KR20220021744A

KR20220021744A - B형 간염 바이러스 유래 폴리펩티드를 포함하는 면역 어쥬번트

Info

Publication number: KR20220021744A
Application number: KR1020200102683A
Authority: KR
Inventors: 김범준; 김병준; 최유민; 정혜인
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2020-08-14
Filing date: 2020-08-14
Publication date: 2022-02-22
Also published as: WO2022035246A1; US20230321222A1

Abstract

일 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 면역 어쥬번트(Immune adjuvant)에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드는 B형 간염 바이러스 유래 폴리펩티드로서, 단독으로 면역 어쥬번트로서 백신들과 병용 투여를 통해 면역 증진에 효과적이며, 특히, 다른 면역 어쥬번트와도 병용 투여될 경우에 보다 현저하게 면역 증진 효과를 나타낼 수 있다. 나아가, 상기 폴리펩티드는 6개의 아미노산 서열 밖에 되지 않는 단분자로서, 세포 독성이 없고, 생체 내 안정성이 우수한 특징을 가지고 있다.

Description

B형 간염 바이러스 유래 폴리펩티드를 포함하는 면역 어쥬번트{AN IMMUNE ADJUVANT COMPRISING HEPATITIS B VIRUS-DERIVED POLYPEPTIDE}

B형 간염 바이러스 유래 폴리펩티드를 포함하는 면역 어쥬번트에 관한 것이다.

백신 개발에는 크게 항원, 면역 증강제, 백신 전달 기술 등의 세 가지 기술이 필요한데, 이들 중 면역 증강제 기술은 백신을 접종하였을 때 항원에 대한 방어 면역 반응을 오랫동안 높게 유지하기 위한 것이다. 그 동안 백신 개발은 주로 항원 개발 기술 위주로 이루어져 왔으나 아직까지 개발에 성공하지 못한 감염병에 대한 예방 백신을 개발하거나 예방 효과가 만족스럽지 못한 백신을 개량하기 위해 면역 증강제의 중요성이 부각되고 있다.

최근에 계속해서 면역 증강제에 대해 연구되고 있으나, 여전히 많은 면역 증강제 물질들의 작용기전을 구체적으로 밝혀내는 부분, 동물실험과 임상시험에서 발생하는 백신 효과의 차이점을 이해하고 극복해야 하는 부분들이 남아있으며, 알려진 면역 증강제 물질들을 항원, 그리고 적절한 백신 전달방법과 함께 효과적으로 조합하는 과정 및 여러 가지 면역 증강제 물질들을 복합적으로 사용했을 때, 백신 효과에 있어서 시너지 효과 및 부작용이 나타나는 지에 대한 지속적인 연구가 필요한 상황이다.

이에, 펩티드 유래 adjuvant인 Poly6가 다양한 백신 종류(DNA 및 단백질)와 면역법(intramuscular, IM; intraperitoneal, IP; subcutaneous, SC)에 적용되었을 때, 효과적으로 면역을 증강시킨다는 결과를 바탕으로, 새로운 면역 증강제로 적용하고, 기존 면역 증강제와의 병용을 통한 복합 면역 증강제로 적용하고자 한다.

한국공개특허 제10-2011-0090926호

일 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역 어쥬번트(Immune adjuvant)를 제공하는 것이다.

다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 DNA 또는 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 DNA 또는 항원을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 증진 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 및 DNA 또는 항원을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환, 후천성면역결핍증(Acquired Immune Deficiency Syndrome: AIDS) 및 결핵(tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질환의 예방 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 면역 어쥬번트(Immune adjuvant)를 제공한다.

상기 용어 "폴리펩티드(Polypeptide)”는 아마이드 결합 (또는 펩티드 결합)으로 연결된 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 폴리머를 의미한다. 상기 폴리펩티드는 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 상기 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열과 각각 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 92% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 펩티드 또는 폴리펩티드의 아미노산들은 보존적으로 또는 비보존적으로 치환될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "보존적 치환"은 펩티드의 천연 염기서열에 존재하는 아미노산을 천연 또는 비천연 발생 아미노산 또는 유사한 입체 물성을 갖는 펩타이도미메틱스로 치환하는 것을 의미한다. 치환될 천연 아미노산의 측쇄가 극성 또는 소수성인 경우, 상기 보존적 치환은 (치환된 아미노산의 측쇄와 동일한 입체적 성질을 갖는 것 이외에) 마찬가지로 극성 또는 소수성인 천연 발생 아미노산, 비천연 발생 아미노산 또는 펩타이도미메틱 모이어티와 함께 존재해야 한다.

천연 발생 아미노산들은 그의 특성들에 따라 전형적으로 분류되기 때문에, 천연 발생 아미노산들에 의한 보존적 치환들은 본 발명에 따라 하전된 아미노산들이 보존적 치환기들로 간주되는 입체적으로 유사한 비하전 아미노산들로 치환된다는 사실을 고려하여 쉽게 결정될 수 있다.

비천연 발생 아미노산들에 의해 보존적 치환을 생성하기 위해, 당분야에 공지된 아미노산 유사체들(합성 아미노산들)을 사용할 수도 있다. 천연 발생 아미노산의 펩타이도미메틱은 숙련된 당업자에게 공지된 문헌에 잘 기록되어 있다.

보존적 치환을 수행할 때, 상기 치환 아미노산은 원래의 아미노산과 같이 측쇄에 동일하거나 유사한 관능기를 가져야 한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비보존적 치환기들"은 부모 서열에 존재하는 것과 같은 아미노산을 다른 전기 화학 및/또는 입체 특성들을 갖는 또 다른 천연 또는 비천연 발생 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 따라서, 치환 아미노산의 측쇄는 치환되는 천연 아미노산의 측쇄보다 현저하게 클 수 있고, 그리고/또는 치환된 아미노산보다 현저하게 다른 전기적인 특성들을 갖는 관능기들을 가질 수 있다. 상기 유형의 비보존적 치환기들의 구체예들은 알라닌에 대한 페닐알라닌 또는 시클로헥실메틸글리신, 글리신에 대한 이소루신, 또는 아스파르트산에 대한 -NH-CH[(-CH2)5-COOH]-CO-의 치환기를 포함한다.

본 명세서의 펩티드 또는 폴리펩티드는 선형으로 이용되지만, 고리화가 펩티드 특성을 심각하게 방해하지 않는 경우, 펩티드의 고리형이 또한 이용될 수 있다고 인식될 것이다.

본 명세서의 펩티드 또는 폴리펩티드는 가용성 형태로 존재할 것을 요구하는 치료제에 사용되기 때문에, 본 명세서의 일부 구체예들의 펩티드, 또는 폴리펩티드는 하나 이상의 비천연 또는 천연 극성 아미노산인 히드록실-포함 측쇄로 인해 펩티드, 또는 폴리펩티드의 안정성을 증가시킬 수 있는 세린 및 트레오닌을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서의 펩티드 또는 폴리펩티드는 의 N 말단 및 C 말단은 관능기에 의해 보호될 수 있다. 적합한 관능기들은, 그 내용이 본 명세서에 참고문헌으로서 통합되어 있는 Green 및 Wuts의 "Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley 및 Sons, Chapters 5 and 7, 1991에 기재되어 있다. 따라서, 상기 펩티드 또는 폴리펩티드는 엔드 캡핑된 변형 펩티드를 생성하기 위해 그것의 N-(아민) 말단 및/또는 C-(카르복실) 말단에서 변형될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 상기 표현 "엔드-캡핑된 변형 폴리펩티드" 및 "보호된 폴리펩티드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용가능하고, 이것의 N-(아민)말단 및/또는 C-(카르복실)말단이 변형된 폴리펩티드를 의미한다. 상기 엔드-캡핑된 변형은 캡을 형성하기 위해 폴리펩티드의 말단에 화학적 모이어티의 부착을 의미한다. 이러한 화학적 모이어티는 본 명세서에서 엔드 캡핑된 모이어티를 의미하며, 통상적으로 본 명세서 및 당 분야에서 상호교환적으로 펩티드 보호 모이어티 또는 관능기로 지칭된다. 히드록실 보호기들은 에스테르, 카르보네이트 및 카르바메이트 보호기들을 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 아민 보호기들은 알콕시 및 아릴록시 카르보닐기를 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 카르복실산 보호기들은 지방족 에스테르, 벤질 에스테르 및 아릴 에스테르를 포함하나, 이들에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같은, 표현 "엔드-캡핑된 모이어티"는 말단에 부착될 때 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단을 변형시키는 모이어티를 의미한다. 말단-캡핑된 변형은 전형적으로 펩티드 말단의 전하를 마스킹하고, 그리고/또는 소수성, 친수성, 반응성, 용해도 등과 같은 그것의 화학적 특성을 변경시키는 결과를 나타낸다. 말단 캡핑된 변형의 성질을 선택함으로써, 소수성/친수성뿐만 아니라 펩티드의 용해도를 미세하게 조절할 수 있다. 특정 구체예들에 따라, 상기 보호기들은 그에 부착된 펩티드의 세포 내로의 운반을 촉진시킨다. 이들 잔기들은 세포내에서 가수분해 또는 효소적으로 생체내에서 분해될 수 있다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 엔드-캡핑은 N 말단 엔드-캡핑을 포함한다. N-말단 엔드-캡핑된 잔기들의 대표적인 예들로는 포르밀, 아세틸(본 명세서에서 "AC"로도 표시됨), 트리플루오로아세틸, 벤질, 벤질옥시카르보닐(본 명세서에서 "Cbz"로도 표시됨), tert-부톡시카르보닐(본 명세서에서 "Boc"로도 표시됨), 트리메틸실릴(본 명세서에서 "TMS"로도 표시됨), 2-트리메틸실릴-에탄설포닐(본 명세서에서 "SES"로도 표시됨), 트리틸 및 치환된 트리틸기들인 알릴옥시카르보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(본 명세서에서 "Fmoc"로도 표시됨), 및 니트로-베라트릴옥시카르보닐("NVOC")을 포함할 수 있다.

특정 구체예들에 따르면, 상기 엔드-캡핑은 C 말단 엔드-캡핑을 포함한다. C-말단 엔드-캠핑된 잔기들의 예시는 C-말단에서 카르복실기의 아실화를 유도하는 전형적인 잔기들이며, 알킬에테르, 테트라히드로피라닐 에테르, 트리알킬실릴 에테르, 알릴에테르, 모노메톡시트리틸 및 디메톡시트리틸뿐만 아니라 벤질 및 트리틸 에테르를 포함할 수 있다. 선택적으로 C-말단-캡핑의 -COOH기는 아미드기로 변형될 수 있다.

다른 펩티드의 엔드-캡핑 변형은 아민 및/또는 카르복실을 히드록시, 티올, 할라이드, 알킬, 아릴, 알콕시, 아릴옥시 등과 같은 다른 모이어티로의 치환을 포함한다.

아울러, 상기 폴리펩티드는 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기를 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 용어 "상동성(Homology)"은 야생형 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 이러한 상동성의 비교는 당업계에서 널리 알려진 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있으며, 2개 이상의 서열간 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다.

상기 폴리펩티드는 천연으로부터 유래될 수도 있고, 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 폴리펩티드 합성 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오티드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩티드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다. 또한, 일례로서, 상기 폴리펩티드는 펩티드, 식물 유래 조직이나 세포의 추출물, 미생물(예를 들어 세균류 또는 진균류, 그리고 특히 효모)의 배양으로 얻어진 생산물일 수 있고, 구체적으로는 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV) 중합효소로부터 유래되는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 HBV 중합효소의 preS1 영역에서 유래되는 것일 수 있다.

상기 폴리펩티드는 수지상 세포를 성숙시킬 수 있고, 체내에서 수지상세포의 이동 능력을 증가시킬 수 있으며, 다른 백신들과 병용적으로 사용되어, 면역을 증진시킬 수 있다.

상기 폴리펩티드는 항 바이러스 활성도 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 바이러스는 아데노 바이러스, 천연두 바이러스, 소아마비 바이러스, 홍역 바이러스, 중증 열성 혈소판 감소 증후군 (Severe Fever with Thrombocytopenia Syndrome) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus), 인간면역결핍 바이러스-1 (Human Immunodeficiency Virus-1: HIV-1) 및 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus: HBV)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 구체적으로 인간면역결핍 바이러스-1 (Human Immunodeficiency Virus-1: HIV-1) 및 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus: HBV)로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

일 양상에 있어서, 상기 면역 어쥬번트는 다른 면역 어쥬번트를 더 포함할 수 있다.

다른 면역 어쥬번트는 기존의 면역 어쥬번트일 수 있고, 새로운 다른 면역 어쥬번트일 수 있다. 다른 면역 어쥬번트를 더 포함할 경우, 상기 폴리펩티드와 시너지 효과를 나타내어, 보다 면역을 효과적으로 증진시킬 수 있다.

상기 다른 면역 어쥬번트는 예를 들어, Alum(Aluminium salts), IL-12, GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), 스쿠알렌(squalene), MF59, AS03, AS04, poly(I:C), MPL(Monophosphoryl Lipid A), GLA, flagellin, Imiquimod, R848, CpG ODN, CpG DNA, saponins (QS-21), C-type lectin ligands (TDB), α-galactosylceramide, 무라밀 디펩티드(muramyl dipeptide), 리포폴리사카라이드(LPS), 쿠일 A, AS01(liposome mixed with monophosphoryl lipid A and saponin QS-21), IC31 (oligo nucleotide and cationic peptide), CFA01 (cationic liposome) 및 GLA-SE (oil-in-water emulsion of MPL and glucopyranosyl lipid)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있으며, 구체적으로 Alum(Aluminium salts)일 수 있다.

일 양상에 있어서, 상기 면역 어쥬번트는 DNA 또는 항원과 병용 투여되는 것일 수 있다.

상기 DNA 또는 상기 항원은 HIV(human immunodeficiency virus), HBV(hepatitis B virus) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나로부터 유래되는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 DNA는 코리스미산 이성화효소(chorismate mutase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Ag85B 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, p24 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HBV s 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 DNA는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 유래 코리스미산 이성화효소(chorismate mutase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 유래 Ag85B 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, HIV(human immunodeficiency virus) 유래 p24 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HBV(hepatitis B virus) 유래 s 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

또한, 상기 항원은 구체적으로 코리스미산 이성화효소(chorismate mutase), Ag85B 단백질, p24 단백질 및 HBV s 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 보다 구체적으로, 상기 항원은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 코리스미산 이성화효소(chorismate mutase), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 유래 Ag85B 단백질, HIV(human immunodeficiency virus) 유래 p24 단백질 및 HBV(hepatitis B virus) 유래 s 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

일 양상에 있어서, 상기 면역 어쥬번트는 HIV(human immunodeficiency virus), HBV(hepatitis B virus) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 감염증 예방용 백신의 면역 어쥬번트일 수 있다.

또한, 일 양상에 있어서, 상기 면역 어쥬번트는 간 질환, 후천성면역결핍증(Acquired Immune Deficiency Syndrome: AIDS) 및 결핵(tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질환의 예방용 백신의 면역 어쥬번트일 수 있다.

상기 후천성면역결핍증(Acquired Immune Deficiency Syndrome: AIDS)은 HIV-1 감염으로부터 발병되는 것일 수 있고, 상기 간질환은 HBV 감염으로부터 발병되는 것일 수 있고, 구체적으로, 간염, 간경변증 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 보다 구체적으로는 B형 간염으로부터 발전되는 것일 수 있다. 또한, 상기 결핵은 안결핵, 피부 결핵, 부신 결핵, 신장결핵, 부고환 결핵, 림프선 결핵, 후두 결핵, 중이 결핵, 장결핵, 다제내성 결핵, 폐결핵, 담결핵, 골결핵, 인후결핵, 임파선 결핵, 폐허증, 유방 결핵 또는 척추 결핵일 수 있다. 또한, 상기 결핵은 한국형 고병원성 결핵균인 K 균주 또는 베이징(Beijing) 결핵 균주에 의해 발병되는 것일 수 있다.

상기 용어 "예방"은 일 양상에 따른 백신 조성물의 투여에 의해 개체의 결핵을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.

상기 용어 "백신"은 동물에서 면역학적 반응을 유도하는 적어도 하나의 면역학적으로 활성인 성분을 함유하는 약학적 조성물을 의미한다. 백신의 면역학적으로 활성인 성분은 살아있거나 죽은 바이러스 또는 세균의 적절한 요소를 함유할 수 있고(서브유닛 백신), 이에 의해 이들 요소는 전체 바이러스 또는 세균 또는 이들의 성장 배양물을 파괴하고, 이어서 원하는 구조물(들)을 수득하는 정제 단계에 의해, 또는 박테리아, 곤충, 포유동물 또는 다른 종과 같은 적절한 시스템의 적절한 조작에 의해 유도된 합성과정 및 이어서 단리 및 정제과정에 의해, 또는 적절한 약학적 조성물을 사용하여 유전자 물질의 직접적인 혼입에 의한 백신을 필요로 하는 동물에서 상기 합성 과정의 유도에 의해 (폴리뉴클레오타이드 백신화) 제조된다. 백신은 상기 기술된 요소의 하나 또는 동시에 하나 이상을 포함할 수 있다.

일 양상에 있어서, 상기 면역 어쥬번트는 사이토카인인 IL-2, IFN-γ. IL-10, IL-1β, IL-6, IL-12, IL-17 및 TNF-α로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 사이토카인의 발현량을 증가시킬 수 있다.

또한, 상기 면역 어쥬번트는 백신 단독 투여된 경우보다, 혈청 내 IgG의 발현을 보다 증진시킬 수 있고, T 세포를 보다 활성화시켜 면역을 보다 증진시키는 것일 수 있다.

다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 면역 증진용 조성물을 제공한다.

상기 "폴리펩티드", "면역 증진" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.

또 다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 및 DNA 또는 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

상기 백신 조성물은 유효성분을 단독으로 포함하거나, 하나 이상의 면역학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 백신 조성물로 제공될 수 있다.

구체적으로, 상기 담체는 예를 들어, 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres) 또는 나노 구형입자일 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.

상기 백신 조성물이 제제화될 경우에는 통상적으로 사용하는 윤활제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있고, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로 제라틴 등이 사용될 수 있고, 점안제 형태로 제조 시 공지의 희석제 또는 부형제 등이 사용될 수 있다.

상기 백신 조성물은 종래에 알려져 있는 백신 조성물 또는 기존의 백신과 혼합되어 제공될 수 있고, 상기 백신 조성물이 다른 백신을 포함하는 경우, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양이 혼합되는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 다른 백신은 종래에 알려져 있는 백신 조성물, 기존의 백신 또는 새롭게 개발되는 백신일 수 있다.

또한, 일 양상에 있어서, 상기 백신 조성물은 단독 투여 또는 공지된 다른 결핵 백신과 병용 투여될 수 있고, 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 투여 방법, 투여 주기, 투여 용량 등을 결정하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 백신 조성물이 다른 결핵 백신과 혼합되어 제공되거나, 병용 투여되는 경우, 상기 백신 조성물만 단독 제공 또는 단독 투여되는 경우 보다 면역 활성 증진 등의 효과가 보다 현저해지는 시너지 효과가 나타날 수 있다.

상기 용어 "투여"란 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, "개체"란 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등의 모든 생물을 의미한다. 구체적인 예로, 인간을 포함한 포유동물일 수 있다.

일 양상에 있어서, 상기 백신 조성물의 투여 경로는 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하내, 복강내, 비강내, 장관내, 흉부내, 국소, 설하내, 직장내 또는 피부 외용일 수 있고, 구체적으로, 피하주사 및 비강내 주사로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

상기 백신 조성물은 면역학적 유효량으로 개체에 투여될 수 있다. 상기 "면역학적 유효량"이란 면역 활성 증진 효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용이나 심각한 또는 과도한 면역반응을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 정확한 투여 농도는 투여될 특정 면역원에 따라 달라지며, 예방 접종 대상자의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 1회 내지 수회 투여 가능하다.

예를 들어, 일 양상에 따른 백신 조성물은 0.1 ng/kg/day 내지 100 mg/kg/day 투여되는 것일 수 있다.

일 양상에 있어서, 상기 백신 조성물의 투여는 하루에 한 번 투여되는 것일 수도 있고, 수 회 나누어 투여되는 것일 수도 있다. 구체적으로 7일 기준 6일 투여 후 1일 휴식, 5일 투여 후 2일 휴식, 4일 투여 후 3일 휴식, 3일 투여 후 4일 휴식, 2일 투여 후 5일 휴식, 1일 투여 후 6일 휴식 주기로 투여되는 것일 수 있다.

일 양상에 따른 백신 조성물은 필요에 따라, 면역학적으로 허용되는 백신보호제, 면역강화제, 희석제, 흡수촉진제 등을 포함할 수 있다. 상기 백신보호제는, 예컨대, 락토오스 포스페이트 글루타메이트 젤라틴 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 면역강화제는, 예컨대, 수산화 알루미늄, 광유 또는 다른 오일 또는 백신에 첨가되거나 이러한 추가의 성분에 의해 각각의 유도 후 신체에 의해 발생되는 보조 분자, 예를 들어 인터페론, 인터류킨 또는 성장인자를 포함할 수 있다. 상기 백신이 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 프로필렌 글리콜 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양(예: 약 1%)의 염화나트륨을 함유할 수 있다.

일 양상에 따른 백신 조성물은 구체적으로 면역강화제로서 다른 면역 어쥬번트(immune adjuvant)를 더 포함할 수 있다.

상기 면역 어쥬번트는 Alum(Aluminium salts), MF59, AS03, AS04, poly(I:C), MPL, GLA, flagellin, Imiquimod, R848, CpG ODN, saponins (QS-21), C-type lectin ligands (TDB), α-galactosylceramide, AS01(liposome mixed with monophosphoryl lipid A and saponin QS-21), IC31 (oligo nucleotide and cationic peptide), CFA01 (cationic liposome) 및 GLA-SE (oil-in-water emulsion of MPL and glucopyranosyl lipid)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있으며, 구체적으로 Alum(Aluminium salts)일 수 있다.

상기 백신 조성물이 다른 면역 어쥬번트를 더 포함할 경우, 보다 현저하게 면역 활성을 증진시키는 시너지 효과를 나타낼 수 있다.

일 양상에 있어서, 상기 DNA 또는 상기 항원은 HIV(human immunodeficiency virus), HBV(hepatitis B virus) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나로부터 유래되는 것일 수 있다.

또한, 구체적으로, 상기 DNA는 코리스미산 이성화효소(chorismate mutase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Ag85B 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, p24 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HBV s 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있고, 보다 구체적으로 상기 DNA는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 유래 코리스미산 이성화효소(chorismate mutase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 유래 Ag85B 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, HIV(human immunodeficiency virus) 유래 p24 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HBV(hepatitis B virus) 유래 s 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나일 수 있다.

또한, 상기 백신 조성물은 HIV(human immunodeficiency virus), HBV(hepatitis B virus) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 감염증 예방용 백신 조성물일 수 있다.

또한, 일 양상에 있어서, 상기 백신 조성물은 간 질환, 후천성면역결핍증(Acquired Immune Deficiency Syndrome: AIDS) 및 결핵(tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질환의 예방용 백신 조성물일 수 있따.

또 다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 및 DNA 또는 항원을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 증진 방법을 제공한다.

상기 "폴리펩티드", "DNA", "항원", "투여" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.

또 다른 양상은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 및 DNA 또는 항원을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간 질환, 후천성면역결핍증(Acquired Immune Deficiency Syndrome: AIDS) 및 결핵(tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질환의 예방 방법을 제공한다.

상기 상기 "폴리펩티드", "DNA", "항원", "투여", "간 질환", "후천성면역결핍증", "결핵" 등은 전술한 범위 내일 수 있다.

일 양상에 따른 B형 간염 바이러스 유래 폴리펩티드는 단독으로 면역 어쥬번트로서 백신들과 병용 투여를 통해 면역 증진에 효과적이며, 특히, 다른 면역 어쥬번트와도 병용 투여될 경우에 보다 현저하게 면역 증진 효과를 나타낼 수 있다. 나아가, 상기 폴리펩티드는 6개의 아미노산 서열 밖에 되지 않는 단분자로서, 세포 독성이 없고, 생체 내 안정성이 우수한 특징을 가지고 있다.

도 1은 HBV 유래 백신 면역 증강제 후보 펩티드 스크리닝, Poly6의 선별 및 개발 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 B형 간염 바이러스 유래 펩티드의 항 HIV-1 및 항 HBV 효과를 확인한 도이다.
도 3은 마우스의 골수세포에서 분화한 수지상세포의 CD11c 마커 발현 정도를 확인한 도이다.
도 4는 마우스 골수세포에서 분화한 수지상세포에 Poly6 peptide를 농도 별로 처리 시 수지상세포의 maturation marker (A) CD80, (B) CD86, (C) MHCⅠ, (D) CCR7 발현을 측정한 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 5는 마우스 골수세포에서 분화한 수지상세포에 Poly6 peptide를 농도별로 처리 시 수지상세포의 염증성 사이토카인 (A) TNF-α, (B) IL-6, (C) IL-12p40를 정량한 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 6의 (A)는 Poly6 peptide에 의해 활성화된 수지상세포를 마우스에 주입하고 3일 후 마우스의 lymph nodes에서 수지상세포의 수를 확인한 도이다. (B)는 Poly6 0.1μM과 LPS 0.1 μg/ml 처리에 의해 활성화된 수지상세포는 아무 처리하지 않은 수지상세포에 비해 마우스 체내에서 lymph nodes로 스스로 이동하는 능력을 가지는 것을 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 7은 pcDNA3.3-Ag85B:ESAT6 DNA 및 Poly6 조합을 통한 마우스 IM 면역 스케줄을 나타낸 도이다.
도 8은 pcDNA3.3-Ag85B:ESAT6 DNA 및 Poly6 조합을 면역시켜 얻은 비장 세포를 Ag85B로 자극 시, 세포에서 발현된 IFN-γ의 양을 ELISPOT으로 측정한 데이터를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; ***, P <0.001).
도 9는 pcDNA3.3-Ag85B:ESAT6 DNA 및 Poly6 조합을 1회 면역 (2 week) 시켜 얻은 비장 세포를 Ag85B로 자극 후, IFN-γ를 발현하는 CD4 및 CD8 T cell population을 FACS로 분석한 데이터를 나타낸 도이다.
도 10은 pcDNA3.3-Ag85B:ESAT6 DNA 및 Poly6 조합을 2회 면역 (4 week) 시켜 얻은 비장 세포를 Ag85B로 자극 후, IFN-γ를 발현하는 CD4 및 CD8 T cell population을 FACS로 분석한 데이터를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01).
도 11은 pcDNA3.3-Ag85B:ESAT6 DNA 및 Poly6 조합을 1회 및 2회 면역한 그룹에 의해 유도된 CTL 반응 결과를 나타낸 도이다((A) 1회 면역, (B) 2회 면역. 통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01).
도 12는 p24 단백질 및 Poly6 조합(농도별, 1 또는 5 μg)을 통한 마우스 IP 면역 스케줄을 나타낸 도이다.
도 13은 p24 단백질 및 Poly6의 조합(1 또는 5 μg)으로 면역(IP route)시킨 마우스의 비장 세포를 p24로 자극 시, 세포에서 발현된 IFN-γ의 양을 ELISPOT으로 측정한 데이터를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. ***, P < 0.001).
도 14는 p24 단백질 및 Poly6의 조합(1 또는 5 μg)으로 면역(IP route)시킨 마우스의 비장 세포를 p24로 자극 시, 세포 배양액에서 발현된 (A) IL-2, (B) IFN-γ, (C) IL-10, (D) IL-1β, (E) IL-6 및 (F) TNF-α 사이토카인을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 15는 p24 단백질 및 Poly6의 조합(1 또는 5 μg)으로 면역(IP route)시킨 마우스의 혈청에서 p24 특이적인 (A) IgG2, (B) IgG1 및 (C) total IgG의 발현을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 16은 각 면역 그룹에 의해 유도된 CTL 반응 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 p24 단백질과 Alum 및 Poly6 조합(농도별, 1 또는 5 μg)을 통한 마우스 IP 면역 스케줄을 나타낸 도이다.
도 18은 p24 단백질과 Alum 및 Poly6의 조합(1 또는 5 μg)으로 면역(IP route)시킨 마우스의 비장 세포를 p24로 자극 시, 세포에서 발현된 IFN-γ의 양을 ELISPOT으로 측정한 데이터를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. **, P < 0.01; ***, P < 0.001).
도 19는 p24 단백질과 Alum 및 Poly6의 조합(1 또는 5 μg)으로 면역(IP route)시킨 마우스의 비장 세포를 p24로 자극 시, 세포 배양액에서 발현된 (A) TNF-α, (B) IFN-γ, (C) IL-2, (D) IL-6 및 (E) IL-10 사이토카인을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 20은 p24 단백질과 Alum 및 Poly6의 조합(1 또는 5 μg)으로 면역(IP route)시킨 마우스의 혈청에서 p24 특이적인 (A) IgG2, (B) IgG1 및 (C) total IgG의 발현을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 21은 각 면역 그룹에 의해 유도된 CTL 반응 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01).
도 22는 Poly6와 HBV S 단백질의 조합을 통한 마우스 면역 스케줄을 나타낸 도이다.
도 23은 S 단백질과 Poly6 및 Alum의 병용 면역 시, 마우스의 혈청에서 S 항원에 대한 IgG의 발현을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 24는 HBV 유래 peptide Poly6와 S 단백질을 마우스에 주입 시 수지상세포의 maturation marker (A) CD40, (B) CD86의 발현을 확인한 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 25는 Poly6와 HBV S 단백질을 병용하여 마우스에 주입 시 비장 세포에서 IFNγ를 분비하는 (A) CD4 T 세포와 (B) CD8 T 세포의 수를 확인한 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 26은 TG 마우스에 S 항원과 Poly6 병용 투여시 혈청 내 HBsAg 및 HBV DNA의 감소를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 27은 TG 마우스에 S 항원과 Poly6 병용 투여시 HBsAg에 대한 특이적 IgG 증가를 확인한 도이다.
도 28은 TG 마우스에 S 항원과 Poly6 병용 투여시 비장 세포에서 분비되는 사이토카인 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 29는 TG 마우스에 S 항원과 Poly6 병용 투여시 림프절에서 수지상세포의 성숙도를 측정한 도이다.
도 30은 Poly6 및 sAg의 병용 투여 시 H&E 염색을 통한 마우스의 간 조직 병리학적 평가를 나타낸 도이다.
도 31은 S 항원과 Poly6 병용 투여 시 TG 마우스 간 조직 내 IFN-γ분비 T 세포의 활성화 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 32는 S 항원과 Poly6 병용 투여 시 Effector memory T cell popluation 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 33은 말초 혈액 단핵 세포에서 Poly6의 처리에 따른 IFN-γ 분비 T 세포 발현 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 34의 (A)는 분리 정제된 TBCM 단백질을 농도별로 SDS-PAGE 내린 후, coomassie blue 염색한 결과를 나타내며, (B)는 분리 정제된 TBCM 단백질을 polyclonal anti-TBCM antibody로 western blot 한 결과를 나타낸 도이다(M, marker; 1, TBCM (1 μg); 2, TBCM (5 μg); 3, p24 (5 μg)).
도 35는 TBCM 및 다양한 adjuvant 조합을 통한 마우스 SC 면역 스케줄을 나타낸 도이다.
도 36은 TBCM 및 다양한 adjuvant 조합을 면역 시켜 얻은 비장 세포를 TBCM으로 자극 시, 세포에서 발현된 IFN-γ의 양을 ELISPOT으로 측정한 데이터를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 37은 TBCM 및 다양한 adjuvant 조합을 면역 시켜 얻은 비장 세포를 TBCM으로 자극 시, 세포 배양액에서 발현된 (A) IFN-γ, (B) IL-12, (C) TNF-α 및 (D) IL-10 사이토카인을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 38은 TBCM 및 다양한 adjuvant 조합을 면역 시킨 후, 혈청에서 TBCM 특이적인 (A) IgG2, (B) IgG1 및 (C) total IgG의 발현을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 39는 TBCM과 Alum 또는 Pol6 추가 조합을 통한 마우스 IN 면역 스케줄을 나타낸 도이다.
도 40은 TBCM과 alum 또는 Pol6 추가 조합을 면역 (IN route) 시켜 얻은 비장 세포 및 폐 세포를 TBCM으로 자극 시, 세포에서 발현된 IFN-γ의 양을 ELISPOT으로 측정한 데이터를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05).
도 41은 TBCM과 alum 또는 Pol6 추가 조합을 면역 (IN route) 시켜 얻은 비장 세포를 TBCM으로 자극 시, 세포 배양액에서 발현된 (A) IFN-γ, (B) IL-12, (C) IL-17 및 (D) IL-10 사이토카인을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 42는 TBCM과 alum 또는 Pol6 추가 조합을 면역 (IN route) 시켜 얻은 폐 세포를 TBCM으로 자극 시, 세포 배양액에서 발현된 (A) IFN-γ, (B) IL-12, (C) IL-17 및 (D) IL-10 사이토카인을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 43은 TBCM과 alum 또는 Pol6 추가 조합을 면역 (IN route) 시킨 후, 폐 세척액 (BAL fluid)에서 IL-12의 발현량을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. **, P < 0.01).
도 44는 TBCM과 alum 또는 Pol6 추가 조합을 면역 (IN route) 시킨 후, 혈청과 BAL fluid에서 TBCM 특이적인 (A) IgG2, (B) IgG1, (C) total IgG 및 (D) IgA의 발현을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 45는 TBCM 및 다양한 adjuvant 조합을 통한 마우스 면역 스케줄을 나타낸 도이다. 구체적으로, BCG 면역 그룹을 비교 그룹으로 선정하였고, 면역이 끝난 후, H37Ra 감염 (IN) 4주 후에 마우스를 희생시켜 면역 반응, 장기 내 CFU 및 폐 조직 H&E 염색을 진행하였다.
도 46 및 47은 TBCM 및 다양한 adjuvant 조합을 면역시킨 후, H37Ra를 감염시켜 얻은 비장 세포를 TBCM 및 Ag85B 단백질로 자극 시, 세포 배양액에서 발현된 IFN-γ(도 46A), IL-12(도 46B), TNF-α(도 47A) 및 IL-10(도 47B) 사이토카인을 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 48은 TBCM 및 다양한 adjuvant 조합을 면역시킨 후, H37Ra를 감염시켜 얻은 혈청에서 TBCM 및 Ag85B 단백질 특이적인 IgG2 (A 및 D), IgG1 (B 및 E) 및 total IgG (C 및 F)를 ELISA로 확인한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 49는 폐에서 확인된 H37Ra 콜로니 개수를 비교한 결과를 나타낸 도이다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. **, P < 0.01; ***, P <0.001).
도 50은 TBCM 및 다양한 adjuvant 조합을 면역시킨 후, H37Ra를 감염된 마우스 폐 조직의 H&E 염색 사진을 나타낸 도이다.
도 51은 각 면역 그룹에 의해 유도된 CTL 반응 결과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 51의 (A)는 TBCM specific lysis, (B)는 Ag85B specific lysis를 나타낸다(통계적 유의성은 Student-t-test로 검정함. **, P < 0.01; ***, P <0.001).

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 수지상세포의 활성화를 이용한 B형 간염 바이러스 유래 펩티드 면역보조제 개발

HBV 유전자 C형의 간 질환 발전에 연관이 있는 변이주들을 스크리닝하고, 유전자 C2형 B형 만성 간염 바이러스 환자들에게서 HBV preS1 시작 부위의 15, 18, 21개의 뉴클레오타이드 결함을 발견하여 이것이 환자 체내에서 HBV 증식 및 간 질환 발전에 주요한 연관성이 있다고 보고하였다.

스크리닝 된 펩티드들 중, 폴리머레이즈 부위와 중첩되는 preS1 결손 부위(5-7개의 아미노산)가 HBV 증식 및 항바이러스 반응과 큰 관련이 있다는 가설을 세우고 이 폴리펩티드 후보군(poly5, poly6 및 poly 7)을 개발하였다(도 1).

폴리펩티드 후보군인 Poly5 (GRLVF, 서열번호 1), Poly6 (GRLVFQ, 서열번호 2) 및 Poly7 (GRLVFQT, 서열번호 3) 중 Poly6(또는 Pol6)는 항 HIV-1 효과를 보이며 자체적으로 항바이러스능이 있음이 관찰되었고 또한 HBV-carrier mouse model에서 (hydrodynamic injection) 항 HBV 효과 역시 관찰되었다(도 2).

2. Poly6 adjuvant의 수지상 세포 활성화 유도 평가

(1) 수지상세포 분화

C57BL/6 마우스의 넓다리뼈 (femur)와 정강뼈 (tibia)를 분리하여 그 속의 골수세포(bone marrow cell)을 분리하였다. 분리한 골수세포를 IMDM 배지 (supplemented with IL-4 and GM-CSF)에서 배양하여 수지상세포 분화를 유도하였다. 6일 간 배양한 후 CD11c 마커를 80% 이상 가진 수지상세포일 경우 실험에 사용하였다(도 3).

(2) HBV 유래 poptide Poly6 처리 시 수지상세포의 maturation marker 발현 확인

면역반응을 유발하여 항바이러스 효과를 증진시키기 위해서는 후천 면역을 활성화시키는 수지상세포가 중요한 세포로 작용하기 때문에 Poly6 peptide가 수지상세포의 maturation을 유도하는 관찰하고자 하였다.

마우스의 골수세포로부터 분화한 수지상세포에 Poly6 peptide를 0.1, 0.5, 1 μM 농도별로 처리하여 24시간 배양한 후 수지상세포의 대표적인 maturation marker CD80, CD86, MHCⅠ와 migraton marker CCR7의 발현을 FACS 로 확인하였다.

그 결과, Poly6를 처리한 농도가 증가함에 따라 수지상세포의 maturation marker 의 발현 정도가 증가하는 것을 확인하였으며, 이를 통해 Poly6 peptide는 수지상세포를 자극하여 maturation 시키는 것을 알 수 있었다(도 4).

(3) Poly6 peptide 처리 시 수지상세포가 분비하는 사이토카인 측정

Poly6 peptide에 의해 활성화된 수지상세포의 표면 maturation marker 발현뿐만 아니라 TNF-α, IL-6, IL-12p40와 같은 염증성 사이토카인 분비가 후천면역반응 촉진에 관여하는 바, 이 역시 확인하고자 하였다.

Poly6 peptide를 0.1, 0.5, 1 μM 농도로 수지상세포에 24시간 처리하였을 때 수지상세포가 분비하는 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, IL-12p40을 ELISA로 확인하였다.

그 결과, 처리한 Poly6 peptide 농도가 증가함에 따라 수지상세포가 분비하는 TNF-α, IL-6, IL-12p40의 양이 증가하였고 이를 통해 Poly6 peptide는 수지상세포를 자극하여 염증성 사이토카인의 분비를 유도하는 것을 알 수 있었다(도 5).

(4) Poly6 peptide를 처리한 수지상세포를 마우스에 foodpad injection 시 수지상세포의 migration 능력 확인

Poly6에 의해 활성화된 수지상세포의 migration marker인 CCR7이 증가함에 따라 수지상세포가 마우스 체내에서도 스스로 lymph nodes로 이동하는지 확인하고자 하였다.

Poly6 peptide를 24시간 처리하여 활성화된 수지상세포를 형광(CFSE) 표지하여 C57BL/6 마우스에 foodpad injection의 방법으로 체내에 주사하였을 때, 3일 후 마우스의 inguinal lymph nodes를 적출하여 표지된 수지상세포의 수를 확인하였다.

그 결과, Poly6 0.1 μM을 처리한 수지상세포를 마우스에 주입하였을 때 lymph nodes에서 발견되는 수지상세포가 아무 처리하지 않은 수지상세포를 주입하였을 때 보다 통계적으로 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 Poly6 peptide는 수지상세포의 표면 성숙 마커의 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 실제 체내에서의 migration 능력을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다(도 6).

3. Poly6 adjuvant 조합에 의한 마우스 면역 시 면역 유도능 평가

(1) Poly6의 DNA vaccine에 대한 면역 증강 효과 제시

도 7과 같은 스케줄로 pcDNA3.3-Ag85B:ESAT6 벡터 및 벡터와 Poly6의 조합을 통해 마우스에 1회, 또는 2주 간격으로 2회 면역하였다(intramuscular injection, IM). 최종 면역 2주 후에, 마우스를 희생시켜 비장 세포 및 혈청에서 Ag85B에 특이적인 면역 반응을 관찰하였다. 면역시킨 DNA 및 adjuvant의 농도는 하기와 같았다.

i) pcDNA3.3-Ag85B:ESAT6(서열번호 6) (50 μg/mouse)

ii) Poly6 (5 μg/mouse)

1) IFN-γ Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) assay

pcDNA3.3-Ag85B:ESAT6 DNA 및 Poly6의 조합으로 면역시킨 마우스의 비장 세포를 사용하여, Ag85B 항원 자극에 대한 IFN-γ의 발현량을 ELISPOT으로 확인하였다.

그 결과, 1회 및 2회 면역 (면역 2주 및 4주에 마우스 희생) 모두, DNA+Poly6 조합이 DNA 단독 면역에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 IFN-γ spot을 증가시켰음을 확인하였다(도 8).

2) FACS 분석

pcDNA3.3-Ag85B:ESAT6 DNA 및 Poly6의 조합으로 면역시킨 마우스의 비장 세포를 Ag85B 단백질로 자극한 후, 세포 내에서 IFN-γ의 발현을 FACS로 분석하였다.

그 결과, 면역 2주 째에는 IFN-γ를 분비하는 T cell population의 차이가 미미하였으나(도 9), 면역 4주 째에는 Poly6에 의해, 특히, IFN-γ를 분비하는 CD4 T cell population이 크게 증가함을 확인할 수 있었다. DNA와 Poly6를 같이 면역 했을 때, CD8+ IFN-γ+ T cell population 또한 면역하지 않은 그룹에 비해 증가하였지만, DNA 단독 면역과는 큰 차이를 보이지 않았다(도 10).

3) 세포 독성 T 세포 활성 평가 (cytotoxic T lymphocyte response, CTL)

pcDNA3.3-Ag85B:ESAT6 DNA 및 Poly6의 조합으로 면역시킨 마우스의 비장 세포(effector cell)와 Ag85B로 자극시킨 MEF 세포(H-2b, target cell)를 같이 6시간 동안 target:effector cell = 1:10, 1:20, 1:50의 비율로 같이 배양시켰다. 그 후 세포 독성 평가를 세포 배양액 내 노출된 lactate dehydrogenase (LDH)의 양을 측정하여 진행하였다.

그 결과, pcDNA3.3-Ag85B:ESAT6 DNA와 Poly6를 같이 면역한 그룹에서 Ag85B 특이적인 cell lysis가 DNA 단독 면역 그룹에 비해 높은 양상을 보였다(도 11).

(2) Poly6의 protein vaccine에 대한 면역 증강 효과 제시

도 12와 같은 스케줄로 p24 단백질 및 Poly6의 조합(농도별, 1 또는 5 μg)을 통해 마우스에 2주 간격으로 2회 면역시켰다(intraperitoneal injection, IP). 최종 면역 2주 후에, 마우스를 희생시켜 비장 세포 및 혈청에서 p24에 특이적인 면역 반응을 관찰하였다. 면역시킨 단백질 및 adjuvant의 농도는 하기와 같았다.

i) p24 단백질(서열번호 7) (30 μg/mouse)

ii) Poly6 (5 μg/mouse)

1) IFN-γ Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) assay

p24 단백질 및 Poly6의 조합으로 면역시킨 마우스의 비장 세포를 사용하여, p24 항원 자극에 대한 IFN-γ의 발현량을 ELISPOT으로 확인하였다.

그 결과, p24와 Poly6를 함께 면역한 그룹에서 p24 단백질 단독 면역에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 IFN-γ spot을 증가시킴을 확인하였다. 또한, Poly6의 농도에 따라 p24에 특이적인 IFN-γ spot이 증가함을 확인할 수 있었다(도 13).

2) Cytokine 측정

p24 단백질 및 Poly6의 조합으로 면역시킨 마우스의 비장 세포를 p24 단백질로 자극한 후, 세포 배양액에서 IL-2, IFN-γ. IL-10, IL-1β, IL-6 및 TNF-α에 대한 ELISA를 수행하였다.

그 결과, IFN-γ ELISPOT 결과와 비슷하게, p24와 Poly6의 조합에 의해 IFN-γ의 발현이 p24 단독 면역에 비해 증가하였고, Poly6의 농도가 증가할수록 IFN-γ의 발현량이 증가하였다. IL-10을 제외한 나머지 사이토카인에서 Poly6에 의해, 그리고 Poly6의 농도 증가에 따라 사이토카인의 발현량이 증가함을 확인할 수 있었다(도 14).

3) 혈청 내 IgG 발현 측정

p24 단백질 및 Poly6의 조합으로 면역시킨 마우스의 혈청 내 p24 특이적인 IgG2, IgG1, 및 total IgG를 ELISA를 통해 평가하였다.

혈청 내 IgG2, IgG1 그리고 total IgG의 발현은 Poly6를 조합한 면역 그룹에서 p24 단독 면역 그룹에 비해 모두 증가되었으나, Poly6의 농도에 따른 차이는 확인되지 않았다(도 15).

4) 세포 독성 T 세포 활성 평가 (cytotoxic T lymphocyte response, CTL)

p24 단백질 및 Poly6의 조합으로 면역시킨 마우스 마우스 비장 세포(effector cell)와 p24 펩티드로 자극시킨 P815 세포 (H-2d, target cell)를 같이 6시간 동안 target:effector cell = 1:10, 1:20, 1:50의 비율로 같이 배양시켰다. 그 후 세포 독성 평가를 세포 배양액 내 노출된 lactate dehydrogenase (LDH)의 양을 측정하여 진행하였다.

그 결과, 1:50의 배양 조건에서 5 μg의 Poly6와 같이 조합한 p24 단백질 면역이 다른 면역법에 비해 상대적으로 높은 p24 특이적인 세포 독성을 유도하는 것을 확인할 수 있었다(도 16).

(3) 기존 adjuvant와 Poly6의 병용에 의한 면역 증강 효과 제시

도 12와 같은 스케줄로 p24 단백질과 Alum 및 Poly6의 조합(농도별, 1 또는 5 μg)을 통해 마우스에 2주 간격으로 2회 면역시켰다(intraperitoneal injection, IP). 최종 면역 2주 후에, 마우스를 희생시켜 비장 세포 및 혈청에서 p24에 특이적인 면역 반응을 관찰하였다. 면역시킨 단백질 및 adjuvant의 농도는 하기와 같았다.

i) p24 단백질 (30 μg/mouse)

ii) Alum (100 μg/mouse)

iii) Poly6 (5 μg/mouse)

1) IFN-γ Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) assay

p24 단백질과 Alum 및 Poly6의 조합으로 면역시킨 마우스의 비장 세포를 사용하여, p24 항원 자극에 대한 IFN-γ의 발현량을 ELISPOT으로 확인하였다.

그 결과, p24와 Alum을 함께 면역한 그룹은 p24 단독 면역과 비슷한 수준의 IFN-γ spot이 유도되었다. Poly6와 Alum을 같이 면역했을 때, Poly6 1 μg 면역 시에는 p24 단독 및 p24 + Alum 면역 그룹과 큰 차이 없었으나, Poly6 5 μg을 같이 면역했을 때에는, 다른 면역 그룹에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 IFN-γ spot을 증가시킴을 확인하였다(도 18).

2) Cytokine 측정

p24 단백질과 Alum 및 Poly6의 조합으로 면역시킨 마우스의 비장 세포를 p24 단백질로 자극한 후, 세포 배양액에서 TNF-α, IFN-γ. IL-2, IL-6 및 IL-10에 대한 ELISA를 수행하였다.

그 결과, 전반적으로 p24와 Alum의 조합에 의한 면역 그룹에서 p24 단독 면역 그룹에 비해 상대적으로 높은 사이토카인의 발현을 보였다. 하지만, p24와 Alum 조합에 Poly6를 더해 면역했을 때 사이토카인 발현량이 더 증가되었으며, Poly6의 농도에 따라 사이토카인의 발현량이 전반적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 19).

3) 혈청 내 IgG 발현 측정

p24 단백질과 Alum 및 Poly6의 조합으로 면역시킨 마우스의 혈청 내 p24 특이적인 IgG2, IgG1, 및 total IgG를 ELISA를 통해 평가하였다.

그 결과, 혈청 내 IgG2, IgG1 그리고 total IgG의 발현은 p24 단독 면역 그룹에 비해 adjuvant를 같이 면역한 그룹에서 상대적으로 증가되는 경향을 보였으나, Alum과 Poly6의 병용 및 Poly6의 농도에 따른 차이는 미미하였다(도 20).

p24 단백질과 Alum 및 Poly6의 조합으로 면역시킨 마우스 마우스 비장 세포(effector cell)와 p24 펩티드로 자극시킨 P815 세포 (H-2d, target cell)를 같이 6시간 동안 target:effector cell = 1:10, 1:20, 1:50의 비율로 같이 배양시켰다. 그 후 세포 독성 평가를 세포 배양액 내 노출된 lactate dehydrogenase (LDH)의 양을 측정하여 진행하였다.

그 결과, 1:50의 배양 조건에서 p24와 Alum 및 Poly6를 같이 조합하여 면역한 그룹에서 p24 특이적인 세포 독성 유도능이 p24 단독 및 p24와 Alum의 조합에 의한 면역 그룹에 비해 증가하는 것을 확인할 수 있었고, Poly6의 농도에 의존적으로 세포 독성이 증가함을 확인하였다(도 21).

(4) Poly6와 HBV S 항원 병용 시, S 항원 특이적인 면역 유도능 제시 (예방 백신 효과 평가)

도 22와 같이 7주령의 C57BL/6 마우스에 Poly6 peptide 10 μg과 HBV s 단백질 10 μg을 2주 간격으로 2회 intraperitoneal injection 방법으로 면역하고 2주 후 마우스의 비장 세포에서 수지상세포의 표면 성숙 마커의 발현을 FACS 로 확인하였다.

1) 혈청 내 IgG 발현 측정

Poly6를 S 단백질과 병용하여 마우스에 면역한 뒤 2주 및 4주에 안와채혈을 통해 혈청을 확보한 후, HBsAg에 대한 항체가 생성되었는 지를 IgG ELISA를 통해 확인하였다.

그 결과 2주차, 4주차에서 모두 SHB + Poly6 면역군에서 S 항원에 대한 IgG1, IgG2, 및 total IgG가 유의하게 증가함을 확인하였으며, 그 유도 시기도 상용 대조군인 Alum 병용 그룹보다 빨라 2주 차에서는 Poly6 병용 그룹에서만 유의하게 S 항원에 대한 항체가 형성되었음을 확인하였다. 따라서 Poly6 병용 S 항원의 예방적 백신 차원으로서의 잠재성을 확인할 수 있었다(도 23).

2) 면역된 마우스 비장 세포에서 수지상 세포의 면역 활성능 평가

Poly6와 HBV S 단백질을 주입한 C57BL/6 마우스의 비장 세포를 적출하여 single cell 로 분리한 후 FACS를 이용해 수지상세포의 표면 maturation marker 발현을 확인하였다.

그 결과, HBV 유래 peptide Poly6와 S 단백질을 병용하여 주입하였을 때 수지상세포의 maturation marker인 CD40과 CD86이 아무 처리하지 않은 마우스에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 Poly6 peptide 와 S 단백질의 병용투여는 마우스 체내에서 수지상세포의 면역활성능을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다(도 24).

3) 면역된 마우스 비장 세포에서 T 세포 활성 확인

Poly6와 HBV S 단백질을 주입한 C57BL/6 마우스의 비장 세포에서 수지상세포의 maturation marker CD40과 CD86의 발현이 증가하는 것으로 보아 Poly6와 HBV S 단백질 주입에 의해 활성화된 수지상세포가 세포 도움 T 세포 또는 세포 독성 T 세포의 염증성 사이토카인 발현을 유도할 것으로 예상하였다.

Poly6 peptide와 HBV S 단백질을 병용 투여한 마우스의 비장 세포에서 intracellular cytokine statining을 통해 IFN gamma를 분비하는 T 세포의 비율을 FACS 로 분석하였다.

그 결과, HBV 유래 peptide Poly6와 S 단백질을 병용 투여한 군에서 IFN gamma를 분비하는 세포 도움 T 세포와 세포 독성 T 세포가 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 Poly6 peptide와 HBV S 단백질을 병용 투여를 통해 마우스의 비장 세포에서 염증성 사이토카인을 분비하는 T 세포의 비율이 증가한다는 것을 알 수 있었다(도 25).

(5) S 항원과 Poly6 병용 시, 치료용 백신으로서의 항바이러스 효과 평가

1) 마우스에서 Poly6를 s 단백질 백신과 병용 주입시 혈청 내 HBV DNA 및 HBsAg 항원의 감소 효과

상기와 같이 Poly6를 S 항원과 병용하여 면역 시 수지상 세포 및 T 세포 활성이 일어나는 것을 바탕으로 치료용 백신의 궁극적 목적인 항바이러스 능을 측정하였다. 이 때, Poly6 병용 단백질 백신은 형질 전환되어 지속적으로 HBV DNA를 혈청 내에 분비하는 TG 마우스에 투여되었다. 투여 방법의 차이를 관찰하기 위하여 암컷 및 수컷 마우스에 각각 피하주입 및 복강내 s 단백질 백신 및 Poly6를 병용 투여 후 2주, 4주 후 안와채혈을 통해 채혈 및 혈청, 간조직을 분리함. 혈청 및 간 조직에서 QIAamp DNA Blood kit (QIAGEN)를 사용하여 혈청 내 HBV viral DNA를 추출하였다.

HBV를 정량하는 프라이머 (Samll S gene, SF/SR, position 309-328)를 사용하여 qPCR 수행, standard를 사용하여 정량 및 그룹 별 비교하였다.

또한 혈청을 dilution하여 (1:100 또는 1:20) HBsAg ELISA를 사용하여 제공된 프로토콜대로 수행하여 TECAN 기기로 측정 OD 값 비 교함으로써 혈청 내 HBsAg 항원의 분비량을 측정하고 항바이러스능이 관찰되는지 확인하였다.

그 결과, Poly6와 S 항원을 같이 면역한 TG 마우스에서 HBsAg 및 HBV DNA가 감소하는 것이 확인되었으며, 이는 현재 상용하고 있는 면역 보조제인 Alum과 함께 투여되었을 때에 더욱 유의한 차이를 보였다(도 26).

2) 혈청 내 IgG 측정

단백질 및 adjuvant의 조합으로 면역시킨 마우스의 혈청 내 HBsAg 특이적인 IgG2, IgG1 및 total IgG를 ELISA를 통해 측정하였다.

그 결과, SC 또는 IP 주사한 모든 TG 마우스 그룹에서 PBS 및 Poly6 단독 주사 그룹에 대비하여 IgG1, IgG2, total IgG가 모두 증가하는 양상을 보였다. 이를 통해 Poly6가 sAg 단백질과 병용 투여시 HBs 항원에 대한 특이적인 IgG의 발현이 증가함을 알 수 있었다. 이 때에도 Alum과 함께 병용 투여시에 그 효과가 더욱 크게 증가함을 관찰하였다(도 27).

3) 비장 세포 내 사이토카인 발현 평가

S 단백질과 Poly6를 병용 투여한 TG 마우스의 비장 세포를 수득하여, 세포 배양액에서 분비하는 사이토카인 IL-2, IFN-γ, IL-12의 발현을 ELISA로 측정하였다.

그 결과, Poly6와 s단백질(SHB)을 병용 투여한 TG 마우스에서 PBS 및 S 단백질 단독 투여 그룹에 비해 IL-2, IFNγ, IL-2가 유의하게 증가함을 관찰하였다. 다만 항원 챌린지에 의한 사이토카인은 TG (형질전환) 마우스에서는 관찰되지 않았다(도 28).

4) 림프구 내 수지상 세포 성숙도 측정

Poly6 및 S 단백질의 TG 마우스 병용 투여 후 림프절을 분리하여 single cell로 분리한 후 FACS를 이용해 수지상 세포의 성숙도를 측정하였다.

C57BL/6 마우스에 Poly6 및 S 단백질의 병용 투여 시, 비장 세포에서 수지상세포의 면역활성능이 증가된 것과 같이 TG 마우스의 림프구에서도 수지상세포의 활성 마커인 CD80, CD40, MHCII가 유의한 수준으로 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해 Poly6와 S 단백질의 병용 투여가 2차 면역기관인 림프구에서도 수지상세포의 면역 활성능을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다(도 29).

5) 간 조직 병리학적 평가

Poly6를 S 항원과 병용 투여한 마우스를 희생시켜 간 조직 일부를 포르말린에 고정하였다. 고정된 샘플을 파라핀에 포매하여 hematoxylin-eosin 염색 (H&E staining)을 진행하였다. 염색 조직을 현미경으로 관찰하여 면역 세포의 infiltration 정도를 확인하였다

H&E 염색 결과를 확인한 결과, PBS 및 S 항원의 단톡 투여 그룹에 비해 S 항원과 Poly6를 병용 투여한 마우스의 간 조직에서 면역세포들의 infiltration이 간 조직 내 여러 곳에서 발견되었다. 이를 통해 S 항원의 단독 투여 보다 S 항원과 Poly6의 병용 투여 시 면역 세포들의 활성 및 이동이 더욱 증가될 수 있음을 확인하였다(도 30).

6) Poly와 S 단백질 병용 투여 시 TG 마우스의 간 조직에서 IFN-γ를 분비하는 T cell population 평가

TG 마우스에서 항바이러스 능 및 면역 세포의 간 조직 침투현상을 혈청 및 간 조직에서 확인함으로써 Poly6와 S 항원 병용으로 인한 수지상세포의 활성능뿐만 아니라 2차 면역기관의 활성화, 그리고 궁극적으로 항바이러스 능을 보이는 기능성 T 세포의 활성화 및 이동이 관찰될 것이라는 가설을 세웠다.

Poly6와 S 단백질을 병용 투여한 TG 마우스의 간조직을 분리하여 single cell 단위로 만들고 이를 FACS로 분석하였다. 그 결과, Poly6와 S 단백질을 같이 면역한 그룹에서 IFN-γ를 분비하는 CD4 및 CD8 T 세포가 PBS 및 Poly6의 단독 면역 그룹에 비해 유의하게 증가하였음을 알 수 있었다. 다만 Alum의 추가 병용에 따른 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 이를 통해 본래 Poly6 펩티드 면역 증강제 및 S 단백질과의 병용에 따른 치료용 백신 개발의 주요한 목적에 부합하게 실제적인 항바이러스능을 보이는 기능적 T 세포의 활성능을 Poly6가 유도할 수 있음을 확인하였다(도 31).

7) Poly6와 S 단백질의 병용 면역 시 effector T cell population 평가

기능적 T 세포의 증가 및 IFN-γ 발현 뿐만 아니라 Poly6의 S 단백질과의 병용은 실제로 백신 면역 후 오랜 기간 후에도 그 기억을 가지고 항원 침투 시 기능을 다 할 수 있는 effector memory T 세포(CD44^high

CD62L^low)를 활성화 시킴을 간 조직을 분리 후 FACS를 통해 확인하였다(도 32).

8) 말초 혈액 단핵세포 (PBMC)에서 Poly6의 처리로 인한 IFNγ 분비 T 세포의 발현 증가

Poly6의 처리로 인한 수지상세포의 면역 활성능 및 기능적 T 세포 활성화, 그리고 T 세포의 memory 기능 활성화를 확인함에 따라 실제로 인간 세포에서도 그러한 기능이 보이는 지 확인하고자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 추출하여 3일간 IL-2 사이토카인을 처리함으로 T 세포를 확대 배양 시킨 후 Poly6를 여러 가지 농도에서 처리한 후 T 세포의 활성화를 측정하였다.

그 결과, Poly6의 처리가 PBS군에 대비하여 유의하게 IFNγ를 발현하는 T 세포가 유의하게 증가하였을 뿐만 아니라 농도 의존적인 경향 역시 관찰되었다. 따라서 세포 단위 및 마우스 동물 실험에서뿐만 아니라 인간 세포에서도 면역 활성화 기능이 관찰되었으며, 이는 추후 백신 개발 시 임상적으로 유의한 결과를 도출하는 데 큰 이점이 될 수 있음을 재 확인하였다(도 33).

4. Pol6(또는 Poly6)의 TBCM( Mycobacterium tuberculosis chorismate mutase)과의 병용 처리에 따른 면역 증진 효과의 확인

(1) TBCM( Mycobacterium tuberculosis chorismate mutase) 단백질 발현 벡터의 제조 및 확인

서열번호 4의 결핵균의 TBCM (Rv1885c) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결핵균 genomic DNA를 주형으로 하여 증폭하였다. 이 후, pET28a 발현 벡터에 클로닝(서열번호 5; His tag 포함)하여 E. coli에서 단백질을 발현 및 정제하여 약 25 kD의 TBCM 단백질을 확보하였다. (도 34).

(2) TBCM 및 Pol6를 통한 마우스 면역 시 TBCM 및 결핵 특이적인 면역 유도능 평가

1) TBCM 단백질 및 Pol6 조합 면역(SC)에 의한 TBCM 특이적인 면역 유도능 결과

도 35과 같은 스케줄로 TBCM과 다양한 adjuvant 조합(TBCM 단독, TBCM+Alum, TBCM+Pol6, TBCM+Alum+Pol6)을 통해 마우스에 2주 간격으로 2회 면역한 후 (subcutaneous injection, SC) 마우스를 희생시켜 비장 세포 및 혈청에서 TBCM에 특이적인 면역 반응을 관찰하였다. TBCM 단백질 및 adjuvant의 농도는 하기와 같았다.

i) TBCM (10 μg/mouse)

ii) Alum (100 μg/mouse)

iii) Pol6 (5 μg/mouse)

① IFN-γ Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) assay

각 단백질 및 adjuvant의 조합으로 면역시킨 마우스의 비장 세포를 사용하여, TBCM 항원 자극에 대한 IFN-γ의 발현량을 ELISPOT으로 확인하였다.

그 결과, TBCM+Pol6 조합이 TBCM 단독 및 TBCM+Alum 조합에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 IFN-γ spot을 증가시켰음을 확인하였다. 또한, TBCM+Alum+Pol6 조합으로 면역 시, TBCM에 특이적인 IFN-γ 발현량이 가장 높아짐을 확인할 수 있었다(도 36).

② Cytokine 측정

각 단백질 및 adjuvant의 조합으로 면역시킨 마우스의 비장 세포를 TBCM 단백질로 자극한 후 세포 배양액에서 IFN-γ. IL-12, TNF-α 및 IL-10에 대한 ELISA를 수행하였다.

그 결과, TBCM+Pol6 조합으로 면역한 마우스 비장 세포에서 방어 면역에 중요한 사이토카인인 IFN-γ 및 IL-12의 발현이 TBCM 단독 및 TBCM+Alum 조합에 비해 통계적 유의성을 보이며 증가됨을 확인할 수 있었다(도 37).

또한, TBCM+Alum+Pol6 조합으로 면역했을 때, 다른 조합보다 더 높은 IFN-γ 및 IL-12의 발현을 보였다(도 37).

염증성 사이토카인인 TNF-α와 항염증 사이토카인인 IL-10의 경우, TBCM+Pol6 조합은 TBCM 단독 및 TBCM+Alum 조합과 비슷한 수준의 발현 양상을 보였으며, TBCM+Alum+Pol6 조합으로 면역한 비장 세포에서는 다른 조합의 면역에 비해 높은 TNF-α 및 IL-10의 발현을 보였다(도 37).

③ 혈청 내 IgG 측정

각 단백질 및 adjuvant의 조합으로 면역시킨 마우스의 혈청 내 TBCM 특이적인 IgG2, IgG1 및 total IgG를 ELISA를 통해 평가하였다.

IgG2 발현을 비교하면, TBCM 단독에 비해, adjuvant와 같이 면역한 그룹에서 IgG2의 발현이 증가하였으며, TBCM+Alum에 비해 TBCM+Pol6 조합이 상대적으로 증가되었으나, 통계적 유의성은 없었다. 또한, TBCM+Alum+Pol6 조합의 경우, TBCM+Pol6 조합에 의한 면역 그룹을 제외하고 다른 모든 면역 그룹에 비해 통계적 유의성을 보이며 가장 높은 IgG2 발현량을 보였다(도 38).

IgG1의 경우, TBCM+Pol6 조합에 의한 면역 시, TBCM 단독 면역과 비슷한 수준, 그리고 TBCM+Alum 조합에 의한 면역에 비해 상대적으로 낮은 IgG1 발현을 보였다. 앞서, IgG2 발현 비교에서처럼 TBCM+Alum+Pol6 조합 시, IgG1의 발현이 다른 면역 그룹에 비해 증가되는 경향을 보였다(도 38).

IgG2는 Th1 면역 반응과, IgG1은 Th2 면역 반응과 연관되어 있다고 알려져 있는 바, TBCM+Pol6 조합으로 면역 시, TBCM 단독 및 TBCM+Alum 면역에 비해 높은 IgG2의 발현과 비슷하거나 낮은 IgG1의 발현은 이 조합에 의한 Th1 biased 면역 반응이 증가된다는 것을 의미한다는 것을 알 수 있었다.

2) TBCM 단백질 및 Pol6 조합 면역(IN)에 의한 TBCM 특이적인 면역 유도능 결과

도 39와 같은 스케줄로 TBCM과 alum 또는 Pol6를 추가 조합하여 마우스에 2주 간격으로 2회 면역한 후 (intranasal injection, IN), 마우스를 희생시켜 비장 세포, 폐 세포, BAL (bronchoalveolar lavage) fluid 및 혈청에서 TBCM에 특이적인 면역 반응을 관찰하였다. TBCM 단백질 및 adjuvant의 농도는 하기와 같았다.

i) TBCM (10 μg/mouse)

ii) Alum (100 μg/mouse)

iii) Pol6 (5 μg/mouse)

① IFN-γ Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) assay

TBCM과 Alum 또는 Pol6 추가 조합으로 면역시킨 마우스의 비장 세포 및 폐 세포를 사용하여, TBCM 항원 자극에 대한 IFN-γ의 발현량을 ELISPOT으로 확인하였다.

그 결과, 모든 세포에서 TBCM+Alum 또는 TBCM+Alum+Pol6 면역에 의해 TBCM 특이적인 IFN-γ가 PBS 그룹에 비해 증가되는 양상을 확인할 수 있었다. 하지만 비장 세포에서는 TBCM+Alum+Pol6 면역 그룹이, 폐 세포에서는 TBCM+Alum 면역 그룹이 가장 높은 IFN-γ를 내는 특징을 보였다(도 40).

② Cytokine 측정

TBCM과 Alum 또는 Pol6 추가 조합으로 면역시킨 마우스의 비장 세포 및 폐 세포를 TBCM 단백질로 자극한 후 세포 배양액에서 IFN-γ. IL-12, IL-17 및 IL-10에 대한 ELISA를 수행하였다. 또한 BAL fluid에서 IL-12 ELISA를 수행하였다.

그 결과, 비장 세포에서는 IFN-γ ELISPOT 결과와 비슷하게, TBCM+Alum+Pol6 면역 그룹에 의해 IFN-γ, IL-12 및 IL-17의 발현량이 TBCM+Alum 면역 그룹에 비해 통계적 유의성을 보이며 증가됨을 확인할 수 있었다(도 41). 폐 세포에서는 TBCM+Alum 면역 그룹이 IFN-γ와 IL-17의 발현을 TBCM+Alum+Pol6에 비해 증가시켰으나, 통계적 유의성은 없었다(도 42).

항염증 사이토카인인 IL-10의 경우, 비장 세포 및 폐 세포 모두에서 TBCM+Alum 면역에 의해 가장 높은 발현을 보였다(도 41 및 42).

또한, BAL fluid에서는 IL-12의 발현량만 확인이 되었고, TBCM+Alum 및 TBCM+Alum+Pol6 면역 그룹 모두 PBS 그룹에 비해 통계적으로 유의한 수준으로 발현이 증가되어 있었으나 두 그룹 간 차이는 없었다(도 43).

③ 혈청 및 BAL fluid 내 IgG, IgA 측정

TBCM과 Alum 또는 Pol6 추가 조합으로 면역시킨 마우스의 혈청 및 BAL fluid 내 TBCM 특이적인 IgG2, IgG1, total IgG 및 IgA를 ELISA를 통해 평가하였다.

혈청 내 IgG2, IgG1 그리고 total IgG의 발현은 TBCM+Alum 및 TBCM+Alum+Pol6를 면역시킨 그룹에서 모두 증가되었으나, 상대적으로 TBCM+Alum+Pol6 그룹이 더 높은 발현 양상을 보였다(도 44). 또한 점막 면역에 중요한 역할을 하는 IgA의 경우, BAL fluid에서 두 면역 그룹 모두 IgA의 발현이 증가되어 있는 양상을 보였다(도 44).

3) TBCM 단백질 및 Pol6 조합 면역에 의한 결핵 방어 유도능 평가

도 45와 같은 스케줄로 TBCM과 다양한 adjuvant 조합(TBCM 단독, TBCM+Alum, TBCM+Pol6, TBCM+Alum+Pol6))을 통해 마우스에 2주 간격으로 2회 면역한 후 (subcutaneous injection, SC), H37Ra 균주를 감염시켰다(intranasal injection, IN). 감염 4주 째에 마우스를 희생시켜 비장 세포 및 혈청에서 TBCM 및 결핵 항원인 Ag85B에 특이적인 면역 반응을 관찰하였고, 장기 내 H37Ra의 균 수 (CFU)와 폐 조직 내 염증 반응 양상을 hematoxylin and eosin (H&E) 염색으로 확인하였다. BCG를 면역시킨 (SC) 그룹을 비교 그룹으로 선정하였다. 면역한 TBCM 단백질 및 adjuvant의 농도와 BCG 균수는 하기와 같았다.

i) TBCM (10 μg/mouse)

ii) Alum (100 μg/mouse)

iii) Pol6 (5 μg/mouse)

iv) BCG (1 x 10⁶ CFU/mouse)

① Cytokine 측정

각 단백질 및 adjuvant의 조합으로 면역시키고 H37Ra를 감염시킨 마우스의 비장 세포를 TBCM 및 Ag85B 단백질로 자극한 후 세포 배양액에서 IFN-γ. IL-12, TNF-α 및 IL-10에 대한 ELISA를 수행하였다.

그 결과, TBCM으로 자극 시, TBCM+Pol6 조합에 의한 면역에 의해 IFN-γ의 발현이 BCG, TBCM 단독 및 TBCM+Alum에 비해 통계적 유의성을 보이며 증가되어 있음을 확인하였다. 반면, Ag85B로 자극 시, TBCM+Alum 조합에 의한 면역이 BCG, TBCM 단독 및 TBCM+Pol6 조합에 비해 IFN-γ의 발현을 증가시키는 것을 확인하였다(도 46A).

IL-12의 경우, TBCM 및 Ag85B 자극 했을 때, TBCM+Pol6와 TBCM+Alum이 거의 유사한 수준으로 다른 면역 그룹에 비해 IL-12의 발현을 증가시키는 양상을 보였다(도 46B).

TNF-α의 경우도 IL-12의 경향과 비슷하게 TBCM+Pol6와 TBCM+Alum이 거의 유사한 수준으로 다른 면역 그룹에 비해 TNF-α의 발현을 증가시키는 양상을 보였다(도 47A).

Anti-inflammatory cytokine인 IL-10의 경우, 결핵균을 감염시킨 후 면역 반응을 관찰해서인지 면역시키지 않은 그룹을 제외하고 모든 면역 그룹이 비슷하거나 큰 차이가 없는 양상을 보였다(도 47B).

② 혈청 내 IgG 측정

TBCM 단백질 및 adjuvant의 조합으로 면역시키고 결핵균을 감염시킨 마우스의 혈청 내 TBCM 및 Ag85B 단백질 특이적인 IgG2, IgG1 및 total IgG의 발현을 ELISA로 평가하고 확인하였다.

그 결과, TBCM에 특이적인 IgG 발현 양상을 관찰했을 때, TBCM+Pol6 조합에 의해 IgG2 발현이 다른 면역 그룹에 비해 통계적 유의성을 보이며 증가되는 양상을 보였고, IgG1의 경우 BCG 면역을 제외한 나머지 면역 그룹에서 비슷한 수준의 발현량을 관찰할 수 있었다. 전반적으로 TBCM+Pol6를 면역했을 때, TBCM 특이적인 IgG의 발현량이 가장 높다는 것을 total IgG로 확인하였으나, TBCM+Alum 면역의 결과와는 유의성이 없었다(도 48).

결핵 항원인 Ag85B에 특이적인 IgG 발현 양상을 관찰했을 때, BCG 면역에 의해 IgG2와 IgG1이 가장 높게 발현되었다. TBCM+Pol6에 의한 면역도 IgG2의 발현을 BCG 면역을 제외하고 많이 유도함을 확인할 수 있었다. 또한 TBCM+Pol6 면역 그룹이 BCG와 비슷한 수준의 Ag85B 특이적인 IgG 발현을 유도한다는 사실을 total IgG 결과로 확인할 수 있었다(도 48).

③ 장기 내 CFU 확인

TBCM 및 다양한 adjuvant 조합으로 면역시킨 마우스에 H37Ra 균을 감염시킨 후 (도 45), 마우스를 희생시켜 폐를 균질화하여 적당한 희석 배수로 PBS에 희석하였다. 각 희석액의 일부를 7H10 고체 배지 (supplemented with OADC)에 도말한 후, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 4주 가량 배양하였다. 그 후 자란 콜로니 개수를 확인하여 CFU (colony forming unit)를 계산하였다.

폐에서 CFU를 계산했을 때, 면역시키지 않은 그룹에 비해 모든 면역 그룹의 CFU가 감소되어 있는 양상이었으나, BCG, TBCM+Alum 및 TBCM+Pol6 면역에 의한 그룹의 CFU가 가장 낮은 양상을 보였으며, 세 그룹 간의 차이는 보이지 않았다(도 49). 현재 결핵 백신으로 사용되고 있는 BCG와 비슷한 수준으로 감염된 H37Ra의 CFU가 감소되는 결과는 TBCM 단백질의 결핵 백신 개발 가능성을 나타낸다.

④ 폐 조직 병리학적 평가

TBCM 및 다양한 adjuvant 조합으로 면역시킨 마우스에 H37Ra 균을 감염시킨 후 (도 45), 마우스를 희생시켜 폐 조직 일부를 포르말린에 고정하였다. 고정된 샘플을 파라핀에 포매하여 hematoxylin-eosin 염색 (H&E staining)을 진행하였다. 염색 조직을 현미경으로 관찰하여 염증 반응의 차이를 확인하였다.

H&E 염색 결과를 확인한 결과, H37Ra만 감염시킨 그룹에 비해 모든 면역 그룹에서 전반적으로 염증이 완화되는 경향을 보였으나 (조직 내 세포 수 감소 및 폐포의 격벽 두께가 줄어드는 현상 등) TBCM+Pol6 그룹에서 염증 완화 정도가 가장 높은 경향을 보였다(도 50).

⑤ 세포 독성 T 세포 활성 평가 (cytotoxic T lymphocyte response, CTL)

TBCM 및 다양한 adjuvant 조합을 면역시킨 후 H37Ra로 감염시킨 마우스 비장세포(effector cell)와 Ag85B 및 TBCM 단백질로 자극시킨 P815 세포 (H-2d, target cell)를 같이 6시간 동안 배양시켰다. 그 후 세포 독성 평가를 세포 배양액 내 노출된 lactate dehydrogenase (LDH)의 양을 측정하여 진행하였다.

그 결과, TBCM에 대한 CTL 반응은 TBCM+Alum 및 TBCM+Pol6에 의해 증가되었고, Ag85B에 대한 CTL 반응은 BCG가 가장 높았으나, TBCM+Pol6에 의한 Ag85B 특이적인 cell lysis가 다른 면역 그룹 (TBCM 단독 및 TBCM+Alum 면역 그룹)에 비해 높은 양상을 보였다(도 51).

SEQUENCE LISTING <110> SNU R&DB FOUNDATION <120> AN IMMUNE ADJUVANT COMPRISING HEPATITIS B VIRUS-DERIVED POLYPEPTIDE <130> PN200810 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> poly5 peptide <400> 1 Gly Arg Leu Val Phe 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> poly6 peptide <400> 2 Gly Arg Leu Val Phe Gln 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> poly7 peptide <400> 3 Gly Arg Leu Val Phe Gln Thr 1 5 <210> 4 <211> 199 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 4 Met Leu Thr Arg Pro Arg Glu Ile Tyr Leu Ala Thr Ala Val Ser Ile 1 5 10 15 Gly Ile Leu Leu Ser Leu Ile Ala Pro Leu Gly Pro Pro Leu Ala Arg 20 25 30 Ala Asp Gly Thr Ser Gln Leu Ala Glu Leu Val Asp Ala Ala Ala Glu 35 40 45 Arg Leu Glu Val Ala Asp Pro Val Ala Ala Phe Lys Trp Arg Ala Gln 50 55 60 Leu Pro Ile Glu Asp Ser Gly Arg Val Glu Gln Gln Leu Ala Lys Leu 65 70 75 80 Gly Glu Asp Ala Arg Ser Gln His Ile Asp Pro Asp Tyr 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agagcggtgg gaacaactca 960 cctgcggttt atctgctcga cggcctgcgc gcccaagacg actacaacgg ctgggatatc 1020 aacaccccgg cgttcgagtg gtactaccag tcgggactgt cgatagtcat gccggtcggc 1080 gggcagtcca gcttctacag cgactggtac agcccggcct gcggtaaggc tggctgccag 1140 acttacaagt gggaaacctt cctgaccagc gagctgccgc aatggttgtc cgccaacagg 1200 gccgtgaagc ccaccggcag cgctgcaatc ggcttgtcga tggccggctc gtcggcaatg 1260 atcttggccg cctaccaccc ccagcagttc atctacgccg gctcgctgtc ggccctgctg 1320 gacccctctc aggggatggg gcctagcctg atcggcctcg cgatgggtga cgccggcggt 1380 tacaaggccg cagacatgtg gggtccctcg agtgacccgg catgggagcg caacgaccct 1440 acgcagcaga tccccaagct ggtcgcaaac aacacccggc tatgggttta ttgcgggaac 1500 ggcaccccga acgagttggg cggtgccaac atacccgccg agttcttgga gaacttcgtt 1560 cgtagcagca acctgaagtt ccaggatgcg tacaacgccg cgggcgggca caacgccgtg 1620 ttcaacttcc cgcccaacgg cacgcacagc tgggagtact ggggcgctca gctcaacgcc 1680 atgaagggtg acctgcagag ttcgttaggc gccggcatga cagagcagca gtggaatttc 1740 gcgggtatcg aggccgcggc aagcgcaatc cagggaaatg tcacgtccat tcattccctc 1800 cttgacgagg ggaagcagtc cctgaccaag ctcgcagcgg cctggggcgg tagcggttcg 1860 gaggcgtacc agggtgtcca gcaaaaatgg gacgccacgg ctaccgagct gaacaacgcg 1920 ctgcagaacc tggcgcggac gatcagcgaa gccggtcagg caatggcttc gaccgaaggc 1980 aacgtcactg ggatgttcgc atagaagggt tcgatcccta ccggttagta atgagtttaa 2040 acgggggagg ctaactgaaa cacggaagga gacaataccg gaaggaaccc gcgctatgac 2100 ggcaataaaa agacagaata aaacgcacgg gtgttgggtc gtttgttcat aaacgcgggg 2160 ttcggtccca gggctggcac tctgtcgata ccccaccgag accccattgg ggccaatacg 2220 cccgcgtttc ttccttttcc ccaccccacc ccccaagttc gggtgaaggc ccagggctcg 2280 cagccaacgt cggggcggca ggccctgcca tagcagatct gcgcagctgg ggctctaggg 2340 ggtatcccca cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca 2400 gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct 2460 ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcggggcatc cctttagggt 2520 tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac 2580 gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct 2640 ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt 2700 ttgatttata agggattttg gggatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac 2760 aaaaatttaa cgcgaattaa ttctgtggaa tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc 2820 aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg 2880 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 2940 agcaaccata gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc 3000 ccattctccg ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc 3060 tgcctctgag ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa 3120 aaagctcccg ggagcttgta tatccatttt cggatctgat caagagacag gatgaggatc 3180 gtttcgcatg attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag 3240 gctattcggc tatgactggg cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg ccgtgttccg 3300 gctgtcagcg caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa 3360 tgaactgcag gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc 3420 agctgtgctc gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc 3480 ggggcaggat ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga 3540 tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa 3600 acatcgcatc gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct 3660 ggacgaagag catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat 3720 gcccgacggc gaggatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt 3780 ggaaaatggc cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta 3840 tcaggacata gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga 3900 ccgcttcctc gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg 3960 ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg cgaaatgacc gaccaagcga 4020 cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa aggttgggct 4080 tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat ctcatgctgg 4140 agttcttcgc ccaccccaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 4200 gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 4260 aactcatcaa tgtatcttat catgtctgta taccgtcgac ctctagctag agcttggcgt 4320 aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 4380 tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 4440 taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 4500 aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 4560 cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 4620 aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 4680 aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 4740 tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 4800 caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 4860 cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 4920 ctcaatgctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 4980 gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 5040 agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 5100 gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 5160 acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 5220 gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 5280 gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 5340 cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 5400 caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 5460 gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 5520 cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 5580 cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 5640 caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 5700 gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 5760 gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 5820 cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 5880 catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 5940 gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 6000 ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 6060 gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 6120 cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 6180 tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 6240 gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 6300 atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 6360 ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 6420 gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 6480 acgtcgacgg atcgggagat ctcccgatcc cctatggtcg actctcagta caatctgctc 6540 tgatgccgca tagttaagcc agtatctgct ccctgcttgt gtgttggagg tcgctgagta 6600 gtgcgcgagc aaaatttaag ctacaacaag gcaaggcttg accgacaatt gcatgaagaa 6660 tctgcttagg 6670 <210> 7 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> p24 protein <400> 7 Met Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile 1 5 10 15 Ser Pro Arg Thr 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230

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 면역 어쥬번트(Immune adjuvant).
청구항 1에 있어서, 다른 면역 어쥬번트를 더 포함하는 면역 어쥬번트(Immune adjuvant).
청구항 2에 있어서, 상기 다른 면역 어쥬번트는 Alum(Aluminium salts), CpG ODNs(oligodeoxynucleotides), GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), IL-12(Interleukin-12), poly(I:C), MPL(Monophosphoryl Lipid A), AS01(liposome mixed with monophosphoryl lipid A and saponin QS-21), IC31 (oligo nucleotide and cationic peptide), 및 CFA01 (cationic liposome)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 면역 어쥬번트(Immune adjuvant).
청구항 1에 있어서, 상기 면역 어쥬번트는 DNA 또는 항원과 병용 투여되는 것인, 면역 어쥬번트(Immune adjuvant).
청구항 4에 있어서, 상기 DNA 또는 상기 항원은 HIV(human immunodeficiency virus), HBV(hepatitis B virus) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나로부터 유래되는 것인, 면역 어쥬번트(Immune adjuvant).
청구항 4에 있어서, 상기 DNA는 코리스미산 이성화효소(chorismate mutase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Ag85B 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, p24 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HBV s 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 면역 어쥬번트(Immune adjuvant).
청구항 4에 있어서, 상기 항원은 코리스미산 이성화효소(chorismate mutase), Ag85B 단백질, p24 단백질 및 HBV s 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 면역 어쥬번트(Immune adjuvant).
청구항 1에 있어서, 상기 면역 어쥬번트는 HIV(human immunodeficiency virus), HBV(hepatitis B virus) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 감염증 예방용 백신의 면역 어쥬번트인, 면역 어쥬번트(Immune adjuvant).
청구항 1에 있어서, 상기 면역 어쥬번트는 간 질환, 후천성면역결핍증(Acquired Immune Deficiency Syndrome: AIDS) 및 결핵(tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질환의 예방용 백신의 면역 어쥬번트인, 면역 어쥬번트(Immune adjuvant).
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함하는 면역 증진용 조성물.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 및 DNA 또는 항원을 포함하는 백신 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 백신 조성물은 다른 면역 어쥬번트를 더 포함하는 백신 조성물.
청구항 12에 있어서, 상기 다른 면역 어쥬번트는 Alum(Aluminium salts)인, 백신 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 DNA 또는 상기 항원은 HIV(human immunodeficiency virus), HBV(hepatitis B virus) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나로부터 유래되는 것인, 백신 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 DNA는 코리스미산 이성화효소(chorismate mutase)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, Ag85B 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, p24 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 HBV s 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 백신 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 항원은 코리스미산 이성화효소(chorismate mutase), Ag85B 단백질, p24 단백질 및 HBV s 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나인, 백신 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 백신 조성물은 HIV(human immunodeficiency virus), HBV(hepatitis B virus) 및 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 감염증 예방용 백신 조성물인, 백신 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 면역 어쥬번트는 간 질환, 후천성면역결핍증(Acquired Immune Deficiency Syndrome: AIDS) 및 결핵(tuberculosis)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질환의 예방용 백신 조성물인, 백신 조성물.