CN111529566A - 一种抗病毒喷剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗病毒喷剂及其制备方法和应用。本发明首先提供了一种抗病毒喷剂，包括余甘子提取物、金属盐和溶媒。该喷剂中的余甘子提取物来源于中药余甘子，具有天然、安全、药效温和等优点，应用该喷剂制备得到的抗病毒药物具有广谱的抗病毒活性，对新冠病毒、流感病毒等具有显著的治疗效果；且该喷剂的制备方法简单、成本低，用于环境空气的消毒，能够短时间内有效杀灭各种病毒，对人体无毒、无害，使用方法独特、方便携带，可大规模生产，能够有效抑制这些病毒侵入、危害人体，对于病毒感染人体引起的疾病的传播和危害具有很好的防控意义。

Description

一种抗病毒喷剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域。更具体地，涉及一种抗病毒喷剂及其制备方法和应用。
背景技术
呼吸道病毒是指一大类能够侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变；或仅以呼吸道为入侵门户，主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒，90％以上的急性呼吸道感染是由该类病毒引起的。呼吸道病毒是引起呼吸道疾病的重要病原，能够通过呼吸道传播，可以通过病人打喷嚏、咳嗽等散布到空气当中，健康人吸入后感染。
常见的呼吸道病毒包括属于RNA病毒的呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、风疹病毒、鼻病毒、冠状病毒和正呼肠孤病毒，以及属于DNA病毒的腺病毒、水痘-带状疱疹病毒和博卡病毒；其中，流感病毒和冠状病毒常常引起人类严重的呼吸系统感染。流感病毒属于正黏液病毒科，流行性感冒病毒属，常见的流感病毒包括甲型流感病毒(H1N1、H2N3、H5N1、H7N9)、乙型流感病毒(Yamagata系，代表株：16、88)、丙型流感病毒。冠状病毒属于巢状病毒目，冠状病毒科，能够感染人体的冠状病毒包括：SARS-CoV、SARS-CoV-2、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKU1共7种。
余甘子(Phyllanthus emblica Linn.)为大戟科叶下珠属植物余甘子的成熟干燥果实，在中国分布于江西、福建、台湾、广东、海南、广西、四川、贵州和云南等省区，果实富含丰富的丙种维生素，供食用，可生津止渴，润肺化痰，治咳嗽、喉痛，解河豚鱼中毒等。初食味酸涩，良久乃甘，故名“余甘子”。树根和叶供药用，能解热清毒，治皮炎、湿疹、风湿痛等。目前，已有利用余甘子制备抗H1N1流感病毒的药物的报道(CN102836200A)；但是其仅仅适用于抗H1N1流感病毒，而由于呼吸道病毒感染人体引起的上呼吸道感染的发病率极高、传播快、流行范围广，人均年发病5-6次，尤其是流感病毒和冠状病毒；该病毒可以扩展到下呼吸道，形成支气管炎和肺炎，有些可出现病毒血症，还可侵犯其它器官如肠道等。另外，引起呼吸道感染的病毒群具有两个特点：1)多样性，这些病毒的理化和生物学活性都有不同，不同病毒科的成员进入入侵上呼吸道上皮的受体也不相同；2)变异性，这一群病毒在自然界不断变异，种类多，变异大，免疫力不持久。因此，亟需研发广谱抗病毒药物。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种抗病毒喷剂及其制备方法和应用。
本发明的目的是提供一种抗病毒喷剂。
本发明另一目的是提供所述喷剂在制备抗冠状病毒或流感病毒的药物中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种抗病毒喷剂，包括余甘子提取物、金属盐和溶媒。
优选地，所述金属盐为锌盐、铁盐、钙盐、镁盐、钨盐或铷盐等。
更优选地，所述锌盐为硫酸锌或葡萄糖酸锌；所述铁盐为葡萄糖酸亚铁；所述钙盐为葡萄糖酸钙；所述镁盐为氧化镁；所述钨盐为钨酸钠；所述铷盐为碘化铷。
优选地，所述溶媒为具有挥发性的溶媒。
所述溶媒可以根据其使用条件来选择，当用于制备入口的药物时，则选用食品级的溶媒。
更进一步优选地，所述溶媒为乙醇。
优选地，所述余甘子提取物为余甘子水提物或余甘子醇提物。
优选地，所述余甘子水提物的制备方法中起始料液比为质量比1:6～12。
更优选地，所述余甘子水提物的制备方法中起始料液比为质量比1:9～12。
更优选地，利用索氏提取法，将余甘子粉末加入去离子水中索氏提取3.5～4.5h，经回收、浓缩，即得余甘子水提取物。
更进一步优选地，所述余甘子粉末与去离子水的质量比1:11。
更优选地，所述索氏提取的时间为4h。
优选地，所述余甘子醇提物为乙醇提取物。
更优选地，所述余甘子醇提物的制备方法为：将余甘子粉末用80％～85％乙醇加热回流提取2～5次，减压回收溶剂得浸膏，将浸膏分散于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取4～6次，即得余甘子醇提物。
更优选地，所述乙醇的浓度为85％。
更优选地，所述回流提取的次数为3次。
更优选地，所述萃取的次数为5次。
优选地，所述抗病毒喷剂还包括唾液酸。
优选地，所述余甘子提取物和唾液酸的质量比为1:(0.01～20)。
更优选地，所述余甘子提取物和唾液酸的质量比为1:(0.01～10)。
更优选地，所述唾液酸的来源可以为哺乳动物下颌提取物、燕窝、母乳、牛奶、鸡蛋或奶酪。
更进一步优选地，所述哺乳动物为猪或牛。
优选地，所述抗病毒喷剂还包括润湿剂和香精。
优选地，所述润湿剂为甘油。
所述喷剂在制备抗冠状病毒或流感病毒的药物中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述冠状病毒为2019-nCoV、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43或HCoV-HKU1。
优选地，所述流感病毒为甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。
本发明要求保护的喷剂应用于作为抗冠状病毒或抗流感病毒的药物时，包括但不限于，使用本发明的喷剂的有效量对患者给药来制备用于预防或治疗冠状病毒或流感病毒引发的疾病，减轻冠状病毒或流感病毒引发的疾病症状，或者延缓冠状病毒或流感病毒引发的疾病的发展或发作的药品的用途。
本发明要求保护的喷剂除了对人类治疗有益以外，还可应用于兽医治疗宠物、引进品种的动物和农场的动物，包括哺乳动物，啮齿类动物等等。另外一些动物的实例包括马、狗和猫等。
优选地，所述抗病毒喷剂，以重量份计，包括以下组分：余甘子提取物8～20份，金属盐2～20份，溶媒2～10份，甘油8～15份，香精1～16份。
更优选地，所述抗病毒喷剂，以重量份计，还含有唾液酸8～20份。
本发明通过科学合理的配合，抗病毒喷剂各个组分之间相互配伍、优化组合，能够发挥明显的协同增效作用，其中的乙醇作为良好的有机溶剂，甘油作为很好的润湿剂，能够使得抗病毒喷剂很好的润湿于施用对象，香精能够产生令人愉快的气味；具有显著的抗病毒(冠状病毒或流感病毒)功效，有助于冠状病毒或流感病毒感染患者的治疗和康复，提高生存质量，同时也能作为正常人日常防护和预防呼吸系统感染疾病(冠状病毒或流感病毒引起的)的有效方法；余甘子提取物来源于中药余甘子，无毒副作用，且所述抗病毒喷剂制备方法简单，可大规模生产，使用方便。
更优选地，所述抗病毒喷剂，以重量份计，包括以下组分：余甘子提取物14～18份，唾液酸14～18份，金属盐4～9份，溶媒6～8份，甘油10～13份，香精2～10份。
更进一步优选地，所述抗病毒喷剂，以重量份计，包括以下组分：余甘子提取物18份，唾液酸18份，金属盐10.3份，溶媒6份，甘油11份，香精2份。
优选地，所述抗病毒喷剂的制备方法为：按照所述重量份将余甘子提取物、唾液酸、金属盐、溶媒、甘油和香精充分溶解于去离子水中即得。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种抗病毒喷剂及其制备方法和应用。本发明提供的喷剂配方中各个组分之间相互配伍、优化组合，能够发挥明显的协同增效作用，具有显著、广谱的抗病毒功效，能够有效抑制这些病毒侵入、危害人体，对新冠病毒、流感病毒具有显著的治疗效果；
另外，将该喷剂以喷雾的形式使用，用于环境空气的消毒，能够短时间内有效杀灭各种病毒，又能清新空气，又对人体无毒、无害，使用方法独特、方便携带；且该喷剂的原料来源于中药余甘子，具有天然、安全、药效温和等优点，无毒副作用，制备方法简单、成本低，可大规模生产，是防控病毒感染人体引起的疾病的传播和危害的有效手段。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明实施例中的抗病毒活性实验委托广东省疾病预防控制中心进行。
实施例1一种抗病毒喷剂1的制备
抗病毒喷剂1，以重量份计，包括以下组分：余甘子水提物18份，唾液酸18份，硫酸锌10.3份，乙醇6份，甘油11份，香精2份。
抗病毒喷剂1的制备方法，包括以下步骤：
S1.将新鲜余甘子果实晒干碾碎，制成余甘子粉末；
S2.称取100g余甘子粉末，用滤纸包好后，放入索氏抽提器中，加入去离子水(余甘子粉末与去离子水的质量比为1:11)索氏提取4h，回收水提物，在水浴锅上浓缩并定容，得到余甘子水提物；
S3.按照以上重量份将步骤S2得到的余甘子提取物、唾液酸、硫酸锌、乙醇、甘油和香精充分溶解于去离子水中，再按照每瓶50mL分装于气雾瓶中，即得抗病毒喷剂1。
实施例2一种抗病毒喷剂2的制备
抗病毒喷剂2，以重量份计，包括以下组分：余甘子水提物18份，唾液酸18份，葡萄糖酸钙10.9份，乙醇6份，甘油11份，香精2份。
抗病毒喷剂2的制备方法，按照以上重量份，除了步骤S2中余甘子粉末与去离子水的质量比为1:9，索氏提取的时间为4.5h，其余方法均与实施例1中抗病毒喷剂1的制备方法相同。
实施例3一种抗病毒喷剂3的制备
抗病毒喷剂3，以重量份计，包括以下组分：余甘子水提物18份，葡萄糖酸锌6.4份，乙醇6份，甘油11份，香精2份。
抗病毒喷剂2的制备方法，按照以上重量份，除了步骤S2中余甘子粉末与去离子水的质量比为1:6，索氏提取的时间为3.5h，其余方法均与实施例1中抗病毒喷剂1的制备方法相同。
实施例4一种抗病毒喷剂3的制备
抗病毒喷剂4，以重量份计，包括以下组分：余甘子水提物8份，唾液酸8份，葡萄糖酸亚铁20份，乙醇2份，甘油8份，香精16份。
抗病毒喷剂4的制备方法，按照以上重量份，除了步骤S2中余甘子粉末与去离子水的质量比为1:12，索氏提取的时间为3.5h，其余方法均与实施例1中抗病毒喷剂1的制备方法相同。
实施例5一种抗病毒喷剂5的制备
抗病毒喷剂5，以重量份计，包括以下组分：余甘子乙醇提取物20份，唾液酸20份，氧化镁2份，乙醇10份，甘油15份，香精1份。
抗病毒喷剂5的制备方法，包括以下步骤：
S1.将新鲜余甘子果实晒干碾碎，制成余甘子粉末；
S2.称取100g余甘子粉末，用85％乙醇加热回流提取3次，减压回收溶剂得浸膏，将浸膏分散于蒸馏水中，用乙酸乙酯萃取5次，得到余甘子乙醇提取物；
S3.按照以上重量份将步骤S2得到的余甘子乙醇提取物、唾液酸、氧化镁、乙醇、甘油和香精充分溶解于去离子水中，再按照每瓶50mL分装于气雾瓶中，即得抗病毒喷剂5。
实施例6一种抗病毒喷剂6的制备
抗病毒喷剂6，以重量份计，包括以下组分：余甘子乙醇提取物18份，唾液酸18份，钨酸钠4份，乙醇8份，甘油13份，香精2份。
抗病毒喷剂6的制备方法，按照以上重量份，除了步骤S2中乙醇的浓度为80％，回流提取的次数为5次，萃取的次数为6次外，其余方法均与实施例5中抗病毒口服液5的制备方法相同。
实施例7一种抗病毒喷剂7的制备
抗病毒喷剂7，以重量份计，包括以下组分：余甘子乙醇提取物14份，唾液酸14份，碘化铷9份，乙醇6份，甘油10份，香精10份。
抗病毒喷剂7的制备方法，按照以上重量份，除了步骤S2中乙醇的浓度为83％，回流提取的次数为2次，萃取的次数为4次外，其余方法均与实施例5中抗病毒口服液5的制备方法相同。
对比例1
一种喷剂a，除了不包括余甘子水提物和金属盐，其余组分及其制备方法与实施例1相同。
对比例2
一种喷剂b，除了不包括余甘子水提物、金属盐和溶媒，其余组分及其制备方法与实施例1相同。
对比例3
一种喷剂c，除了不包括余甘子乙醇提取物、金属盐、溶媒和唾液酸，其余组分及其制备方法与实施例5相同。
以下以实施例1～3制备得到的抗病毒喷剂1、2和3，以及对比例制备的得到的喷剂a、b和c为例，验证本发明制备得到的喷剂的体外和体内的抗病毒活性，具体实验方法和结果分别如下：
应用例1抗病毒喷剂的细胞毒性测试
1、实验方法
本应用例利用MTT法测试本发明实施例制备得到的抗病毒喷剂1、2和3对细胞的毒性实验，具体实验步骤如下：
(1)按1×105个/孔的浓度，将人胚胎肾细胞293(HEK293细胞)接种到96孔板，加入100μL DMEM培养基，37℃、5％CO2培养至单层细胞形成；
(2)弃培养液，PBS清洗2次，将本发明实施例制备得到的抗病毒喷剂1、2和3用DMEM进行梯度稀释，接种于细胞上，100μL/孔，每个浓度4个以上复孔，设相同浓度对照组，37℃5％CO2培养48h；
(3)每孔加入20μL MTT溶液(2.5mg/mL)，37℃、5％CO2孵育4h；弃上清，加入120μLDMSO/孔，振荡20min；
(4)在多功能读数仪上测定各孔490nm波长的吸光值(optical density，OD)，并用Reed-Muench法计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(toxic concentration for 50％of the population，TC50)。
2、实验结果
抗病毒喷剂1、2和3对HEK293细胞的TC50值分别是135.21μg/mL、132.79μg/mL和139.32μg/mL；说明本发明制备得到的喷剂无细胞毒性(毒性很低可忽略)。
应用例2抗病毒喷剂的体外抗病毒性能测试
1、实验方法
本应用例测试本发明实施例制备得到的抗病毒喷剂1、2和3的体外抗病毒实验，具体实验步骤如下：
(1)将HEK293细胞按4.5×104个细胞/孔浓度加入96孔板，在含1％胎牛血清的DMEM的条件下，37℃5％CO2培养24h；
(2)弃上清，每孔分别加入100TCID50 2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒两种病毒液，37℃5％CO2吸附2h；
(3)弃上清并用PBS洗涤细胞，将本发明实施例制备得到的抗病毒喷剂1、2和3用DMEM进行梯度稀释，分别加入孔板中，设置为实验组，空白对照组加入等量DMEM，37℃5％CO2孵育72h，收集病毒上清；
(4)将HEK293细胞按2×106个细胞/孔，接种到12孔板，37℃5％CO2培养24h；
(5)将步骤(3)收集的病毒上清进行10倍梯度稀释，接种至HEK293细胞，37℃5％CO2吸附2h；
(6)弃上清并用PBS洗涤细胞，加入2mL 1％(w/v)甲基纤维素-DMEM覆盖物，37℃5％CO2培养72h；
(7)除去甲基纤维素-DMEM覆盖物，PBS洗涤细胞2次，10％甲醛室温固定细胞30min；
(8)弃上清，PBS洗涤细胞2次，加入0.5％结晶紫室温染色5min，用去离子水洗2次，干燥后空斑计数，并用Reed-Muench法计算50％病毒被抑制的药物浓度为药物的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。
2、实验结果
抗病毒喷剂1对2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒的体外抑制活性结果如表1所示，可以看出，抗病毒喷剂1的浓度为6.25μg/mL时，能抑制2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒在HEK293细胞的复制，均降低1.83lg PFU/mL和1.87lgPFU/mL的平均病毒滴度；当喷剂1浓度达到50μg/mL时，可使平均病毒滴度分别下降4.14lgPFU/mL和3.66lgPFU/mL，治疗指数分别为8.93和7.42。
抗病毒喷剂2对2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒的体外抑制活性结果如表2所示，可以看出，抗病毒喷剂2的浓度为6.25μg/mL时，能抑制2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒在HEK293细胞的复制，分别降低1.74lg PFU/mL和2.25lg PFU/mL的平均病毒滴度；当喷剂2浓度达到50μg/mL时，可使平均病毒滴度分别下降3.96lgPFU/mL和4.19lgPFU/mL，治疗指数分别为8.75和7.70。
抗病毒喷剂3对2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒的体外抑制活性结果如表3所示，可以看出，抗病毒喷剂3的浓度为6.25μg/mL时，能抑制2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒在HEK293细胞的复制，分别降低1.77lg PFU/mL和1.70lg PFU/mL的平均病毒滴度；当喷剂3浓度达到50μg/mL时，可使平均病毒滴度分别下降3.76lgPFU/mL和3.36lgPFU/mL，治疗指数分别为7.42和6.41。
表1 抗病毒喷剂1对2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒的体外抑制活性结果
Figure BDA0002535674740000091
表2 抗病毒喷剂2对2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒的体外抑制活性结果
Figure BDA0002535674740000092
表3 抗病毒喷剂3对2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒的体外抑制活性结果
Figure BDA0002535674740000101
以上结果说明：本发明制备得到的抗病毒喷剂有很好的体外抗病毒(2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒)活性。
应用例3喷剂的体内抗病毒的性能测试
1、实验方法
本应用例测试本发明实施例制备得到的抗病毒喷剂1、2和3的体内抗病毒(2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒)实验，具体实验步骤如下：
(1)将2.5×108PFU表达hCD26的重组腺病毒载体滴鼻转染BALB/c小鼠(购买于广东省实验动物监测所)；
(2)转染后第4天用2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒滴鼻感染表达hCD26小鼠，将小鼠随机分成4组，分别为空白对照组、抗病毒喷剂1组[90mg/(kg·d)]、抗病毒喷剂2组[90mg/(kg·d)]、抗病毒喷剂3组[90mg/(kg·d)]、喷剂a组、喷剂b组和喷剂c组，每组6只，均为雌性，灌胃给药，空白对照组使用等量的0.1％DMSO溶液；
(3)感染后第5天，每组随机挑选3只小鼠麻醉后CO2处死，取鼠肺移入PBS，使用手动匀浆器于冰上匀浆，4℃12000r/min离心5min，收集上清；
(14)进行病毒滴度检测，检测方法同以上应用例2的体外抗病毒实验。
2、实验结果
抗病毒喷剂1、2和3对2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒的体内抑制作用结果如表4所示，可以看出，与空白对照组和喷剂a、b、c组相比，BALB/c小鼠感染2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒后第5天，抗病毒喷剂1、2和3组抑制病毒(2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒)在小鼠体内的复制作用显著增强，且抗病毒喷剂1和2对2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒的抑制效果均高于抗病毒喷剂3；而喷剂a、b、c组对病毒(2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒)的抑制作用与空白对照组无显著差异。
以上结果说明：本发明制备得到的抗病毒喷剂能够有效且显著地抑制2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒在小鼠体内的复制。
表4 抗病毒喷剂1、2和3对2019-nCoV和甲型H1N1流感病毒的体内抑制作用结果
Figure BDA0002535674740000111
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种抗病毒喷剂，其特征在于，包括余甘子提取物、金属盐和溶媒。
2.根据权利要求1所述的喷剂，其特征在于，所述余甘子提取物为余甘子水提物或余甘子醇提物。
3.根据权利要求2所述的喷剂，其特征在于，所述余甘子水提物的制备方法中起始料液比为质量比1:6～12。
4.根据权利要求2所述的喷剂，其特征在于，所述余甘子醇提物为乙醇提取物。
5.根据权利要求1～4任一所述的喷剂，其特征在于，还包括唾液酸。
6.根据权利要求1～5任一所述的喷剂，其特征在于，还包括润湿剂和香精。
7.根据权利要求1～6任一所述的喷剂，其特征在于，以重量份计，包括以下组分：余甘子提取物8～20份，金属盐2～20份，溶媒2～10份，甘油8～15份，香精1～16份。
8.根据权利要求7所述的喷剂，其特征在于，以重量份计，还含有唾液酸8～20份。
9.一种抗病毒喷剂的制备方法，其特征在于，按照权利要求8所述重量份将余甘子提取物、唾液酸、金属盐、溶媒、甘油和香精充分溶解于去离子水中即得。
10.权利要求1～8任一所述喷剂在制备抗冠状病毒或流感病毒的药物中的应用。
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