液a组、口服液b组、口服液c组和口服液d组,每组6只,均为雌性,灌胃给药,空白对照组使用等量的0.1%DMSO溶液;
(3)感染后第3、5天,每组随机挑选3只小鼠麻醉后CO2处死,取鼠肺移入PBS,使用手动匀浆器于冰上匀浆,4℃12000r/min离心5min,收集上清;
(14)进行病毒滴度检测,检测方法同以上应用例2的体外抗病毒实验。
2、实验结果
抗流感病毒的口服液1、2和3组对甲型H1N1流感病毒的体内抑制作用结果如表4所示,可以看出,与空白对照组和口服液a、b、c和d组相比,BALB/c小鼠感染甲型H1N1流感病毒后第3天,抗流感病毒的口服液1、2和3组抑制甲型H1N1流感病毒在小鼠体内的复制作用显著增强;在BALB/c小鼠感染后第5天,抗流感病毒的口服液1、2和3组对甲型H1N1流感病毒的抑制作用进一步显著增强,且口服液3组对甲型H1N1流感病毒的抑制作用低于口服液1和2组;而口服液a、b、c和d组对甲型H1N1流感病毒的抑制作用与空白对照组无显著差异,且均显著低于抗流感病毒的口服液1、2和3组的抑制效果。
表4抗流感病毒的口服液1、2和3组对甲型H1N1流感病毒的体内抑制作用结果(甲型H1N1流感病毒滴度(lg PFU/mL))
以上结果说明:本发明制备得到的抗流感病毒的口服液能够有效且显著地抑制甲型H1N1流感病毒在小鼠体内的复制,且其抑制作用具有时间依赖性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种抗流感病毒的制剂,其特征在于,包括余甘子和金属盐。
2.根据权利要求1所述的制剂,其特征在于,所述余甘子为余甘子提取物。
3.根据权利要求2所述的制剂,其特征在于,所述余甘子提取物为余甘子水提物或余甘子醇提物。
4.根据权利要求3所述的制剂,其特征在于,所述余甘子水提物的制备方法中起始料液比为质量比1:6~12。
5.根据权利要求3所述的制剂,其特征在于,所述余甘子醇提物为乙醇提取物。
6.根据权利要求1~5任一所述的制剂,其特征在于,还包括唾液酸。
7.根据权利要求1~6任一所述的制剂,其特征在于,还包括抗氧化剂,香精和甜味剂。
8.根据权利要求7所述的制剂,其特征在于,以重量份计,包括以下组分:余甘子提取物8~20份,金属盐2~20份,抗氧化剂2~50份,香精2~18份,甜味剂2~20份。
9.根据权利要求8所述的制剂,其特征在于,以重量份计,还包括唾液酸8~20份。
10.权利要求9所述制剂的制备方法,其特征在于,按照所述重量份将余甘子提取物、金属盐、抗氧化剂、香精和甜味剂充分溶解于纯化水中即得。
11.权利要求1~9任一所述制剂在制备抗流感病毒药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用,其特征在于,所述流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。
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